Antagonista ghrelínového receptora (GHS-R1A) zmierňuje odmeňujúce vlastnosti morfínu a zvyšuje hladiny opioidného peptidu v oblastiach odmeňovania u myší (2015)

Akútne aj chronické vystavenie návykových látok hlboko ovplyvňuje mesolimbický dopamínový systém, dôležitý kľúčový okruh systémov odmeňovania mozgov (Nestler, 2005). Tieto účinky boli navrhnuté tak, aby aspoň čiastočne podporovali rozvoj drogovej závislosti (Wise, 2004). Drogová závislosť spôsobuje širokú škálu škodlivých účinkov na jednotlivca, ako aj na spoločnosť, a sú opodstatnené nové farmakologické intervencie, ktoré riešia tento veľký problém verejného zdravia (Koob a Le Moal, 2001). Vyjasnením signalizačných systémov sprostredkujúcich schopnosť návykových liekov aktivovať mezolimbický dopamínový systém možno identifikovať jedinečné liečebné stratégie pre poruchy užívania látok.

Výskum ukázal, že spoločné neurobiologické mechanizmy regulujú príjem a odmenu vyvolanú jedlom a návykovými látkami (Morganstern et al., 2011), pričom navrhujú, aby úloha regulačných črevných mozgových peptidov, ako je napríklad ghrelín, zahŕňala sprostredkovanie odmeňovania. Pôvodne sa ukázalo, že ghrelín spôsobuje uvoľňovanie rastového hormónu (Kojima et al., 1999) a indukuje adipozitu u potkanov (Tschop et al., 2000). Doteraz je dobre známe, že ghrelín zvyšuje príjem potravy, hlad a stimuluje chuť k jedlu via hypotalamické obvody (pre prehľad pozri Egecioglu et al. (2011)). Okrem hypotalamu sú receptory ghrelinu (GHS-R1A) exprimované v oblastiach súvisiacich s odmeňovaním, ako je amygdala, striatum, prefrontálna kôra, ventrálna tegmentálna oblasť (VTA) a hipokampus (na prehľad pozri Engel a Jerlhag (2014)), čo naznačuje fyziologická úloha ghrelinu presahuje reguláciu energetickej homoeostázy. Ukázalo sa, že orexigénny peptid ghrelín bol skutočne aktivátorom mezolimbického dopamínového systému, ako aj regulátorom odmeny, motivácie a príjmu alkoholu, nikotínu, amfetamínu a kokaínu u myší (prehľad pozri v Engel a Jerlhag (2014)).

Opioidy, podobne ako iné návykové lieky, aktivujú mezolimbický dopamínový systém, ktorý spôsobuje uvoľňovanie akumulovaného dopamínu via aktivácia ß- a / alebo ô-opioidných receptorov v nucleus accumbens (NAc) (Hirose et al., 2005, Murakawa a kol., 2004, Yoshida a kol., 1999) a vo VTA, pravdepodobne znížením GABA -inhibícia dopamínových neurónov (Johnson a North, 1992). Okrem toho, akumulátory κ-opioidných receptorov regulujú aktivitu mezolimbického dopamínového systému (Chefer et al., 2005, Spanagel et al., 1992). Opakovaná expozícia opioidom produkuje adaptívne zmeny niekoľkých neurotransmiterov, vrátane opioidných peptidov, v oblastiach odmeňovania, ktoré prispievajú k rozvoju závislosti (De Vries a Shippenberg, 2002). U potkanov farmakologická supresia GHS-R1A zoslabuje uvoľňovanie morfínu vyvolaného akumuláciou dopamínu, ako aj stereotypného správania (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Cieľom prvej časti tejto série experimentov bolo skúmať akútny účinok antagonistu GHS-R1A, JMV2959, na schopnosť morfínu vyvolať lokomotorickú stimuláciu, uvoľňovanie akumulácie dopamínu a preferovanú podmienku miesta u myší. Cieľom druhej časti tejto štúdie bolo vyhodnotiť účinok opakovanej liečby JMV2959 alebo ghrelínom na hladiny opioidného peptidu (Met-enkefalín-Arg⁶Phe⁷ (MEAP), dynorfín B (DynB) a Leu-enkefalín-Arg⁶ (LeuArg)) v oblastiach súvisiacich s odmenou vrátane amygdaly, striatum, prefrontálneho kortexu, VTA a hipokampu.

Použili sa dospelé post-pubertálne vekovo zodpovedajúce mužské NMRI myši (8-12 týždne a 25-40 g telesnej hmotnosti; Charles River, Sulzfeld, Nemecko). Stručne povedané, všetky myši boli chované v skupine 12 / 12 h svetlo / tma (svetlá zapnuté v siedmej ráno). Dodala sa voda z vodovodu a potrava (normálne krmivo; Harlan Teklad, Norfolk, Anglicko) podľa chuti, okrem experimentálnych nastavení. Nové myši sa použili na každý test správania, ako aj na analýzu opioidného peptidu. Experimenty boli schválené Švédskym etickým výborom pre výskum zvierat v Göteborgu. Vyvinulo sa všetko úsilie na minimalizáciu utrpenia zvierat a zníženie počtu použitých zvierat. Všetky zvieratá sa nechali aklimatizovať aspoň jeden týždeň pred začiatkom experimentov.

Hydrochlorid morfínu (Apoteksbolaget Sahlgrenska Hospital; Gothenburg, Švédsko) bol rozpustený vo vehikule (0.9% roztok chloridu sodného) a bol podávaný ip v dávke 20 mg / kg 10 min pred začiatkom experimentu. Táto dávka bola vybraná, pretože nižšia dávka (10 mg / kg, ip) nespôsobila lokomotorickú stimuláciu u našich myší (údaje nie sú uvedené). Vybraná dávka (6 mg / kg, ip) JMV2959 (syntetizovaná na Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR5247, CNRS, Montpellier 1 a 2 Universities, Francúzsko), bola predtým stanovená a má žiadny vplyv na lokomotorickú aktivitu, uvoľňovanie akumulácie dopamínu a preferované miesto u myší (Jerlhag et al., 1). JMV2009 bol rozpustený vo vehikule (2959% roztok chloridu sodného) a bol vždy podávaný dvadsať minút pred vystavením morfínu alebo dekapitáciou pre analýzu hladín opioidného peptidu. Vybraná dávka JMV0.9 neovplyvnila hrubé správanie myší v žiadnom experimente. Pre testy správania sa JMV2959 podával akútne, pretože naše perverzné štúdie ukázali, že jediná injekcia JMV2959 zmierňuje odmenu vyvolanú liečivom (prehľad pozri Engel a Jerlhag (2959)). JMV2014 bol podávaný sub-chronicky počas piatich nasledujúcich dní na analýzu opioidného peptidu, aby sa zvýšila možnosť detegovať silný účinok. Okrem toho pri opakovaných injekciách sa vyhnete možnému mätúcemu účinku akútneho injekčného stresu na peptidy. Acylovaný potkaní ghrelín (Bionuclear; Bromma, Švédsko) sa zriedil v 2959% chloridu sodnom a vybraná dávka ghrelínu (0.9 mg / kg, ip) už skôr ukázala, že vyvoláva odmenu u myší (Jerlhag, 0.33). Vyvážený dizajn bol použitý pre všetky drogové výzvy.

Predchádzajúce štúdie ukázali, že morfín spôsobuje lokomotorickú stimuláciu u hlodavcov (Wise a Bozarth, 1987). Lokomotorická aktivita bola zaznamenaná u ôsmich zvukovo oslabených, vetraných a osvetlených lokomotorických boxov (420 × 420 × 200 mm, Kungsbacka mät- och reglerteknik AB; Fjärås, Švédsko). Päť piatimi radmi svetelných lúčov fotobunky, na úrovni podlahy krabice, vytvorením detekcie fotobuniek umožnilo počítačovému systému zaregistrovať aktivitu myší. Lokomotorická aktivita bola definovaná ako akumulovaný počet nových lúčov fotobunky prerušených počas periódy 60-min. Vo všetkých experimentoch sa myši nechali zvyknúť na lokomotorickú aktivitu jednu hodinu pred problémami s liečivom. Neboli zistené žiadne rozdiely medzi návykmi v žiadnej z liečených skupín (údaje nie sú uvedené).

V prvej sérii experimentov sa skúmali účinky JMV2959 (6 mg / kg, ip) na lokomotorickú stimuláciu vyvolanú morfínom (20 mg / kg, ip). JMV2959 sa podával 20 min pred morfínom a registrácia aktivity sa začala desať minút po poslednej injekcii. Každá myš dostala jednu kombináciu liečby (vehikulum / vehikulum, JMV2959 / vehikulum, morfín / vehikulum alebo JMV2959 / morfín; n= 8 na liečebnú kombináciu) a bol podrobený iba jednej experimentálnej skúške.

Na vyhodnotenie účinkov lieku JMV2959 na odmeňovací účinok morfínu u nových myší sa uskutočnili testy preferovaného miesta u myší, ako bolo opísané vyššie (Jerlhag, 2008). Stručne povedané, bol použitý dvojkomorový CPP prístroj s osvetlením 45 lx a zreteľnými vizuálnymi a hmatovými pokynmi. Jedna komora bola definovaná čiernymi a bielymi pruhovanými stenami a tmavou laminátovou podlahou, zatiaľ čo druhá mala bielu drevenú podlahu a steny z drevenej textúry. Procedúra pozostávala z predkondicionovania (deň 1), kondicionovania (dni 2-5) a post-kondicionovania (deň 6). Pri predkondicionovaní sa myšiam injektovali ip vehikulom a umiestnili sa do komory s voľným prístupom do oboch kompartmentov počas 20 min, aby sa určilo počiatočné miesto (alebo strana) preferencie. Kondicionovanie (20 min na sedenie) sa uskutočnilo s použitím skresleného postupu, pri ktorom sa morfín (20 mg / kg) spároval s najmenej preferovaným kompartmentom a vehikulom s výhodným kompartmentom. Všetkým myšiam bola podávaná jedna injekcia morfínu a vehikula každý deň a injekcie boli zmenené medzi ranným a popoludňajším návrhom. Pri post-kondicionovaní myší (n16) boli injikované JMV2959 (6 mg / kg, ip) alebo rovnakým objemom roztoku vehikula a 20 min neskôr umiestnené na stredovú líniu medzi dvoma kompartmentmi s voľným prístupom do oboch kompartmentov pre 20 min (vytvorenie nasledujúcich liečebných skupín; Morph-Veh a Morph-JMV2959).

Preferencia miesta sa vypočítala ako rozdiel v% celkového času stráveného v párovaní s liekom (tj, najmenej výhodné) oddelenie počas postkondicionovania a predkondicionovania.

Vzhľadom na to, že JMV2959 zoslabuje morfínom indukovanú lokomotorickú stimuláciu a preferenciu kondicionovaného miesta u myší, skúmal sa účinok JMV2959 (6 mg / kg, ip) na uvoľňovanie morfínom indukovaného (20 mg / kg, ip) abalbového dopamínu s použitím in vivo mikrodialýzou u voľne sa pohybujúcich myší. Na meranie extracelulárnych hladín dopamínu boli myši implantované jednostranne s mikrodialyzačnou sondou umiestnenou v nucleus accumbens. Preto boli myši anestetizované izofluranom (Isofluran Baxter; Univentor 400 Anesthesia Unit, Univentor Ldt., Zejtun, Malta), umiestnené do stereotaxického rámu (David Kopf Instruments; Tujunga, CA, USA) a udržiavané na vyhrievacej podložke, aby sa zabránilo podchladenie. Ako lokálne anestetiká sa použil xylokaín adrenalín (5 μg / ml; Pfizer Inic; New York, USA) a na zmiernenie akejkoľvek možnej bolesti sa použil karprofén (Rimadyl, 5 mg / kg ip) (Astra Zeneca; Gothenburg, Švédsko). Kosť lebky bola odkrytá a vyvŕtala sa jedna diera pre sondu a jedna pre kotevnú skrutku. Sonda sa náhodne striedala s ľavou alebo pravou stranou mozgu. Súradnice 1.5 mm predné k bregma, ± 0.7 laterálne k stredovej čiare a 4.7 mm pod povrchom povrchu mozgu boli použité pre nucleus accumbens (Franklin a Paxinos, 1997). Exponovaný koniec dialyzačnej membrány (20,000 kDa odrezaný od / id 310 / 220 μm, HOSPAL, Gambro, Lund, Švédsko) sondy bol 1 mm. Všetky sondy boli chirurgicky implantované dva dni pred experimentom. Po operácii boli myši držané v jednotlivých klietkach až do testovacieho dňa (Macrolon III).

V deň testu sa sonda pripojila k mikroperfúznej pumpe (injekčná pumpa U-864; AgnThós AB) a perfundovala sa roztokom Ringer v množstve 1.5 μl / min. Po jednej hodine návyku na mikrodialýzu sa odobrali vzorky perfúzie každý 20 min. Východisková hladina dopamínu bola definovaná ako priemer troch po sebe idúcich vzoriek pred prvým podaním lieku / vehikula a zvýšenie akumulácie dopamínu bolo vypočítané ako percentuálny nárast od základnej hodnoty. Po východiskových vzorkách (-40 min. Až 0 min.) Boli myšiam injikované JMV2959 alebo vehikulum (v 0 min), po ktorom nasledovala injekcia morfínu alebo vehikula (v 20 min). Po podaní týchto liečiv sa odobralo ďalších osem vzoriek 20 min. Súhrnne nasledujúce liečebné skupiny (n= 8 v každej skupine): vozidlo-vozidlo (Veh-Veh), vozidlo-morfín (Veh-Morph), vozidlo JMV2959 (JMV2959-Veh) a JMV2959-morfín (JMV2959-Morph).

Hladiny dopamínu v dialyzátoch boli stanovené pomocou HPLC s elektrochemickou detekciou. Čerpadlo (Gyncotec P580A; Kovalent AB; V. Frölunda, Švédsko), ionomeničová kolóna (2.0 × 100 mm, Prodigy 3 μm SA; Skandinaviska GeneTec AB; Kungsbacka, Švédsko) a detektor (Antec Decade; Antec Leyden; Zoeterwoude , Holandsko) vybavené VT-03 prietokovou kyvetou (Antec Leyden). Mobilná fáza (pH 5.6), pozostávajúca z kyseliny sulfónovej 10MM, kyseliny citrónovej 200MM, citrátu sodného 200MM, 10% EDTA, 30% MeOH, sa vákuovo prefiltrovala s použitím membránového filtra 0.2 μm (GH Polypro; PALL Gelman Laboratory; Lund, Švédsko). Mobilná fáza sa priviedla pri prietoku 0.2 ml / min prechádzajúcom odplyňovačom (Kovalent AB) a analyt sa oxidoval pri + 0.4 V.

Po dokončení mikrodialyzačných experimentov boli myši dekapitované a sondy boli premývané pontamínovým nebomodrým 6BX, aby sa uľahčila lokalizácia sondy. Mozgy boli upevnené na vibroslátkovom zariadení (752 M Vibroslice; Campden Instruments Ltd., Loughborough, UK) a narezané na rezy 50 μm. Umiestnenie sondy bolo stanovené hrubým pozorovaním s použitím svetelnej mikroskopie. Presná poloha sondy bola overená (Franklin a Paxinos, 1997) a v štatistickej analýze boli použité iba myši so správnym umiestnením.

Skúmali sa účinky liečby JMV2959 na hladiny MEAP, DynB a LeuArg v oblastiach súvisiacich s odmenou. Myšiam bola injikovaná buď JMV2959 (6 mg / kg, ip, n= 8) alebo rovnaký objem vozidla (ip, n= 8) počas piatich nasledujúcich dní. 20 min po poslednej injekcii sa myši usmrtili a odobrali sa mozgy z týchto myší. Samostatným myšiam bol injikovaný buď ghrelín (0.33 mg / kg, ip, n= 8) alebo rovnaký objem vozidla (ip, n= 8) počas piatich nasledujúcich dní. Päť minút po poslednej injekcii sa myši usmrtili a odobrali sa mozgy z týchto myší. Amygdala, striatum, prefrontálny kortex, VTA a hipokampus sa rýchlo rozrezali a okamžite sa položili na suchý ľad a potom sa uskladnili pri -80 ° C až do ďalšieho spracovania.

Postupy homogenizácie a extrakcie peptidom nasledovali štandardný postup, ktorý bol podrobne opísaný (Nylander et al., 1997). Krátko, k zmrazeným vzorkám sa pridala horúca kyselina octová (95 ° C) (1 M). Vzorky sa zahriali vo vodnom kúpeli (95 ° C) pre 5 min, ochladili na ľade a potom homogenizovali s Branson Sonifier (Danbury, CT, USA). Homogenát bol znovu zahrievaný pri 95 ° C počas 5 min a ochladený na ľade pred centrifugáciou pre 15 min pri 4 ° C a 12,074 ×g v centrifúge Beckman GS-15R (Fullerton, CA, USA). Extrakty sa ďalej purifikovali podľa vyššie opísaného postupu (Nylander et al., 1997). Zozbierali sa dve frakcie: frakcia III (Leu-Arg a MEAP) a frakcia V (DynB). Vzorky sa sušia vo vákuovej odstredivke (Savant SpeedVac Plus SC210A; Thermo Scientific Inc., Waltham, MA USA) a skladujú sa v mrazničke (-20 ° C) až do analýzy peptidu.

Imunoreaktívne (ir) hladiny DynB, LeuArg a MEAP boli analyzované dobre zavedenými rádioimunologickými testami a protokoly boli podrobne opísané inde (Nylander et al., 1997). V teste DynB sa použil kozí anti-králičí IgG (GARGG; Bachem, Bubendorf, Švajčiarsko) na separáciu voľného peptidu viazaného na protilátku. Dyn antisérum (113 +) sa použilo v konečnom zriedení 1: 600000. Krížová reaktivita s veľkým Dyn bola 100% as DynB (1 – 29) 1%. Nebola pozorovaná žiadna skrížená reaktivita s inými opioidnými peptidmi. V testoch LeuArg a MEAP sa použila suspenzia aktívneho uhlia na separáciu voľného peptidu viazaného na protilátku. Pre LeuArg antisérum (91: 6D +, konečné riedenie 1: 60000) bola skrížená reaktivita nižšia ako 0.01% pre leu-enkefalín a MEAP, 0.02% pre DynB, 0.04% pre DynA a 0.08% pre alfa-neoendorfín. MEAP antisérum 90: 3D (II) sa použilo v konečnom zriedení 1: 160 000. Krížová reaktivita s met-enkefalínom, met-enkefalínom-Arg⁶Met-enkefalín-Arg⁶Gly⁷Leu⁸, Leu-enkefalín a Leu-enkefalín-Arg⁶ bolo <0.1%

Celkový hlavný účinok liečby bol zistený na lokomotorickú aktivitu u myší po systémovom podávaní morfínu (20 mg / kg) a JMV2959 (6 mg / kg) (F (3,27) = 7.409, P= 0.0009; n= 8 pre Veh-Veh, JMV2959-Veh, JMV2959-Morph a n= 7 pre Veh-Morph). Ako je znázornené na obrázku Obrázok 1A posthoc analýza ukázala, že predliečenie jednorazovou injekciou JMV2959 (P<0.001) významne utlmila morfínom indukovanú pohybovú stimuláciu (P<0.01 Veh – Veh vs Voz-Morph). Vybraná dávka lieku JMV2959 nemala žiadny vplyv na pohybovú aktivitu v porovnaní s liečbou vehikulom (P> 0.05). Nebol žiadny rozdiel v reakcii na pohybovú aktivitu u myší liečených vehikulom a u myší liečených JMV2959-morhpínom (P> 0.05).

  

Obrázok 1

Antagonista GHS-R1A JMV2959 zmierňuje morfínom indukovanú lokomotorickú stimuláciu, uvoľňovanie akumulácie dopamínu a preferované miesto u myší. (A) Lokomotorická stimulácia vyvolaná morfínom (20 mg / kg ip) bola znížená jednorazovou injekciou JMV2959 (6 mg / kg ip) (n= 7 – 8 v každej skupine; **P<0.01, ***P<0.001 jednosmerná ANOVA nasledovaná Bonferroniho post hoc testom). (B) Morfínom indukovaná preferencia stavu (20 mg / kg ip) (CPP) bola oslabená akútnou jednorazovou injekciou JMV2959 (6 mg / kg ip) do myší (n= 8 v každej skupine, *P<0.05, nespárovaný t-test). (C) Najskôr sme preukázali významný účinok morfínu (20 mg / kg ip) na zvýšenie uvoľňovania dopamínu v porovnaní s liečbou vehikulom (časový interval 40–180 min (P<0.001), Veh – Veh vs Voz-Morph). Ako je uvedené v (C) predliečbe JMV2959 (6 mg / kg ip), zmiernili zvýšenie uvoľňovania dopamínu vyvolané morfínom v porovnaní s predchádzajúcou liečbou vehikulom v časovom intervale 40 – 100 a 140 – 180 min (^##P<0.01, ^{# # #}P <0.001, JMV2959-Morph v porovnaní s liečbou Veh-Morph). Zvolená dávka JMV2959 nemala v žiadnom časovom intervale žiadny významný vplyv na uvoľnenie dopamínu vumbumbalite v porovnaní s liečbou vehikulom (P> 0.05, Veh – Veh vs JMV2959-voz). JMV2959 znížil, ale úplne nezablokoval, uvoľňovanie akumulovaného dopamínu vyvolaného morfínom v časovom intervale 60-140 (*).P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001, JMV2959-Morph v porovnaní s liečbou Veh-Morph). Šípky predstavujú časové body injekcie JMV2959, vehikula a morfínu. Údaje sa analyzovali pomocou obojsmernej ANOVA nasledovanej Bonferroniho post-hoc testom (n= 8 v každej skupine). Veh – veh (Námestie), Veh-Morph (kosoštvorec), JMV2959-Veh (trojuholník), JMV2959-Morph (kruh). Všetky hodnoty predstavujú priemer ± SEM.

Zobraziť veľký obrázok | Zobraziť obrázok Hi-Res | Stiahnite si aplikáciu PowerPoint Slide

Morfínom indukovaná prednosť (20 mg / kg) (Morph – Veh) podmienená podmienkou bola významne znížená akútnou jednorazovou injekciou JMV2959 (6 mg / kg) (Morph-JMV2959) v deň po kondicionovaní (P= 0.025, n= 8 v každej skupine; Obrázok 1B).

Merania dopamínu u myší pri akumulovanej mikrodialýze ukázali celkový hlavný účinok liečby (F(3,33) = 24.15, P<0.0001), čas F(11,308) = 7.05, P<0.0001) a liečba × časová interakcia (F(11,308) = 8.63, P<0.0001) (Obrázok 1C; n= 8 v každej skupine). Morfín zvýšil uvoľňovanie akumulácie dopamínu v porovnaní s liečbou vehikulom v časovom intervale 40 – 180 min (P<0.001). Ako je uvedené v Obrázok 1Tento účinok bol znížený pred liečbou s JMV2959 v časovom intervale 40 – 80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) a 160–180 min. (P<0.001). JMV2959 znižoval, ale úplne neblokoval, morfínom indukované uvoľňovanie dopamínuumbalumbia, pretože v časovom intervale 2959–60 bol rozdiel medzi liečbou vehikulom a liečbou JMV80-morfínom (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) a 160 min (P<0.05). Zvolená dávka JMV2959 nemala v žiadnom časovom intervale žiadny významný vplyv na uvoľnenie dopamínu vumbumbalite v porovnaní s liečbou vehikulom (P> 0.05).

Táto štúdia ďalej podporuje hypotézu, že fyziologická úloha orexigénneho peptidu zahŕňa reguláciu odmeňovania. Skutočne sme ukázali, že periférne podávanie antagonistu GHS-R1A zmierňuje schopnosť morfínu spôsobiť lokomotorickú stimuláciu, zvýšiť hladiny dopamínu v NAc a indukovať preferenciu podmieneného miesta u myší. Tiež sme zistili, že sub-chronická JMV2959, ale nie ghrelín, liečba zvýšila hladiny MEAP v tkanivách VTA, DynB v hipokampe a LeuArg v striate, čo predstavuje prvý dôkaz, že schopnosť signalizácie ghrelínu regulovať zosilnenie môže zahŕňať opioidné peptidy. ,

Dáta uvedené v tomto dokumente ukazujú, že antagonizmus GHS-R1A ovplyvňuje schopnosť morfínu aktivovať mezolimbický dopamínový systém u myší. V zhode sú zistenia, ktoré ukazujú, že JMV2959 blokuje schopnosť morfínu zvyšovať extracelulárne hladiny akumbálneho dopamínu a vyvolávať stereotypné správanie u potkanov (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Podporuje centrálne podávanie grelínu hraničný bod, ale nie počet aktívnych stlačení páky, v harmonograme progresívneho posilňovania pomeru u potkanov, ktorí si sami spravujú heroín (Maric et al., 2012). Tvrdenie, že signalizácia ghrelinu je základom drogovej závislosti, je ďalej podporené zisteniami, ktoré ukazujú, že JMV2959 znižuje príjem, ako aj motiváciu konzumovať alkohol u potkanov a že amfetamínom, kokaínom a nikotínom indukovaná odmena je blokovaná antagonizmom GHS-R1A u hlodavcov ( na prehľad pozri Engel a Jerlhag (2014)) a že polymorfizmy v génoch súvisiacich s ghrelínom súvisia s príjmom alkoholu, fajčenia a amfetamínu (na prehľad pozri Engel a Jerlhag (2014)).

Predkladané zistenia so zvýšenými hladinami opioidných peptidov v striate, VTA a hippocampus po sub-chronickej liečbe JMV2959 naznačujú prvýkrát interakcie medzi opioidnými peptidmi a ghrelínovou signalizáciou. Endogénne opioidy sa podieľajú na odmeňovaní účinkov, nielen indukovaných opioidmi, ale aj inými drogami zneužívania a prirodzenými odmenami, ako aj adaptívnymi procesmi pozorovanými po opakovanej expozícii lieku (Trigo a kol., 2010, Van Ree a kol., 2000). Aktivita mezolimbického dopamínového systému je skutočne regulovaná endogénnymi opioidmi na úrovni VTA aj NAc (Hirose et al., 2005, Spanagel et al., 1992) a ukázalo sa, že tieto účinky sú buď priame alebo nepriame. prostredníctvom modulácie iných vysielačov (Charbogne et al., 2014).

Zistili sme, že sub-chronická liečba JMV2959 zvýšila hladiny MEAP vo VTA. MEAP je odvodený výlučne z proenkefalínu a bol použitý ako marker proenkefalínových peptidov, ktoré aktivujú hlavne ô-opioidné receptory. Predpokladáme, že zvýšené hladiny endogénneho MEAP v liečbe VTA po liečbe liekom JMV2959 môžu zabrániť schopnosti morfínu znižovať inhibíciu GABA mezoakumálnych dopamínových neurónov (Johnson a North, 1992), čo môže prispieť k zníženým účinkom vyvolaným morfínom pozorovaným po liečbe. JMV2959. Podporne, GHS-R1A sa nachádza na GABAergných interneurónoch vo VTA (Abizaid et al., 2006). Okrem toho predchádzajúce štúdie ukázali, že infúzia lieku JMV2959 vo vnútri VTA, \ t via neznáme mechanizmy, zmierňujú ghrelínom indukovanú odmenu (Jerlhag et al., 2011), ako aj príjem sacharózy sprostredkovaný ghrelínom u hlodavcov (Skibicka et al., 2011), naznačujú, že ventrálna tegmentálna GHS-R1A je dôležitá pre reguláciu odmeňovania. Na podporu takéhoto tvrdenia sú zistenia, ktoré ukazujú, že iné peptidy regulujúce hlad, ako napríklad galanín a orexín, sprostredkovávajú odmeňujúce vlastnosti morfínu via lokálne mechanizmy v rámci VTA (Narita et al., 2006, Richardson a Aston-Jones, 2012).

V striate sme zistili, že sub-chronický JMV2959 zvýšil hladinu LeuArg ir, čo naznačuje, že schopnosť JMV2959u zmierniť preferenciu podmieňovaného kondicionovaného miesta vyvolaného morfínom, uvoľňovanie dopamínu a lokomotorickú stimuláciu závisí aspoň čiastočne na zosilnenej akumulácii δ- aktivita opioidného receptora. Zvýšené hladiny LeuArg môžu byť výsledkom zvýšenej enzymatickej konverzie peptidov dynorfínu na enkefalíny alebo zvýšeného uvoľňovania Dyn v NAc ako odozvy na zvýšený dopamín, po čom nasleduje degradácia na LeuArg. Hoci predchádzajúce štúdie ukázali, že aktivita mezolimbického dopamínového systému je regulovaná via K-opioidné receptory v NAc (Spanagel et al., 1992) a endogénne κ-opioidné receptory poskytujú tonickú inhibíciu mesoaccumbal dopamínovej neurotransmisie a zmierňujú uvoľňovanie dopamínu indukovaného kokaínom v NAc (Chefer et al., 2005), ukazujú, že JMV2959 mení hladiny ir DynB v striate. Preto sú potrebné ďalšie štúdie na prodynorfínových peptidoch na objasnenie interakcií medzi GHS-R1A antagonizmom a dynorfínmi.

V tejto štúdii sme tiež ukázali, že liečba JMV2959 významne zvyšuje hladiny hipokampálneho DynB. Ghrelín zvyšuje konsolidáciu pamäte, ako aj tvorbu dendritickej chrbtice, vytvára dlhodobú potenciáciu a indukuje uľahčenie pamäti. via hipokampálny GHS-R1A u hlodavcov (Carlini et al., 2010, Diano et al., 2006). Okrem toho, GHS-R1A knockoutované myši vykazujú zlepšenú priestorovú pamäť v teste Morrisovho vodného bludiska a narušenú kontextovú pamäť v paradigme ovplyvňovania strachu v porovnaní s myšami divokého typu (Albarran-Zeckler et al., 2012). Peptidy Dynorphinu, vrátane DynB, sú hojné v hipokampoch a zmierňujú dlhodobú potenciáciu (Chavkin et al., 1985, Wagner et al., 1993), ako aj zhoršujú priestorové učenie u potkanov (Sandin et al., 1998). Preto sa domnievame, že antagonista GHR-R1A môže zmierniť spomienku na odmenu tým, že inhibuje dlhodobú potenciaciu hipokampu via aktivácia DynB. Tieto údaje spoločne poskytujú nový potenciálny mechanizmus, ktorým JMV2959 via opioidné peptidy môžu meniť zosilnenie. Opioidné receptory sú však široko distribuované v mozgu, čo naznačuje, že iné oblasti, ktoré nie sú zahrnuté v tejto štúdii, môžu byť zahrnuté v GHS-R1A regulovanej odmene vyvolanej morfínom. Napríklad príjem potravy indukovaný ghrelínom, ako aj stlačenie páky pre sacharózu sa znižuje centrálnym alebo intra-hypotalamickým podávaním antagonistu κ-opioidného receptora (Romero-Pico et al., 2013). Úloha opioidných peptidov v iných oblastiach však musí byť objasnená v budúcich štúdiách.

Endogénne u-receptorové ligandy, endomorfíny a beta-endorfín sa tu neanalyzovali, takže nemôžeme vylúčiť možný účinok JMV2959 na tieto peptidy. Odmeňujúce vlastnosti morfínu skutočne zahŕňajú μ-opioidné receptory vo VTA, ako aj NAc (Hirose a kol., 2005, Johnson a North, 1992, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999). Antagonista μ-receptora však neoslabuje príjem potravy vyvolaný ghrelínom (Naleid et al., 2005) ani stimuláciu lokomotorom vyvolanú ghrelínom a uvoľňovanie akumulácie dopamínu (Jerlhag et al., 2011), čo znamená, že schopnosť GHSR- Antagonista 1A na reguláciu zosilnenia nezahŕňa μ-receptory. Na druhej strane JMV2959 ovplyvňoval opioidné peptidy odvodené od proenkefalínu a prodynorfínu, čo dokazuje, že sa môžu podieľať na účinkoch indukovaných antagonistami GHSR-1A.

Zatiaľ čo predchádzajúce štúdie ukázali, že systémová aplikácia ghrelínu spôsobuje odmeňovanie (Jerlhag, 2008), ako aj zvyšuje odmeňujúce vlastnosti návykových liekov (na preskúmanie pozri Engel a Jerlhag (2014)), ukázali sme, že subchronická liečba ghrelínom sa nezmenila hladiny neopioidných peptidov ir tkaniva v ktorejkoľvek zo študovaných oblastí súvisiacich s odmenou. Systémové podávanie ghrelínu aktivuje expresiu c-fos v oblastiach hypotalamu, ale nie v mezolimbických a hipokampálnych oblastiach (Pirnik et al., 2011) a väzba fluorescenčne značeného ghrelínu je obmedzená na potravinové regulačné neuróny hypotalamu (Schaeffer et al., 2013 ). Spolu s nálezmi, ktoré ukazujú, že ghrelín, vylúčený zo stopových množstiev v hypotalame, nemôže byť detegovaný v hlbších oblastiach mozgu po podaní periférneho ghrelínu (Furness a kol., 2011, Grouselle a kol., 2008, Sakata et al., 2009 ), vyvoláva možnosť, že systémový ghrelín aktivuje systém odmeňovania via nepriame mechanizmy nezávislé od endogénnych opioidov. Podporné uvoľňovanie akumulovaného dopamínu vyvolaného ghrelínom vyžaduje upstream orexigénnu hypotalamickú signalizáciu (Cone et al., 2014), podávanie periférneho ghrelínu nemení príjem alkoholu u myší (Lyons et al., 2008) a že neutralizácia periférneho ghrelínu neoslabuje alkohol - indukovaná odmena u myší alebo príjem alkoholu u potkanov (Jerlhag et al., v tlači). Mala by sa zvážiť možnosť, že subchronické podávanie ghrelínu zvyšuje hladiny opioidných peptidov v tkanivách v tkanivách, čo však treba podrobne preskúmať v pripravovaných štúdiách.

Schopnosť návykových liekov vyvolať stimuláciu, uvoľňovanie dopamínu a vyvolanie preferencie podmieneného miesta sú úzko spojené s posilňujúcimi vlastnosťami návykových liekov a tieto parametre sa považujú za súčasť procesu závislosti (Wise, 2004). Vzhľadom k tomu, že sme zistili, že JMV2959 zmierňuje tieto parametre odmeňovania u myší, predpokladáme, že GHS-R1A môže hrať dôležitú úlohu v procesoch závislostí a že endogénne opioidy sú zapojené do týchto procesov. Súhrnne tieto údaje ukazujú, že antagonisty GHS-R1A by mali byť objasnené ako liečba závislosti od liekov.

JE a EJ sú podporované grantmi Švédskej výskumnej rady (Grant no. 2011-4646, 2009-2782 a 2011-4819), švédskej nadácie pre mozog, LUA / ALF (Grant no. 148251) od Univerzity v Sahlgrenska, Alkohol výskumná rada švédskeho monopolu na maloobchodný predaj alkoholu a základy Adlerbertska, Fredrika a Ingrid Thuring, Tore Nilsson, Längmanska, Torsten a Ragnar Söderberg, Wilhelm a Martina Lundgren, NovoNordisk, Knut a Alice Wallenberg, Magnus Bergvall, Anérs, Jeansons, Åke Wiberg Švédska lekárska spoločnosť, Švédska spoločnosť pre lekársky výskum a Gothenburgská psychiatrická výskumná nadácia. Rada pre výskum alkoholov švédskeho monopolu pre maloobchodný predaj alkoholu a Švédska rada pre výskum (K2012-61X-22090-01-3) podporila IN. Zdroje financovania nemali žiadnu úlohu v dizajne štúdie, v zbere, analýze a interpretácii údajov, v písaní správy av rozhodnutí zverejniť údaje.