Numeroase studii efectuate cu markerul activității neuronale Fos indică faptul că cocaina activează doar o mică parte din neuronii striatici cu o distribuție redusă. Până acum, nu au fost disponibile metode eficiente pentru a evalua neuroadaptările induse în mod specific în acești neuroni activi. Am utilizat sortarea de celule activate cu fluorescență (FACS) pentru purificarea neuronilor striatici activați în timpul locomoției induse de cocaină în naivitate și sensibilizată cu cocaină lacZ-CFOs șobolani transgenici. Neuronii activați au fost marcați cu un anticorp împotriva β-galactosidazei, produsul proteic al genei lacZ. Cocaina a indus un profil de expresie genică unic în mod selectiv în proporția mică de neuroni activi care nu a fost observată în majoritatea neactivată a neuronilor. Aceste gene au inclus niveluri modificate ale genelor imediate timpurii arc, fosB, și nr4a3, precum și genele implicate în semnalizarea p38 MAPK și specificitatea tipului de celule. Vă propunem că această metodă FACS poate fi utilizată pentru a studia neuroadaptările moleculare în neuroni specifici care codifică efectele comportamentale ale medicamentelor abuzate și a altor comportamente învățate.

animale

Femeie lacZ-CFOs șobolani transgenici (Kasof și colab., 1995; Koya și colab., 2009) și șobolanii de sex feminin Sprague-Dawley (Charles River, Raleigh, NC, SUA) au fost adăpostiți individual în cuști standard din plastic, într-o cameră controlată de temperatură și umiditate. Au fost menținute pe o lumină inversă 12: 12 h: ciclu întunecat (luminile aprinse la 20.00 h) și au permis accesul liber la alimente și apă. Au fost aclimatizate la aceste condiții de locuință timp de cel puțin 7 zile înainte de tratamentele medicamentoase. Procedurile experimentale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din NIDA.

Tratamente de droguri

Pentru experimentele acute de cocaină, șobolanii au fost injectați cu cocaină (30 mg / kg, ip; n = 8) sau soluție salină (1 ml / kg; n = 6) și au fost plasați într-o cameră rotundă din Plexiglass (diametru 38 cm). Șobolanii au fost sacrificați 90 minute după injecții pentru a obține țesutul creierului. Acest tratament a fost repetat de trei ori în zile separate pentru a obține trei replici biologice pentru analiza microarray. În plus, trei replici biologice independente au fost produse în mod similar pentru PCR cantitativă (qPCR). Pentru analizele qPCR ale arc, pdyn, adora2a, numai aceste trei replici biologice independente au fost utilizate. Pentru analizele qPCR ale fosB, nr4a3, kcnc1 și hartă2k6, am folosit, de asemenea, ARN rămas din fiecare dintre probele de microarray.

Pentru experimentele repetate de cocaină, șobolanii de sex feminin au fost sensibilizați cu patru injecții de cocaină (15 mg / kg ip) administrate o dată în a doua zi. În zilele de injecție, fiecare șobolan a fost plasat într-o cameră de activitate locomotorie Plexiglas 43 × 43 cm pătrat (Med Associates, St Albans, VT, SUA) pentru a obișnui timp de 30 minute. Șobolanii au fost injectați cu cocaină și activitatea locomotorie a fost înregistrată ca distanță parcursă timp de 60 minute. În urma celei de-a patra injecții repetate de cocaină, șobolanii au rămas în cușca lor timp de 7-8 zile. În ziua testării, șobolanii au fost obișnuiți cu 30 min în camerele de activitate locomotorie și apoi s-au injectat cu cocaină (30 mg / kg ip) sau cu un vehicul salin. Șobolanii au fost decapitați și creierul a fost extras la nouăzeci de minute după injecții. Întregul tratament de sensibilizare a fost repetat de trei ori pe săptămâni separate pentru a obține trei replici biologice ale fiecărui grup pentru analiza qPCR.

Disocierea celulară

Țesutul striatal a fost disociat pentru a obține o suspensie unicelulară. Șobolanii au fost decapitați și striata lor extrasă în două minute. Fiecare striatum a fost tocat cu lame de ras pe o placă de sticlă rece cu gheață și introdus în 1 ml de Hibernat A (Cat # HALF; Brain Bits, Springfield, IL). Striata a fost digerată enzimatic în 1 ml Accutase per striatum (Cat # SCR005; Chemicon, Billerica, MA) cu amestecare de capăt peste cap pentru 30 min la 4 ° C. Țesutul a fost centrifugat timp de două minute la 425 × g și a fost resuspendat în 300 µl de hibernat rece A. Toate etapele de centrifugare ulterioare au fost efectuate la 4 ° C.

Țesutul striat digerat a fost disociat mecanic prin triturare. Patru striate au fost combinate într-un tub Eppendorf și triturate de zece ori cu o pipetă Pasteur cu diametru mare (~ 1.3mm). Tuburile au fost plasate scurt pe gheață pentru ca piesele mari de țesut să se așeze; 600 μl de suspensie tulbure conținând celule disociate au fost transferate într-un tub Falcon 15 ml pe gheață. 600μL de Hibernat A proaspăt a fost adăugat la tubul Eppendorf original și apoi etapele de triturare au fost repetate ca mai sus cu pipete cu diametru mediu și mic (~ 0.8mm și ~ 0.4mm). Fiecare suspensie tulbure conținând celule disociate a fost reunită cu suspensia anterioară.

Resturile de celule rămase în suspensia celulelor reunite au fost îndepărtate prin filtrare prin filtre de pre-udare 100 μm și 40 μm (marca Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA). Resturile celulare mici din suspensie au fost reduse prin centrifugarea filtratului pentru 3 min la 430 × g printr-un gradient de densitate în trei trepte de Percoll (Cat # P1644; Sigma, St. Louis, MO). Stratul superior tulbure (aproximativ 2 ml) care conține resturi a fost aruncat. Celulele din straturile rămase au fost resuspendate în soluția Percoll rămasă și centrifugate timp de cinci minute la 550xg. Peletul a fost resuspendat în 1 ml de Hibernat A.

Imunomarcare și FACS

Celulele disociate au fost fixate și permeabilizate prin adăugarea unui volum egal de etanol pentru o concentrație finală de 50% etanol și menținute pe gheață timp de 15 minute cu amestecare ocazională. Celulele au fost centrifugate timp de două minute la 425xg și au fost resuspendate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) fără RNază. Celulele au fost incubate cu un anticorp primar biotinilat împotriva NeuN (diluție 1: 1000, Cat # MAB377B, Chemicon) și un anticorp primar împotriva β-galactosidaza ((β-gal; 1: diluție 10000, Cat # 4600-1409, Biogeneză, , Marea Britanie). Celulele au fost rotite la capăt în extremitate în anticorp primar timp de 30 minute la 4 ° C și centrifugate timp de trei minute la 425xg. Celulele au fost spălate cu 800 μl de PBS și resuspendate în 700 μl de PBS. cu streptavidină marcată fluorescent (Streptavidin-phycoerythrin, 1: 1000 diluție, Cat # SA1004-1, Invitrogen, Carlsbad, CA) și anticorp secundar (IgG anti-capră, marcat cu 488, 1: 1000 11055, Invitrogen) și capăt final rotit pentru 15 min. Celulele au fost spălate cu 800 µl de PBS, centrifugate timp de trei minute la 425 × g și resuspendate în 1 ml de PBS.

Celulele imunomarcate au fost scanate și sortate la centrul de citometrie al fluxului din campusul Johns Hopkins Bayview. Aria FACS (BD, Franklin Lakes, NJ) a fost utilizată pentru sortarea celulelor. Probele de control au fost analizate mai întâi pentru a determina criteriile optime pentru sortarea eșantioanelor de testare. În mod specific, au fost utilizate celule fixe fără tratament cu anticorpi pentru a seta poarta de împrăștiere a luminii. Celulele fixe tratate cu anticorp secundar fluorescent, dar fără anticorp primar, au fost apoi utilizate pentru a stabili praguri pentru fluorescența țesutului endogen și legarea nespecifică prin streptavidină sau anticorp secundar. În continuare, probele de control au fost marcate cu un singur anticorp primar și secundar pentru fiecare proteină (NeuN sau β-gal) pentru a compensa suprapunerea fluorescentă în canalele vecine. În cele din urmă, probele de testare etichetate cu ambii markeri fluorescenti au fost analizate și sortate. Celulele sortate au fost colectate în tuburi cu legătură scăzută (Cat # 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) cu 100 µl de PBS în fiecare tub.

Extracția ARN

După sortare, probele care conțin celule βgal-pozitive sau βgal-negative de la șobolani injectați cu cocaină sau toate celulele NeuN pozitive de la șobolani injectați cu soluție salină au fost centrifugate pentru 8 min la 2650 × g la 18 ° C. Celulele negative NeuN de la șobolani injectați cu soluție salină au fost centrifugate pentru 8 min la 6000 ×g la 18 ° C. Pentru experimentele microarray, ARN-ul a fost extras cu reactiv Trizol (Cat # 15596-026, Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. Calitatea și cantitatea de ARN au fost evaluate utilizând Bioanalizatorul Picochip (Cat # 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Pentru experimentele qPCR, ARN-ul a fost extras cu kit-ul RNEasy Micro (Cat # 74004; Qiagen, Valencia, CA), conform instrucțiunilor producătorului cu tratament DNase. Cantitatea și puritatea ARN-ului au fost evaluate utilizând un spectrofotometru Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Experimente microarray

Microarrays au fost utilizate pentru a analiza ARN din celulele NeuN-pozitive și NeuN-negative de la șobolani injectați cu soluție salină, și neuronii βgal-pozitivi și βgal-negativi de la șobolani injectați cu cocaină. Așa cum s-a descris mai sus în secțiunea de tratament cu medicamente, microarrays a conținut trei replici biologice pentru fiecare din cele patru tipuri de probe. Cinci µl de ARN total de la fiecare eșantion au fost etichetați utilizând Kit-ul de amplificare ARN Illumina TotalPrep (Cat # IL1791; Ambion, Austin, TX) într-un proces în două etape de sinteză de ADNc urmat de in vitro Transcrierea ARN cu biotină-16-UTP. 0.75 μg de ARNc marcat cu biotină a fost hibridizat timp de 16 ore la Illumina Sentrix Rat Ref12_v1 BeadChips (Cat # BD-27-303; Illumina, San Diego, CA). ARNc biotinilat hibridizat la cip a fost detectat cu streptavidină marcată cu Cy3 și cuantificat folosind scanerul Sistemelor de analiză genetică BeadStation 500GX de la Illumina. Toată etichetarea și analiza s-au făcut la Johns Hopkins Bayview Medical Campus Lowe Family Genomics Core.

PCR cantitativ în timp real

PCR cantitativă în timp real a fost utilizată pentru validarea rezultatelor FACS și microarray. ARN a fost transcris invers în ADNc folosind kitul RETROscript (Cat # AM1710, Ambion) cu un primer oligo (dT). Fiecare reacție PCR 25 μl a inclus 12.5 μl de amestecul principal de expresie genică Taqman (Cat #4369514; Applied Biosystems, Foster City, CA), 1.1 μl, fiecare dintre 20 μM înainte și înapoi invers, 0.25 μl de 100 μM FAM marcat cu sonda 5 µl de apă și 5 μl de 1 ng / µl ADNc. Combinații de grund și sondă [Tabelul 1] au fost concepute folosind Centrul de Proces de Asașare a Bibliotecii Universale Roche Probe pentru a se extinde pe intron. Reacțiile PCR au fost monitorizate utilizând Cycler Light Opticon (Biorad, Hercules, MD). Programul a început cu 20 plăci citite la 50 ° C pentru fotoblocare, urmat de 5 min la 95 ° C, apoi cicluri 40 de 20 sec la 94 ° C, 1 min la 60 ° C și o placă citită.

 

Tabelul 1

Grunduri și sonde utilizate pentru qPCR

Reacțiile standard la curbă au fost efectuate pentru fiecare genă pentru a determina eficiența de amplificare [Tabelul 1]. Nivelurile de expresie pentru fiecare genă amplificată au fost calculate folosind eficiența ^ ΔC_q unde ΔC_q = C_q(genă experimentală) - C_q(gena de referință) pentru fiecare replică biologică. Gorasp2 a fost aleasă ca o genă de referință, deoarece nu a fost exprimată diferit între neuroni și glia în analizele microarray. Acesta a fost validat în continuare ca o genă de referință datorită amplificării egale cu QPCR la toate probele la încărcarea aceleiași cantități de șablon. Testul tehnic triplicat C_q valorile au fost mediate înainte de calcularea ΔC_q pentru fiecare genă dintr-o probă. Pentru fiecare ARNm măsurat în qPCR, valorile de exprimare ale genelor au fost mediate pe replicile biologice. Apoi, pentru a reflecta valorile de schimbare a faldurilor, am împărțit această medie la valorile medii de expresie genică ale celulelor pozitive NeuN de la șobolani injectați cu soluție salină. Aceste valori sunt indicate ca mijloace și erori standard în graficele și tabelele.

imunohistochimie

Țesutul creierului a fost obținut de la șobolani Spraque-Dawley, de tip sălbatic, în urma acelorași tratamente acute și repetate de cocaină descrise mai sus pentru experimentele microarray și qPCR. Cu toate acestea, 90 minute după injecțiile din ziua de testare, șobolanii au fost profund anesteziați cu izofluran și perfuzați cu 100 ml de PBS urmată de 400 ml de 4% paraformaldehidă (PFA). Creierul a fost post-fixat în PFA timp de 2 ore și transferat în soluție de zaharoză 30% la 4 ° C pentru 2-3 zile. Creierele au fost înghețate pe gheață uscată sub formă de pulbere și menținute la -80 ° C până la secționare. Secțiunile coronale au fost tăiate cu 40 μm grosime între Bregma 2.5 și −0.5 (Paxinos și Watson, 1998).

Secțiunile au fost imunomarcate pentru Fos și Arc. Pe scurt, secțiunile au fost spălate de trei ori în soluție salină tamponată cu Tris (TBS) și permeabilizate pentru 30 min în TBS cu 0.2% Triton X-100. Secțiunile au fost spălate din nou în TBS și incubate în anticorpi primari diluate în PBS cu 0.3% Triton X-100 timp de 24 ore pe un agitator la 4 ° C. Am folosit un policlonal de iepure împotriva anticorpului c-Fos (diluție 1: 500, Cat # sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) și un anticorp Arc monoclonal de șoarece (diluție 1: 100, Cat # sc-17839, Santa Biotehnologie Cruz). Secțiunile au fost spălate de trei ori în TBS și incubate în anticorpi secundari diluate în PBS timp de 1.5 ore pe un agitator la temperatura camerei. Am folosit anticorp anti-iepure marcat cu Alexa Fluor 488 (diluție 1: 200, Cat # A21206, Invitrogen) și anticorp anti-mouse de capră marcat cu 568 Alexa Fluor (diluție 1: diluție 200, Cat # A11004, Invitrogen). Secțiunile au fost spălate în TBS, montate pe lamele acoperite cu crom-alumini și acoperite cu suporturi de fixare rigide VectaShield.

Imaginile fluorescente ale imunoreactivității Fos și Arc în caudat-putamen și NAc (aproximativ 2.0 mm anterior față de Bregma) au fost surprinse folosind o cameră CCD (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ) atașată la un microscop Zeiss Axioskop 2. Imaginile pentru numărarea celulelor marcate au fost luate la mărirea 200x; imaginile pentru determinarea colocalizării Fos și Arc au fost luate la mărirea 400x. Celulele etichetate din patru emisfere pe șobolan au fost contorizate automat folosind software-ul IPLab pentru Macintosh, versiunea 3.9.4 r5 (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). Numărul din toate cele patru emisfere au fost mediați pentru a obține o singură valoare pentru fiecare șobolan.

Analiza datelor

Datele de sensibilizare locomotorie au fost analizate folosind ANOVA unidirecțional cu măsuri repetate pentru efectul principal al timpului pe parcursul a 4 zile de injecție. Semnificația statistică a fost stabilită la p <0.05. Datele microarray au fost analizate folosind DIANE 6.0, un program de analiză microarray bazat pe foaie de calcul bazat pe SAS JMP 7.0, așa cum a fost descris anterior (Garg și colab., 2009). Datele de intensitate de fluorescență de la microrauri au fost supuse filtrării prin detectare p-valori și Z normalizare. Calitatea eșantionului a fost analizată folosind scatterplots, analiza componentelor principale și proba de genă Z-corporare ierarhică bazată pe scoruri pentru a exclude posibile valori aberante. Testele ANOVA au fost apoi utilizate pentru a elimina genele cu varianțe mai mari în cadrul fiecărui grup de comparație. Genele au fost identificate ca exprimate diferențial dacă p <0.01, absolut Z-ratio ≥ 1.5 și raport de descoperire falsă (fdr) <0.07. Pentru datele qPCR, a fost utilizat ANOVA unidirecțional pentru a compara datele pentru fiecare genă. Semnificația statistică a fost stabilită la p <0.05. Pentru imunohistochimia Fos și Arc, s-a folosit un test t presupunând o varianță inegală pentru a calcula semnificația statistică, stabilit la p <0.05.

șobolani transgenici cfos-lacZ

lacZ-CFOs transgenul la acei șobolani este reglementat de o c-fos promotor similar cu cel din endogen c-fos gena și este astfel activat în mod similar la neuroni de niveluri ridicate de aport sinaptic excitator (Shin și colab., 1990; Labiner și colab., 1993; Sgambato și colab., 1997). Produsul proteic al lacZ-CFOs transgenul, β-galactosidaza (βgal), este co-exprimat cu c-Fos în neuronii puternic activați (Koya și colab., 2009) și a fost utilizat pentru a eticheta neuronii striatici activați în procedura de purificare FACS următoare.

Purificarea FACS a neuronilor striatici activați după injecții acute de cocaină

Striata integrală a fost obținută din lacZ-CFOs șobolani 90 minute după injecții acute de 30 mg / kg cocaină sau soluție salină în afara cuștii lor de origine. Celulele striatale disociate de la șobolani tratați în mod similar au fost reunite înainte de purificarea FACS pentru fiecare dintre replicile biologice în microarray ulterior și analize cantitative PCR (qPCR). Celulele striatale disociate au fost analizate inițial în funcție de caracteristicile lor de împrăștiere a luminii înainte și laterale [Figura 1a]. Majoritatea neuronilor marcați NeuN au fost găsiți într-o fâșie de evenimente de-a lungul părții inferioare a complotului. Astfel, toate analizele ulterioare au fost reduse pentru a include doar evenimentele găsite în această bandă.

 

Figura 1

Sortarea cu fluorescență a neuronilor marcați βgal de la șobolani tratați cu o singură injecție de cocaină

Celulele din această poartă au fost separate în funcție de gradul lor de imunomarcare cu markerul neuronal NeuN și markerul de activare neurală βgal. În țesutul obținut de la șobolani injectați cu cocaină, aproximativ 15% dintre neuronii marcați NeuN au avut un nivel ridicat de βgal [Figura 1b], care corespundea cu aproximativ neuroni marcați 100,000 βgal la șobolan. Toate celulele marcate cu βgal au exprimat NeuN co-exprimat, ceea ce indică faptul că numai neuronii au exprimat βgal. În schimb, foarte puțini neuroni marcați NeuN obținuți de la șobolani injectați cu soluție salină au exprimat markerii de activare βgal sau Fos, care susțin imunoreactivitatea βgal și Fos ca markeri ai activării neurale la șobolani injectați cu cocaină. Numărul redus de neuroni care exprimă βgal de la șobolani injectați cu soluție salină nu a furnizat suficiente celule pentru analizele moleculare ulterioare. Astfel, am utilizat doar marcare NeuN pentru a separa neuronalul de celulele non-neuronale în toate experimentele ulterioare cu țesutul striatal obținut de la șobolani injectați cu soluție salină. În general, aproximativ 30% din toate corpurile de celule striatale au fost pozitive NeuN, ceea ce a corespuns la aproximativ 600,000 neuroni striatali la șobolan. Când celulele purificate de FACS au fost examinate cu microscopie cu fluorescență, toate celulele erau rotunde și lipsite de procese [Figura 2]. Observația microscopică a confirmat că celulele sortate FACS au fost etichetate în mod corespunzător pentru NeuN- și βgal-imunoreactivitate. Probele de celule purificate cu FACS s-au dovedit a fi> 90% pure atunci când au fost evaluate cu o a doua rundă de citometrie în flux (datele nu sunt prezentate).

 

Figura 2

Fotografii la microscop de celule și resturi purificate de FACS

Am determinat selectivitatea procedurii noastre de purificare FACS cu microarray pentru a analiza tiparele de expresie genică ale celulelor purificate FACS. Am comparat expresia genelor în neuronii βgal-pozitivi și βgal-negativi de la șobolani injectați cu cocaină, precum și celule NeuN-pozitive și NeuN-negative de la șobolani injectați cu soluție salină. Componenta principală și analiza clusterului au indicat că principalul factor de diferenție a fost dacă celulele erau neuroni sau glia [Figura 3a]. Al doilea factor de diferențiere a fost expresia βgal utilizată pentru a separa neuronii activați de cei ne-activați. Genele au fost identificate ca exprimate diferențial dacă p <0.01, absolut Z-ratio ≥ 1.5 și raport de descoperire falsă (fdr) <0.07. Am constatat că 125 de gene au fost mărite și 467 de gene au fost reduse în neuronii βgal-pozitivi față de neuronii βgal-negativi obținuți din același țesut striatal al șobolanilor injectați cu cocaină [Figura 3b]. Când aceiași neuroni βgal-pozitivi de la șobolani injectați cu cocaină au fost comparați cu probe de control din toți neuronii marcați NeuN de la șobolani injectați cu soluție salină, 133 de gene au fost crescute și 890 de gene au fost scăzute în neuronii βgal-pozitivi. În special cele două grupuri de control - neuroni βgal negativi de la șobolani injectați cu cocaină și toți neuronii marcați NeuN de la șobolani injectați cu soluție salină - au produs modele de expresie genică foarte similare; expresia genică nu a fost semnificativ diferită între aceste grupuri de control [Figura 3b].

 

Figura 3

Analiza microarray a celulelor sortate din striata de șobolan după o singură injecție de cocaină sau soluție salină

Genele specifice găsite în diferitele grupuri de eșantion au confirmat separarea activităților de neuronii ne-activați, precum și neuronale de celulele non-neuronale folosind FACS [Tabelul 2]. Neuronii βgal-pozitivi de la șobolani injectați cu cocaină au exprimat niveluri mai ridicate ale multor gene markere de activare neuronală în raport cu neuronii βgal-negativi de la aceiași șobolani injectați cu cocaină sau de la toți neuronii marcați NeuN de la șobolani injectați cu soluție salină [Figura 3c]. Aceste gene de marker de activitate au fost incluse c-fos, junB, arc, RGE familie (1, 2, 4) și nr4a3 (Guzowski și colab., 2005). Interesant este faptul că acești neuroni βgal-pozitivi și-au exprimat, de asemenea, niveluri semnificativ mai mari ale genei de marker specific a tipului de celule a receptorului D1 dopamină, gena prodynorfină și niveluri semnificativ mai mici ale genei receptorului D2 dopamina.

 

Tabelul 2

Rezumatul datelor de microarray și qPCR din experimentul acut de cocaină.

Datele de expresie genică Microarray au fost validate folosind qPCR. Genele markerului de activitate fosB, arc, și nr4a3 au fost exprimate la niveluri mai ridicate în neuronii βgal-pozitivi de la șobolani injectați cu cocaină în raport cu ambii neuroni βgal-negativi de la același șobolani injectați cu cocaină și la toți neuronii de la șobolani injectați cu soluție salină [Figura 4a; date și informații statistice în Tabelul 2]. Neuronii βgal-pozitivi au exprimat, de asemenea, niveluri mai mari ale genei prodinorfine [Figura 4b]. În timp ce neuronii βgal-pozitivi au avut niveluri de exprimare aparent mai mici pentru mai multe gene, incluzând receptorul adenozinei A2A, canalul de potasiu Kv3.1 și genele map2k6 / MEKK6, doar nivelurile de expresie Kv3.1 și map2k6 / MEKK6 au fost statistic diferiteFigura 4c]. În general, modificările expresiei genice evaluate cu qPCR au fost aproape identice cu alterările expresiei genice evaluate prin experimentele microarray.

 

Figura 4

PCR cantitativă demonstrează un profil de expresie genică diferit pentru neuronii βgal-pozitivi după injecții acute de cocaină, în comparație cu neuronii βgal-negativi de la aceiași șobolani sau pentru toți neuronii de la șobolani injectați cu soluție salină

Pentru a determina dacă modificările ARNm în neuronii activi au fost reflectate la nivel de proteine, am folosit analiza imunohistochimică a secțiunilor cerebrale coronale de la șobolani de tip sălbatic injectat cu cocaină și salină [Figura 5]. Aceste secțiuni nu au suferit disociere sau FACS și, prin urmare, analiza imunohistochimică nu a fost afectată de disocierea celulară găsită în procedura FACS. În striatul ventral de la șobolani injectați cu cocaină [Figura 5a], markerii de activitate neuronală Fos și Arc au fost co-exprimați în aceleași celule: 85 ± 4% din toate celulele Fos-pozitive au fost Arc-pozitive, în timp ce 82 ± 3% din toate celulele Arc-pozitive au fost Fos-pozitive. Injecțiile cu cocaină au produs o creștere de 2.7 în neuronii marcați Fos și o creștere de 2.7 în neuronii marcați Arc. În striatul dorsal de la șobolani injectați cu cocaină [Figura 5b], 80 ± 2% din toate celulele Fos-pozitive au fost Arc-pozitive, în timp ce 86 ± 3% din toate celulele Arc-pozitive au fost Fos-pozitive. Injecțiile cu cocaină au produs o creștere de 4.4 în neuronii marcați Fos și o creștere de 3.8 în neuronii marcați Arc.

 

Figura 5

Fos și Arc sunt co-exprimate în (a) striat ventral și (b) striat dorsal după o singură injecție de cocaină

Purificarea FACS a neuronilor striatici activați de la șobolani sensibilizați la cocaină

În al doilea experiment FACS, toți șobolanii au fost sensibilizați cu injecții repetate de cocaină. Administrarea repetată a cocainei în cutia locomotorie a îmbunătățit locomoția indusă de cocaină: locomoție în ziua 7 a fost 180 ± 18% din zi Locația 1 (efectul principal al timpului peste injecțiile repetate 4, F_{3, 363} = 24.9, p <0.001), ceea ce a indicat o sensibilizare psihomotorie semnificativă. Șapte zile mai târziu, în ziua testului, cocaina sau soluția salină a fost administrată șobolanilor în aceeași cutie locomotorie. Nouăzeci de minute mai târziu, țesutul striatal, inclusiv NAc, a fost extras, iar celulele au fost purificate FACS folosind procedura descrisă mai sus.

Celulele din aceeași fâșie de evenimente cu dispersie de lumină ca în experimentul precedent au fost separate în funcție de gradul lor de imunomarcare cu markerul neuronal NeuN și markerul de activare neurală βgal. În țesutul obținut de la șobolani injectați cu cocaină, aproximativ 10% dintre neuronii marcați NeuN au avut un nivel ridicat de βgal [Figura 6], care corespundea cu aproximativ neuroni marcați 60,000 βgal la șobolan. Toate celulele marcate cu βgal au exprimat NeuN co-exprimat, ceea ce indică faptul că numai neuronii au exprimat βgal. Din nou, țesutul obținut de la șobolani injectați cu soluție salină în ziua testării a produs foarte puțini neuroni βgal sau Fos, și astfel nu sunt suficiente celule pentru analizele moleculare ulterioare. Prin urmare, am folosit doar marcare NeuN pentru a separa neuronal de celulele non-neuronale obținute de la șobolani injectați cu soluție salină. Aproximativ 30% din totalul corpurilor de celule la șobolani injectați cu soluție salină au fost pozitivi NeuN, care în acest experiment corespundeau cu aproximativ 400,000 neuroni striatici la șobolan.

 

Figura 6

Sortarea cu fluorescență a neuronilor marcați βgal de la șobolani sensibilizați, provocați cu 7 de cocaină zile după tratamentul repetat cu cocaină

Am folosit qPCR pentru a compara expresia genelor la neuronii βgal-pozitivi și βgal-negativi de la șobolani injectați cu cocaină, precum și toți neuronii NeuN-pozitivi de la șobolani injectați cu soluție salină după sensibilizarea la cocaină. Neuronii βgal pozitivi de la șobolanii injectați cu cocaină au exprimat niveluri mai ridicate de trei gene marker de activitate neuronală - fosB, arc, și nr4a3–Relativ la neuronii beta-negativi de la aceiași șobolani injectați cu cocaină și la toți neuronii de la șobolani injectați cu soluție salină [Figura 7a; date și informații statistice în Tabelul 3]. Neuronii βgal-pozitivi au exprimat, de asemenea, un nivel mai ridicat al genei prodynorfin similare cu cea din experimentul de injecție cu cocaină unică [Figura 7b]. În schimb, neuronii βgal-pozitivi au avut niveluri mai mici de exprimare pentru mai multe gene [Figura 7c], inclusiv Drd2 care codifică receptorul de dopamină D2 și Map2k6 codificarea kinazei care activează p38 MAPK, similar experimentului unic de injecție acută de cocaină. În cele din urmă, neuronii βgal-pozitivi au avut o exprimare crescută a dusp1, cunoscut și sub numele de mkp1 [Figura 7c], care codifică fosfatasa care inactivează p38 MAPK (Sgambato și colab., 1998).

 

Figura 7

PCR cantitativă demonstrează un profil de expresie genică diferit la neuronii βgal-pozitivi de la șobolani sensibilizați cu provocări de cocaină, în comparație cu neuronii βgal-negativi de la aceiași șobolani sau toți neuronii de la șobolani cu provocări saline.

 

Tabelul 3

Rezumatul datelor qPCR din experimentul repetat de cocaină.

Pentru a determina dacă modificările ARNm ale neuronilor activi sunt reflectate la nivel de proteine, am utilizat analiza imunohistochimică a secțiunilor cerebrale coronale de la șobolani femelini sensibilizați la tipul de cocaină, în urma unor injecții cu cocaină sau cu soluție salină în ziua testării. În striatul ventral de la șobolani injectați cu cocaină, markerii de activitate neuronală Fos și Arc au fost co-exprimați în aceleași celule: 90 ± 2% din toate celulele Fos-pozitive au fost Arc-pozitive, iar 83 ± 2% din toate Arc-pozitive celulele au fost pozitive. Injecțiile testului de cocaină au produs o creștere de 2.3 de neuroni marcate cu Fos și o creștere de 2.2 de neuroni marcați Arc. În striatul dorsal de la șobolani injectați cu cocaină, 93 ± 2% din toate celulele Fos-pozitive au fost Arc-pozitive, iar 90 ± 3% din toate celulele Arc-pozitive au fost Fos-pozitive. Injecțiile testului de cocaină au produs o creștere de 4.4 de neuroni marcate cu Fos și o creștere de 4.5 de neuroni marcați Arc. Astfel, foarte puține celule care nu au fost marcate cu Fos au exprimat Arc și foarte puține celule non-marcate cu Arc au exprimat Fos, ceea ce susține concluziile noastre din celulele sortate.

Această cercetare a fost susținută de Programul de cercetare intramurală al Institutului Național pentru Abuzul de Droguri. D. Guez-Barber a fost susținut de NIH MSTP TG 5T32GM07205, Numărul de premiere F30DA024931 de la Institutul Național pentru Abuzul de Droguri și de catedra Charles BG Murphy în Psihiatrie de la Universitatea Yale. Mulțumim lui Joe Chrest pentru asistența sa tehnică excelentă cu FACS, și lui Chris Cheadle, Tonya Watkins și Alan Berger pentru munca depusă pe microarray. Mulțumim lui Yavin Shaham pentru comentarii utile despre manuscris.

Nu există conflicte de interese pentru niciun autor al acestui manuscris.

1. Badiani A, Oates MM, Ziua HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Modulația de mediu a expresiei c-fos indusă de amfetamină în D1 față de neuronii striatali D2. Rezervarea creierului Behav 1999; 103: 203-209. [PubMed]
2. Berretta S, Robertson HA, Graybiel AM. Agoniștii dopaminei și glutamatului stimulează expresia specifică neuronului proteinei asemănătoare Fos în striatum. J Neurofiziol. 1992; 68: 767-777. [PubMed]
3. Bolshakov VY, Carboni L, Cobb MH, Siegelbaum SA, Belardetti F. Căile kinasei MAP duale mediază forme opuse de plasticitate pe termen lung la sinapsele CA3-CA1. Nat Neurosci. 2000; 3: 1107-1112. [PubMed]
4. Bowers MS, Chen BT, Bonci A. Plasticitatea sinaptică a receptorului AMPA indusă de psihostimulanți: trecutul, prezentul și viitorul terapeutic. Neuron. 2010; 67: 11-24. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
5. Cenci MA, Campbell K, Wictorin K, Bjorklund A. Striatal c-fos Inducerea prin cocaină sau apomorfină are loc preferențial în neuronele de ieșire care se proiectează la substanța Nigra la șobolan. Eur J Neurosci. 1992; 4: 376-380. [PubMed]
6. Curran T, Franza BR., Jr Fos și Jun: conexiunea AP-1. Cell. 1988; 55: 395-397. [PubMed]
7. Garg S, Nichols JR, Esen N, Liu S, Phulwani NK, Syed MM, Wood WH, Zhang Y, Becker KG, Aldrich A, Kielian T. MyD88 expresia de către celulele rezidente ale CNS este pivot pentru a genera imunitate protectoare în abcese cerebrale. ASN Neuro. 2009: 1. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
8. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EB. D1 și D2 dopamina funcționează în striatum: coactivarea receptorilor D1 și D2-dopamină pe populații separate de neuroni duce la o reacție potențată imediată rapidă a genei la neuronii care conțin D1. J Neurosci. 1995; 15: 8167-8176. [PubMed]
9. Guzowski JF, Timlin JA, Roysam B, McNaughton BL, Worley PF, Barnes CA. Cartografierea circuitelor neuronale relevante comportamental, cu expresie genică imediată-timpurie. Curr Opin Neurobiol. 2005; 15: 599-606. [PubMed]
10. Hernandez-Lopez S, Bargas J, DJ Surmeier, Reyes A, Galarraga E. Activarea receptorilor D1 îmbunătățește descărcarea evocată în neuronii neoestriatali spinos mediu prin modularea unei conductanțe Ca2 + de tip L. J Neurosci. 1997; 17: 3334-3342. [PubMed]
11. Hope B, Simmons D, Mitchell T, Kreuter J, Mattson B. Activitatea locomotorie indusă de cocaină și expresia Fos în nucleu accumbens sunt sensibilizate timp de 6 luni după administrarea repetată de cocaină în afara cuștii de acasă. Eur J Neurosci. 2006; 24: 867-875. [PubMed]
12. Izumi Y, Tokuda K, Zorumski CF. Inhibarea potențării pe termen lung prin activarea receptorului la nivel scăzut de N-metil-D-aspartat implică calcineurină, oxid nitric și proteină kinază activată cu mitogen p38. Hipocampus. 2008; 18: 258-265. [PubMed]
13. Jaber M, Cador M, Dumartin B, Normand E, Stinus L, Bloch B. Tratamentele cu amfetamină acută și cronică reglează diferit nivelurile de ARN ale mesagerilor neuropeptide și imunoreactivitatea Fos la neuronii striatali de șobolan. Neuroscience. 1995; 65: 1041-1050. [PubMed]
14. Kalivas PW. Ipoteza dependenței de homeostază cu glutamat. Nat Rev Neurosci. 2009; 10: 561-572. [PubMed]
15. Kasof GM, Mahanty NK, Pozzo Miller LD, Curran T, Connor JA, Morgan JI. Semnalizarea spontană și evocată a glutamatului influențează expresia Fos-lacZ și moartea celulelor piramidale în culturile de felii hipocampale de la șobolani transgenici. Brain Res Mol Brain Res. 1995; 34: 197-208. [PubMed]
16. Koya E, Golden S, Harvey B, Guez-Barber D, Berkow A, Simmons D, Bossert J, Nair S, Uejima J, Marin M, Mitchell T, Farquhar D, Ghosh S, Mattson B, Hope B. perturbarea vizată a neuronul activat cu cocaină accumbens neuroni previne sensibilizarea specifică contextului. Nat Neurosci. 2009; 12: 1069-U1152. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
17. Kwon B, Houpt TA. O metodă combinată de captare cu microdisecție cu laser și histologie X-Gal pentru a analiza expresia genelor în neuronii specifici c-Fos. J Metode Neurosci. 2010; 186: 155-164. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
18. Labiner DM, Butler LS, Cao Z, Hosford DA, Shin C, McNamara JO. Inducerea mRNA c-fos prin convulsii aprinse: relație complexă cu focar neuronal. J Neurosci. 1993; 13: 744-751. [PubMed]
19. Liberles SD, Buck LB. O a doua clasă de receptori chemosenzoriali în epiteliul olfactiv. Natură. 2006; 442: 645-650. [PubMed]
20. Lobo MK, Karsten SL, Gray M, Geschwind DH, Yang XW. Profilul de tip FACS al subtipurilor de neuroni cu proiecție striatică la creierul de șoarece pentru copii și adulți. Nat Neurosci. 2006; 9: 443-452. [PubMed]
21. Loebrich S, Nedivi E. Funcția genelor reglate în activitate în sistemul nervos. Physiol Rev. 2009; 89: 1079 – 1103. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
22. Mattson B, Koya E, Simmons D, Mitchell T, Berkow A, Crombag H, Hope B. Sensibilizarea specifică a contextului activității locomotorii induse de cocaină și a ansamblurilor neuronale asociate la nucleul accumbens. Eur J Neurosci. 2008; 27: 202-212. [PubMed]
23. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: un comutator molecular pentru adaptarea pe termen lung în creier. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-154. [PubMed]
24. Nestler E, Hope B, Widnell K. Dependența de droguri - un model pentru baza moleculară a plasticității neuronale. Neuron. 1993; 11: 995–1006. [PubMed]
25. Nestler EJ. Baza moleculară a plasticității pe termen lung care stă la baza dependenței. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 119-128. [PubMed]
26. Nicola SM, Surmeier J, Malenka RC. Modulația dopaminergică a excitabilității neuronale în striatum și nucleu accumbens. Annu Rev Neurosci. 2000; 23: 185-215. [PubMed]
27. Nicola SM, Hopf FW, Hjelmstad GO. Ameliorarea contrastului: un efect fiziologic al dopaminei striatale? Țesut celular Rez. 2004; 318: 93-106. [PubMed]
28. O'Donnell P. Acoperirea dopamină a ansamblurilor neuronale ale antebrațului. Eur J Neurosci. 2003; 17: 429-435. [PubMed]
29. Paxinos G, Watson C. Creierul de șobolan în coordonate stereotaxice. 4. San Diego: Presă academică; 1998.
30. Pennartz CM, Groenewegen HJ, Lopes da Silva FH. Nucleul se accentuează ca un complex de ansambluri neuronale distincte funcțional: o integrare a datelor comportamentale, electrofiziologice și anatomice. Neurobiol Prog. 1994; 42: 719-761. [PubMed]
31. Peters RV, Aronin N, Schwartz WJ. expresia c-Fos în prospectul intergeniculat de șobolan: reglare fotică, co-localizare cu Fos-B și identificare celulară. Rez. Creier 1996; 728: 231-241. [PubMed]
32. Sgambato V, Abo V, Rogard M, Besson MJ, Deniau JM. Efectul stimulării electrice a scoarței cerebrale asupra expresiei proteinei Fos în ganglionii bazali. Neurosci. 1997; 81: 93-112. [PubMed]
33. Sgambato V, paginile C, Rogard M, Besson MJ, Caboche J. Kinaza reglată prin semnal extracelular (ERK) controlează inducerea imediată a genei timpurii asupra stimulării corticostriatale. J Neurosci. 1998; 18: 8814-8825. [PubMed]
34. Shaham Y, Hope BT. Rolul neuroadaptărilor în recidiva la căutarea medicamentelor. Nat Neurosci. 2005; 8: 1437-1439. [PubMed]
35. Shin C, McNamara JO, Morgan JI, Curran T, Cohen DR. Inducerea expresiei ARNm c-fos prin descărcarea ulterioară în hipocampul șobolanilor naivi și aprinși. J Neurochem. 1990; 55: 1050-1055. [PubMed]
36. Wilson CJ, Kawaguchi Y. Originile fluctuațiilor potențiale ale membranei spontane în două state ale neuronilor spinării neostriatale. J Neurosci. 1996; 16: 2397-2410. [PubMed]
37. Wolf ME, Ferrario CR. Plasticitatea receptorului AMPA din nucleul se accentuează după expunerea repetată la cocaină. Neurosci Biobehav Rev 2010 [Articol gratuit PMC] [PubMed]