Hypocretin (orexín) uľahčuje odmenu tým, že zmierňuje protiredukčné účinky jeho cotransmitter dynorphin v ventral tegmental oblasti (2014)

John W. Muschamp,^a,1 Jonathan A. Hollander,^b Jennifer L. Thompson,^c George Voren,^b Linda C. Hassinger,^a Sara Onvani,^a Theodore M. Kamenecká,^b Stephanie L. Borgland,^c Paul J. Kenny,^b a William A. Carlezon, Jr.^a

Informácie o autorovi ► Autorské práva a licenčné informácie

Hypokretín (orexín) a dynorfín sú neuromodulátory, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu pri regulácii účinkov a motivácie. Orexín je rozhodujúci pre odmenu a je zapojený do hľadania liekov, zatiaľ čo dynorfín sprostredkuje negatívnu náladu a je zapojený do depresívnych stavov. Vzhľadom na tieto protichodné účinky sú správy o tom, že oba peptidy sú exprimované v rovnakých neurónoch a sú Coreleased, kontraintuitívne. Tu demonštrujeme, že orexín a dynorfín sa koexprimujú v rovnakých synaptických vezikulách a že táto kolokalizácia má hlboký vplyv na odmenu, užívanie drog a impulzívne správanie. Skutočnosť, že orexín uzatvára depresívne antirewardové účinky dynorfínu, významne mení spôsob, akým vnímame funkčnú úlohu orexínu v mozgu.

Hypokretín (orexín) a dynorfín sú neuropeptidy s opačným účinkom na motivované správanie. Orexín sa podieľa na stavoch vzrušenia a odmeňovania, zatiaľ čo dynorfín sa podieľa na depresívnych stavoch. Ukazujeme, že napriek svojim protichodným účinkom sú tieto peptidy balené v rovnakých synaptických vezikulách v hypotalame. Narušenie funkcie orexínu oslabuje prospešné účinky stimulácie laterálnej hypotalamu (LH), eliminuje kokulínom indukovanú impulzivitu a znižuje samoaplikáciu kokaínu. Súčasné narušenie funkcie dynorfínu zvráti tieto zmeny správania. Ukazujeme tiež, že orexín a dynorfín majú protichodné účinky na excitabilitu dopamínových neurónov ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA), prominentný cieľ neurónov obsahujúcich orexín a že antagonizmus orexínu v rámci VTA spôsobuje zníženie samoaplikácie kokaínu a autostimulácie LH. ktoré sú zvrátené antagonizmom dynorfínu. Naše zistenia identifikujú jedinečný bunkový proces, pomocou ktorého môže orexín uzavrieť účinky zvyšovania prahovej hodnoty pre odškodnenie coreleased dynorphin, a tým pôsobiť tolerantne na uľahčenie odmeňovania.

Orexín a dynorfín sú Cotransmitery.

Pomocou fluorescenčnej mikroskopie sme potvrdili koexpresiu orexínu a dynorfínu v rovnakých neurónoch laterálneho, perifornického a dorzomedálneho hypotalamu myši.18) (Obr. 1A). Existencia neurónov, ktoré exprimujú viacnásobné vysielače, bola opísaná v iných mozgových obvodoch a môže predstavovať nervový základ pre filtračné mechanizmy, pomocou ktorých dochádza k uvoľňovaniu koexpresovaných neurotransmiterov pri rôznych rýchlostiach spaľovania (19). Použitím EM sme však zistili, že orexín a dynorfín sú kolokalizované v rovnakých synaptických vezikulách. Väčšina prípadov spoločného balenia sa pozorovala v nemyelínových, varikóznych axonálnych procesoch, kde sa imunooznačenie našlo vo vezikulách alebo blízko nich. V tele neuronálnych buniek bolo významné značenie spojené s komplexom Golgiho, zatiaľ čo žiadne nebolo nájdené v susedných jadrách (Obr. 1 B a C). Dendrity tiež obsahovali značenie spojené s vezikulami pre oba peptidy, čo naznačuje potenciálne dendritické uvoľňovanie týchto vysielačov. Malý počet mikroštruktúrnych profilov zachytil terminály axónov so značením pre oba peptidy umiestnené vo veľkých vezikulách (∼100 nm) umiestnených mimo uvoľňovacej zóny asymetrických synapsií (Obr. 1 B a C), pričom sa podporuje záver, že orexín a dynorfín fungujú ako kotransmitery a že za normálnych podmienok sa uvoľňujú skôr ako diferenciálne v závislosti od frekvencie vypaľovania buniek.

 

Obr. 1.

Orexín a dynorfín sú kotransmittory v neurónoch hypotalamu. (A, ďaleko vľavo) Mikrosnímok s jasným poľom ukazuje plochu hypotalamu vyšetrenú na imunoreaktivitu orexínu (červená) a dynorfínu (zelená). (A, úplne vpravo) Zlúčený dvojkanálový obraz ...

Účinky orexínovej blokády na zvýšenie prahovej hodnoty sa odvracajú prostredníctvom dynorfínovej blokády.

Aby sme preskúmali funkčný význam tohto jedinečného modelu expresie vysielača, skúmali sme, či prerušenia signalizácie orexínu a dynorfínu môžu ovplyvniť zložité správanie, ktoré odráža normálnu a aberantnú motiváciu. U myší C57BL / 6 trénovaných na vykonávanie intrakraniálnej autostimulácie (ICSS) zosilnenej laterálnou hypotalamickou (LH) stimuláciou (20), blokáda OX₁Rs N- (2-metyl-6-benzoxazolyl) -N '-1,5-naftyridín-4-ylmočovinou (SB334867) počas svetelnej fázy spôsobil zvýšenie odmien závislých od dávky (Obr. 2A; jednosmerné opakované merania ANOVA pre dávku: F_3,12 = 4.44, P <0.02). Zvýšenie prahových hodnôt ICSS odráža zníženie v stimulačnom účinku stimulácie vyvolané liečbou, čo je depresívny znak naznačujúci zníženú citlivosť na odmenu (20). Tento účinok nebol spôsobený sedáciou alebo inými nešpecifickými poruchami správania, pretože miera odpovede na ICSS nebola ovplyvnená (Obr. 2B; jednosmerné opakované merania ANOVA pre dávku: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Obr. 2.

Účinky blokovania orexínu na zvýšenie prahu sa zvrátia blokádou dynorfínu. (A) Blokovanie signalizácie orexínu v OX₁R podľa SB334867 (0 – 30 mg / kg, ip) zvyšuje prahové hodnoty odmien v teste ICSS, čo naznačuje zníženú odmien. Tento účinok ...

Zvýšeniu prahov odmeňovania spôsobených SB334867om sa predchádzalo predbežnou liečbou norbinaltorfimínom (norBNI) [obojsmerne opakované merania ANOVA pre interakciu liečiva (medzi subjektmi) × dávka SB (v rámci faktora subjektu): F_3,24 = 3.98, P <0.01], ktorý spôsobuje dlhotrvajúcu blokádu dynorfínových účinkov v KOR (10). Tieto údaje naznačujú, že strata signalizácie orexínu odhaľuje latentné protirezistentné účinky coreleased dynorphin. Podávanie norBNI samo o sebe neznížilo prahové hodnoty odmien. Aj keď tento účinok môže súvisieť s jedinečnou farmakodynamikou norBNI a iných prototypových antagonistov KOR (10), môže to tiež naznačovať, že v procesoch, ktoré modulujú činnosť mozgových odmeňovacích obvodov, alebo že fázové zvyšovanie orexínového tonusu samotného (neexponovaného korelurovaným dynorfínom) nepostačuje na prenos signálu odmeňovania zo stimulačného miesta v laterálnom hypotalame, je redundancia. Tieto zistenia sa môžu na prvý pohľad zdať v rozpore s prácou iných, ktorí skúmali SB334867 na prahu ICSS počas tmavej fázy (21). Existuje však značný dôkaz, že pokles funkcie orexínu môže mať následky, ktoré závisia od toho, či sú zvieratá testované počas fázy svetla alebo tmy. Napríklad jedlo a voda si zachovávajú svoje prospešné účinky u myší s orexínom KO, keď sa testovanie vykonáva počas temnej fázy, ale nie počas svetelnej fázy (22), kedy sme vykonali všetky naše testy správania.

Na lokalizáciu účinkov systémového podávania SB334867 a norBNI na ICSS sa do samostatnej kohorty myší implantovalo LH stimulačné elektródy a vodiace kanyly VTA. Mikrofúzia SB334867 do VTA spôsobila výrazné zvýšenie prahov odmien, čo naznačuje zníženú citlivosť odmien. Aj keď intra-VTA norBNI samotný nemal žiadny vplyv na prahové hodnoty ICSS, blokoval prahové zvýšenie účinkov následnej infúzie SB334867 (Obr. 2C; jednosmerné opakované opatrenia ANOVA pre drogy: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Aj keď intrakraniálne infúzie liekov mali tendenciu viesť k miernemu zníženiu maximálnej miery odpovede v porovnaní so systémovými injekciami liekov, tieto účinky nedosahovali štatistickú významnosť (Obr. 2D; jednosmerné opakované opatrenia ANOVA pre drogy: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Impulzívnosť regulovaná prenosom orexínu a dynorfínu.

Impulzívnosť sa vyznačuje deficitmi v potlačovaní správania zameraného na odmeňovanie, pričom vysoká úroveň impulzivity je spoločným znakom mnohých psychiatrických chorôb (23). Drogy zneužívania, vrátane kokaínu, môžu tiež vyvolať zvýšenie impulzívnosti, ktorá je predpokladaná na podporu rozvoja závislosti (24). Vzhľadom na kľúčovú úlohu coreleased orexin and dynorphin pri kontrole citlivosti na prospešný účinok stimulácie LH v teste ICSS sme predpokladali, že interakcie medzi týmito dvoma neuropeptidmi môžu ovplyvniť základnú impulzivitu a deficity vyvolané kokaínom v tomto správaní. Impulzivita sa dá u hlodavcov kvantifikovať meraním predčasných reakcií v sériovej reakčnej dobe 5-výber (5-CSRTT) (25), zvierací model analogický testu nepretržitej výkonnosti, ktorý sa používa na štúdium pozornosti u ľudí. Predčasná odpoveď v tomto teste má tendenciu byť nízka za normálnych podmienok a je zhoršovaná liekmi, ktoré zvyšujú prenos DA (26). Použili sme 5-CSRTT na preskúmanie prínosu systému orexín-dynorfín k spontánnemu a kokaínmi indukovanému impulzívnemu správaniu. Pri samostatnom podaní SB334867 ďalej znížil už aj tak nízky počet spontánnych predčasných reakcií (Obr. 3A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). Tieto zníženia nastali pri absencii účinkov na presnosť odozvy (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), latencia získania peliet (F_3,21 = 0.91, P = 0.44) alebo počet ukončených stimulačných skúšok (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), čo naznačuje, že neboli spôsobené zníženou ostražitosťou alebo motorickými schopnosťami. Podávanie norBNI však zvrátilo účinky SB334867u na predčasnú odpoveď (Obr. 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), čo naznačuje, že pri sprostredkovaní týchto antiimpulzívnych účinkov je kritický neoficiálny prenos dynorfínu. NorBNI, keď sa podáva samostatne alebo v kombinácii so SB334867om, nemal žiadny vplyv na mieru presnosti odpovede (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), latencia (F_3,18 = 3.09, P > 0.06) alebo počet dokončených stimulačných testov (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). Predbežná liečba SB334867 tiež zabránila dvojnásobnému zvýšeniu predčasnej odpovede vyvolanej kokaínom (Obr. 3C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Tieto údaje poskytujú dôkazy o tom, že neurotransmisia orexínu môže regulovať impulzívne správanie za východiskových aj kokaínom stimulovaných podmienok spôsobom citlivým na dynorfín.

 

Obr. 3.

Impulzívne správanie regulované rovnováhou orexínu a dynorfínu. (A) SB334867 zmierňuje predčasné reakcie v modeli impulzivity motora 5-CSRTT na potkanoch. Miera presnosti, latencie na získanie potravinovej pelety a počet vynechaných pokusov boli ...

Dynorphin sprostredkuje zníženú samokontamináciu kokaínu v OX₁R-nulové myši.

U impulzívnych jednotlivcov sa zraniteľnosť voči závislosti výrazne zvyšuje a predpokladá sa, že zvýšenie impulzivity vyvolané kokaínom prispieva k vzniku závislosti (23, 27). Okrem toho sa na regulácii prospešných účinkov kokaínu a iných návykových látok nezávisle zúčastňuje aj prenos orexínu a prenos dynorfínu (28-32). Predpokladali sme, že interakcie medzi prenosom orexínu a dynorfínu môžu priamo riadiť užívanie drog. Aby sme túto možnosť preskúmali, skúmali sme iv podanie kokaínu u geneticky modifikovaných myší bez OX₁Rs (OX₁R^{- / -}). Myši tohto genotypu vykazujú signifikantne nižšie samo-podávanie kokaínu v širokom rozmedzí dávok (0.1 – 1 mg / kg na infúziu), ale vykazujú nezmenenú reakciu na potravinové odmeny v rámci rovnakých schém zosilnenia (33), z čoho vyplýva, že zníženie užívania kokaínu nie je sekundárne k nedostatkom v správaní. Navyše, OX₁R^{- / -} myši vykazujú normálnu mieru samoaplikácie kokaínu počas približne troch počiatočných relácií prístupu k kokaínu, ale potom rýchlo ukazujú pokles užívania kokaínu (33). Tento fenotyp sme potvrdili v dávke 0.3 mg / kg na infúziu, čo naznačuje túto signalizáciu prostredníctvom OX₁Rs hrá rozhodujúcu úlohu pri vytváraní a udržiavaní správania pri podávaní kokaínu [Obr. 4; obojsmerné opakované merania ANOVA, genotyp (medzi subjektovým faktorom) × Liečba drogami (v rámci faktora subjektu): F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Rovnako ako predbežná liečba norBNI obnovila normálne ICSS a impulzívne správanie u myší, ktorým sa podával SB334867, čiastočne obnovila aj samopodanie kokaínu v OX₁R^{- / -} myši, čo poskytuje jedinečný príklad, pri ktorom je behaviorálna deficiencia vyvolaná genetickou abláciou vo funkcii jedného neurotransmiterového systému zachránená blokádou iného. Tieto zistenia naznačujú, že v prípade OX₁R^{- / -} u myší, neotvorené účinky dynorfínu oslabujú prospešné vlastnosti kokaínu, a tým znižujú samoaplikáciu lieku. Zaujímavé je, že v OX₁R^{+ / +} (kontrolné) myši, norBNI neočakávane znížili samopodanie kokaínu. Jedným z možných vysvetlení tohto účinku je to, že dynorfín uvoľňovaný neorexínovými neurónmi, ako sú tzv. „Priame“ striatonigrálne stredne ostnaté neuróny, má opačné účinky na príjem kokaínu a môže skutočne uľahčovať prospešné účinky kokaínu. Existencia dvoch populácií KORs s opačnými úlohami v odmene za kokaín by tiež vysvetlila, prečo norBNI iba čiastočne zvrátil nedostatky v správaní pri užívaní kokaínu zistené v OX.₁R KO myši. Alternatívne antagonizmus KOR znižuje averzívne alebo stresujúce účinky vysadenia kokaínu (34), ktoré prispievajú k vzorcom príjmu drog (17). Bez ohľadu na to tieto údaje naznačujú, že depresívne účinky dynorfínu prevládajú v neprítomnosti neporušenej signalizácie orexínu, čo vedie k zníženiu prospešných účinkov kokaínu, zatiaľ čo účinky orexínu uľahčujú prospešné účinky kokaínu a predlžujú ich trvanie v neprítomnosti dynorfínová signalizácia.

 

Obr. 4.

Znížené podávanie kokaínu v OX₁Myši R KO sa obnovia blokádou KOR. Porucha signalizácie orexínu v OX₁R genetickým deléciou tohto receptora znižuje iv samoaplikáciu kokaínu (0.3 mg / kg na infúziu). Tento deficit je čiastočne ...

Orexín a dynorfín môžu mať vyvážené protichodné účinky na excitabilitu neurónov VTA DA.

Mozgové štruktúry, ktoré dostávajú vstup z hypotalamických orexínových a dynorfínových neurónov, sú potenciálne vystavené obidvom peptidom, a teda podliehajú ich opačným účinkom na neuronálnu excitabilitu (35, 36). Miera, v ktorej účinky jedného peptidu prevažujú nad účinkami druhého pravdepodobne závisí od mnohých faktorov, vrátane relatívnej hojnosti každého peptidu, dlhovekosti v extracelulárnom priestore a expresie receptora v rôznych populáciách cieľových neurónov, ako aj od interakcií medzi receptory a ich vnútrobunkové signálne mechanizmy v postsynaptických bunkách. Impulzívnosť a odmena za kokaín sú regulované, aspoň čiastočne, DA neurónmi vo VTA (26), prominentný cieľ buniek obsahujúcich hypotalamické orexíny (37). Okrem toho infúzia orexínu do VTA zlepšuje hľadanie liekov (6). Na vyhodnotenie relatívneho prínosu každého peptidu na aktivitu neurónov VTA sme urobili elektrofyziologické záznamy z DA buniek v mozgových rezoch C57BL / 6 vystavených orexínu a dynorfínu aplikovaných jednotlivo alebo spolu. Ako sa predpokladalo, pri samostatnej aplikácii bol orexín rovnomerne excitačný, zatiaľ čo dynorfín mal iba inhibičné účinky (Obr. 5 A a B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). V zaznamenanej populácii DA neurónov najčastejšie reagovali na saturačné koncentrácie obidvoch peptidov, hoci malá menšina bola selektívne citlivá iba na orexín alebo dynorfín (Obr. 5B). Je pozoruhodné, že keď sa oba peptidy aplikovali na duálne reagujúce neuróny (n = 10), nebol zaznamenaný žiaden čistý vplyv na rýchlosť prepúšťania (Obr. 5A), čo naznačuje, že protichodné účinky každého peptidu pri nasýtených koncentráciách sa navzájom účinne rušia pri spoločnom uvoľňovaní. Štyri z 10 neurónov vykazovali preferenčnú inhibíciu dynorfínom napriek prítomnosti orexínu, zatiaľ čo jedna bunka bola prednostne excitovaná (> 1.5-násobná zmena) orexínom napriek prítomnosti dynorfínu (Obr. 5 A a C). Celkovo, hoci na orexín reagovalo viac buniek ako dynorfín, tie bunky, ktoré reagovali na oba peptidy, nemali žiadnu čistú zmenu rýchlosti vypaľovania, keď sa orexín a dynorfín spoločne aplikovali, čo naznačuje, že protichodné vplyvy každého peptidu boli vyvážené v sade VTA DA študovali neuróny.

 

Obr. 5.

Orexín a dynorfín majú vyvážené, ale protichodné účinky na neuróny VTA DA. (A, doľava) Spoločne aplikovaný orexín a dynorfín nevedú k žiadnej čistej zmene rýchlosti spaľovania neurónov VTA DA (n = 10). Aplikovaný jednotlivo, dynorfín bol inhibičný a orexín bol excitačný. ...

Aby sme ďalej objasnili potenciálne interakcie orexín-dynorfín v neurónoch VTA DA, ktoré boli citlivé na orexín aj na dynorfín, pokúsili sme sa alternatívne zvýšiť inhibičné účinky dynorfínu aplikovaného kúpeľom pôsobením SB334867 (Obrázok S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01) alebo na zvýšenie excitačných účinkov orexínu aplikovaného do kúpeľa pôsobením norBNI (Obrázok S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). V obidvoch experimentoch bol OX₁Blokáda R a KOR tieto účinky nepriniesla, čo naznačuje, že SB334867 a norBNI nemajú účinky prostredníctvom nešpecifických účinkov. Čo je dôležitejšie, tieto údaje naznačujú, že tón každého peptidu in vitro je nedostatočný na to, aby bol ovplyvnený aplikáciou antagonistov s malými molekulami, ako je SB334867 a norBNI. Toto zistenie je v súlade s predchádzajúcou prácou, ktorá naznačuje, že exocytóza veľkých vezikúl obsahujúcich peptidy sa zvyčajne vyskytuje iba pri vysokých frekvenciách trvalého vypaľovania, ktoré sa bežne nevyskytujú v preparátoch plátky (38).

Overiť, že norBNI neovplyvňovalo správanie prostredníctvom akcií mimo cieľ priamo na OX₁Rs, ďalej sme skúmali účinky tohto antagonistu na OX₁R signalizácia. Konkrétne sme použili test fluorometrických zobrazovacích platní (FLIPR) na stanovenie schopnosti orexínu A, SB334867 alebo norBNI aplikovaného kúpeľom indukovať intracelulárne vápnikové prechody v kultivovaných CHO bunkách exprimujúcich ľudské OX.₁Rs. Hoci orexín A spôsobil očakávané zvýšenie intracelulárneho vápnika (EC₅₀ = 0.01 μM) a SB334867 v závislosti od dávky zmiernili tento účinok (EC₅₀ = 0.035 μM), norBNI nepriniesol žiadne účinky na zvýšenie intracelulárneho vápnika vyvolané východiskovou hodnotou alebo orexínom A. To naznačuje, že účinky norBNI na VTA DA neurónovú fyziológiu sú výhradne prostredníctvom navrhovaných signalizačných mechanizmov KOR a liek nemá priamy účinok na OX₁R (39) (Obrázok S3 A-C).

Interakcie orexínu s dynorfínom vo VTA regulujú samopodávanie kokaínu.

Naše elektrofyziologické štúdie ukazujú, že dynamické interakcie medzi orexínom a dynorfínom regulujú aktivitu VTA DA a že neuróny VTA pravdepodobne slúžia ako kľúčový substrát pre účinky systému orexín-dynorfín na motivované správanie. Na priame otestovanie tejto hypotézy sme skúmali účinky infúzie SB334867u v-VTA na iv podanie kokaínu samým potkanom. V porovnaní s infúziou vehikula intra-VTA spôsobil intra-VTA SB334867 výrazné zníženie príjmu kokaínu, ktoré bolo blokované norBNI (Obr. 6; jednosmerná ANOVA: F_3,24 = 11.56, P <0.01), čo naznačuje, že neoponované akcie dynorfínu v tejto oblasti mozgu oslabujú odmenu za kokaín. Tieto výsledky sa zdajú byť v rozpore s tými, ktoré demonštrovali absenciu intra-VTA SB334867 pri samostatnom podávaní kokaínu v rozvrhnutiach posilnenia s nízkym úsilím s fixným pomerom 1 (FR1) (40). Niekoľko správ však ukázalo, že so zvyšovaním požiadaviek na úlohy je SB334867 účinnejší pri znižovaní užívania drog (2, 33). Pretože potkany v tomto experimente vykonávali plán FR5 s vyššou námahou, súčasné zistenia sú v súlade s touto literatúrou. Tieto údaje poskytujú priamy dôkaz, že protikladná povaha orexínu a dynorfínu na neurónovú fyziológiu VTA DA môže mať výrazný vplyv na správanie založené na odmeňovaní.

 

Obr. 6.

Interakcie orexín-dynorfín pri VTA sprostredkujú užívanie drog. Podávanie kokaínu je znížené pomocou intra-VTA SB334867 (3 μg na stranu), zatiaľ čo tento účinok je zvrátený predbežnou liečbou norBNI (10 mg / kg, ip) (n = 9). ***P < ...

Zvieratá.

Dospelé samce myší C57BL / 6J (vek 8, Jackson Laboratory) použité v EM experimentoch sa umiestnili v skupinách (tri až päť na klietku); tie, ktoré sa použili pre ICSS, boli umiestnené po operácii jednotlivo. Dospelé samce (350 g) Sprague-Dawley potkany (Charles River Laboratories) sa použili v pokusoch s vlastným podávaním 5-CSRTT a kokaínu a boli umiestnené do skupín po štyroch. Dospelé samce myší C57BL / 6J (postnatálne dni 19 – 21) použité na elektrofyziologické experimenty sa umiestnili do skupín (tri až päť na klietku). OX1^{- / -} myši a ich OX1^{+ / +} Littermates (6 wk. vek) používaný na štúdie samopodania boli získané od Jackson Laboratory a boli spätne krížené viac ako sedem generácií k myšiam C57BL / 6. Tieto myši boli ustajnené v skupinách (dve v klietke). Všetky zvieratá boli chované v podmienkach kontrolovaných teplotou v cykle svetlo / tma 12-h a do cyklu svetla sa uskutočnilo testovanie správania 4-5 h; jedlo a voda boli dostupné ad libitum, pokiaľ nie je uvedené inak. Postupy sa uskutočňovali v súlade s národnými inštitútmi zdravia Sprievodca starostlivosťou a používaním laboratórnych zvierat (50) a boli schválené Inštitucionálnymi výbormi pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie v nemocnici McLean Hospital, University of British Columbia a Scripps Florida.

Imunohistochémia a mikroskopia.

Fluorescencia a strieborné zosilnenie imunooznačenia orexínu A alebo prodynorfínu sa uskutočnilo na alternatívnych častiach mozgu myši podľa predtým opísaných postupov (51) a spracované podľa štandardných protokolov EM. Neprekrývajúce sa oblasti imunoznačeného tkaniva sa potom náhodne vybrali a fotografovali na kvantifikáciu častíc pomocou softvéru ImageJ (National Institutes of Health) (National Institutes of Health) (SI Materiály a metódy, imunohistochémia a mikroskopia).

Elektrofyziológia.

Náplasťové pipety (3 – 5 MΩ) boli naplnené 143 mM glukonátom draselným, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (s pH 7.2) a 270 – 280 mM mOsmol. Dáta boli získané pri 20 kHz a filtrované pri 2 kHz pomocou softvéru pClamp 10.0 (Molecular Devices). Po získaní konfigurácie celých buniek sa bunky napäťovo zafixovali pri -70 mV a na detekciu hyperpolarizácie sa použili série napäťových krokov (250 ms, od -60 do -130 mV v krokoch 10-mV).I_h) prúdy. I_h bola určená ako zmena prúdu medzi ∼30 ms a 248 ms po aplikácii kroku napätia. Vnútorná aktivita neurónov VTA DA bola meraná v súčasnom móde. Pokusy sa začali, keď sa dosiahla stabilná východisková rýchlosť spaľovania; substráty sa potom nanášali 5 min a následne sa premyli umelou mozgomiešnou tekutinou. Posledných 3 min každého segmentu 5-min sa použilo na analýzu údajov. Dynorfín A (1 – 17; 200 nM) a orexín A (100 nM) sa získali z amerického peptidu a rozpustili sa v destilovanej vode. Zistilo sa, že tieto koncentrácie mali saturačné účinky na aktivitu buniek VTA (5, 52). Tiorfán (1 μM) a bestatín (10 μM) boli získané od Sigma – Aldrich, rozpustené v destilovanej vode a aplikované spolu s dynorfínom A (SI Materiály a metódy, Elektrofyziológia).

Test FLIPR.

OX₁Aktivita R bola hodnotená meraním hladín intracelulárneho vápnika pomocou testu FLIPR, ako je opísané vyššie (53) (Materiály a metódy SI, Skúška čítačkou doštičiek pre fluorometrické zobrazenie).

ICSS.

Myšiam sa implantovali monopolárne stimulačné elektródy alebo kanyly (PlasticsOne) pod ketamín / xylazín (80 a 10 mg / kg, v danom poradí, ip; Sigma), smerované stereotakticky k LH (18) a / alebo kontralaterálna VTA [z bregma: anteroposterior (AP), -3.2 mm; stredný (ML), -0.5 mm; dorzoventrálna (DV), -4.7 mm od dura]. Po období zotavenia 7-d boli myši trénované tak, aby reagovali na stimuláciu mozgu, ako je opísané vyššie (18). Najnižšia frekvencia, ktorá podporovala odozvu (prahová hodnota), sa vypočítala pomocou analýzy najmenších štvorcov s najlepšou zhodou. Keď myši splnili kritériá stability pre prahy ICSS (± 10% po 5 po sebe nasledujúcich dňoch), zmerali sa účinky liečby liekom. SB334867 (Scripps Florida) alebo DMSO vehikulum sa podávalo striedavo s použitím injekčnej striekačky Hamilton (0.1 ml / kg ip) a prahové hodnoty sa okamžite kvantifikovali v testovacích reláciách 15-min. NorBNI (10 mg / kg ip; Sigma) bol podaný v soľnom roztoku (10 ml / kg) 48 h pred začiatkom testovania ICSS.

5-CSRTT.

Potkany boli obmedzené na potravu (na 85% hmotnosti bez kŕmenia) a vyškolené v počítačom riadených komorách pre operátorov umiestnených vo vetraných, zvukovo izolačných skriniach (Med Associates) a postupoch 5-CSRTT vykonávaných tak, ako je opísané (25). SB334867 (v DMSO, 0.1 ml / kg) a / alebo kokaín (vo fyziologickom roztoku, 1 ml / kg; Sigma) bol podaný ip injekciou 10 min pred testom, ako v iných experimentoch, a norBNI bol podaný najmenej 48 h pred začiatok testovania (SI Materiály a metódy, 5-Vyberte úlohu Serial Reaction Time).

IV Samopodávanie kokaínu.

Potkany a myši sa anestetizovali zmesou izofluránu (1 – 3% obj./obj.) Kyslíka a chirurgicky sa pripravili pomocou silastických (VWR Scientific) katétrov v krčnej žile podľa stanovených postupov (54). Ihneď po implantácii katétra potkanom sa do VTA implantovali bilaterálne vodiace kanyly z nehrdzavejúcej ocele (23 gauge, dĺžka 17 mm) (od bregma: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, -7.5 mm od tvrdej pleny). ). Testovanie s SB334867 alebo norBNI počas 60-minútových denných relácií sa uskutočnilo po dosiahnutí stabilného príjmu kokaínu (<20% variácia v odpovedi počas 3 po sebe nasledujúcich dní; Materiály a metódy SI, IV).

Štatistika.

Dáta sú vyjadrené ako priemer ± SEM. V prípade experimentov ICSS sa na porovnanie prostriedkov medzi stavmi ošetrenými SB334867 a norBNI + SB334867 použili dvojnásobné opakované merania ANOVA. Na porovnanie prostriedkov v podmienkach SB334867 a norBNI + SB334867 sa použili jednosmerné opakované merania ANOVA s Newman – Keulsovými post hoc testami. Jednosmerné opakované merania ANOVA a Newman – Keuls testy sa použili aj na porovnanie prostriedkov vo všetkých experimentoch 5CSRTT. Dvojnásobné opakované merania ANOVA sa použil na porovnanie prostriedkov medzi liečenými skupinami v pokusoch o samoinjekciu kokaínu s OX₁R KO myši. Jednosmerné opakované merania ANOVA a Newman-Keulsove testy sa použili na porovnanie priemerných reakcií na orexín a dynorfín neurónmi VTA DA. Jednosmerné opakované merania ANOVA a Newman – Keuls testy sa použili aj na porovnanie prostriedkov príjmu kokaínu u potkanov ošetrených SB334867 a norBNI. Rozdiely sa považovali za významné, ak P <0.05.

Ďakujeme Dr. Garrettovi Fitzmaurice za užitočné pripomienky k rukopisu a Mirande S. Gallo a Melissa Chen za pomoc pri zbere údajov. Túto prácu podporili Národné inštitúty zdravotných grantov F32-DA026250 a K99-DA031767 (do JWM), F32-DA024932 a K99-DA031222 (do JAH), R01-DA023915 (do. PJK) a R01-MHX do W063266 ) a prostredníctvom grantu na zistenie Rady pre prírodné vedy a inžiniersky výskum (SLB).

Vyhlásenie o konflikte záujmov: WAC je držiteľom patentu (americký patent 6,528,518; Assignee: McLean Hospital), ktorý sa týka použitia kappa-opioidných antagonistov na liečenie depresívnych porúch. Všetci ostatní autori nevyhlasujú žiadne konkurenčné finančné záujmy.

Tento článok je PNAS priame podanie.

Pozri komentár na strane 5765.

Tento článok obsahuje podporné informácie online na adrese www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.