Jonathan P. Fadok, 1,2 Tavis MK Dickerson, 2 a Richard D. Palmiter2 *
J Neurosci. Autorský rukopis; dostupné v PMC 2010 March 9.
Publikované v konečnom upravenom formulári ako:
J Neurosci. 2009 September 9; 29 (36): 11089 – 11097.
doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1616-09.2009.
1 Absolvent programu v neurobiológii a správaní, University of Washington, Seattle, WA 98195
2 Katedra biochémie a Howard Hughes Medical Institute, University of Washington, Seattle, WA, 98195
* Korešpondencia by mala byť adresovaná: Richard D. Palmiter, HHMI a Katedra biochémie, Box 357370, University of Washington, Seattle, WA 98195. e-mail: [chránené e-mailom]
Finálna upravená verzia vydavateľa tohto článku je k dispozícii zadarmo na webovej stránke J. Neurosci
Pozri ďalšie články v PMC, ktoré citujú publikovaný článok.
abstraktné
Dopamín (DA) sa podieľa na mnohých spôsoboch správania, vrátane motorickej funkcie, kognície a spracovania odmien; úloha DA v spracovaní strachu však zostáva nejednoznačná. Na skúmanie úlohy DA v štúdii súvisiacej so strachom boli myši s deficitom dopamínu (DD) testované v strašne potencovanej paradigme. Syntéza DA môže byť obnovená u DD myší podávaním 3, 4-dihydroxy-L-fenylalanínu (L-Dopa), čím sa umožní vyhodnotenie spracovania strachu buď v DA-vyčerpanom alebo úplnom stave. Strach-potencované prekvapenie u DD myší chýbalo, ale mohlo byť obnovené podaním L-Dopa bezprostredne po stabilizácii strachu. Selektívna vírusovo sprostredkovaná obnova syntézy DA v rámci ventrálnej tegmentálnej oblasti plne obnovila učenie strachu u myší DD a obnovenie syntézy DA na neuróny DA premietnuté do bazolaterálnej amygdaly obnovenej krátkodobej pamäte, ale nie dlhodobej pamäte alebo senzibilizácie šoku. Taktiež demonštrujeme, že receptor DA D1 (D1R) a receptory podobné D2 sú nevyhnutné pre učenie strachu závislé od cue.
Tieto zistenia naznačujú, že DA pôsobiace na viac podtypov receptora v rámci viacerých cieľových oblastí uľahčuje stabilizáciu pamäti strachu.
Kľúčové slová: Dopamín, strach, strach-potencovaný úľavy, amygdala, dopamínový receptor D1, receptor dopamínu D2
úvod
Neuromodulátor DA je dôležitý pre učenie zamerané na odmeňovanie a správanie pri hľadaní drog (Schultz, 2002; Wise, 2004) a zhromažďovanie dôkazov naznačuje, že DA môže byť tiež dôležité pre učenie súvisiace so strachom (Lamont a Kokkinidis, 1998; Guarraci et al. , 1999, Greba a Kokkinidis, 2000, Guarraci et al., 2000, Greba a kol., 2001, Pezze a Feldon, 2004, de Oliveira et al., 2006). DA neuróny ventrálneho stredného mozgu projektujú oblasti limbického mozgu dôležité pre učenie sa strachu a hladiny DA v týchto oblastiach mozgu sa zvyšujú počas averzívnych udalostí (Abercrombie et al., 1989; Kalivas a Duffy, 1995; Doherty a Gratton, 1997; Inglis a Moghaddam , 1999). Okrem toho, niektoré neuróny stredného mozgu zvyšujú rýchlosť streľby na averzívne podnety a prediktívne podnety (Guarraci a Kapp, 1999; Horvitz, 2000; Joshua a kol., 2008). Okrem toho sa ukázalo, že DA uľahčuje dlhodobú potenciáciu, kľúčovú nervovú koreláciu pamäti, v oblastiach kritických pre učenie sa strachu, ako je hipokampus a amygdala (Bissiere et al., 2003; Lemon a Manahan-Vaughan, 2006; Swant a Wagner, 2006).
Napriek pokroku dosiahnutému v súvislosti s fyziológiou DA neurónov k strachu, presná úloha DA a jej príbuzných receptorov v učení súvisiacom so strachom zostáva nevyriešená. Ukázalo sa, že injekcie antagonistov podobných D1R systémovo alebo do amygdaly blokujú získavanie alebo expresiu učenia súvisiaceho so strachom; iné však ukázali, že tieto liečivá nemajú žiadny účinok (Guarraci et al., 1999; Greba a Kokkinidis, 2000; de Oliveira a kol., 2006). Okrem toho sa ukázalo, že agonisty podobné D1R buď zvyšujú alebo nemajú žiadny vplyv na podmieňovanie strachu (Guarraci et al., 1999; Greba a kol., 2000; Inoue a kol., 2000; de Oliveira a kol., 2006). Analogické rozdiely sa zistili v štúdiách využívajúcich agonistov alebo antagonistov receptorov podobných D2R (Guarraci et al., 2000; Greba a kol., 2001; Ponnusamy et al., 2005; de Oliveira et al., 2006). Tieto rozdiely by mohli byť spôsobené metodikou správania, dávkami závislými účinkami injekčne podávaných liekov alebo rozdielmi vo výbere farmakologických činidiel. Napríklad antagonisty DA receptorov sa značne líšia vo svojej selektivite, zatiaľ čo niektoré štúdie môžu byť selektívnejšie antagonizujúce D2 receptory, iné môžu byť širšie antagonizujúce D2, D3 a D4 receptory (Missale et al., 1998).
Na objasnenie úlohy DA pri učení spojenom so strachom sme použili myši, ktorým chýbala DA (DD myši), rovnako ako myši, ktorým chýbali buď D1R alebo DA D2 receptory (D2R), a testovali ich v strachu potencovanej paradigme strachu. Strach-potencovaný strach je Pavlovian-paradigma strachu podmieňovanie, v ktorom neutrálne stimuly vyvoláva zvýšenie akustické prekvapenie po párovaní s footshock (Koch, 1999). Strach-potencované prekvapenie je ideálnou paradigmou pre tieto štúdie, pretože nezávisí od hodnotenia zmrazovacieho správania, ktoré je ťažké merať u hypoaktívnych DD myší (Zhou a Palmiter, 1995). Pretože DD myši môžu byť študované buď v DA-depletovanom alebo DA-replete stave, poskytujú ideálnu príležitosť študovať úlohu DA v učení a tvorbe pamäti. Okrem toho, použitím vírusom sprostredkovaného dodania Cre rekombinázy môže byť DA signalizácia selektívne obnovená do špecifických cieľových oblastí reaktiváciou Th alely DD myší (Hnasko et al., 2006). Selektívna obnova DA do špecifických cieľových oblastí umožňuje posúdenie mozgových oblastí regulovaných signalizáciou DA počas strachu.
Materiály a metódy
Zvieratá a liečba
DD myši boli generované ako je opísané (Hnasko et al., 2006). Stručne, myši DD (Thfs / fs; DbhTh / +) nesú dve nefunkčné alely tyrozínhydroxylázy (Th), ktoré boli inaktivované inzerciou génu rezistencie na neomycín (NeoR) ohraničeného lox P miestami do prvého intrónu Th génu. , Tieto myši tiež nesú jednu intaktnú alelu dopamínu p-hydroxylázy (Dbh) a jednu alelu Dbh s cielenou inzerciou Th génu. Kontrolné zvieratá nesú aspoň jednu intaktnú Th alelu a jednu intaktnú alelu Dbh. Hladiny nedepaminergných katecholamínov sú normálne u DD zvierat a hladiny všetkých katecholamínov sú normálne u kontrolných zvierat (Zhou a Palmiter, 1995; Szczypka et al., 1999). Myši boli udržiavané na zmiešanom genetickom pozadí C57BL / 6 X 129 / Sv. Kvôli ťažkej hypofágii boli myšiam DD denne injekčne podávané L-Dopa v dávke 50 mg / kg v objeme 33 μl / g (Zhou a Palmiter, 1995), začínajúc približne v postnatálnom dni 10. Tieto injekcie obnovujú funkciu DA pre 8 na 10 hr (Szczypka et al., 1999). Boli opísané D1R knockout (KO) a D2R KO myši (Drago et al., 1994; Kelly a kol., 1997). Oba kmene sa udržiavali na pozadí C57BL / 6. Kvôli retardácii rastu u myší D1R KO boli odstavené po štyroch týždňoch a potom kŕmené zvlhčeným krmivom na podporu rastu. Všetky zvieratá boli genotypované PCR analýzou. Samce a samice myší boli podrobené testovaniu správania vo veku 2-5 mesiacov. Všetky myši boli chované v cykle 12: 12 (svetlo: tma) v prostredí s kontrolovanou teplotou s potravou (5LJ5; PMI Feeds, St. Louis, MO) a vodou dostupnou ad libitum. Všetky behaviorálne experimenty sa uskutočňovali počas svetelného cyklu. Všetky myši sa liečili v súlade s pokynmi, ktoré stanovil National Institutes of Health a Inštitucionálny výbor pre starostlivosť a používanie zvierat na University of Washington
Na stanovenie, či sú iné receptory podobné D2 dôležité pre učenie strachu, boli myšiam D2R KO podávané antagonisty podobné D2-eticlopridu (Sigma, St. Louis, MO) pri 0.5 mg / kg (ip). Eticloprid bol rozpustený v 0.9% fyziologickom roztoku a bol podávaný v konečnom objeme 10 μl / g. Myši D2R divokého typu (WT) boli injikované vehikulom.
Zariadenie
Zvukové tlmiace komory (SR-Lab, San Diego Instruments, San Diego, CA) boli použité na meranie prepulznej inhibície, úľakových reakcií a strachu potencovaných strachom. Pri reakciách na vyľakanie sa odčítali hodnoty 65 1-ms, počnúc začiatkom pulzu. Na meranie odozvy na nôh sa odčítali hodnoty 500 1-ms, počnúc nástupom šoku. Vrcholová amplitúda odozvy sa použila na výpočet inhibície prepulzie, úľakových reakcií, strachu-potencovaných šokov a reaktivity šoku. Zvuk bieleho šumu bol vytvorený vysokofrekvenčným reproduktorom umiestneným v strope komory. Zvuk pozadia bol udržiavaný na konštantnej úrovni 65 dB. Hladiny zvuku boli merané v decibeloch (stupnica A) pomocou čítačky zvukovej úrovne (RadioShack, Fort Worth, TX). Kalibračná jednotka sa použila na zabezpečenie integrity odozvy odozvy (San Diego Instruments, San Diego, CA). Svetlo 8-watt bolo namontované na zadnú stenu skrinky na prekvapenie na použitie ako tágo.
Krivky odozvy odozvy
Po návyku 5-min boli zvieratám prezentované série siedmich skúšok s eskalujúcimi hladinami zvuku: od 80 do 120 dB, s ITI 30 sec. Táto séria bola predstavená 10 krát pre celkovo 70 skúšok. Vo všetkých skúškach, okrem pokusov s nulovými hodnotami, v ktorých nebol zvuk, bol zvukový impulz 40 ms.
Inhibícia pred pulzom
Zvieratám bol podávaný 10-min habituačný čas, po ktorom boli jedincom prezentované 5 40-ms, 120-dB, pulzne štúdie. Myši boli potom prezentované s 50 štúdiami buď na pokuse samotného pulzného pulzného testu, jednej z troch prepulzných štúdií (5, 10 a 15-dB nad pozadím), alebo na nulovej štúdii, v ktorej nebol žiadny akustický stimul. Intertrial interval (ITI) má priemernú hodnotu 15 sec (rozsah 5 – 25 sec). Skúšobná skúška pozostávala z 40-msec, 120-dB pulzu bieleho šumu. Predpulzové pokusy pozostávali z 20-msec trvania prepulse 70, 75 alebo 80-dB intenzity, ktorá predchádzala 40-msec 120-dB pulzu 100 msec. Inhibícia prepulzie sa vypočítala pre každú úroveň prepulzie s použitím nasledujúceho vzorca:% inhibície = [(priemerná odozva na prepulznú skúšku / priemerná odozva na štúdiu samotného pulzu) × 100]. DD myši boli testované v stave s depléciou DA, 18-24 h po injekcii L-Dopa.
Strach potencovaný strach (paradigma 7-dní)
V deň 1 (základná línia), po 5-minútovom návykovom období, sa myšiam podala pseudonáhodne usporiadaná séria 20 štúdií, ktoré sa rozdelili rovnomerne medzi cue a bez cue podmienok. Pri pokusoch bez cue boli zvieratám predložené akustické impulzy 40-ms, 105-dB. Pre cue pokusy boli zvieratá prezentované s 10-sec svetelným tágom, ktorý bol spolu zakončený s 40-ms, 105-dB pulz. ITI má priemernú hodnotu 120 sec (rozsah 60 až 180 sec).
Školenie sa uskutočnilo v dňoch 2, 4 a 6. Po 10-minútovom návykovom období sa myšiam podali 10 prezentácie cue svetla, ktoré ko-zakončili 0.2-mA, 0.5-sec footshock. ITI má priemernú hodnotu 120 sec (rozsah 60 až 180 sec). Testované sedenia sa uskutočnili v dňoch 3, 5 a 7 a boli identické so základnou reláciou opísanou vyššie. DD myši boli v stave s depléciou DA, 18 na 24 h po poslednej injekcii L-Dopa počas základnej línie, tréningu a testovania. L-Dopa bol injikovaný po tréningoch, ako je uvedené na obrázkoch. Nasledujúci vzorec sa použil na výpočet strachu-potencovaného vyľakania:% potenciácie = [(priemer odpovedí na cue skúšky / priemer odpovedí na ne-cue testy-1) × 100].
Strach potencovaný strach (paradigma 3-dní)
Dni 1 a 3 (základná línia a test) tejto paradigmy boli identické s tými, ktoré boli opísané pre 7-dennú strach-potencovanú paradigmu strachu. V deň 2 (tréning) dostali myši 30 párovanie 10-sec cue svetla s 0.2-mA, 0.5-sec footshock. ITI priemer bol 120 sec (rozsah 60 až 180 sec). DD myši boli deplétané DA počas základnej línie, tréningu a testovania.
Krátkodobá pamäť
Základné a testovacie relácie boli identické s tými, ktoré boli opísané pre paradigmu 7-day. V deň 2, po návykovom období 5-min, boli myšiam podané 30 párovania 10-sec cue svetla, ktoré ko-zakončilo 0.5-sec, 0.2-mA footshock. ITI má priemernú hodnotu 120 sec (rozsah 60 až 180). Po tréningu sa myši umiestnili do svojich domácich klietok na 10 min pred testovaním. Krátkodobá pamäť sa hodnotila s použitím rovnakého vzorca, ktorý sa použil pre strach potencovaný strachom.
Senzibilizácia šoku
Odozvy na stav bez vyšetrenia počas krátkodobej základnej línie testovania a testovania sa spriemerovali pre každé zviera a na výpočet senzibilizácie šoku sa použil nasledujúci vzorec:% senzibilizácie = [(priemerná odozva na vyľakanie počas testovania / priemerná odozva na východiskovú hodnotu) 1) × 100].
Obnova funkcie génu sprostredkovaná Cre rekombinázou
Anestetizované myši izofluranu (1.5-5%) sa umiestnili do stereotaxického prístroja (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Na obnovenie funkcie Th génu vo ventrálnej tegmentálnej oblasti sa rekombinantne AAV1-Cre-GFP vírus (titrovaný pri časticiach 1.2 × 1012 / ml) injektoval bilaterálne do ventrálneho stredného mozgu (súradnice v mm: 3.5 posterior k Bregma, 0.5 laterálny k stredovej línii). , 4.5 ventrálne na Bregma, 0.5 μl / hemisféra). Na špecifickú obnovu BLA DA bol bilaterálne vstreknutý rekombinantný vírus CAV2-Cre (titrovaný na časticiach 2.1 × 1012 / ml) (súradnice v mm: 1.5 posterior od Bregma, 3.25 laterálny od stredovej čiary, 5 ventrálny od Bregma; 0.5 μl / hemisféra) , Boli publikované podrobné opisy oboch vírusových vektorov (Hnasko et al., 2006; Zweifel et al., 2008). Vírusy sa injektovali počas 10-minútovej periódy s použitím injekčnej ihly 32-gauge (Hamilton, Reno, NV) pripojenej k mikro-infúznej pumpe (WPI, Sarasota, FL).
imunohistochémia
Po anestézii 50 mg / ml pentobarbitalom sodným (0.2 – 0.3 ml / zviera) boli myši transcardálne perfundované fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom a potom 4% paraformaldehydom vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku. Rozštiepené mozgy sa post-fixovali v 4% paraformaldehyde cez noc, chránili sa kryogénne v 30% sacharóze vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku a potom sa rýchlo zmrazili v izopentáne. Voľne plávajúce koronálne rezy (30 μm) boli imunofarbené buď protilátkami proti myším anti-TH (1: 1000, Chemicon) alebo králičími anti-TH (1: 2000, Chemicon). Imunofluorescencia sa dosiahla použitím sekundárnych protilátok IgG konjugovaných s Cy2 alebo Cy3- (1: 200, Jackson ImmunoResearch). Zafarbené rezy boli upevnené na sklíčkach, zakryté prekrytím a fotografované pomocou svetelného mikroskopu (Nikon).
Štatistické analýzy
Vykonané analýzy zahŕňali opakované merania a jednosmerný ANOVA, Fisher post-hoc a Studentove t-testy, ako je uvedené vo výsledkoch. Štatistická analýza sa uskutočnila použitím softvéru Statistica (Statsoft, Tulsa, Oklahoma).
výsledky
DD myši majú intaktnú akustickú odozvu a normálnu prepulznú inhibíciu
Strach-potencované vyľakanie vyžaduje neporušené akustické reakcie a senzomotorické hradlovanie. Aby sa určilo, či je akustická odozva zmenená v neprítomnosti DA, boli merané reakcie DA-depletovaných DD myší (18 na 24h po L-Dopa) na viacnásobné hladiny zvuku v decibeli a porovnané s kontrolami (obrázok 1A). Opakované merania ANOVA nevykazovala žiadny hlavný vplyv genotypu a žiadnu významnú interakciu medzi genotypom a hladinou zvuku.
Obrázok 1
DA je rozhodujúca pre učenie strachu zosilneného úľaku. A, Odozva akustického úľaku kontrolných (n=10, čierne štvorce) a DD myší (n=10, prázdne štvorce) na rôzne intenzity zvuku. Odpovede sa uvádzajú v ľubovoľných jednotkách. B, Prepulzná inhibícia sa testovala pri 3 rôznych intenzitách prepulzu u kontrolných (n=10, čierne stĺpce) a DD myší (n=10, prázdne stĺpce). Hviezdičky označujú p<0.05, opakované merania ANOVA. C, Schéma znázorňujúca 7-dňovú paradigmu úľaku zosilneného strachom. Vo východiskovom a testovacom dni myši dostali 10 prezentácií bez podnetu (40 ms trvanie prezentácie 105-dB impulzu úľaku) a 10 prezentácií pokusov nabádania (10-sekundový svetelný signál súčasne ukončený impulzom úľaku) v pseudonáhodnej podobe. objednať. V dňoch tréningu myši dostali 10 párov 10-sekundového svetelného podnetu, ktoré končilo 0.5-sekundovým trvaním, 0.2-mA šokom do nohy. Učenie bolo hodnotené v testovacích dňoch ako percento zosilnenia pri pokusoch s narážkou v porovnaní s pokusmi bez narážky. D, DD myši (n=10, otvorené stĺpce), ktorým bol podaný L-Dopa 3 hodiny po tréningu (deň 2 a 4), sa nedokázali naučiť (test 1 a 2). Keď však DD myši dostali injekciu ihneď po tréningu (6. deň), vykazovali významný strach zosilnený strach (Test 3). Hviezdičky označujú p<0.05, opakované merania ANOVA. E, Merania šokovej reaktivity počas tréningov (kontrola n=10, čierne stĺpce; DD n=10, otvorené stĺpce). Odpovede sa uvádzajú v ľubovoľných jednotkách. F, Schéma ilustrujúca 3-dňovú paradigmu úľaku zosilneného strachom používanú na určenie kritického časového obdobia, v ktorom je DA dôležitá. Všetkých 30 párov podnet-šok bolo podaných v jeden tréningový deň a DD myši boli ošetrené L-Dopa okamžite, 1 hodinu alebo 3 hodiny po tréningu. G, Iba kontrolné (n = 8, plné čierne pruhy, C) a DD myši, ktorým bola podaná injekcia bezprostredne po tréningu (n = 7, zvislé pruhy, 0 hodín), vykazovali v deň testu strach zosilnený strach. Táto úroveň strachu zosilneného úľaku bola významne vyššia ako tá, ktorá bola pozorovaná u DD myší, ktorým bol podávaný L-Dopa 1 hodinu (n=6, diagonálne pruhy) alebo 3 hodiny (n=6, otvorené stĺpce) po tréningu. Hviezdičky označujú p<0.05 v porovnaní s východiskovou hodnotou, Fisher post-hoc. Všetky uvedené hodnoty sú priemery ± DD s depléciou SEMDA a kontrolné myši boli tiež testované v paradigme prepulznej inhibície, ktorá sa bežne používa na detekciu deficitov v senzomotorickom hradlovaní. Prepulzná inhibícia bola zvýšená u DD myší (obrázok 1B; opakované merania ANOVA, genotyp: F1, 18=5.37; p<0.05; nebol detegovaný žiadny významný genotyp interakciou na úrovni prepulzu). Tieto údaje naznačujú, že myši DD nemajú deficity v reakciách na úľak alebo zníženie mechanizmov senzorimotorického hradlovania, zatiaľ čo sú v stave vyčerpania DA, a potvrdzujú ich použitie v experimentoch so strachom zosilneným úľakom.
Dopamín je nevyhnutný v kritickom čase na učenie sa strachu potencovaného strachom
Aby sa určilo, či je DA potrebný na učenie sa úlohy podmieňovania cued-strach, DD a kontrolné myši boli podrobené 7-dňovej paradigme úľaku potencovaného strachom (obrázok 1C). DD myši boli trénované a testované v stave s vyčerpaním DA. Keď boli testované 24 hodín po tréningu, kontrolné myši vykazovali strachom zosilnený strach po jedinom tréningu, ktorý nebol pozorovaný u DD myší (obrázok 1D; opakované merania ANOVA, genotyp, F1, 18=7.4590, p<0.05). Dokonca aj po ďalšom tréningu DD myši nedokázali vyjadriť strachom zosilnený strach, zatiaľ čo kontrolné myši naďalej vyjadrovali silné učenie. Je zaujímavé, že keď sa L-Dopa podávala ihneď po tréningu v deň 6, DD myši vykazovali strachom zosilnený strach, ktorý bol výrazne vyšší ako základná hodnota (jednosmerná ANOVA F1, 18=9.1999, p<0.01) a nelíšil sa od kontrolných hladín ( Obrázok 1D). Šoková reaktivita počas tréningových dní pre DD a kontrolné myši sa významne nelíšila medzi genotypmi v žiadnom tréningovom dni, čo naznačuje, že deficit učenia u DD myší nebol spôsobený neschopnosťou vnímať šok do nôh (obrázok 1E). Na charakterizáciu kritického časového okna pre účinok DA ďalšia štúdia menila čas podávania L-Dopa. DD a kontrolné myši dostali tréning pozostávajúci z 30 párov svetelných šokov (obrázok 1F) a potom im bol injekčne podaný L-Dopa buď okamžite, 1 hodinu alebo 3 hodiny po tréningu a testovali sa o 24 hodín neskôr. DD myši, ktorým bola podaná injekcia ihneď po tréningu, prejavili v deň testu silný strach zosilnený strach, podobne ako kontroly, zatiaľ čo myši DD, ktorým bol podaný L-Dopa 1 hodinu alebo 3 hodiny po tréningu, nevykazovali žiadne učenie (obrázok 1G; opakované merania ANOVA; liečba × sedenie F3, 23=5.1032, p<0.01). Tieto údaje naznačujú, že DA je v určitom časovom období nevyhnutná na učenie sa v paradigme úľaku zosilneného strachom. DA však nie je potrebná na vyjadrenie pamäte cued-strach, pretože DD zvieratá boli vždy testované v neprítomnosti DA. Okrem toho neprítomnosť DA nezhoršuje šokovú reaktivitu.
D1R je nevyhnutný pre strach potencovaný strachom
Aby sme preskúmali, ktoré DA receptory sú potrebné pre strachom zosilnený strach, najprv sme analyzovali D1R KO myši. D1R KO a kontrolné myši divokého typu (WT) boli testované na viacerých úrovniach intenzity impulzu zľaknutia, ako je opísané pre myši DD (obrázok 2A). Medzi myšami D1R KO a WT nebol žiadny významný rozdiel na žiadnej testovanej úrovni zvuku, čo naznačuje, že myši D1R KO majú neporušenú odozvu akustického úľaku. V súlade s predchádzajúcimi štúdiami sme pozorovali neporušenú prepulznú inhibíciu u D1R KO myší (Ralph-Williams et al., 2002). Pri testovaní v 7-dňovej paradigme úľaku potencovaného strachom myši D1R KO nedokázali vyjadriť učenie v žiadnom z testovacích dní (obrázok 2B; opakované merania genotypu ANOVA × testovací deň F3, 48 = 6.28; p < 0.01), zatiaľ čo WT myši mali signifikantné strachom zosilnené vyľakanie v testovacích dňoch 2 a 3 (p<0.05 a p<0.01, kontrolná základná línia verzus test 2 a 3, v uvedenom poradí, Fisher post-hoc). Myši D1R KO mali väčšiu šokovú reaktivitu ako WT vo všetkých troch tréningových dňoch (obrázok 2C; opakované merania ANOVA, genotyp F1, 16 = 10.18; p < 0.01; nebol pozorovaný žiadny významný genotyp x tréningový deň). Hoci teda myši D1R KO majú zvýšené reakcie na šok do nôh v porovnaní s myšami WT, výrazne zhoršili strachom zosilnený strach, dokonca aj po 3 dňoch tréningu. Tieto údaje naznačujú poruchu učenia u zvierat D1R KO a implikujú D1R pri sprostredkovaní účinkov DA pri podmieňovaní strachu závislom od podnetu. Obrázok 2 Myši D1R KO majú výrazne zhoršené učenie. A, Reakcia akustického úľaku u myší D1R WT (n=9, čierne štvorce) a KO (n=9, prázdne štvorce). B, Výsledky 7-dňovej paradigmy vyľakania zosilneného strachom u myší D1R. Myši D1R WT (n=9, plné čierne stĺpce), ale nie myši D1R KO (n=9, otvorené stĺpce), do 3. dňa testu prejavili strachom zosilnený strach. Hviezdičky označujú p<0.01, v porovnaní KO s WT, Fisher post- hoc. C, Merania šokovej reaktivity. Myši D1R KO (n=9, otvorené stĺpce) majú vyššie reakcie na šok do nohy ako WT (n=9, plné stĺpce). Hviezdičky označujú p<0.05, opakované merania ANOVA. Všetky uvádzané hodnoty sú priemery ± SEM Pre odozvy na úľak a šokovú reaktivitu sú čísla uvádzané v ľubovoľných jednotkách.
U myší D2R KO je intaktný strach potencovaný strachom, ale vyžaduje iné receptory podobné D2
Aby sa zistilo, či sú receptory podobné D2 nevyhnutné pre strach potencované strachom, boli myši D2R KO a WT podrobené úľakovým reakciám a testom vyľakaných strachom. Myši WT a D2R KO majú ekvivalentné odozvy na všetky testované hladiny dB, čo naznačuje, že myši D2R KO majú intaktnú akustickú odozvu (obrázok 3A). Podobne ako u myší D1R KO sme pozorovali, že myši D2R KO majú intaktnú inhibíciu prepulózy (Ralph-Williams a kol., 2002). Keď boli testované v 7-dennej strach-potencovanej paradigme strachu, tak WT, ako aj D2R KO myši vykazovali strach-potencované vyľakanie v ekvivalentných hladinách na všetkých testovacích dňoch 3 (obrázok 3B) a šoková reaktivita sa medzi skupinami nelíšila (obrázok 3C). Tieto údaje naznačujú, že D2R nie je potrebný na učenie sa strachu, ktorý je potenciovaný strachom.
Obrázok 3
Myši D2R KO majú neporušený strach zosilnený strach. A, Akustická úľaková odozva D2R WT (n=8, čierne štvorce) a KO myší (n=8, prázdne štvorce). B, Výsledky 7-dňovej paradigmy vyľakania zosilneného strachom u myší D2R. Myši WT (n=8, plné stĺpce) aj KO (n=8, otvorené stĺpce) vykazovali významné úrovne strachu zosilneného úľaku. C, Merania šokovej reaktivity počas tréningu (WT, n=8, plné stĺpce; KO, n=8, otvorené stĺpce). Myši D, WT a D2R KO (n = 11 každá) boli podrobené 3-dňovej paradigme úľaku zosilnenej strachom. Myšiam D2R KO bol pred tréningom podaný etikloprid (0.5 mg/kg) a pri testovaní nevyjadrili strachom zosilnený strach. Hviezdičky označujú p<0.01, KO verzus WT, Fisher post-hoc. Všetky uvádzané hodnoty sú priemer ± SEM Pre reakcie na úľak a šokovú reaktivitu sú reakcie uvádzané v arbitrárnych jednotkách. Predchádzajúce štúdie ukázali, že podávanie antagonistov podobných D2, buď systémovo alebo priamo do amygdaly, zhoršuje podmienený strach (Guarraci et al., 2000; Greba a kol., 2001; Ponnusamy a kol., 2005). Na preskúmanie nesúladu medzi ich výsledkami a našimi sa myšiam D2R KO podával antagonista podobný D2R eticloprid (0.5, 3 mg / kg; podaný ip) pred tréningom v 24-dňovom paradigme úľaku zosilneného strachom. Keď sa testovali 2 hodín po tréningu, myši WT s injekciou vehikula vykazovali silný strach zosilnený strach, zatiaľ čo myši D3R KO s injekciou eticlopridu neprejavili učenie (obrázok 1D; opakované merania genotypu ANOVA × deň F20, 7.5698=0.05, p<1) . Tieto výsledky naznačujú, že okrem D2R je pre strachom zosilnený strach nevyhnutný aj člen rodiny DA receptorov podobných D2, ale nie DXNUMXR.
Krátkodobá pamäť je zhoršená u DD a D1R KO myší
DA sa vyžaduje do jednej hodiny po tréningu, aby sa naučila bázeň potencovaného prekvapenia. V týchto experimentoch sa 24 hodín po tréningu testovala dlhodobá pamäť na strach vyvolaný vystrašením. Vydali sme sa otestovať, či je DA potrebný aj pre krátkodobú pamäť. DD zvieratá a kontroly sa podrobili dvojdennej paradigme, ktorá testovala krátkodobú pamäť 2 minút po tréningu (obrázok 10A). V deň testu sa hodnotila šoková senzibilizácia a krátkodobá pamäť. Krátkodobá pamäť bola definovaná ako zvýšenia odozvy na poplach závislé od podnetu, zatiaľ čo šoková senzibilizácia je kontextovo závislé zosilnenie akustickej odozvy po úderu, ktoré je nezávislé od podnetu (McNish et al., 1997; Richardson, 2000; Risbrough et. al., 2008). DD myši mali významne menšiu šokovú senzibilizáciu ako kontroly (obrázok 4B, p <0.05; Studentov t-test). Podobne kontrolné myši demonštrovali silnú krátkodobú pamäť, ktorá absentovala u DD myší (obrázok 4B, p <0.05, DD verzus kontrola, Studentov t-test). Tieto údaje naznačujú, že DA je potrebný na krátkodobú a dlhodobú pamäť strachu potencovaného zľaknutia. Ďalej je DA nevyhnutná pre kontextuálne závislé učenie strachu, ako sa zisťuje pomocou šokovej senzibilizácie. Tieto údaje tiež posilňujú predchádzajúci záver, že DA je potrebná v kritickom období na stabilizáciu stopy podmieňovania strachu. Obrázok 4 Krátkodobá pamäť a senzibilizácia šokom závisia od DA. A, Návrh paradigmy správania. V deň 1 sa získali východiskové odozvy. V deň 2 dostali myši všetkých 30 párovaní cue-shock a potom boli pred testovaním vložené späť do svojej domácej klietky na 10 minút. B, kontrolné myši (n = 10, čierne pruhy) majú v porovnaní s DD (n = 10, otvorené pruhy) signifikantne väčšiu šokovú senzibilizáciu a strach potenciované vyplašenie. Hviezdičky označujú p <0.05; Študentský t-test. Myši C, WT (n = 7, čierne pruhy) a D1R KO (n = 7, otvorené pruhy) majú intaktnú šokovú senzibilizáciu. Iba WT mali počas testu krátkodobej pamäte strach vyľudnený strachom. Hviezdičky označujú p <0.05, KO oproti WT; Študentský t-test. D, WT (n = 8, čierne stĺpce) myši mali významne väčšiu šokovú senzibilizáciu ako D2R KO (n = 8, otvorené stĺpce). Úrovne potencovaného strachu sú podobné u myší WT a D2R KO. Hviezdičky označujú p <0.05, KO oproti WT; Študentský t-test. Všetky uvedené hodnoty sú priemery ± SEM Aby sa preskúmalo, ktoré podtypy receptorov sprostredkovávajú úlohu DA v krátkodobej pamäti a šokovej senzibilizácii, myši D1R a D2R KO boli testované v rovnakej paradigme ako myši DD. D1R KO myši mali významne nižšie hladiny krátkodobej pamäte ako WT myši (obrázok 4C, p <0.05; Studentov t-test); nebol však žiadny významný rozdiel medzi úrovňami šokovej senzibilizácie u D1R KO a kontrolných myší, čo naznačuje, že kontextovo závislé učenie bolo neporušené. D2R KO myši mali signifikantne nižšie hladiny šokovej senzibilizácie ako WT (Obrázok 4D, p <0.05; Studentov t-test), napriek tomu nebol žiadny významný rozdiel medzi hladinami krátkodobej pamäte medzi WT a KO myšami.
Obnovenie DA do bazolaterálnej amygdaly je dostatočné na to, aby umožnilo krátkodobú pamäť
Basolaterálna amygdala je rozhodujúca pre získanie strachovej pamäte závislej od cue (Maren, 2003; Maren a Quirk, 2004; Sigurdsson et al., 2007). Okrem toho existujú dôkazy naznačujúce dôležitú úlohu DA pri uľahčovaní funkcie bazolaterálnej amygdaly (Rosenkranz a Grace, 2002; Bissiere a kol., 2003; Marowsky et al., 2005). Aby sa zistilo, či je DA v bazolaterálnej amygdale potrebné pre strach-potencované prekvapenie, DD a kontrolné myši sa injikovali bilaterálne s vektorom CAV2-Cre do bazolaterálnej amygdaly (obrázok 5A). Tento vektor je retrográdne transportovaný z miesta injekcie do DA neurónov, kde obnovuje Th génovú aktivitu (Hnasko et al., 2006). Imunohistochémia ukázala, že TH bol prítomný v bazolaterálnej amygdale DD myší injikovaných CAV2-Cre (obrázok 5J), ale chýba v dorzálnom striate a nucleus accumbens (obrázok 5G). TH bol primárne obnovený na malý počet neurónov v caudálnych častiach ventrálnej tegmentálnej oblasti (obrázok 5D). Typicky bolo menej ako 10 TH-pozitívnych buniek na 30-μm sekciu u injekčne podávaných DD myší, čo je v súlade s malým počtom amygdala-projekujúcich DA neurónov uvedených v literatúre (Ford et al., 2006; Lammel et al. , 2008, Margolis a kol., 2008).
Obrázok 5
Regionálne špecifické obnovenie endogénnej TH expresie u DD myší. Schematické znázornenie súradníc pre injekcie pre bazolaterálne amygdala (BLA) záchranné experimenty. DD (n = 7) a kontrolné (n = 7) myši sa injikovali bilaterálne do BLA vektormi CAV2-Cre (0.5 uL / hemisféra). B, Schematické znázornenie injekčných súradníc pre experimenty záchrany ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA). AAV1-Cre-GFP bol injikovaný bilaterálne (0.5 uL / hemisféra) do VTA DD (n = 7) a kontrolných myší (n = 10). Obrázky sú upravené z Paxinos a Franklin, 2001. C – E, Porovnanie TH farbenia v koronálnom reze (4 × zväčšenie) ukazujúce ventrálny stredný mozog WT kontroly injektovanej vírusom, BLA-injikovaného DD a DD injikovaného VTA. C, TH imunohistochémia v kontrolnom strednom mozgu demonštruje prítomnosť DA neurónov vo VTA a substantia nigra pars compacta (SNpc; označené šípkou). D, BLA-zachránené DD myši mali malý počet TH-pozitívnych neurónov vo VTA. Vsunutie je zväčšenie 40 x oblasti v krabici, čo ukazuje expresiu TH v soma a procesoch. E, VTA-zachránené DD myši mali expresiu TH prevažne vo VTA. Všimnite si neprítomnosť TH farbenia v SNpc (označené šípkou). F – H, koronálny rez (4 × zväčšenie) z myší s injekciou WT vírusom, BLA-zachránených a VTA-zachránených DD myší, ktoré vykazujú expresiu TH v dorzálnom striate a nucleus accumbens. F, kontroly injektované vírusom WT majú TH expresiu v celom rozsahu dorzálneho (označeného šípkou) a ventrálneho striata. G, V striatu DD myší zachránených BLA nie je detekovaná žiadna TH expresia. H, V-zachránené DD myši majú expresiu TH v nucleus accumbens, len s malým množstvom farbenia v dorzálnom striate (označenom šípkou). I – K, koronálna sekcia (10 × zväčšenie) ukazujúca TH expresiu v BLA vírusom injikovaných WT kontrol, BLA-zachránených a VTA-zachránených DD myší.
Myši s injekciou basolaterálnej amygdaly sa podrobili 3-dňovej paradigme vyľakania zosilneného strachom. Krátkodobá pamäť a senzibilizácia šoku sa hodnotili 10 minút po tréningu a dlhodobá pamäť na strachom zosilnený strach sa hodnotila 24 hodín po tréningu (obrázok 6A). Je zaujímavé, že u DD myší s injekciou bazolaterálnej amygdaly sa obnovila iba krátkodobá pamäť. Úrovne krátkodobej pamäte boli rovnaké ako u kontrol, ale úrovne dlhodobej pamäte (p<0.05; Studentov t-test) a šokovej senzibilizácie (p<0.05; Studentov t-test) boli významne nižšie ako u kontrol. Počas tréningu boli úrovne šokovej reaktivity medzi skupinami rovnaké (kontrola: 1613 ± 333 verzus DD zachránený BLA: 1758 260 ± 6). Tieto údaje naznačujú, že DA projekcie do bazolaterálnej amygdaly, vychádzajúce hlavne z kaudálneho aspektu ventrálnej tegmentálnej oblasti, sú dostatočné na krátkodobé získanie pamäte cued-strach, ale DA projekcie do iných kortikálnych alebo limbických oblastí mozgu sú pravdepodobne nevyhnutné pre kontextové učenie a dlhodobá stabilizácia stopy strachu. Obrázok 7 Myši s DD zachránenými bazolaterálnou amygdalou (BLA) obnovili krátkodobú pamäť, zatiaľ čo myši s DD zachránenými ventrálnou tegmentálnou oblasťou (VTA) úplne obnovili učenie. A, WT kontrola s injekciou vírusu (n=7) a DD myši zachránené BLA (n=3) boli podrobené 24-dňovej paradigme úľaku zosilnenej strachom. Vľavo, senzibilizácia šokom je výrazne nižšia u myší zachránených BLA. Stredná, krátkodobá pamäť (STM) bola obnovená na kontrolné úrovne u myší zachránených BLA. Vpravo, dlhodobá pamäť (LTM), hodnotená 10 hodín po tréningu, chýba u myší zachránených BLA. B, Výsledky z WT kontroly (n=7) a VTA-zachránených DD myší (n=3) v 0.05-dňovom paradigme úľaku zosilneného strachom. Vľavo, senzibilizácia šokom u DD myší zachránených VTA sa významne nelíšila od kontroly. Stredná a pravá, úrovne pamäte STM a LTM boli rovnaké ako kontrola u VTA-záchranných myší. Hviezdičky označujú p<XNUMX, záchrana verzus kontrola, Studentov t-test. Všetky uvedené hodnoty sú priemery ± SEM
Obnovenie TH na ventrálnu tegmentálnu oblasť DA neuróny sú dostatočné na učenie
Z ventrálneho stredného mozgu vychádzajú dve hlavné okruhy DA; mezostriatálny okruh, ktorý pochádza primárne z substantia nigra pars compacta a mezokortikolimického okruhu, pochádzajúceho primárne z ventrálnej tegmentálnej oblasti. Mezokortikolimický okruh široko premieta mozgové jadrá, o ktorých je známe, že sú dôležité pre podmieňovanie strachu závislé od cue, vrátane basolaterálnej amygdaly (Bjorklund a Dunnett, 2007; Lammel a kol., 2008). Preskúmať, či je pre dlhodobú pamäť a senzibilizáciu šoku potrebná úplná obnova mesokortikolimbickej DA; DD a kontrolné myši sa injikovali bilaterálne vektorom AAV1-Cre-GFP do ventrálnej tegmentálnej oblasti, aby sa špecificky aktivoval endogénny Th gén (obrázok 5B).
Imunohistochémia sa použila na detekciu, ktoré DA neuróny a ktoré ciele obnovili TH expresiu. TH farbenie je neprítomné u myší bez zachránených DD (Hnasko et al., 2006). Imunohistochémia ukázala, že obnova TH v DD myších s ventrálnou tegmentálnou oblasťou bola vysoko špecifická pre ventrálnu tegmentálnu oblasť a jej ciele (obrázok 5E, H, K). V dorzálnom striate sa vyskytol nedostatok TH farbenia, čo je hlavný cieľ DA neurónov vychádzajúcich z substantia nigra pars compacta (obrázok 5H), zatiaľ čo nucleus accumbens a basolaterálna amygdala mali výraznú TH expresiu (Obr. 5H, K).
Myši, ktorým bola injikovaná ventrálna tegmentálna oblasť, boli podrobené rovnakému 3-dňovému strachu-potencovanej paradigme strachu ako basolaterálne myši podané injekciou amygdala (obrázok 6B). Senzibilizácia šoku, krátkodobá pamäť a dlhodobá pamäť boli obnovené na kontrolné hladiny v DD myších s ventrálnou tegmentálnou oblasťou. Nárazová reaktivita počas tréningu bola rovnaká medzi skupinami (kontrola: 1653 ± 268 oproti VTA-zachránenému DD: 1602 ± 198). Tieto údaje naznačujú, že DA projekcie z ventrálnej tegmentálnej oblasti sú postačujúce na vytvorenie krátkodobej a dlhodobej pamäte typu cued-strach, ako aj kontextovo závislej senzibilizácie šoku.
Diskusia
Tieto výsledky demonštrujú, že DA sa vyžaduje pre kondicionovanie s cued-strachom, ako sa meria strachom potencovaným strachom. DD myši nevykazovali strach-potencované prekvapenie, pokiaľ DA nebolo obnovené okamžite po tréningu. DD myši majú tiež zhoršenú krátkodobú pamäť a senzibilizáciu šoku. Dôležité je, že prepulzová inhibícia nebola nižšia u DA-depletovaných DD myší, čo naznačuje, že senzorimotorické bránenie nie je znížené v neprítomnosti DA. Predchádzajúci výskum ukázal, že psychostimulanciá, ktoré zvyšujú transmisiu DA, môžu znížiť inhibíciu prepulz (Schwarzkopf et al., 1992; Bubser a Koch, 1994; Ralph a kol., 1999; Swerdlow a kol., 2006; Doherty a kol., 2007) a iné demonštrovali, že farmakologická inhibícia dopamínových receptorov zvyšuje inhibíciu prepulzie (Schwarzkopf et al., 1993; Depoortere a kol., 1997). V súlade s týmito zisteniami mali myši DD malý, ale významný nárast inhibície prepulzie oproti kontrolným myšiam. Predchádzajúce štúdie tiež ukázali, že farmakologická inhibícia DA receptorov môže znížiť akustickú úľakovú reakciu (Davis a Aghajanian, 1976; Schwarzkopf et al., 1993). Myši s deplénom dopamínu nemali signifikantne zmenenú akustickú odozvu; v porovnaní s kontrolami však existoval trend smerom k zníženým reakciám, najmä pri vysokých intenzitách stimulov v súlade s predchádzajúcimi správami (Schwarzkopf et al., 1993).
Tu prezentované údaje jasne ukazujú, že DA nie je dôležitý pre vyhľadávanie alebo expresiu strachovej pamäte závislej od cue, pretože DD myši nevyžadujú DA počas testovacej relácie, aby vyjadrili strach potencovaný strach, ktorý bol predtým získaný injekciou L-Dopa bezprostredne po výcvik. Okrem toho naše experimenty argumentujú proti DA, ktorá je potrebná na počiatočné spracovanie stimulov počas tréningu, pretože DD myši boli počas všetkých tréningov vyčerpané dopamínom. Namiesto toho naše údaje naznačujú, že DA je nevyhnutná pre včasnú stabilizáciu pamäťovej stopy, pretože DD myši neexprimujú krátkodobú pamäť, a dlhodobá pamäť je viditeľná len vtedy, keď sa L-Dopa podáva okamžite, ale nie 1 hod. výcvik. Predpokladá sa, že injekcia DD myší L-Dopa bezprostredne po tréningu stabilizuje stopu pamäti, čo jej umožňuje zadať dlhodobú formu. Aversívne podnety spôsobujú dlhodobé zvyšovanie hladín DA v oblastiach mozgu, ktoré sú rozhodujúce pre podmieňovanie strachu, ktoré by umožňovali takúto stabilizáciu strachu (Abercrombie et al., 1989; Kalivas a Duffy, 1995; Doherty a Gratton, 1997; Inglis a Moghaddam, 1999). V súlade s našimi údajmi, iní ukázali, že post-tréningové manipulácie funkcie DA menia strach-súvisiace pamäte (Bernaerts a Tirelli, 2003; Lalumiere et al., 2004; LaLumiere et al., 2005).
Naše zistenia poukazujú na to, že na stimuláciu strachu je potrebné viac podtypov DA receptorov. Myšiam D1R KO chýba krátkodobá a dlhodobá pamäť pre strach-potencovaný úľ, čo naznačuje kľúčovú úlohu pre tento receptorový podtyp pri sprostredkovaní účinkov DA v cue-dependentnom učení strachu. Je zaujímavé, že kontextovo závislé učenie strachu bolo u myší D1R KO intaktné. Tieto údaje potvrdzujú ďalšie štúdie, ktoré ukazujú, že antagonisty podobné D1R zmierňujú učenie strachu podmienené cue bez ovplyvnenia senzibilizácie šoku a ukazujú, že farmakologické manipulácie v týchto experimentoch boli špecifické pre D1R (Lamont a Kokkinidis, 1998; Guarraci et al., 1999) , Tieto údaje sú tiež v súlade so štúdiami, ktoré demonštrujú kritickú úlohu D1R v iných paradigmách učenia závislých od cue (Smith et al., 1998; Eyny a Horvitz, 2003).
D2R KO mal intaktný strach potencovaný strachom, ale chýba mu senzibilizácia šoku. Greba a kol. (2001) ukázali, že intra-amygdalarny antagonizmus D2R viedol k zhoršeniu senzibilizácie šoku a strachu-potencovaného vyľakania bez ovplyvnenia východiskovej bázy alebo reakcií na footshock. Aktivácia D2R vedie k indukcii dlhodobej potenciácie v BLA, čo by pravdepodobne bolo životne dôležité pre strach-potencovanú prekvapujúcu pamäť (Bissiere et al., 2003). Naše údaje demonštrujú, že D2R nie je potrebný na učenie strachu závislé od cue, ale skôr na to, aby tento podtyp DA receptora bol dôležitý pre senzitizáciu šoku závislú od kontextu. Pred podaním injekcie D2R KO myšiam systémovo s D2-podobným antagonistom eticlopridom pred tréningom sa zabránilo strachu potencovanému strachom; preto je pravdepodobné, že iné receptory podobné D2R, ktoré sú tiež inhibované eticlopridom, sú kritické v strachu potencovanom vyľakaní (Sigala et al., 1997; Bernaerts a Tirelli, 2003; Laviolette a kol., 2005; Swant a Wagner , 2006). Z tohto dôvodu môžu byť poruchy v učení závislom od cue vyvolané antagonistami podobnými D2 v predchádzajúcich štúdiách pripisované týmto liečivám, ktoré inhibujú iných členov rodiny D2R.
Selektívna obnova endogénneho TH špecificky na ventrálnu tegmentálnu oblasť viedla k obnoveniu učenia u DD myší. Imunohistochémia ukázala, že TH bol obnovený na dôležité limbické jadrá, ako sú nucleus accumbens a basolaterálna amygdala, ale nie na chrbtové striatum. Okrem toho bolo v substantia nigra pars compacta veľmi málo neurónov pozitívnych na TH. Tieto údaje naznačujú, že DA z neurónov ventrálnej tegmentálnej oblasti je dôležitá pre kondicionovanie s kontextovým a kontextovým strachom.
Myši so selektívnou obnovou DA na bazolaterálnu amygdalu exprimovali krátkodobú pamäť, ale nie dlhodobú pamäť alebo senzibilizáciu šoku. Predchádzajúce štúdie ukázali, že DA uľahčuje amygdala funkciu prostredníctvom zmien v GABAergnom inhibičnom tóne a tento účinok je sprostredkovaný buď D1R alebo D2R (Bissiere et al., 2003; Kroner a kol., 2005; Marowsky et al., 2005). Tu prezentované údaje ukazujú, že DA v bazolaterálnej amygdale je rozhodujúci pre získanie krátkodobej pamäte pre strach potencovaný strach, ale nie je dostatočný pre dlhodobú stabilitu pamäte. Obnovenie krátkodobej pamäte je sprostredkované malým počtom bazolaterálnych amygdala-premietajúcich DA neurónov vychádzajúcich z ventrálnej tegmentálnej oblasti. Rozsiahlejšie obnovenie endogénneho TH v DD myokardiálnej oblasti, ktorá bola zachránená ventrálnou tegmentálnou oblasťou, viedlo k neporušenej krátkodobej a dlhodobej pamäti; preto je pravdepodobne potrebné obnoviť TH na iné mezokortikolimbické okruhy, aby sa vytvorila dlhodobá pamäť pre strach potencovaný strachom. Predchádzajúce štúdie naznačujú, že nucleus accumbens a prefrontálny kortex môžu byť tiež dôležitými cieľmi DA počas kondicionovania strachu (Kalivas a Duffy, 1995; Murphy a kol., 2000; Pezze a kol., 2003; LaLumiere et al., 2005; Laviolette et. al., 2005, Floresco a Tse, 2007). Preto je možné, že DA signalizácia buď v nucleus accumbens alebo prefrontálnom kortexe je potrebná na vytvorenie dlhodobej pamäte.
Stručne povedané, naša štúdia využila kombináciu genetických myších modelov, farmakológie a záchrany funkcie špecifickej pre daný región, aby demonštrovala, že DA je potrebný pre strach potencovaný strachom, ktorý je závislý od cue-dependentného strachu. Tieto zistenia zdôrazňujú dôležitú úlohu tohto neurotransmitera mimo spracovania odmeny. Okrem toho, naša štúdia poukazuje na potrebu DA pôsobiaceho na viacerých DA receptoroch súčasne vo viacerých oblastiach mozgu na podmieňovanie strachu závislé od cue. Nedávne štúdie ukázali, že neuróny ventrálnej tegmentálnej oblasti DA sa významne líšia vo svojich molekulárnych a fyziologických vlastnostiach podľa cieľového umiestnenia (Ford et al., 2006; Margolis a kol., 2006; Bjorklund a Dunnett, 2007; Lammel a kol., 2008; Margolis a kol., 2008). Experimenty, v ktorých sme Th gen selektívne reaktivovali v DA neurónoch premietaných do bazolaterálnej amygdaly, ukázali, že ide o malú, vybranú populáciu neurónov ventrálnej tegmentálnej oblasti, skôr než kolaterály DA neurónov premietaných do iných oblastí mozgu. Naše údaje, kombinované so štúdiami preukazujúcimi heterogenitu populácií DA neurónov, zdôrazňujú potrebu pochopiť úlohu každého z týchto diskrétnych DA okruhov. Rozšírenie poznatkov o mnohých behaviorálnych a fyziologických funkciách DA, ktoré zahŕňajú učenie súvisiace so strachom, môže viesť k lepšiemu pochopeniu prevládajúcich porúch súvisiacich so strachom, ako je posttraumatická stresová porucha, obsedantno-kompulzívna porucha a generalizovaná úzkostná porucha.
Poďakovanie
Toto vyšetrovanie bolo čiastočne podporené Úradom verejného zdravotníctva, cenou National Research Service Award, T32 GM07270, z Národného inštitútu všeobecných lekárskych vied a NIH National Institutes of General Medical Sciences Grant 4 R25 GM 058501-05. Ďakujeme Ilene Bernstein, Lisa Beutler, Charlesovi Chavkinovi a Larrymu Zweifelovi za užitočné komentáre k rukopisu, Albertovi Quintanovi za pomoc pri histológii a Valerie Wall za údržbu kolónií myší. Ďakujeme aj Dr. Miguelovi Chillonovi (Vector Production Unit of CBATEG na Universitat Autonoma v Barcelone) za CAV2 a Matthew Počas AAV1 vírusu.
Referencie
1. Abercrombie ED, Keefe KA, DiFrischia DS, Zigmond MJ. Diferenciálny účinok stresu na in vivo uvoľňovanie dopamínu v striate, nucleus accumbens a mediálnom frontálnom kortexe. J Neurochem. 1989, 52: 1655-1658. [PubMed]
2. Bernaerts P, Tirelli E. Uľahčujúci účinok agonistu dopamínového D4 receptora PD168,077 na konsolidáciu pamäte naučenej odozvy inhibičného vyhýbania sa u myší C57BL/6J. Behav Brain Res. 2003;142:41–52. [PubMed]
3. Bissiere S, Humeau Y, Luthi A. Dopamínové gény indukujú LTP indukciu v laterálnej amygdale potlačením doprednej inhibície. Nat Neurosci. 2003, 6: 587-592. [PubMed]
4. Bjorklund A, Dunnett SB. Dopamínové neurónové systémy v mozgu: aktualizácia. Trends Neurosci. 2007, 30: 194-202. [PubMed]
5. Bubser M, Koch M. Prepulzová inhibícia akustickej úľakovej reakcie potkanov je znížená 6-hydroxydopamínovými léziami mediálneho prefrontálneho kortexu. Psychofarmakológia (Berl) 1994;113:487–492. [PubMed]
6. Davis M, Aghajanian GK. Účinky apomorfínu a haloperidolu na akustickú úľakovú reakciu u potkanov. Psychofarmakológia (Berl) 1976;47:217–223. [PubMed]
7. de Oliveira AR, Reimer AE, Brandao ML. Dopamínové D2 receptorové mechanizmy vo vyjadrení podmieneného strachu. Pharmacol Biochem Behav. 2006, 84: 102-111. [PubMed]
8. Depoortere R, Perrault G, Sanger DJ. Zosilnenie prepulznej inhibície úľakového reflexu u potkanov: farmakologické vyhodnotenie postupu ako modelu na detekciu antipsychotickej aktivity. Psychofarmakológia (Berl) 1997;132:366–374. [PubMed]
9. Doherty JM, Masten VL, Powell SB, Ralph RJ, Klamer D, Low MJ, Geyer MA. Príspevky podtypov dopamínových D1, D2 a D3 receptorov k rušivým účinkom kokaínu na prepulznú inhibíciu u myší. Neuropsychofarmakológia. 2007;12:12.
10. Doherty MD, Gratton A. NMDA receptory v nucleus accumbens modulujú stresom indukované uvoľňovanie dopamínu v nucleus accumbens a ventrálnej tegmentálnej oblasti. Synapse. 1997;26:225–234. [PubMed]
11. Drago J, Gerfen ČR, Lachowicz JE, Steiner H, Hollon TR, Love PE, Ooi GT, Grinberg A, Lee EJ, Huang SP, et al. Zmenená funkcia striata u mutantnej myši bez D1A dopamínových receptorov. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:12564–12568. [bezplatný článok o PMC] [PubMed]
12. Eyny YS, Horvitz JC. Protichodné úlohy D1 a D2 receptorov pri apetitívnom kondicionovaní. J Neurosci. 2003;23:1584–1587. [PubMed]
13. Floresco SB, Tse MT. Dopaminergná regulácia inhibičného a excitačného prenosu v bazolaterálnej amygdala-prefrontálnej kortikálnej dráhe. J Neurosci. 2007;27:2045–2057. [PubMed]
14. Ford CP, Mark GP, Williams JT. Vlastnosti a inhibícia opioidov mezolimbických dopamínových neurónov sa líšia podľa cieľového miesta. J Neurosci. 2006, 26: 2788-2797. [PubMed]
15. Greba Q, Kokkinidis L. Periférne a intraamygdalárne podanie antagonistu dopamínového D1 receptora SCH 23390 blokuje strachom zosilnený strach, ale nie šokovú reaktivitu alebo šokovú senzibilizáciu akustického úľaku. Behav Neurosci. 2000;114:262–272. [PubMed]
16. Greba Q, Munro LJ, Kokkinidis L. Účasť cholinergných muskarínových receptorov ventrálnej tegmentálnej oblasti v klasicky podmienenom prejave strachu, ako sa meria strachom zosilneným úľakom. Brain Res. 2000;870:135–141. [PubMed]
17. Greba Q, Gifkins A, Kokkinidis L. Inhibícia amygdaloidných dopamínových D2 receptorov zhoršuje emocionálne učenie merané strachom zosilneným úľakom. Brain Res. 2001;899:218–226. [PubMed]
18. Guarraci FA, Kapp BS. Elektrofyziologická charakterizácia dopaminergných neurónov ventrálnej tegmentálnej oblasti počas diferenciálnej úpravy pavloviánskeho strachu v bdelom králiku. Behav Brain Res. 1999, 99: 169-179. [PubMed]
19. Guarraci FA, Frohardt RJ, Kapp BS. Zapojenie dopamínového receptora amygdaloidu D1 do Pavlovovho podmieňovania strachu. Brain Res. 1999;827:28–40. [PubMed]
20. Guarraci FA, Frohardt RJ, Falls WA, Kapp BS. Účinky intra-amygdaloidných infúzií antagonistu dopamínového receptora D2 na podmieňovanie Pavlovovho strachu. Behav Neurosci. 2000;114:647-651. [PubMed]
21. Hnaško TS, Perez FA, Scouras AD, Stoll EA, Gale SD, Luquet S, Phillips PE, Kremer EJ, Palmiter RD. Obnova nigrostriatálneho dopamínu sprostredkovaná Cre rekombinázou u myší s deficitom dopamínu zvráti hypofágiu a bradykinézu. Proc Natl Acad Sci US A. 2006;103:8858–8863. [bezplatný článok o PMC] [PubMed]
22. Horvitz JC. Mezolimbokortikálne a nigrostriatálne dopamínové reakcie na výrazné udalosti bez odmeny. Neuroveda. 2000;96:651–656. [PubMed]
23. Inglis FM, Moghaddam B. Dopaminergná inervácia amygdaly je vysoko citlivá na stres. J Neurochem. 1999, 72: 1088-1094. [PubMed]
24. Inoue T, Izumi T, Maki Y, Muraki I, Koyama T. Účinok antagonistu dopamínu D(1/5) SCH 23390 na získanie podmieneného strachu. Pharmacol Biochem Behav. 2000;66:573–578. [PubMed]
25. Joshua M, Adler A, Mitelman R, Vaadia E, Bergman H. Stredné mozgové dopamínergné neuróny a striatálne cholinergné interneuróny kódujú rozdiel medzi odmenou a averzívnymi udalosťami v rôznych epochách pravdepodobnostných klasických pokusov o kondicionovaní. J Neurosci. 2008, 28: 11673-11684. [PubMed]
26. Kalivas PW, Duffy P. Selektívna aktivácia prenosu dopamínu v škrupine nucleus accumbens stresom. Brain Res. 1995, 675: 325-328. [PubMed]
27. Kelly MA, Rubinstein M, Asa SL, Zhang G, Saez C, Bunzow JR, Allen RG, Hnasko R, Ben-Jonathan N, Grandy DK, Low MJ. Hyperplázia laktotrofie hypofýzy a chronická hyperprolaktinémia u myší s deficitom dopamínového D2 receptora. Neuron. 1997;19:103–113. [PubMed]
28. Koch M. Neurobiológia vyľakania. Prog Neurobiol. 1999, 59: 107-128. [PubMed]
29. Kroner S, Rosenkranz JA, Grace AA, Barrionuevo G. Dopamín moduluje excitabilitu bazolaterálnych amygdala neurónov in vitro. J. Neurophysiol. 2005, 93: 1598-1610. [PubMed]
30. Lalumiere RT, Nguyen LT, McGaugh JL. Intrabasolaterálne infúzie dopamínu do amygdaly po tréningu modulujú konsolidáciu inhibičnej vyhýbavej pamäte: zapojenie noradrenergných a cholinergných systémov. Eur J Neurosci. 2004;20:2804–2810. [PubMed]
31. LaLumiere RT, Nawar EM, McGaugh JL. Modulácia konsolidácie pamäte basolaterálnym amygdala alebo nucleus accumbens shell vyžaduje súčasnú aktiváciu dopamínového receptora v oboch oblastiach mozgu. Learn Mem. 2005, 12: 296-301. [PMC free article] [PubMed]
32. Lammel S, Hetzel A, Hackel O, Jones I, Liss B, Roeper J. Jedinečné vlastnosti mezoprefrontálnych neurónov v rámci duálneho mezokortikolimbického dopamínového systému. Neuron. 2008;57:760–773. [PubMed]
33. Lamont EW, Kokkinidis L. Infúzia antagonistu dopamínového D1 receptora SCH 23390 do amygdaly blokuje prejav strachu v zosilnenej paradigme úľaku. Brain Res. 1998;795:128–136. [PubMed]
34. Laviolette SR, Lipski WJ, Grace AA. Subpopulácia neurónov v mediálnom prefrontálnom kortexe kóduje emocionálne učenie s nárazovými a frekvenčnými kódmi prostredníctvom bazolaterálneho vstupu amygdaly závislého od dopamínového D4 receptora. J Neurosci. 2005;25:6066–6075. [PubMed]
35. Lemon N, Manahan-Vaughan D. Dopamínové D1/D5 receptory bránia získavaniu nových informácií prostredníctvom hipokampálnej dlhodobej potenciácie a dlhodobej depresie. J Neurosci. 2006;26:7723–7729. [PubMed]
36. Maren S. Amygdala, synaptická plasticita a pamäť strachu. Ann NY Acad Sci. 2003;985:106–113. [PubMed]
37. Maren S, Quirk GJ. Neurónová signalizácia pamäte strachu. Nat Rev Neurosci. 2004;5:844–852. [PubMed]
38. Margolis EB, Mitchell JM, Ishikawa J, Hjelmstad GO, Fields HL. Dopamínové neuróny stredného mozgu: projekčný cieľ určuje trvanie akčného potenciálu a inhibíciu receptora dopamínu D (2). J Neurosci. 2008, 28: 8908-8913. [PubMed]
39. Margolis EB, Lock H, Chefer VI, Shippenberg TS, Hjelmstad GO, Fields HL. Kappa opioidy selektívne kontrolujú dopaminergné neuróny vyčnievajúce do prefrontálneho kortexu. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:2938–2942. [bezplatný článok o PMC] [PubMed]
40. Marowsky A, Yanagawa Y, Obata K, Vogt KE. Špecializovaná podtrieda interneurónov sprostredkováva dopaminergné uľahčenie funkcie amygdaly. Neurón. 2005, 48: 1025-1037. [PubMed]
41. McNish KA, Gewirtz JC, Davis M. Dôkaz kontextového strachu po léziách hipokampu: prerušenie mrazenia, ale nie strachom zosilnený strach. J Neurosci. 1997;17:9353–9360. [PubMed]
42. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG. Dopamínové receptory: od štruktúry k funkcii. Physiol Rev. 1998;78:189-225. [PubMed]
43. Murphy CA, Pezze M, Feldon J, Heidbreder C. Diferenciálne zapojenie dopamínu v obale a jadre nucleus accumbens pri expresii latentnej inhibície na averzne podmienený stimul. Neuroveda. 2000;97:469–477. [PubMed]
44. Pezze MA, Feldon J. Mesolimbické dopamínergické dráhy v kondicionovaní strachu. Prog Neurobiol. 2004, 74: 301-320. [PubMed]
45. Pezze MA, Bast T, Feldon J. Význam prenosu dopamínu v mediálnom prefrontálnom kortexe potkana pre podmienený strach. Cereb Cortex. 2003;13:371–380. [PubMed]
46. Ponnusamy R, Nissim HA, Barad M. Systémová blokáda dopamínových receptorov podobných D2 uľahčuje zánik podmieneného strachu u myší. Learn Mem. 2005, 12: 399-406. [PMC free article] [PubMed]
47. Ralph RJ, Varty GB, Kelly MA, Wang YM, Caron MG, Rubinstein M, Grandy DK, Low MJ, Geyer MA. Subtyp receptora dopamínu D2, ale nie D3 alebo D4, je nevyhnutný na narušenie prepulznej inhibície produkovanej amfetamínom u myší. J Neurosci. 1999;19:4627–4633. [PubMed]
48. Ralph-Williams RJ, Lehmann-Masten V, Otero-Corchon V, Low MJ, Geyer MA. Diferenciálne účinky priamych a nepriamych agonistov dopamínu na prepulznú inhibíciu: štúdia na D1 a D2 receptorových knock-out myšiach. J Neurosci. 2002;22:9604–9611. [PubMed]
49. Richardson R. Šoková senzibilizácia preľaknutia: naučený alebo nenaučený strach? Behav Brain Res. 2000;110:109–117. [PubMed]
50. Risbrough VB, Geyer MA, Hauger RL, Coste S, Stenzel-Poore M, Wurst W, Holsboer F. Receptory CRF(1) a CRF(2) sú potrebné pre potencované vyľakanie na kontextové, ale nie diskrétne podnety. Neuropsychofarmakológia. 2008;19:19.
51. Rosenkranz JA, Grace AA. Dopamínom sprostredkovaná modulácia amygdalových potenciálov vyvolaných zápachom počas pavlovianskej úpravy. Nature. 2002, 417: 282-287. [PubMed]
52. Schultz W. Formálnosť s dopamínom a odmenou. Neuron. 2002;36:241–263. [PubMed]
53. Schwarzkopf SB, Mitra T, Bruno JP. Senzorické vrátkovanie u potkanov ochudobnených o dopamín ako novorodencov: potenciálny význam pre zistenia u schizofrenických pacientov. Biol Psychiatry. 1992;31:759–773. [PubMed]
54. Schwarzkopf SB, Bruno JP, Mitra T. Účinky haloperidolu a SCH 23390 na akustickú inhibíciu úľaku a prepulzu za bazálnych a stimulovaných podmienok. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 1993;17:1023–1036. [PubMed]
55. Sigala S, Missale C, Spano P. Opačné účinky dopamínových D2 a D3 receptorov na učenie a pamäť u potkanov. Eur J Pharmacol. 1997;336:107–112. [PubMed]
56. Sigurdsson T, Doyere V, Cain CK, LeDoux JE. Dlhodobá potenciácia v amygdale: bunkový mechanizmus učenia strachu a pamäti. Neurofarmakológia. 2007;52:215–227. [PubMed]
57. Smith DR, Striplin CD, Geller AM, Mailman RB, Drago J, Lawler CP, Gallagher M. Hodnotenie správania myší, ktorým chýbajú dopamínové receptory D1A. Neuroveda. 1998;86:135–146. [PubMed]
58. Swant J, Wagner JJ. Blokáda dopamínového transportéra zvyšuje LTP v oblasti CA1 potkanieho hipokampu prostredníctvom aktivácie dopamínového receptora D3. Naučte sa Mem. 2006;13:161–167. [bezplatný článok o PMC] [PubMed]
59. Swerdlow NR, Shoemaker JM, Kuczenski R, Bongiovanni MJ, Neary AC, Tochen LS, Saint Marie RL. Funkcia D1 predného mozgu a senzomotorické hradlovanie u potkanov: účinky blokády D1, čelné lézie a denervácia dopamínu. Neurosci Lett. 2006;402:40–45. [PubMed]
60. Szczypka MS, Rainey MA, Kim DS, Alaynick WA, Marck BT, Matsumoto AM, Palmiter RD. Kŕmne správanie u myší s deficitom dopamínu. Proc Natl Acad Sci US A. 1999;96:12138–12143. [bezplatný článok o PMC] [PubMed]
61. Múdry RA. Dopamín, učenie a motivácia. Nat Rev Neurosci. 2004;5:483–494. [PubMed]
62. Zhou QY, Palmiter RD. Myši s deficitom dopamínu sú silne hypoaktívne, adipsické a afagické. Bunka. 1995, 83: 1197-1209. [PubMed]
63. Zweifel LS, Argilli E, Bonci A, Palmiter RD. Úloha NMDA receptorov v dopamínových neurónoch pre plasticitu a návykové správanie. Neuron. 2008;59:486–496. [bezplatný článok o PMC] [PubMed]
;