Požitie sacharózy vyvoláva rýchle obchodovanie s AMPA receptorom (2013)

J Neurosci. Autorský rukopis; dostupné v PMC Oct 3, 2013.
Publikované v konečnom upravenom formulári ako:
Finálna upravená verzia tohto článku vydavateľa je k dispozícii zadarmo na adrese J Neurosci
Pozri ďalšie články v PMC to citát publikovaný článok.

abstraktné

Mechanizmy, ktorými prírodné odmeny, napríklad cukor, ovplyvňujú synaptický prenos a správanie, sa do značnej miery nepreskúmajú. Tu skúmame reguláciu synapsií nucleus accumbens pomocou príjmu sacharózy. Predchádzajúce štúdie ukázali, že obchodovanie s receptormi AMPA je hlavným mechanizmom regulácie synaptickej sily, a to in vitro, k obchodovaniu s AMPA receptormi obsahujúcimi GluA1 podjednotku dochádza dvojstupňovým mechanizmom zahŕňajúcim extrasynaptický a potom synaptický transport receptorov. Uvádzame, že u potkanov opakované denné požitie roztoku 25% -nej sacharózy prechodne zvýšilo spontánnu lokomóciu a zosilnilo synapsie jadra prostredníctvom začlenenia Ca2+-priepustné receptory AMPA (CPAR), ktoré sú receptormi AMPA obsahujúcimi GluA1 a chýbajúcimi GluA2. Štúdie elektrofyziologickej, biochemickej a kvantitatívnej elektrónovej mikroskopie odhalili, že tréning sacharózy (7 dní) indukoval stabilnú (> 24 hodín) intraspinálnu populáciu GluA1 a že u týchto potkanov bol jediný stimul sacharózy rýchlo (5 minút), ale prechodne (<24 hodín) zvýšený GluA1 na extrasynaptických miestach. Vyžadovali sa CPAR a receptory dopamínu D1 in in vivo na zvýšenú pohyblivosť po požití sacharózy. Je dôležité, že 7-denný protokol denného požitia 3% roztoku sacharínu, nekalorického sladidla, indukoval synaptický GluA1 podobne ako 25% sacharóza. Ttieto zistenia identifikujú viacstupňové obchodovanie s GluA1, ako bolo opísané vyššie in vitro, ako mechanizmus pre akútnu reguláciu synaptického prenosu in vivo prírodnou orosenzorickou odmenou. Obchodovanie s ľuďmi je stimulované chemosenzorickou cestou, ktorá nezávisí od kalorickej hodnoty sacharózy.

úvod

Nadmerná spotreba sacharózy je vážnym problémom v oblasti verejného zdravia (Hu a Malik, 2010), ale nie sú známe mechanizmy, ktorými prírodné, orosenzorické odmeny, ako napríklad sacharóza, regulujú synaptický prenos, aby ovplyvnili správanie. Synaptická plasticita v jadre accumbens, neoddeliteľná súčasť obvodov odmeňovania mozgu (Sesack a Grace, 2010), prispieva k mnohým formám motivovaného správania vrátane učenia sa odmeňovania (Deň a Carelli, 2007), reakcie na sociálny stres (LaPlant a kol., 2010) a patológie závislostí (Luscher a Malenka, 2011). Opakovaná expozícia kokaínu spôsobuje synaptickú plasticitu v neurónoch accumbens a ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) (Brebner a kol., 2005; Grueter a kol., 2010; Mameli a kol., 2009; Pascoli a kol., 2012; Thomas a kol., 2001; Ungless a kol., 2001). Pri samostatnom podaní kokaínu s predĺženým prístupom, po ktorom nasleduje predĺžené vysadenie, sú synapsie zosilnené začlenením Ca2+-priepustné glutamátové receptory typu AMPA typu GluA2 (CPAR), ktorých signalizácia sprostredkuje inkubáciu kokaínovej túžby (Conrad a spol., 2008; McCutcheon a kol., 2011a). Podobne ako kokaín, orosenzorické výhody, ako napríklad sacharóza, výrazne zvyšujú accumbens dopamín (Smith, 2004), ale orosenzorická indukcia plasticity accumbens sa neskúmala.

Receptory AMPA (AMPAR) sú primárnymi mediátormi excitačného prenosu centrálneho nervového systému a ich obchodovanie prispieva k rôznym nervovým procesom vrátane učenia a pamäte. (Nedelescu a kol., 2010; Rumpel a kol., 2005; Whitlock a kol., 2006). AMPAR sa skladajú zo štyroch rôznych podjednotiek, GluA1-4. AMPAR obsahujúce GluA2 sú Ca2+- nepriepustný a konštitutívne prevádzka na synapsie, zatiaľ čo receptory bez GluA2 (CPAR), ktoré sú prevažne homogénmi GluA1, vedú Ca2+ a vykazujú vnútornú opravu. GluA1 podlieha synaptickému obchodovaniu závislému od aktivity dvojstupňovou cestou, v ktorej fosforylácia Ser 845 fosforyláciou proteínovej kinázy II závislej od cAMP (PKA) a proteínovej kinázy II závislej od cGMP (cGKII) podporuje akumuláciu receptora na extrasynaptických miestach v plazmatickej membráne (Esteban a kol., 2003; Serulle a kol., 2007; Sun a kol., 2008; Sun a kol., 2005). Po laterálnej difúzii do synapsie, fosforylácia Ser 818 pomocou PKC stabilizuje AMPAR v synapsii (Boehm a kol., 2006), zakotvené v postsynaptickej hustote (Ehlers a kol., 2007; Oh a kol., 2006; Serulle a kol., 2007). Rovnako ako2+/ kalmodulín-dependentná proteínkináza II (CaMKII) fosforylácia Ser 567 a Ser 831 tiež prispieva k synaptickému začleneniu a extrasynaptickému zacieleniu (Lu a kol., 2010; Roche a kol., 1996). Nie je však známe, či in vivo začlenenie CPAR využíva tieto rýchle, viacstupňové mechanizmy opísané in vitro.

Na skúmanie mechanizmov, ktorými orosenzorické odmeny, ako napríklad sacharóza reguluje excumbačné synapsie accumbens, sme použili paradigmu krátkeho príjmu sacharózy a merali zmeny synaptického prenosu v neurónoch accumbens. Zaznamenali sme, že opakované požitie sacharózy zosilňuje synapsie inkorporáciou CPAR a že u živočíchov trénovaných na sacharózu postačuje jediný stimulátor sacharózy na vyvolanie rýchleho prenosu GluA1 na extrasynaptické miesta. Pretože sacharín, nekalorické sladidlo, vyvolávalo synaptické obchodovanie podobne ako sacharóza, je obchodovanie skôr reakciou na orosenzorické ako na kalorické dráhy. Blokáda CPAR okrem toho zabránila zvýšeniu spontánnej lokomotorickej aktivity vyvolanej sacharózou in vivo, ďalšia identifikácia pripisuje CPARs ako dôležitým regulátorom odpovedí na prírodné výhody.

Materiály a metódy

Subjekty a chirurgické postupy

Subjekty boli samce potkanov Sprague-Dawley (Taconic; behaviorálne experimenty) s hmotnosťou 150-300 gramov pri príchode a samice E18 gravidných potkanov Sprague-Dawley (Taconic; experimenty s bunkovou kultúrou). Potkany boli chované v klietke 2 na pokus o behaviorálne experimenty v cykle svetlo-tma 12h / 12h (svetlá zhasnuté pri 18: 00) a mali prístup k potrave a vode. podľa chuti po celú dobu. Všetky experimentálne postupy boli schválené Výborom ústavnej starostlivosti o zvieratá a ich používaním na New York University School of Medicine a boli vykonané v súlade so „Zásadami laboratórnej starostlivosti o zvieratá“ (publikácia NIH 85 – 23).

Meranie sacharózy a pohybového ústrojenstva

Potkany boli prepravené do testovacej miestnosti 3 po sebe idúce dni počas 2 h / deň vo svojich domácich klietkach. Štvrtý deň sa do veka klietky zavádzali fľaše obsahujúce vodu alebo 25% sacharózu po dobu 5 min. Fľaše sa potom zvážili. Pri všetkých pokusoch sa od potkanov vyžadovalo, aby počas Xminútu prístupu 1 počas 5 dní od začiatku tréningu, ktorý sa má zahrnúť do štúdie, vypili najmenej 3 g sacharózy; toto potkanie v skutočnosti splnili všetky potkany. Po vybratí fliaš zostali potkany v testovacej miestnosti 30 min pred transportom späť do zariadenia pre zvieratá. V deň usmrtenia CO dostali potkany do bezvedomia2, dekapitované gilotinou a vzorky tkaniva boli odobraté na ľade. Pre lokomotorické experimenty boli potkany umiestnené do komôr na meranie lokomotorov (Accuscan, Columbus, OH) na celkovú dobu 35-min. Po 15-min v komore sa cez hornú časť komory zaviedla fľaša so zátkou s guľkami a stabilizovala sa. Fľaša bola odstránená z hornej časti komory po 5-min a potkany zostali v komore ďalších 15-min po vybratí fľaše. Tento postup sa opakoval identicky počas nasledujúcich 7 dní. Ubehnutá vzdialenosť sa merala pomocou systému VersaMax (Accuscan, Columbus, OH), ktorý monitoroval aktivitu zvierat prostredníctvom mriežky infračervených svetelných lúčov 16 × 16, ktoré prechádzajú klietkou pre zvieratá (42 × 42 × 30 cm) spredu dozadu a zľava doprava. , Informácie o stave lúča, skenované rýchlosťou 100-krát za sekundu, boli uložené na disk. Aktivita bola vyjadrená ako ambulantná vzdialenosť meraná v cm počas 12 rôznych košov 3-min v relácii 35 min (konečný kôš bol 2-min).

Sacharínový tréning

Na porovnanie obchodovania s GluA1om indukovaného sacharózou s účinkami požitia sacharínu sa dospelé samce potkanov 12 (250 g) umiestnili v zariadení pre zvieratá na cyklus 12 hodín svetlo / tma. Všetky potkany boli potom navyknuté do testovacej miestnosti transportom do testovacej miestnosti, ponechané 2 hodín a transportované späť do zariadenia pre zvieratá. Jeden 4 deň (po 3 dňoch habituácie) sa potkanom dostali prístupové fľaše obsahujúce vodu, sacharózu alebo sacharín. Potkanom 4 sa umožnil prístup k fľaši obsahujúcej vodu položenú na vrchu klietky s výlevkou vyčnievajúcou do veka cez veko. Čas prístupu bol 5 minút, potom bola fľaša odstránená a po 15 min. Boli ďalšie minúty potkany transportované späť do zariadenia pre zvieratá. Potkanom 4 sa umožnil prístup k 25% roztoku sacharózy a potkanom 4 sa poskytol prístup k roztoku sacharínu 3% (Sweet'n Low). Zmeral sa objem spotrebovanej tekutiny. Tento postup sa opakoval 7 dní. V deň pitia 7, bezprostredne po vybratí fľaše, sa potkany usmrtili a odobralo sa jadro accumbens a hladiny GluA1 sa testovali pomocou Western blotu.

elektrofyziológie

Potkany boli vyškolené na sacharózu, ako je opísané vyššie, v priehľadných plastových klietkach a po odstránení fľaše v deň 7 boli anestetizované ketamínom (100 mg / kg ip) a xylazínom (10 mg / kg ip) a transkardiálne perfundované chladným soľným roztokom (experimenty mEPSC). alebo okamžite dekapitované (rektifikačné experimenty). Mozgy boli rýchlo odstránené do umelej mozgomiechovej tekutiny (ACSF) pozostávajúcej z nasledujúcich (v mM): pre experimenty mEPSC: NaCl (118), KCl (2.5), CaCl2 (3), MgCl2 (1), NaHCO3 (26), NaH2PO4 (1), D-glukóza (10), osmolarita upravená na 325 mOsm a prevzdušnená 95% O2/ 5% CO2 (pH 7.4); pre rektifikačné experimenty: 75 sacharóza, 87 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 0.5 CaCl27 MgCl2 6 H2O, 25 NaHCO3, 10 dextróza, prebublávaný 95% O2 / 5% CO2 (pH 7.4). Koronálne rezy (hrúbka 300μm) obsahujúce jadro accumbens sa rozrezali v ľadovo chladnom ACSF s použitím vibrotómu (Leica, VT1200S) a udržali sa ponorené v ACSF (ACSF, v mM: 124 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH)2PO4, 2.5 CaCl21.5 MgSO4 7H2O, 26 NaHCO3a 10 dextrózy) po dobu <30 minút; potom sa udržiavala v predinkubátore rezov pri izbovej teplote najmenej 1 hodinu, aby sa umožnilo zotavenie. Pre experimenty mEPSC: jeden plátok sa potom preniesol do záznamovej komory, v ktorej sa udržiaval ponorený v nylonovej sieti pri 32 ° C s radičom TC324B in-line na ohrev roztoku a radičom (Warner Instruments, CT). Komora bola kontinuálne premývaná ACSF konštantnou rýchlosťou 2 ml / min. Stredne ostnaté neuróny z jadra oblasti nucleus accumbens boli identifikované pod vizuálnym vedením pomocou infračervenej-diferenčnej interferenčnej kontrastnej video mikroskopie (Hamamatsu C5405) s vertikálnym mikroskopom Olympus BX50WI vybaveným objektívom na ponorenie do vody so 40-násobnou dlhou vzdialenosťou. Náplasťové elektródy (4–6 MΩ) naplnené intracelulárnym pipetovým roztokom pozostávajúcim z (v mM): CsCl (145), HEPES (10), EGTA (0.5) a MgATP (5). Osmolarita bola upravená na 290 mOsm pomocou sacharózy a pH bolo upravené na 7.4 pomocou CsOH. Miniatúrne excitačné postsynaptické prúdy (mEPSC) boli zaznamenané v prítomnosti bikukulínu (10 μM) a tetrodotoxínu (1 μM) pomocou zosilňovača Axopatch 200B (Molecular Devices, CA) a digitalizované pomocou Digidata 1322A (Molecular Devices, CA). Pre rektifikačné experimenty: plátky sa preniesli do záznamovej komory a premývali (min. 2.0 - 2.5 ml-1) s okysličeným ACSF pri 33 – 35 ° C, ktorý obsahuje 50 μm picrotoxín na izoláciu EPSC. Somatické celobunkové záznamy sa uskutočňovali z stredne ostnatých neurónov v jadrovej oblasti v napäťovej svorke s multiclampovým 700B zosilňovačom (Molecular Devices) pomocou video-mikroskopie IR-DIC. Náplasťové pipety (4 – 6 MΩ) boli naplnené intracelulárnym roztokom (v mM: 125 Cs-glukonát, 2 CsCl, 5 TEA-Cl, 4 Mg-ATP, 0.3 GTP, 10 fosfokreatín, 10 HEPES, 0.5 EGX a 3.5 QTAX) a 314. -2). Dáta boli filtrované pri 10 kHz, digitalizované pri 10 kHz a analyzované pomocou Clampfit 0.01 (Molecular Devices). Extracelulárna stimulácia (1 – 5 ms, 150 – 0.2 μA, 0.05 Hz) sa aplikovala malou sklenenou bipolárnou elektródou 0.5 – 10 mm od záznamovej elektródy. Po-200 min. Základného záznamu sa roztok obsahujúci Naspm (10 μM) perfundoval do kúpeľa počas 70 min. Zmeny v amplitúde EPSC boli merané pred a po aplikácii liečiva na udržanie potenciálov m-50, -30, -0, 20, + 40, + 60 a + XNUMX. Index korekcie (ir) sa vypočítala korigovaním všetkých potenciálnych posunov reverzného potenciálu a vypočítala sa z nasledujúcej rovnice: ir = (I-70 / 70) / (I+ 40 / 40), kde I-70 a I+ 40 sú amplitúdy EPSC zaznamenané pri -70 mV a + 40 mV.

Subcelulárna frakcionácia a Western blot

Accumbens sa zbieral na ľade, ako je opísané vyššie. Keď boli jadro a škrupina oddelené oddelene, separácia bola potvrdená sondovaním synaptozómových frakcií na dopamín β-hydroxylázu, enzým nájdený v termináloch axónov k škrupine, ale nie v jadre (Sesack a Grace, 2010). Frakcie celých buniek, synaptozómu a PSD sa pripravili tak, ako už bolo opísané (Jordan a kol., 2004). Synaptozomálne pelety sa resuspendovali v 200 ul 25 mM Tris s 1% Triton X-100, kolísali sa pri 4 ° C počas 30-min a centrifugovali sa pri 13,800 x g po dobu 15-min v mikrocentrifúge na pelety PSD. Peleta obsahujúca surové PSD sa resuspendovala v 25 mM Tris s 2% SDS. Frakcie boli analyzované pomocou Western blotu na SDS-PAGE géloch, ako je opísané vyššie (Jordan a kol., 2004). Boli použité nasledujúce protilátky: dopamínová β-hydroxyláza (1: 1,000, Abcam), GluA1 (1: 1,000, Millipore), fosfor-Ser 845 GluA1 (1: 1,000, Millipore), GluA2 (1, XUMUM, XUMUM, XUMUM, XUMUM: XUMUM, XUMUM, XUMUM) (1,000: 1, Sigma).

Elektrónová mikroskopia

V deň odberu tkaniva (deň 7 tréningu sacharózy) sa potkany z testovacích skupín 3 (voda, sacharóza / voda, sacharóza; krysy 3 / testovacia skupina) umiestnili do komôr na meranie lokomotora na 15-min; v 15-min sa cez vrch komory vložila fľaša. Potkany v skupine Water dostali vodu, potkany v skupine s sacharózou dostali 25% sacharózu, potkany v skupine sacharóza / voda, ktoré konzumovali 25% sacharózu počas 6 dní, dostali vodu. Potkany sa hlboko anestetizovali Nembutalom (50 mg / kg ip) a transkardiálne perfundovali s 0.1 M fosfátovým pufrom (pH 7.4) obsahujúcim 4% paraformaldehyd a 0.1% glutaraldehyd rýchlosťou 50 ml / min počas prvých 3-min, potom pri rýchlosť 20 ml / min pre nasledujúce 7-min. Tkanivo sa pripravilo na postemblované imunogoldné (PEG) značenie a obrázky sa zachytili tak, ako už bolo opísané (Nedelescu a kol., 2010). Imuno štítky boli kategorizované podľa ich polohy vzhľadom na PSD v asymetrických synaptických spojeniach ako „rozštep“, „blízko PSD“ (v šírke 1 PSD od PSD), „v PSD“, „intraspinózna“ alebo „extrasynaptická membrána“. každé zviera, 93 synapsie boli vzorky z jadra accumbens. Náhodné vzorkovanie bolo zabezpečené analýzou všetkých prvých náhodne sa vyskytujúcich synapsií 93, keď sme systematicky preplávali mriežkou, potom sa zhromaždil rovnaký počet synapsií od každého z troch zvierat, ktoré dostali rovnaké ošetrenie ante mortem. Uskutočnili sa dva typy kvantifikácie. Jedným z nich bolo vyhodnotiť úroveň imunoreaktivity GluR1, spočítaním počtu PEG častíc, ktoré sa vyskytli v diskrétnych funkčných doménach chrbtice. Druhým bolo vyhodnotenie podielu synapsií označených na PSD akýmkoľvek počtom častíc PEG. Dokonca aj synapsie označené iba časticami PEG 1 boli považované za značené na základe predchádzajúcej práce preukazujúcej špecifickosť postupu GluR1-PEG (Nedelescu a kol., 2010). Účinky liečby na proporciu a úroveň imunoznačenia GluR1 sa analyzovali jednocestnou ANOVA s plánovanými post hoc porovnaniami (Fisher's LSD). Aby sa eliminovala experimentálna zaujatosť, údaje boli trojito zaslepené: jeden experimentátor vykonával sacharózový výcvik a uchovával záznamy o zvieratách v troch testovaných skupinách, druhý experimentátor vytvoril elektrónové mikrografy a každému mikrografu pridelil nový alfanumerický kód a kód udržal zapečatený a tri ďalšie experimenty skenovali mikrografy a kvantifikované PEG častice. Po dokončení kvantifikácie PEG sa experimentátori zvolali, aby odhalili identity každého mikrografu.

Implantácia kanyly a intrakraniálne injekcie

Na dodanie Naspm a APV do jadra accumbens sa použila intrakraniálna injekcia. Pre implantáciu kanyly, ako je opísané vyššie (Carr a kol., 2010) sa potkany hlboko anestetizovali ketamínom (100 mg / kg ip) a xylazínom (10 mg / kg ip) a po operácii sa injekčne podali analgetický benamín (1 mg / kg subkutánne). Potkanom sa stereotaxicky implantovali dve vodiace kanyly meradla 26 (PlasticsOne, Roanoke, VA), bilaterálne v jadre accumbens so súradnicami: 1.6 mm pred bregmou; 2.9 mm laterálne k sagitálnej stehu, špičky sklonené 8 ° k stredovej línii, 5.6 mm ventrálne k povrchu lebky. Kanyly boli držané na mieste dentálnym akrylom a priechodnosť bola udržiavaná oklúznym styletom. Na intrakraniálne injekcie sa roztoky Naspm a APV naplnili do dvoch trubičiek PE-30 s dĺžkou 50 cm pripojených na jednom konci k injekčným striekačkám Hamilton naplneným destilovanou vodou a na druhom konci do injekčných kanyl meradla 25, ktoré predĺžili 31 mm za implantované vodiace lišty. Injekčné striekačky boli namontované na dvojitých držiakoch mikrolitrovej injekčnej pumpy Harvard 2.0, ktorá dodáva injekčné objemy 2272 μl po dobu 0.5 s. Jednu minútu po dokončení injekcie boli injekčné kanyly odstránené z vodidiel, boli vymenené mandrety a zvieratá boli umiestnené do komôr na testovanie lokomotorov na výcvik na sacharózu. Po usmrtení zvierat boli kryogénne rezy mozgu analyzované na lokalizáciu kanyly; 100 zo zvierat 2 bol vylúčený zo štúdie z dôvodu nesprávneho umiestnenia kanyly.

Štatistická analýza

Na elektrónovú mikroskopiu, imunocytochémiu a biotinylačné experimenty sa použila jednosmerná ANOVA nasledovaná Fisherovými post hoc testami. Na elektrofyziológiu sa použili dvojstranné Studentove t-testy. Pre experimenty s hyperaktivitou sacharózy sa použili dvojsmerné ANOVA a následne Fisherove post hoc testy.

VÝSLEDKY

Charakterizácia paradigmy požitia sacharózy

Použili sme paradigmu požitia sacharózy na skúmanie účinkov prirodzenej, orosenzorickej odmeny na synaptický prenos (Obrázok 1A). Dospelé samce potkanov boli prepravené do testovacej miestnosti tri po sebe nasledujúce dni. Na štvrtý deň (prvý deň tréningu) boli potkany umiestnené do komory na meranie lokomotora. Po 15 minútach merania pohybovej aktivity v komore boli do meracích komôr zavedené fľaše obsahujúce buď vodu (pre vodné zvieratá) alebo 25% roztok sacharózy (pre zvieratá zo sacharózy) cez otvory vo veku komory. Fľaše sa vybrali po 5 minútach a pohybová aktivita sa merala ďalších 15 minút predtým, ako sa zvieratá vrátili do domácich klietok. Tento postup sme zopakovali počas nasledujúcich 7 dní. V niektorých experimentoch bol tréning sacharózy rozšírený na 8th deň. Tento krátky, nepredvídaný prístup k vysoko chutnému roztoku nám umožnil skúmať akútne aj kumulatívne účinky príjmu sacharózy, pretože zvieratá spoľahlivo absorbovali sacharózu počas prístupového okna do troch dní od tréningu (Obrázok 1B). Tieto experimentálne podmienky umožnili porovnanie testovaných skupín bezprostredne po ukončení užívania. Naším kritériom na zahrnutie do štúdie bolo, že potkany začnú konzumovať najmenej jeden gram sacharózy počas obdobia prístupu do troch dní od začiatku výcviku; na základe tohto kritéria neboli zo štúdie vylúčení žiadne zvieratá.

Obrázok 1  

Opakované požitie sacharózy spôsobuje prechodné zvýšenie spontánnej lokomócie.

Zistili sme, že do troch dní od tréningu zvieratá sacharózy spotrebovali podstatne viac roztoku sacharózy ako voda spotrebovali vodu (Obrázok 1B). Okrem toho, zatiaľ čo v tréningových dňoch 1 – 6 (údaje nie sú uvedené) neboli pozorované žiadne významné rozdiely v spontánnej lokomócii (údaje nie sú uvedené), pozorovali sme významné zvýšenie celkovej vzdialenosti prejdenej u zvierat so sacharózou v porovnaní s vodnými zvieratami za tri minúty po vybratí fľaše v deň 7 (Obrázok 1D) a tento rozdiel sa vyskytol aj v deň 8 (Obrázok 1E). Počas troch minút pred zavedením fľaše v ktorýkoľvek z testovacích dní neboli pozorované žiadne rozdiely v celkovej prejdenej vzdialenosti medzi zvieratami s vodou a sacharózou.Obrázok 1C), naznačujúce, že zvýšená pohybová aktivita bola skôr akútnou reakciou na požitie sacharózy pre potkanov trénovaných na sacharózu, než podmienenou reakciou na lokomotorickú komoru. V súlade s touto možnosťou existuje významná pozitívna korelácia medzi množstvom spotrebovanej sacharózy a celkovou ubehnutou vzdialenosťou (Obrázok 1F). Medzi skupinami sacharózy a vody nebol pred alebo po tréningových dňoch 7 žiadny rozdiel vo hmotnosti zvierat (údaje nie sú uvedené).

Požitie sacharózy indukuje začlenenie CPAR

Sacharózový tréning v posledný tréningový deň viedol k prechodnému zvýšeniu pohyblivosti. Aby sme určili, či tento dôsledok požitia sacharózy bol sprevádzaný elektrofyziologickými zmenami v nucleus accumbens, regióne, ktorý reguluje správanie pri odmeňovaní, pripravili sme plátky nucleus accumbens bezprostredne po vybratí fľaše v deň 7 a zaznamenali sa z neurónov jadra accumbens (Obrázok 2A). Jadro podoblasti sa podieľa na lokomotorických reakciách na odmeňujúce stimuly (Sesack a Grace, 2010). Zistili sme, že tak amplitúda, ako aj frekvencia spontánnych miniatúrnych excitačných postsynaptických prúdov (mEPSC) boli podstatne väčšie v jadre accumbens zvierat sukrózy v porovnaní s vodnými zvieratami (Obrázok 2B). To demonštrovalo, že opakovaná konzumácia sacharózy by mohla pozitívne regulovať synaptický prenos v jadre accumbens. Aby sme určili, či začlenenie CPAR hrá úlohu pri potencii po sacharóze, stanovili sme indexy rektifikácie pre accumbens core neurons meraním EPSC pri rôznych membránových potenciáloch (Obrázky 2C, 2D a 2E). CPARs dovnútra usmerňujú depolarizované potenciály kvôli endogénnej polyamínovej blokáde. Pozorovali sme významnú rektifikáciu v záznamoch z neurónov zvierat sacharózy, čo naznačuje nelinearita vo vzťahu I / V v porovnaní s vodnými zvieratami (Obrázok 2E), okrem výrazného zvýšenia indexu korekcie (Obrázok 2F).

Obrázok 2  

Po opakovanom požití sacharózy sú zosilnené jadrové synapsie Accumbens.

Na potvrdenie zvýšenia hladín CPAR iným spôsobom sme zaznamenali z jadrových neurónov accumbens po zahrnutí špecifického blokátora CPAR, 1-naftylacetylového spermínu (Naspm) do kúpeľa. Zistili sme, že Naspm významne znížil amplitúdu EPSC v záznamoch z neurónov zo sacharózy, ale nie z vodných živočíchov (Obrázky 3A – C). Okrem toho po liečbe Naspm sa vzťah I / V v neurónoch zo sukróznych zvierat stal lineárnym, čo odráža inhibíciu CPAR v sacharózových synapsiách zvierat, zatiaľ čo po ošetrení Naspm v neurónoch z vodných živočíchov nebol pozorovaný žiadny významný účinok na vzťah I / V (Obrázky 3D). Tieto výsledky ukazujú, že opakované požitie sacharózy indukuje začlenenie CPAR do synapsií jadra accumbens.

Obrázok 3  

Požitie sacharózy spôsobuje zabudovanie Ca2 + -priepustných AMPA receptorov.

Požitie sacharózy indukuje obchodovanie s GluA1om

CPAR sú receptory AMPA, ktorým chýba podjednotka receptora GluA2 AMPA. Synaptická inkorporácia CPAR tak najčastejšie zahŕňa obchodovanie s podjednotkou GluA1 závislou od synaptickej aktivity (He a kol., 2009; Isaac a kol., 2007; Liu a Zukin, 2007; Plant a kol., 2006). Aby sa potvrdilo začlenenie synaptickej CPAR po tréningu v sacharóze, skúmali sme, či príjem sacharózy zvyšuje synaptickú expresiu GluA1. Potkanom sa poskytol prístup k sacharóze, ako je opísané vyššie, po dobu nasledujúcich 7. V dňoch 1, 3, 5 a 7 sme izolovali frakcie celých buniek, synaptozómu a postsynaptickej hustoty (PSD) z troch oblastí mozgu: accumbens jadro (core), accumbens shell (shell) a somatosenzorická kôra (cortex). Analyzovali sme celú bunkovú a PSD frakcie pomocou Western blotu na expresiu GluA1 a GluA2.

V testovaných dňoch sme nenašli žiadne zmeny v GluA1 alebo GluA2 v celých bunkových frakciách accumbens lyzátov, čo naznačuje, že opakovaná konzumácia sacharózy nereguluje celkové hladiny týchto proteínov (Obrázky 4A – C). Vo frakciách PSD accumbens sa však GluA1 významne zvýšil v deň 7 v jadre, ale nie v škrupine, zatiaľ čo GluA2 sa významne nezmenil ani v jednej frakcii (Obrázky 4D – 4F a údaje nie sú zobrazené). V predchádzajúcich testovacích dňoch sme nezaznamenali významné zvýšenie GluA1 v jadrách PSD podľa accumbens (Obrázky 4D – F) a GluA1 alebo GluA2 sa nezmenili vo frakciách PSD kôry v žiadnom z testovacích dní (údaje nie sú uvedené). Zvýšený GluA1, najmä v porovnaní s GluA2, v PSD jadra accumbens po opakovanom požití sacharózy je v súlade so zvýšenou rektifikáciou pozorovanou v jadrových neurónoch accumbens, ako je opísané vyššie.

Obrázok 4  

Postsynaptická hustota GluA1, ale nie GluA2, sa po požití sacharózy zvyšuje v jadre accumbens.

Ukázalo sa, že obchodovanie s GluA1 závislé od aktivity prispieva k synaptickej plasticite in vitro a tiež in vivo (Lu a Roche, 2011). Bol preukázaný rýchly viacstupňový mechanizmus obchodovania s GluA1 in vitro (Serulle a kol., 2007; Sun a kol., 2008; Sun a kol., 2005). Doteraz však príspevok tohto viacstupňového mechanizmu k synaptickej akumulácii GluA1 in vivo nebol testovaný. Aby sa určilo, či tréning sacharózy indukuje akútne obchodovanie s GluA1 prostredníctvom viacstupňového mechanizmu, lokalizovali sme GluA1 v jadre accumbens synapsie zvierat trénovaných na sacharózu a vodu pomocou kvantitatívnej elektrónovej mikroskopie. Jadrové tkanivo Accumbens bolo odobraté siedmy deň cvičenia na sacharóze z testovaných skupín potkanov 3. Boli to potkany, ktoré: 1) konzumovali vodu po dobu 7 dní (voda), 2) konzumovali sacharózu počas 7 dní (sacharóza), a 3) konzumovali sacharózu počas 6 dní a vodu v deň 7 (sacharóza / voda). Potkany sa usmrtili na 7th deň, 5 minút po konzumácii sacharózy alebo vody. Porovnanie dvoch testovaných skupín, zvierat Sacharóza / Voda a Sacharóza, medzi sebou navzájom a Zvieratami vody teda odhalilo časové obdobie postsynaptických zmien vyvolaných spotrebou sacharózy u potkanov trénovaných na sacharózu. Merali sme pozmenený imunogold (PEG) značený GluA1 v 5 rôznych postsynaptických kompartmentoch: dendritický chrbtový cytosol (intraspinózny), extrasynaptická plazmatická membrána (membrána), PSD blízko PSD a synaptická štrbina, pričom posledné tri kompartmenty boli zoskupené ako 'PSD „(Obrázok 5A). Aby sa eliminovala predpojatosť experimentátora, boli trojnásobne zaslepené identity testovacích skupín elektrónových mikroskopov.

Obrázok 5  

Elektrónová mikroskopia odhalí indukciu viacstupňového obchodovania s GluA1 požitím sacharózy.

Zvieratá zo sacharózy aj zo sacharózy / vody vykazovali významne zvýšené intraspinózne GluA1 v porovnaní s vodnými zvieratami (Obr. 5B a 5C). To naznačuje, že chronická spotreba sacharózy zvyšuje intracelulárny pool AMPA receptorov obsahujúcich GluA1 susediacich so synaptickými miestami, receptory, ktoré môžu byť ľahko dostupné pre synaptické obchodovanie, a čo je dôležité, že tento intracelulárny pool môže pretrvávať 24 hodiny po konečnej spotrebe sacharózy. , Potom sme preskúmali významnú otázku, či akútny stimul sacharózy môže vyvolať rýchle obchodovanie s GluA1. Zistili sme, že extrasynaptická plazmatická membrána GluA1 bola významne zvýšená u zvierat so sacharózou v porovnaní so zvieratami so sacharózou / vodou a vodou (Obrázky 5B a 5D). Toto pozorovanie naznačuje, že prirodzená orosenzorická odmena poskytnutá jediným stimulom sacharózy môže rýchlo (<5 min), ale prechodne (doba rozpadu <24 h) zvýšiť extrasynaptickú populáciu AMPA receptorov obsahujúcich GluA1, čím sa vytvorí labilná zásoba, z ktorej sa receptory dostávajú. môže prevádzkovať synapsu.

Je príznačné, in vitro Štúdie naznačujú, že synaptické začlenenie AMPA receptorov sa uskutočňuje v krokoch 2. V prvom prípade fosforylácia Ser 845-dependentného na glutamáte alebo dopamíne zvyšuje hladiny receptorov na extrasynaptických miestach v plazmatickej membráne (Esteban a kol., 2003; Serulle a kol., 2007; Sun a kol., 2008; Sun a kol., 2005), zatiaľ čo v druhom prípade Ser 818 fosforylácia podporuje synaptické začlenenie (Boehm a kol., 2006). Naše porovnanie elektrónovej mikroskopie zvierat so sacharózou so sacharózou / vodou a vodou preukázalo, že sa pozoroval prvý krok obchodovania s GluA1om. in vitro (Makino a Malinow, 2009), dochádza tiež k rýchlemu transportu na extrasynaptickú membránu in vivo po poskytnutí orosenzorickej odmeny.

V súlade s vyššie opísanou elektrofyziológiou a biochemickými výsledkami PEG EM demonštroval, že príjem sacharózy tiež indukoval druhý krok v obchodovaní s GluA1 vstupom receptora GluA1 do synapsie, pretože úroveň imunoreaktivity GluA1 pri PSD bola významne vyššia pre sacharózu v porovnaní s vodnými potkanmi, a tam bol trend k zvýšeniu GluA1 v sacharóze / vode v porovnaní s vodou potkanov (Obrázky 5B a 5E). Zvýšenie zvierat so sacharózou / vodou je v súlade buď s rýchlou inkorporáciou GluA1, ktorá sa rozpadá so synaptickým polčasom ~ 24 h, alebo s rýchlou inkorporáciou GluA1 a nahradením za synaptickú GluA1 / 2 v podobnom časovom období. Percentuálny podiel synapsií exprimujúcich GluA1 v PSD bol tiež významne vyšší u potkanov sacharózy v porovnaní s vodnými potkanmi (Obrázok 5F), čo naznačuje, že GluA1 sa obchodoval so synapsiami, ktoré predtým GluA1 nemali. To tiež naznačuje, že zvýšenie amplitúdy mEPSC pozorované u potkanov sacharózy je výsledkom zvýšenia synaptického GluA1 a že zvýšenie frekvencie mEPSC môže byť výsledkom náboru GluA1 do predtým tichých synapsií accumbens, aj keď nemožno vylúčiť potenciáciu uvoľňovania glutamátu. Tiež sme merali počet synapsií v každej z troch testovacích skupín, aby sme určili, či požitie sacharózy vyvolalo synaptogenézu; medzi tromi testovanými skupinami neboli žiadne rozdiely (údaje nie sú uvedené). Dospeli sme k záveru, že opakované požitie sacharózy zvyšuje stabilnú (> 24 hodín) intraspinálnu zásobu GluA1 a jediný sacharózový stimul pre potkana trénovaného na sacharózu (6 dní) je dostatočný na rýchle (5 minút) zvýšenie GluA1 v extrasynaptickej plazmatickej membráne, potenciálne čerpanie receptorov z intraspinóznej skupiny. Navrhujeme, aby časť týchto extrasynaptických receptorov bola stabilne zabudovaná do PSD, čo vedie k pozorovanému indexu korekcie a zmenám PSD GluA1, predtým, ako sa extrasynaptická skupina vráti k základnej hodnote 24 hodín po stimulácii. Tieto výsledky ukazujú, že prirodzená odmena môže akútne vyvolať rýchle obchodovanie s GluA1 s trénovaným zvieraťom.

Aktivita CPAR je potrebná pre zvýšenú pohyblivosť po požití sacharózy

Stredne ostnaté neuróny prijímajú dopaminergné aj glutamatergické vstupy (Calabresi a kol., 1992). Aby sa vyhodnotila účasť glutamátovej signalizácie na zvýšenej spontánnej lokomócii, ktorú sme pozorovali po požití sacharózy u potkanov vyškolených v sacharóze, implantovali sme kanyly do jadra potkanov accumbens a vycvičili sme zvieratá v komorách na meranie pohybového ústrojenstva, ako je opísané vyššie. V deň 8 tréningu sacharózy sme mikroinjektovali Naspm do jadra pred umiestnením do testovacej komory lokomotora. Injekcia znížila celkovú prejdenú vzdialenosť zvierat so sacharózou a eliminovala rozdiel medzi zvieratami so sacharózou a vodou, ktoré sa pozorovali bezprostredne po vybratí fľaše (Obrázok 6A). Na overenie toho, že stres spôsobený manipuláciou so zvieratami neovplyvnil sacharózovú odpoveď, sme nasledujúci deň (deň 9 tréningu sacharózy) vstrekli fyziologický roztok; Ihneď po vybratí fľaše sa u zvierat so sacharózou pozorovala významná hyperaktivita (Obrázok 6B). To dokazuje, že Naspm špecificky inhiboval zvýšenie lokomócie vyvolané sacharózou. Injekcia NMDAR antagonistu, APV, do jadra v nasledujúcich dňoch tiež eliminovala rozdiel medzi zvieratami so sacharózou a vodou (Obrázok 6C), ktoré preukazujú, že NMDAR sú potrebné aj na zvýšenie spontánnej lokomócie po požití sacharózy. Za účelom stanovenia, či podmienená reakcia na testovaciu komoru zohrala úlohu pri indukcii hyperaktivity, boli zvieratá umiestnené do komory na 35 min bez zavedenia fľaše; neboli pozorované žiadne rozdiely v prejdenej vzdialenosti medzi sacharózou a vodnými zvieratami (Obrázok 6D). Naspm a APV neovplyvňovali spotrebu sacharózy (Obrázok 6E), čo dokazuje, že základné CPAR a NMDAR nie sú potrebné na intenzívny príjem sacharózy. Zvieratá, v ktorých kanyly neboli umiestnené do jadra accumbens (2 zo zvierat 15), hodnotené po usmrtení (Obrázok 6F), neboli zahrnuté do štúdie. Záverom tieto dáta spoločne dokazujú, že konzumácia sacharózy u potkanov trénovaných na sacharózu indukuje synaptické obchodovanie s GluA1 za 5 minút a že blokáda signálnych mechanizmov, ktoré kontrolujú toto obchodovanie, zabraňuje zvýšeniu spontánnej lokomotorickej aktivity po sacharóze.

Obrázok 6  

Zvýšená spontánna pohyb po požití sacharózy vyžaduje CPAR a NMDAR.

Možno predpokladať dve cesty signalizácie sacharózy. Jedna, prísne chemosenzorická alebo orosenzorická cesta, sa iniciuje väzbou sacharózy k receptoru sladkej chuti, čo zodpovedá heteromérnemu receptorovému komplexu spojenému s heteromérnym G, T1R2 / T2R3 (Kitagawa a kol., 2001; Max a kol., 2001; Nelson a kol., 2001; Sainz a kol., 2001). Živiny bohaté na kalórie môžu tiež regulovať funkciu mozgu metabolickými cestami nezávisle od chuti, hoci mechanizmy nie sú dobre známe (de Araujo a kol., 2008). Aby sme rozlíšili tieto dve alternatívy pre cestu obchodovania s GluA1 indukovanú sacharózou, opakovali sme tréningový protokol s tromi skupinami potkanov (4 potkany / skupina), ktorým bol umožnený prístup 5 minút do fliaš obsahujúcich vodu, 25% roztok sacharózy. alebo 3% sacharín (sladký a nízky). Fľaše sa vybrali a potkany zostali v tréningovej klietke dlhšie 15 minút. Tréning sa opakoval 7 dní. Objemy tekutín spotrebovaných testovanými skupinami pre sacharózu a sacharín sa navzájom významne nelíšili a obidve boli väčšie ako spotreba vodnou skupinou, čo je v súlade s odmenou obidvoch sladkých látok (Obrázok 7A). V deň pitia 7, ihneď po vybratí fľaše, sa potkany usmrtia, odoberie sa jadro tkaniva accumbens a zhromaždí sa pre každú testovanú skupinu, izoluje sa PSD frakcia a hladiny GluA1 sa testujú pomocou Western blotu (Obrázok 7B). Ako predtým, zvieratá, ktoré konzumovali sacharózu, vykazovali zvýšené množstvo GluA1 vo frakcii PSD v porovnaní s vodnou skupinou (Obrázok 7C). Je dôležité, že GluA1 bol tiež zvýšený vo frakcii PSD zvierat, ktoré konzumovali sacharín. Nebol žiadny významný rozdiel v hladinách GluA1u v celých bunkových frakciách z accumbens jadra vody, sacharózy a sacharínu, čo naznačuje, že zvýšenie GluA1 bolo špecifické pre synaptickú frakciu (Obrázok 7D). Pretože sacharín stimuluje rovnaký komplex receptorov chuti spojený s heteromérnym G proteínom ako sacharóza (Masuda a kol., 2012; Nelson a kol., 2001), ale chýba jej kalorická hodnota, dospeli sme k záveru, že stimulácia receptora sladkej chuti je dostatočná na iniciáciu signalizácie, ktorá zvyšuje hladiny GluA1 v jadre accumbens core synapses.

Obrázok 7  

Sacharínový tréning indukuje zvýšenie synaptického GluA1u podobne ako pri sacharózovom tréningu.

Diskusia

Ukázali sme, že orosenzorická odmena, opakovaná konzumácia sacharózy, môže akútne vyvolať synaptické začlenenie GluA1 prostredníctvom skôr opísaného mechanizmu obchodovania s viacerými krokmi. in vitro. Opakovaná spotreba sacharózy počas 6 - 7 dní zosilňovala elektrofyziologické jadro synapsií vložením CPAR. Tento účinok bol sprevádzaný akumuláciou GluA1, ale nie GluA2 v PSD jadra, a bol regionálne a časovo špecifický, pretože pred tréningovým dňom 7 v jadre neboli pozorované žiadne zmeny a v akumbensovom škrupine alebo v somatosenzorická kôra. Elektrónová mikroskopická analýza odhalila, že opakované požitie sacharózy zvýšilo relatívne stálu (t1/2 > 24 hodín) populácia intraspinóznych receptorov obsahujúcich GluA1. Sacharóza tiež rýchlo (5 minút) a prechodne (t1/2 <24 hodín) zvýšené hladiny receptorov obsahujúcich GluA1 na extrasynaptických miestach u zvierat trénovaných na sacharózu, čo zvyšuje populáciu AMPAR schopných laterálnej difúzie do synapsie. Synaptický GluA1, ako je zastúpený frakciou PSD, tak ako bol detegovaný PEG-EM, bol významne zvýšený v sacharóze v porovnaní s vodnými zvieratami. Z týchto výsledkov navrhujeme, aby bol predtým opísaný dvojstupňový mechanizmus extrasynaptickej exocytózy nasledovaný synaptickým transportom pre synaptickú inzerciu AMPAR. in vitro (Boehm a kol., 2006; Makino a Malinow, 2009; Oh a kol., 2006; Serulle a kol., 2007; Sun a kol., 2005) je možné spustiť rýchlo in vivo prirodzenou orosenzorickou odmenou.

Zmeny v synaptických hladinách GluA1u sa pozorovali až po školeniach 7, čo naznačuje, že na potenciaciu je potrebný niekoľko denný proces. V biochemických experimentoch in vivo, v dňoch 1, 1 a 3 sacharózy sme nezaznamenali výrazné zvýšenie základných hladín PSD GluA5 accumbens; iba po 7 dňoch sacharózy bol GluA1 v PSD významne zvýšený. Pri experimentoch s elektrónovou mikroskopiou sme pozorovali, že zvieratá zo sacharózy / vody, ktoré boli trénované na sacharózu po dobu 6 dní, ale nedostali stimul sacharózy do 24 hodín, vykazovali trend k zvýšeniu PSD GluA1. Tieto zvieratá tiež vykazovali zvýšený intraspinózny GluA1 v porovnaní s vodnými zvieratami, ale nepozorovala sa žiadna zmena v extrasynaptickej membráne GluA1. Z týchto výsledkov vyvodzujeme tri závery. Po prvé, AMPA receptory obsahujúce GluA1 sa akumulujú intraspinózne s následnou stimuláciou sacharózou. Vzhľadom na to, že predchádzajúce štúdie preukázali, že požitie sacharózy indukuje uvoľňovanie dopamínu v accumbens (Cacciapaglia a kol., 2012; McCutcheon a kol., 2012; Rada et al., 2005) a že D1R môžu riadiť lokálny preklad GluA1 v dendritoch (Smith a kol., 2005), uvoľňovanie dopamínu po požití sacharózy môže spustiť lokálnu syntézu GluA1, ktorá vedie k intraspinóznej akumulácii GluA1. Intraspinózne zvýšenie môže odrážať transport GluA1u z distálnych miest. Je pravdepodobné, že exocytotické transportovanie z tohto zvýšeného intraspinózneho poolu prispieva k extrasynaptickému poolu v plazmatickej membráne. Po druhé, pozorovanie zvýšenia extrasynaptickej membrány GluA1 v sacharóze, ale nie u zvierat so sacharózou / vodou alebo vodou naznačuje, že extrasynaptické receptory sa buď pohybujú druhým krokom do synapsie alebo sú endocytované v 24 h po konzumácii sacharózy, čím sa prechodný extrasynaptický bazén. Po tretie, zvýšenie obsahu sacharózy u zvierat PSD GluA1 v porovnaní s vodnými živočíchmi, ale nie u zvierat so sacharózou / vodou, tiež naznačuje, že po každom stimulácii sacharózy sa receptory pohybujú bočne do synapsie zo skupiny receptorov, ktoré sa rýchlo dopravujú na extrasynaptickú plazmatickú membránu. Nemôžeme vylúčiť, že GluA1 sa prepravuje priamo z intraspinózneho fondu do synapsie. Takáto cesta sa však zdá nepravdepodobná vzhľadom na štúdie, ktoré ukazujú, že GluA1 sa vkladá extrasynapticky (Boehm a kol., 2006; Makino a Malinow, 2009; Oh a kol., 2006; Serulle a kol., 2007; Sun a kol., 2005). Tieto objavy predstavujú prvú demonštráciu, že bol pozorovaný časový priebeh obchodovania s GluA1 (<5 min) a dráha in vitro sú tiež pozorované in vivo, Naše výsledky okrem toho naznačujú, že stimuly s opakovaným odmeňovaním modifikujú kapacitu na zosilnenie synapsie zvýšením zásoby intraspinóznych receptorov, s ktorými je možné obchodovať.

Pretože sacharín indukuje obchodovanie s GluA1om podobne ako sacharóza, nie je potrebný kalorický obsah sacharózy. Sacharín stimuluje rovnaký receptor sladkej chuti, T1R2 / T2R3, ako sacharózu. (Masuda a kol., 2012; Nelson a kol., 2001), saktivácia tohto receptora pravdepodobne iniciuje inkorporáciu GluA1 do MSN synapsií. Sacharóza zvyšuje uvoľňovanie dopamínu v akumbénoch z neurónov VTA (Cacciapaglia a kol., 2012; McCutcheon a kol., 2012; Rada et al., 2005) lOkrem obchodovania s povrchom GluA1. Cesta, ktorá spája receptor sladkej chuti s VTA, bude teda pravdepodobne ústredná pre študovanú plasticitu.

Je pravdepodobné, že rýchle obchodovanie s GluA1 po požití sacharózy hrá úlohu pri regulácii spontánnej lokomócie. U zvierat trénovaných na sacharózu skutočne inhibícia CPAR zabránila zvýšeniu spontánnej lokomotorickej aktivity bezprostredne po požití sacharózy. Celková vzdialenosť prekonaná potkanmi po spotrebe sacharózy meraná v nasledujúcich dňoch bola významne zvýšená iba na obdobie 3 min bezprostredne po konzumácii sacharózy na siedmy deň tréningu. Zvýšená aktivita bezprostredne po sacharóze sa pozorovala od 3 dňa tréningu, ale až do dňa 7 sa významne nelíšila. Tento časový priebeh aktivity koreluje s časovým priebehom akumulácie GluA1 v accumbens jadrových dendritoch, Zvýšená pohyblivosť bola funkčným dôsledkom obchodovania s CPAR na MSN synapsie v jadre accumbens, pretože injekcia Naspm do jadra inhibovala zvýšenie aktivity. Prevencia zvýšenej lokomócie inhibítorom NMDA receptora ukázala, že glutamátová signalizácia prostredníctvom NMDA receptorov, ako aj CPAR, bola nevyhnutná na zvýšenie lokomotorickej aktivity. Požitie sacharózy však nebolo ovplyvnené blokádou glutamátovej signalizácie, v súlade s predchádzajúcimi štúdiami, ktoré preukazujú, že accumbensovo jadro je zapojené do orchestrácie motorických reakcií súvisiacich s orosenzorickou odmenou, ale nie so samotnou spotrebou (Smith, 2004). Podobný časový priebeh vývoja hyperlokomócie bol zaznamenaný pre vývoj podmienenej hyperaktivity u zvierat kŕmených ich denným jedlom v charakteristickom prostredí (Matthews a kol., 1996). Keby však súčasná reakcia bola podmienenou hyperaktivitou vyplývajúcou z párovania kontextu a sacharózy, predchádzalo by to dodaniu sacharózy, čo nebolo pozorované. Je možné, že subjekty vykazujú prieskumné vzrušenie. Bolo by potrebné vykonať ďalšie experimenty, aby sa rozlíšilo, či zvýšená pohyblivosť po požití sacharózy je vzrušením z prieskumu na rozdiel od formy motorickej senzibilizácie alebo iného správania. V každom prípade zvýšenie spontánnej lokomócie vyžadovalo glutamátovú signalizáciu a bolo výsledkom, aspoň sčasti, zavedením CPAR do jadra accumbens.

Zvýšená lokomotorická aktivita po požití sacharózy môže vyplývať priamo z pozorovaného zosilnenia synapsií jadra accumbens, pretože zvýšený výstup z priamej dráhy bazálnych ganglií podporuje lokomóciu prostredníctvom potlačenia motorického talamu (Sesack a Grace, 2010). Tpotencoval synapsie, ktoré s najväčšou pravdepodobnosťou sídlia na priamej dráhe podľa jadrových neurónov, ktoré exprimujú D1R. Zosilnenie synapsií neurónov s priamou dráhou by malo za následok, keby aktivita D1R indukovala obchodovanie s AMPAR obsahujúcimi GluA1 za účelom synapsií v týchto neurónoch po robustnom uvoľnení dopamínu. Výsledná potenciácia by zvýšila aktivitu pri inhibičných projekciách neurónov s priamou dráhou na výstupné jadrá bazálnych ganglií, čím by sa potlačila motorická talamus a podporovala aktivita motorickej kôry (Gerfen a Surmeier, 2011; Kravitz a kol., 2010; Sesack a Grace, 2010). Synaptické zosilnenie pozorované po opakovanom požití sacharózy sa pravdepodobne vyskytuje konkrétne v neurónoch s priamou cestou, pretože dopamín pôsobiaci prostredníctvom receptora D1 môže indukovať fosforyláciu GluA1 S845, čo vedie k obchodovaniu s povrchom.

Niekoľko štúdií skúmalo účinky opakovanej stimulácie kokaínom s následným vysadením, čo je liečba, ktorá má výrazné účinky na funkciu systému odmeňovania a nakoniec vedie k senzibilizácii na kokaín, ktorá sa vyznačuje zvýšenou motorickou odpoveďou na kokaín, túžbou po drogách a relapsom. (Kalivas a kol., 1998). Opakovaná IP injekcia kokaínu počas 5 – 10 dní, po ktorej nasledovalo vysadenie, viedla k postupnému nárastu povrchových receptorov AMPA obsahujúcich GluA14 počas 2 dní. (Boudreau a kol., 2007; Kourrich a kol., 2007). Avšak v 45 dňoch od vysadenia po 10 d po samostatnom podaní sa pozorovalo veľké zvýšenie rektifikačného indexu u MSN potkanov. (McCutcheon a kol., 2011b) čo naznačuje zvýšenie CPAR. Obchodovanie s CPAR sa teda pozorovalo po požití sacharózy, v súčasnej práci a po samostatnom podaní kokaínu, aj keď za veľmi odlišných podmienok liečby.. Pretože nie sú známe okamžité následky podania alebo injekcie kokaínu (napr. V 5 minútach po ňom), nie je možné priamo porovnávať účinok kokaínu so súčasným pôsobením sacharózy. Podobne nie je známe, či CPAR pretrvávajú v MSN synapsiách zvierat trénovaných na sacharózu po ukončení tréningu na sacharózu, alebo či tieto zvieratá vykazujú senzibilizáciu na sacharózu po zdĺhavom stiahnutí.

Pochopenie toho, ako obohacujúce podnety regulujú plasticitu a správanie accumbens, sú rozhodujúce pre riešenie závislosti, hyperfágie, patologického hráčstva a iných porúch správania (Basar a kol., 2010; Berridge, 2009; Luscher a Malenka, 2011). Nadmerná spotreba cukru prispieva k epidémii obezity (Hu a Malik, 2010), a hoci je potenciálne podobný zneužívaniu drog (Avena a kol., 2008), jeho mechanizmus nebol podrobne preskúmaný. Súčasné zistenia zavádzajú základné prvky plasticity vyvolanej odmenou, z ktorej sa budúce štúdie môžu zaoberať reguláciou komplexného správania a potenciálne poskytujú nové cesty na riešenie patológií súvisiacich s odmeňovaním.

Poďakovanie

Ďakujeme členom Ziffovho laboratória, minulým aj súčasným, za technickú pomoc a užitočné diskusie, vrátane H. Girmy, L. Lee a Drs. B. Fernholz, B. Jordan, W. Lu, G. Rameau, S. Restituito a Y. Serulle. Táto práca bola podporená Národným ústavom pre duševné zdravie Predoctoral Fellowship F31MH76617-01 a NIH Training Grant 5T32DC000063 pre New York University Training Program in Neurosciences (DST), R01NS061920 od National Institute of Neurological Disorders and Stroke (EBZ), 1R21MH091445- 01 z Národného ústavu duševného zdravia a Úradu pre výskum zdravia žien, Grantový program nadácie Klarman Family Foundation vo výskume porúch stravovania, NYU's Research Challenge Fund a P30EY13079 (CA), grant Národného ústavu pre zneužívanie drog DA003956 a cena nezávislého vyšetrovateľa od NARSAD (KDC), Národný inštitút pre hluchotu a iné komunikačné poruchy, udeľuje RC009635 spoločnosti RCF a grant na počiatočnú akciu v Centre excelentnosti pre závislosť z New York University Langone Medical Center.

poznámky pod čiarou

Konflikt záujmov: Autori nevyhlasujú konkurenčné finančné záujmy.

Referencie

  1. Avena NM, Rada P, Hoebel BG. Dôkaz závislosti od cukru: behaviorálne a neurochemické účinky prerušovaného nadmerného príjmu cukru. Neurosci Biobehav Rev. 2008, 32: 20 – 39. [Článok bez PMC] [PubMed]
  2. Basar K, Sesia T, Groenewegen H, Steinbusch HW, Visser-Vandewalle V, Temel Y. Nucleus accumbens a impulzivita. Prog Neurobiol. 2010, 92: 533-557. [PubMed]
  3. Berridge KC. „Lajkanie“ a „chcenie“ odmeny za jedlo: mozgové substráty a úlohy pri poruchách stravovania. Fyziológia a správanie. 2009; 97: 537–550. [Článok bez PMC] [PubMed]
  4. Boehm J, Kang MG, Johnson RC, Esteban J, Huganir RL, Malinow R. Synaptická inkorporácia AMPA receptorov počas LTP je kontrolovaná fosforylačným miestom PKC na GluR1. Neurón. 2006, 51: 213-225. [PubMed]
  5. Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M, Wolf ME. Receptory AMPA na bunkovom povrchu v jadre potkana sa zvyšujú počas odoberania kokaínu, ale internalizujú sa po kokaínovej stimulácii v spojení so zmenenou aktiváciou mitogénom aktivovaných proteínkináz. J Neurosci. 2007, 27: 10621-10635. [Článok bez PMC] [PubMed]
  6. Brebner K, Wong TP, Liu L, Liu Y, Campsall P, Gray S, Phelps L, Phillips AG, Wang YT. Jadro pripisuje dlhodobú depresiu a prejav behaviorálnej senzibilizácie. Science. 2005, 310: 1340-1343. [PubMed]
  7. Cacciapaglia F, Saddoris MP, Wightman RM, Carelli RM. Diferenciálna dynamika uvoľňovania dopamínu v jadre pripisuje jadru a škrupine zreteľné aspekty správania orientovaného na cieľ pre sacharózu. Neurofarmakológia 2012 [Článok bez PMC] [PubMed]
  8. Calabresi P, Maj R, Pisani A, Mercuri NB, Bernardi G. Dlhodobá synaptická depresia v striate: fyziologická a farmakologická charakterizácia. J Neurosci. 1992, 12: 4224-4233. [PubMed]
  9. Carr KD, Chau LS, Cabeza de Vaca S, Gustafson K, Stouffer M, Tukey DS, Restituito S, Ziff EB. AMPA receptorová podjednotka GluR1 po stimulácii dopamínového receptora D-1 v jadre accumbens shell sprostredkuje zvýšenú hodnotu liekovej odmeny u potkanov s obmedzeným prístupom potravy. Neuroscience. 2010, 165: 1074-1086. [Článok bez PMC] [PubMed]
  10. Conrad KL, Tseng KY, Uejima JL, Reimers JM, Heng LJ, Shaham Y, Marinelli M, Wolf ME. Tvorba adnexumbens GluR2-chýbajúcich AMPA receptorov sprostredkováva inkubáciu kokaínu. Nature. 2008, 454: 118-121. [Článok bez PMC] [PubMed]
  11. Deň JJ, Carelli RM. Učenie nucleus accumbens a Pavlovian. Neurológ. 2007, 13: 148-159. [Článok bez PMC] [PubMed]
  12. de Araujo IE, Oliveira-Maia AJ, Sotnikova TD, Gainetdinov RR, Caron MG, Nicolelis MA, Simon SA. Odmena za jedlo pri absencii signalizácie receptora chuti. Neurón. 2008, 57: 930-941. [PubMed]
  13. Ehlers MD, Heine M, Groc L, Lee MC, Choquet D. Difúzne odchytávanie receptorov GluR1 AMPA pomocou vstupne špecifickej synaptickej aktivity. Neurón. 2007, 54: 447-460. [Článok bez PMC] [PubMed]
  14. Esteban JA, Shi SH, Wilson C, Nuriya M, Huganir RL, Malinow R. PKA fosforylácia podjednotiek AMPA receptora riadi synaptické obchodovanie so základnou plasticitou. Nat Neurosci. 2003, 6: 136-143. [PubMed]
  15. Gerfen CR, Surmeier DJ. Modulácia striatálnych projekčných systémov dopamínom. Ročné hodnotenie neurovedy. 2011, 34: 441-466. [Článok bez PMC] [PubMed]
  16. Grueter BA, Brasnjo G, Malenka RC. Postsynaptická TRPV1 spúšťa dlhodobú depresiu špecifickú pre bunkový typ v nucleus accumbens. Prírodná neuroveda. 2010, 13: 1519-1525. [Článok bez PMC] [PubMed]
  17. On K, Song L, Cummings LW, Goldman J, Huganir RL, Lee HK. Stabilizácia Ca2 + -priepustných AMPA receptorov v perisynaptických miestach fosforyláciou GluR1-S845. Proc Natl Acad Sci US A. 2009; 106: 20033 – 20038. [Článok bez PMC] [PubMed]
  18. Hu FB, Malik VS. Cukrom sladené nápoje a riziko obezity a cukrovky 2. typu: epidemiologické dôkazy. Fyziológia a správanie. 2010; 100: 47–54. [Článok bez PMC] [PubMed]
  19. Isaac JT, Ashby MC, McBain CJ. Úloha podjednotky GluR2 vo funkcii AMPA receptora a synaptickej plasticite. Neurón. 2007, 54: 859-871. [PubMed]
  20. Jordan BA, Fernholz BD, Boussac M, Xu C, Grigorean G, Ziff EB, Neubert TA. Identifikácia a overenie nových proteínov postsynaptickej hustoty hlodavcov. Mol Cell Proteomics. 2004, 3: 857-871. [PubMed]
  21. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J, Sorg BA. Úloha senzibilizácie pri túžbe a recidíve závislosti od kokaínu. J. Pharmacol. 1998, 12: 49-53. [PubMed]
  22. Kitagawa M, Kusakabe Y, Miura H, Ninomiya Y, Hino A. Molekulárna genetická identifikácia kandidátneho génu receptora pre sladkú chuť. Biochemický a biofyzikálny výskum. 2001, 283: 236-242. [PubMed]
  23. Kourrich S, Rothwell PE, Klug JR, Thomas MJ. Skúsenosť s kokaínom riadi obojsmernú synaptickú plasticitu v jadre accumbens. J Neurosci. 2007, 27: 7921-7928. [PubMed]
  24. Kravitz AV, Freeze BS, Parker PR, Kay K, Thwin MT, Deisseroth K, Kreitzer AC. Regulácia parkinsonovského motorického správania optogenetickou reguláciou obvodov bazálnych ganglií. Nature. 2010, 466: 622-626. [Článok bez PMC] [PubMed]
  25. LaPlant Q, Vialou V, Covington HE, 3rd, Dumitriu D, Feng J, Warren BL, Maze I, Dietz DM, Watts EL, Iniguez SD, a kol. Dnmt3a reguluje emocionálne správanie a plasticitu chrbtice v nucleus accumbens. Nat Neurosci. 2010, 13: 1137-1143. [Článok bez PMC] [PubMed]
  26. Liu SJ, Zukin RS. Ca2 + -propustné receptory AMPA v synaptickej plasticite a smrti neurónov. Trendy v neurovede. 2007, 30: 126-134. [PubMed]
  27. Lu W, Isozaki K, Roche KW, Nicoll RA. Synaptické zacielenie AMPA receptorov je regulované miestom CaMKII v prvej intracelulárnej slučke GluA1. Proc Natl Acad Sci US A. 2010; 107: 22266 – 22271. [Článok bez PMC] [PubMed]
  28. Lu W, Roche KW. Posttranslačná regulácia obchodovania s AMPA receptormi a ich funkcie. Aktuálny názor na neurobiológiu 2011 [Článok bez PMC] [PubMed]
  29. Luscher C, Malenka RC. Synaptická plasticita vyvolaná liečivom v závislosti od molekulárnych zmien až po prestavbu obvodu. Neurón. 2011, 69: 650-663. [Článok bez PMC] [PubMed]
  30. Začlenenie Makino H, Malinow R. AMPA do synapsií počas LTP: úloha laterálneho pohybu a exocytózy. Neurón. 2009, 64: 381-390. [Článok bez PMC] [PubMed]
  31. Mameli M, Halbout B, Creton C, Engblom D, Parkitna JR, Spanagel R, Luscher C. Synaptická plasticita vyvolaná kokaínom: perzistencia v VTA spôsobuje prispôsobenie v NAc. Nat Neurosci. 2009, 12: 1036-1041. [PubMed]
  32. Masuda K, Koizumi A, Nakajima K, Tanaka T, Abe K, Misaka T, Ishiguro M. Charakterizácia spôsobov väzby medzi ľudským receptorom sladkej chuti a nízkomolekulárnymi sladkými zlúčeninami. PloS one. 2012, 7: e35380. [Článok bez PMC] [PubMed]
  33. Matthews K, Wilkinson LS, Robbins TW. Opakované materské oddeľovanie preweanlingových potkanov zmierňuje behaviorálne reakcie na primárne a podmienené stimuly. Physiol Behav. 1996, 59: 99-107. [PubMed]
  34. Max M, Shanker YG, Huang L, Rong M, Liu Z, Campagne F, Weinstein H, Damak S, Margolskee RF. Tas1r3, kódujúci nový kandidátsky chuťový receptor, je alelický pre lokus Sac. Prírodná genetika. 2001, 28: 58-63. [PubMed]
  35. McCutcheon JE, Beeler JA, Roitman MF. Sacharóza-prediktívne narážky vyvolávajú väčšie fázové uvoľňovanie dopamínu ako sacharín-predpovedajúce narážky. Synapsie. 2012, 66: 346-351. [Článok bez PMC] [PubMed]
  36. McCutcheon JE, Wang X, Tseng KY, Wolf ME, Marinelli M. Vápnikovo priepustné receptory AMPA sú prítomné v synapsiách nucleus accumbens po dlhšom ukončení samoaplikácie kokaínu, ale nie kokaínom podávaným experimentom. Žurnál neurovedy: Úradný vestník Spoločnosti pre neurovedy. 2011; 31: 5737-5743. [Článok bez PMC] [PubMed]
  37. McCutcheon JE, Loweth JA, Ford KA, Marinelli M, Wolf ME, Tseng KY. Aktivácia mGluR skupiny I zvracia kokaínom indukovanú akumuláciu AMPA receptorov priepustných pre vápnik v jadrových accumbenssynapsách prostredníctvom mechanizmu závislého od proteínkinázy C. J Neurosci. 2011b; 31: 14536-14541. [Článok bez PMC] [PubMed]
  38. Nedelescu H, Kelso CM, Lazaro-Munoz G, Purpura M, Kain CK, Ledoux JE, Aoki C. Endogénne AMPA receptory obsahujúce GluR1 sa translokujú do asymetrických synapsií v laterálnom amygdale počas skorej fázy tvorby strachu: elektrónový mikroskopický imunocytochemikál študovať. Žurnál porovnávacej neurológie. 2010, 518: 4723-4739. [Článok bez PMC] [PubMed]
  39. Nelson G, Hoon MA, Chandrashekar J, Zhang Y, Ryba NJ, Zuker CS. Cicavčie receptory sladkej chuti. Bunka. 2001, 106: 381-390. [PubMed]
  40. Oh MC, Derkach VA, Guire ES, Soderling TR. Prenos extrasynaptickej membrány regulovaný fosforyláciou serínu 1 GluR845 serínom 2006 aktivuje receptory AMPA pre dlhodobú potenciáciu. J Biol Chem. 281, 752: 758-XNUMX. [PubMed]
  41. Pascoli V, Turiault M, Luscher C. Zvrátenie synaptického zosilnenia vyvolaného kokaínom resetuje adaptívne správanie vyvolané drogami. Nature. 2012, 481: 71-75. [PubMed]
  42. Rastlina K, Pelkey ​​KA, Bortolotto ZA, Morita D, Terashima A, McBain CJ, Collingridge GL, Isaac JT. Prechodné zabudovanie natívnych AMPA receptorov bez GluR2 počas dlhodobého potenciomu hipokampu. Nat Neurosci. 2006, 9: 602-604. [PubMed]
  43. Rada P, Avena NM, Hoebel BG. Každodenné záchvaty cukru opakovane uvoľňujú dopamín do shellu accumbens. Neuroscience. 2005, 134: 737-744. [PubMed]
  44. Roche KW, O'Brien RJ, Mammen AL, Bernhardt J, Huganir RL. Charakterizácia viacerých fosforylačných miest na podjednotke GluR1 receptora AMPA. Neurón. 1996, 16: 1179-1188. [PubMed]
  45. Rumpel S, LeDoux J, Zador A, Malinow R. Postsynaptické obchodovanie s receptormi, ktoré je základom formy asociatívneho učenia. Science. 2005, 308: 83-88. [PubMed]
  46. Sainz E, Korley JN, Battey JF, Sullivan SL. Identifikácia nového člena rodiny domnelých chuťových receptorov T1R. Žurnál neurochémie. 2001, 77: 896-903. [PubMed]
  47. Serulle Y, Zhang S, Ninan I, Puzzo D, McCarthy M, Khatri L, Arancio O, Ziff EB. Interakcia GluR1-cGKII reguluje obchodovanie s AMPA receptormi. Neurón. 2007, 56: 670-688. [Článok bez PMC] [PubMed]
  48. Sesack SR, Grace AA. Sieť odmien Cortico-Basal Ganglia: mikroobvod. Neuropsychofarmakológia: oficiálna publikácia Americkej vysokej školy neuropsychofarmakológie. 2010, 35: 27-47. [Článok bez PMC] [PubMed]
  49. Smith GP. Accumbens dopamín sprostredkuje prospešný účinok orosenzorickej stimulácie sacharózou. Chuti do jedla. 2004, 43: 11-13. [PubMed]
  50. Smith WB, Starck SR, Roberts RW, Schuman EM. Dopaminergná stimulácia syntézy lokálnych proteínov zvyšuje povrchovú expresiu GluR1 a synaptický prenos v hipokampálnych neurónoch. Neurón. 2005, 45: 765-779. [PubMed]
  51. Sun X, Milovanovic M, Zhao Y, Wolf ME. Akútna a chronická stimulácia dopamínovým receptorom moduluje obchodovanie s AMPA receptormi v jadre pripisujú neuróny súbežne kultivované s prefrontálnymi neurónmi kôry. Žurnál neurovedy: Úradný vestník Spoločnosti pre neurovedy. 2008, 28: 4216-4230. [Článok bez PMC] [PubMed]
  52. Sun X, Zhao Y, Wolf ME. Stimulácia dopamínového receptora moduluje synaptickú inzerciu AMPA receptora v prefrontálnych kortexových neurónoch. J Neurosci. 2005, 25: 7342-7351. [PubMed]
  53. Thomas MJ, Beurrier C, Bonci A, Malenka RC. Dlhodobá depresia v nucleus accumbens: neurálny korelát behaviorálnej senzibilizácie na kokaín. Nat Neurosci. 2001, 4: 1217-1223. [PubMed]
  54. Neprípustný MA, Whistler JL, Malenka RC, Bonci A. Jediná expozícia kokaínu in vivo indukuje dlhodobé potencovanie v dopamínových neurónoch. Nature. 2001, 411: 583-587. [PubMed]
  55. Whitlock JR, Heynen AJ, Shuler MG, Bear MF. Učenie vyvoláva dlhodobú potenciu v hippocampe. Science. 2006, 313: 1093-1097. [PubMed]