メタンフェタミンは雄ラット（2010）の性行動を調節するニューロンの亜集団に作用する

神経科学 2010 Mar 31; 166（3）：771-84。 土井：10.1016 / j.neuroscience.2009.12.070。 Epub 2010 1月4。

Frohmader KS, ウィスケルケJ, ワイズRA, リーマンミネソタ, クーレンLM.

ソース

カナダ西部オンタリオ西部オンタリオ大学シューリッヒ医学歯学部解剖学および細胞生物学科、N6A 5C1。

抽象

メタンフェタミン（メス）は中毒性の高い覚せい剤です。 Methの虐待は一般的に性的リスク行動の習慣やHuman Immunodeficiency Virusの有病率の上昇に関連しており、Methユーザーは性欲の高揚、覚醒、性的快楽を報告しています。 この薬物 - 性関連の生物学的根拠は不明である。 現在の研究は、雄ラットへのMeth投与が、性行動の調節に関与している中側辺縁系の脳領域のニューロンを活性化することを示しています。 具体的には、Methと交配は、側坐核のコアとシェル、側底側扁桃体、および前帯状皮質の細胞を共活性化する。 これらの所見は、現在の虐待の信念とは対照的に、天然の強化剤と同じ細胞、すなわち性行動を活性化することができ、ひいてはこの天然の報酬の強迫的な探求に影響を与える可能性があることを示しています。

キーワード： 側坐核、側底外側扁桃体、前頭前野、薬物乱用、生殖、中毒

動機付けと報酬は、中側辺縁系、腹側被蓋野（VTA）、側坐核、内側前頭前野（mPFC）で構成される脳領域の相互接続ネットワーク（ケリー、2004, カリヴァスとボルコウ、2005） 中脳辺縁系が両方の乱用物質に​​反応して活性化されるという十分な証拠がある（ディ・キアラとインペラト、1988, Chang et al。、1997, Ranaldi et al。、1999そして性的行動のような自然にやりがいのある行動（Fiorino et al。、1997, Balfourら、2004). 男性モデルの性行動、特に射精は動物モデルでは非常にやりがいがあり強化されています (Pfausら、2001). 雄のげっ歯類は交尾に対する条件付き場所嗜好（CPP）を発達させる (アグモとベレンフェルド、1990, マルチネスとパレデス、2001, Tenk、2008そして、性的に受容的な女性へのアクセスを得るためにオペラントタスクを実行しますEverittら、1987, エヴェリットアンドステイシー、1987） 虐待の薬物もまたやりがいがあり強化されており、動物は鎮静剤、ニコチン、アルコール、精神刺激薬を含む虐待の物質を自己投与することを学ぶでしょう（賢い、1996, ピアースとクマレサン、2006, Feltenstein and See、2008） 乱用薬物と性行動の両方が中脳辺縁系脳領域を活性化することが知られているが、乱用薬物が性行動を媒介する同じニューロンに影響を及ぼすかどうかは現在不明である。

電気生理学的研究は、食物とコカインの両方がNAcのニューロンを活性化することを示しました。 しかしながら、２つの強化剤はＮＡｃ内の同じ細胞を活性化しない。 (Carelliら、2000, CarelliとWondolowski、2003） さらに、食物およびスクロースの自己投与は、コカインによって誘発されるように電気生理学的特性の長期的変化を引き起こさない（Chenら、2008). 対照的に、一連の証拠は、男性の性行動および乱用薬物が実際に同じ中脳辺縁系ニューロンに作用する可能性があることを示唆している。 精神刺激薬とオピオイドは雄ラットの性行動の発現を変化させる（ミッチェルとスチュワート、1990, フィオリノとフィリップス、1999a, フィオリノとフィリップス、1999b). 私たちの研究室からの最近のデータは、性的経験が性的経験のある動物における感作された自発運動反応およびd-アンフェタミンに対する感作された報酬知覚によって証明されるように精神刺激薬に対する反応性を変えることを示した (Pitchers他、2009). アンフェタミンまたは他の乱用薬物への反復暴露でも同様の反応が以前に観察されている (レット、1989, ShippenbergとHeidbreder、1995, Shippenberg他、1996, ヴァンダーシュレンとカリヴァス、2000). まとめると、これらの知見は、性行動および乱用薬物に対する反応が、中側辺縁系の同じニューロンによって媒介されていることを示唆している。 したがって、本研究の第一の目的は、同じ動物における性的行動および薬物投与による中脳辺縁系の神経活性化を調べることである。 特に、覚せい剤メタンフェタミン（Meth）が、通常は性行動を媒介するニューロンに直接作用するという仮説を検証した。

メスは世界で最も虐待された違法薬物の1つです（NIDA、2006、 Ellkashefら、2008）へそれは性的行動の変化と頻繁に関連している。 興味深いことに、Methユーザーは性的欲求と覚醒の向上、そして性的快楽の向上を報告しています (Semple et al。、2002, Schilderら、2005） また、 虐待は性的強迫行動と一般的に関連している (Rawsonら、2002). ユーザーは多くの性的パートナーを持っていると報告することが多く、他の薬物乱用者よりも保護を使用する可能性が低い (Somlai et al。、2003, Springerら、2007） 残念なことに、性的リスク行動の予測因子としてのMethの使用を示す研究は、未確認の自己報告に頼っているため限られています（Elifsonら、2006） したがって、動物モデルにおける性行動のメス誘発変化の細胞基盤の調査は、この複雑な薬物 - 性関連を理解するために必要とされる。

乱用薬物、特にMethが性行動の仲介に通常関与するニューロンに作用する可能性があることを示唆する上記のエビデンスを考慮して、本研究の目的は性行動による精神活性化および精神刺激薬Methの投与を調査することであった。。 本研究は、性的行動およびMethによる同時神経活性化をそれぞれ検出するために、前初期遺伝子Fosおよびリン酸化Map Kinase（pERK）の免疫組織化学的可視化を利用して、神経解剖学的技術を実施した。 Fosは細胞の核内でのみ発現され、ニューロンの活性化後最大の発現レベルは30〜90分です。 性的活動が脳内のFos発現を誘導するという十分な証拠があります（PfausとHeeb、1997, Veening and Coolen、1998（中皮質コルチコイド系を含む）Robertson et al。、1991, Balfourら、2004). また、乱用薬物が中皮質脳辺縁系内でpERK発現を誘導するという証拠もあります (Valjentら、2000, Valjentら、2004, Valjentら、2005） Fosの発現とは対照的に、ERKのリン酸化は非常に動的なプロセスであり、ニューロンの活性化から数分後に起こるのは5〜20だけです。 ＦｏｓおよびｐＥＲＫの異なる時間的プロファイルは、それらを２つの異なる刺激によるその後のニューロン活性化のための理想的なマーカーのセットにする。

実験手順

科目

チャールズリバーラボラトリーズ社（カナダ、ケンタッキー州モントリオール）から入手した成体オスのスプラーグドーリーラット（ＸＮＵＭＸ − ＸＮＵＭＸ ｇ）を標準的なプレキシグラスケージ（ホームケージ）にケージ当たり２匹収容した。 動物室は、ＸＮＵＭＸ ／ ＸＮＵＭＸ ｈの逆光サイクル（ＸＮＵＭＸ ｈで消灯）に維持した。 食べ物と水が手に入りました 自由にご利用いただけます。 全ての試験は、暗赤色照明下の暗期の前半に行われた。 性行動に使用される刺激のある女性は、深部麻酔下で両側に卵巣摘出され（13 mg / kgケタミンおよび87 mg / kgキシラジン）、5％エストラジオールベンゾエート（EB）および95％コレステロールを含む皮下インプラントを受けた。 試験の前に、500 mlゴマ油0.1中の4μgプロゲステロンの皮下（sc）投与により性的受容性を誘導した。 すべての手順は、西オンタリオ大学の動物管理委員会によって承認され、カナダの動物保護協議会によって概説されたガイドラインに準拠しています。

実験デザイン

実験ＸＮＵＭＸおよびＸＮＵＭＸ：雄ラット（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）を受容性の雌と１回の射精（Ｅ）またはＸＮＵＭＸ ｍｉｎで交配させた。これは５回の間にクリーンテストケージ（ＸＮＵＭＸ×ＸＮＵＭＸ×ＸＮＵＭＸ ｃｍ）で初めて行われた。 - 性的経験を積むために、交配セッションを週に1回テストします。 後半の2つのセッションでは、性的能力に関するすべての標準的なパラメーターが記録された：マウント潜伏期（ML；女性の導入から最初のマウントまでの時間）、挿入潜伏期（IL；女性の導入から最初のマウントまでの時間）膣への侵入）、射精潜伏期（EL;最初の挿入から射精までの時間）、射精後の間隔（PEI;射精から最初の挿入までの時間）、マウント数（M）、および挿入回数（IM）（Agmo、1997） 取り扱いおよび注射の慣れのために、試験日の前の連続した日に、1％NaCl（生理食塩水； sc）0.9の3 ml / kgを毎日注射した。 試験日の前日に、すべての男性が一人暮らしになった。 経験豊富な男性では、Fosは以前の性的経験と関連した条件付き文脈合図によって誘発されることがあるBalfour他、2004） したがって、最終試験の間のすべての交配および対照操作は、非交配対照男性における条件付き合図誘発活性化を防止するために、ホームケージ内で行われた（予測条件付合図の回避）。 最後の2つの交配セッション中に、性的能力の測定値に差がない8つの実験群に男性を分配した（データは示さず）。 最終試験の間、男性は射精を示すまで（性別）、または女性のパートナーを受け入れないまで（性別なし）、ホームケージで交配することを許可された。 すべての交配雄は、交配の開始からX分後に灌流して、交配誘導性Fos発現の分析を可能にした。 薬物誘発リン酸化の分析のために、男性に、灌流の少なくとも60（実験4）または1（実験4）のいずれかで、10 mg / kg Methまたは1 ml / kg食塩水（sc）（それぞれn = 15）の注射を受けた。 MAPキナーゼ 投与量および灌流までの時間は以前の報告に基づいていた（Choeら、2002, Choe and Wang、2002, 陳と陳、2004Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉら、ＸＮＵＭＸ、 石川ほか、2006） 対照群は、交尾していないが屠殺前にMeth 10（n = 7）または15（n = 5）を受けた雄、または屠殺前に10（n = 5）または15（n = 4）を受けた。 屠殺後、脳を免疫組織化学用に処理した。

実験ＸＮＵＭＸ：実験ＸＮＵＭＸおよびＸＮＵＭＸでは高用量のＭｅｔｈを使用したので、性行動および低用量のＭｅｔｈが重複神経活性化の用量依存的パターンを誘導するかどうかを調べるために追加の神経解剖学的実験を行った。 この研究は実験ＸＮＵＭＸおよびＸＮＵＭＸと同じ方法で行われた。 しかしながら、最終試験では、交配および非交配グループ（それぞれｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）は、屠殺前にＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ Ｍｅｔｈ（ｓｃ）ＸＮＵＭＸ分を受けた。

実験ＸＮＵＭＸ：性別およびＭｅｔｈによって引き起こされる神経活性化がＭｅｔｈに特異的であるかどうかを試験するために、この実験では、覚醒剤ｄ−アンフェタミン（Ａｍｐｈ）を用いて、重なり合う神経活性化の類似パターンが見られ得るかどうか調べた。 この実験は、実験ＸＮＵＭＸおよびＸＮＵＭＸと同じ方法で実施した。 しかし、最終試験では、屠殺前に男性にAmph（4 mg / kg）または生理食塩水（1 mg / kg）（sc）2のいずれかを投与した（それぞれn = 5）。 対照の未婚男性は、屠殺の数分前に食塩水またはAmph 1を受けた。 実験に利用された実験群の概要ＸＮＵＭＸ〜ＸＮＵＭＸは、に提供されている。 テーブル1.

テーブル1      

実験に含まれる実験群の概要1〜4。

組織の準備

動物をペントバルビタール（270 mg / kg; ip）で麻酔し、5 mlの食塩水、続いて500 Mリン酸緩衝液（PB）中の4 ml 0.1％パラホルムアルデヒドで経心的に灌流した。 脳を取り出し、そして同じ固定剤中で室温でＸＮＵＭＸ時間後固定し、次いでＸＮＵＭＸ Ｍ ＰＢ中のＸＮＵＭＸ％スクロースおよびＸＮＵＭＸ％アジ化ナトリウム中に浸漬し、そしてＸＮＵＭＸ℃で貯蔵した。 冠状切片（ＸＮＵＭＸμｍ）を凍結ミクロトーム（ＨＸＮＵＭＸＲ、Ｍｉｃｒｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で切断し、凍結防止剤溶液（ＸＮＵＭＸ％スクロースおよびＸＮＵＭＸ％ＰＢ中のＸＮＵＭＸ％エチレングリコール）中に４つの並行シリーズで集め、さらにＸＮＵＭＸ℃で保存した。処理。

免疫組織化学

全てのインキュベーションは室温で穏やかに撹拌しながら実施した。 自由浮遊切片をインキュベーションの間に0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で十分に洗浄した。 切片を1％H中でインキュベートした。2O2 その後、10分のインキュベーション溶液（0.1％ウシ血清アルブミンおよび0.4％Triton X-100を含むPBS）中でブロックした。

PERK / Fos

組織をｐＸＮＵＭＸおよびｐＸＮＵＭＸマップキナーゼＥＲＫＸＮＵＭＸおよびＥＲＫＸＮＵＭＸに対するウサギポリクローナル抗体（ｐＥＲＫ； ＸＮＵＭＸ：ＸＮＵＭＸ、実験ＸＮＵＭＸ：ＸＮＵＭＸ、実験：ＸＮＵＭＸおよびＸＮＵＭＸ、およびＸＮＵＭＸ；およびＸＮＵＭＸ； ＸＮＵＭＸ； Ｃｅｌｌ ＳｉｇｎａｌＸ、続いてＸ．ビオチン化ロバ抗ウサギIgG（42：44； Jackson Immunoresearch Laboratories、ペンシルベニア州ウェストグローブ）およびアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ABC Elite； 1：2； Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）との1 hインキュベーション。 次に、組織をビオチン化チラミド（ＢＴ； ＸＮＵＭＸ：ＰＢＳ中のＸＮＵＭＸ ＋ ＸＮＵＭＸ％Ｈ）と共にＸＮＵＭＸ分間インキュベートした。2O2; Ｔｙｒａｍｉｄ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、マサチューセッツ州ボストンのＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、およびＡｌｅｘａ ＸＮＵＭＸコンジュゲートストレプトアビジン（ＸＮＵＭＸ：ＸＮＵＭＸ；ペンシルバニア州ウェストグローブのＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いたＸＮＵＭＸ ｍｉｎ用。 次に、組織をｃ − Ｆｏｓに対するウサギポリクローナル抗体（ＸＮＵＭＸ：ＸＮＵＭＸ； ＳＣ − ＸＮＵＭＸ； Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルーズ）と共に一晩インキュベートし、続いてヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ ＸＮＵＭＸ（ＸＮＵＭＸ）と共にインキュベートした。 ＸＮＵＭＸ；ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）。 染色後、切片を30 M PBで完全に洗浄し、ddH中488％ゼラチンを含むスライドガラスにマウントした。2ＸＮＵＭＸおよび褪色防止剤ＸＮＵＭＸ−ジアザビシクロ（ＸＮＵＭＸ）オクタン（ＤＡＢＣＯ； ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｍｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ − Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する水性封入剤（Ｇｅｌｖａｔｏｌ）でカバーガラスをかけた。 免疫組織化学的対照は、一方または両方の一次抗体の省略を含み、その結果、適切な波長での標識化が行われなかった。

データ解析

性行為

４つ全ての実験について、性的能力に関する標準的なパラメーターを上記のように記録し、そして分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。 最終試験日の間の性行動のデータ分析は、性的能力のいずれのパラメータにおいても群間に有意差がないことを明らかにした。

PERK / Fosセル数

ＦｏｓおよびｐＥＲＫのための単一および二重標識細胞を、ＮＡｃコアおよびシェル小領域、側底外側扁桃体（ＭＥＡｐｄ）、中央扁桃体（ＣｅＡ）、内側視索前核（ＭＰＮ）の後部レベルで計数した。末梢側索の後外側床核（BNSTpmおよびBNSTpl）、ならびにmPFCの前帯状域（ACA）、前縁（PL）、および下縁（IL）小領域。 ライカ顕微鏡（ＤＭＸＮＵＭＸＢ、ライカマイクロシステムズ、ヴェッツラー、ドイツ）に取り付けられた冷却ＣＣＤカメラ（Ｍｉｃｒｏｆｉｒｅ、Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ）および全ての被験者に対して固定カメラ設定を有するＮｅｕｒｏｌｕｃｉｄａソフトウェア（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｆｉｅｌｄ Ｉｎｃ）を使用して（ＸＮＵＭＸｘ対物レンズを使用して）画像を撮影した。 neurolucidaソフトウェアを使用して、ランドマークに基づいて分析領域を定義した（スワンソン、1998）各脳領域に固有のもの 図1） 分析の標準領域は、NAcコアとシェルを除くすべての領域で使用されました。 後者の領域では、pERKとFosの発現は均一ではなく、パッチ様のパターンで現れた。 したがって、中心部と殻全体がランドマーク（側脳室、前方交際、およびCallejaの島）に基づいて概説されていました。 分析範囲は実験群間で異ならず、1.3 mmであった。2 NAcのコアとシェルで。 残りの領域の標準分析領域は次のとおりです。1.6 mm2 BLA、2.5および2.25 mm2 MEApdとCeAではそれぞれ1.0 mm2 MPNでは、1.25 mm2 BNSTおよびmPFCサブ領域内、および3.15 mm2 VTAで。 動物あたり各脳領域について２つの切片を両側でカウントし、そしてｐＥＲＫおよびＦｏｓについての単一および二重標識細胞の数、ならびにＦｏｓマーカーを発現したｐＥＲＫ細胞の割合を計算した。 実験ＸＮＵＭＸ、ＸＮＵＭＸ、およびＸＮＵＭＸについて、二元配置分散分析（因子：交配および薬物）およびフィッシャーのＬＳＤを用いて群平均を比較した。 事後に 有意水準0.05での比較。 実験3について、有意水準0.05で対応のないt検定を使用してグループ平均を比較しました。

図1      

分析の脳領域を説明する概略図および画像。 示された分析領域は、各脳領域に固有のランドマークに基づいており、実験群間で異ならず、そして1.25 mmであった。2 mPFCサブ領域内（a）、1.3 mm2 セクションに ...

画像

デジタル画像 図3 Ｌｅｉｃａ顕微鏡（ＤＭＸＮＵＭＸＢ）に取り付けられたＣＣＤカメラ（ＤＦＣ ＸＮＵＭＸＦＸ、Ｌｅｉｃａ）を用いて捕獲し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＸＮＵＭＸソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンノゼ）にインポートした。 明るさの調整を除いて、画像はいかなる方法でも変更されていません。

図3      

各実験群の動物のFos（赤、a、d、g、j）およびpERK（緑、b、e、h、k）について免疫染色したNAc切片の代表的な画像：性別なし+ Sal（a、b、c） 、性別＋ Ｓａｌ（ｄ、ｅ、ｆ）、無性別＋ Ｍｅｔｈ（ｇ、ｈ、ｉ）、および性別＋ Ｍｅｔｈ（ｊ、ｋ、ｌ）。 右側のパネルは ...

結果

性行動とメチル投与による辺縁系の神経活性化

実験ＸＮＵＭＸ：屠殺の数分前にＭｅｔｈ ＸＮＵＭＸを受けた雄における交配誘導ＦｏｓおよびＭｅｔｈ誘導ｐＥＲＫについての単一および二重標識細胞の分析は、ＭＰＮ、ＢＮＳＴｐｍ、ＮＡｃコアおよびシェル、ＢＬＡ、ＶＴＡにおける交配誘導Ｆｏｓを明らかにした。これらの領域での交配誘導性Fos発現を実証した以前の研究と一致している。バウムとエヴェリット、1992, PfausとHeeb、1997, Veening and Coolen、1998, ハル他、1999） 他の精神刺激薬によって誘発される活性化パターンと一致する、屠殺前10分のNAcコアおよびシェル、BLA、MeApd、CeA、BNSTpl、およびmPFCの領域における誘発されたpERK（Valjentら、2000, Valjentら、2004, Valjentら、2005).

さらに、性行動とMethによる3つのパターンの神経活性化の共発現が観察された。最初に、性別と薬物が重ならない神経集団を活性化した脳領域が同定された。テーブル2）。 具体的には、CeA、MEApd、BNSTpl、およびmPFCでは、薬物誘発性pERK（F（1,16）= 7.39–48.8; p = 0.015- <0.001）と性別誘発性Fos（F（1,16、 16.53）= 158.83–0.001; p <1,16）が観察されました。 ただし、これらの地域では、交尾した覚醒剤治療を受けた雄の二重標識ニューロンに有意な増加はありませんでした。 唯一の例外はMEApdで、二重標識細胞の数に対する交配の影響が見られました（F（9.991）= 0.006; p = XNUMX）。 しかし、薬物治療の全体的な効果はなく、覚醒剤治療群の二重標識は生理食塩水治療群よりも有意に高くなかったため、薬物によるものではありませんでした（テーブル2） 第二に、交尾によってのみ神経活性化が誘導される脳領域が同定された（テーブル3） 具体的には、MPN、BNSTpm、およびVTAは交配によってのみ活性化され、交配誘発性Fosの有意な増加を含んでいた（F（1,16）= 14.99-248.99; p≦0.001）が、Meth誘発性pERKは含まなかった。

テーブル2      

性別と薬物が非重複神経集団を活性化する脳領域における交配誘導FosとMeth誘導pERK発現の概観
テーブル3      

交配によってのみ神経活性化が誘導された脳領域における交配誘導FosおよびMeth誘導pERK発現の概観

最後に、性と薬物が重なり合うニューロン集団を活性化させる脳領域が発見された（図2 & and3）.3）。 NAcコアとシェル、BLA、およびACAでは、交配（F（1,16）= 7.87–48.43; p = 0.013- <0.001）および薬物治療（F（1,16）= 6.39–）の全体的な効果がありました。 52.68; p = 0.022- <0.001）、および両方を発現する細胞の数に対するこれら1,16つの要因間の相互作用（F（5.082）= 47.27–0.04; p = 0.001- <0.027; ACAでの有意な相互作用なし）交配によって誘発されたFosおよびMethによって誘発されたpERK。 事後分析により、二重標識ニューロンの数は、交尾していないメタンフェタミン処理（p = 0.001- <0.001）または交配生理食塩水処理（p = 0.001- <XNUMX）のオスと比較して、交尾したメタンフェタミンを注射したオスで有意に高かったことが明らかになりました（図2 & and3）.3） データを薬物活性化ニューロンのパーセンテージとして表した場合、NAcコアにおける39.2±5.3％、NAcシェルにおける39.2±5.8％、BLAにおける40.9±6.3％、およびACNニューロンの50.0±5.3％は、によって活性化された。交配とメスの両方。

図2      

10 mg / kg Meth投与後、NAc、BLA、およびACAニューロン4での性誘導FosおよびMeth誘導pERK発現。 NAcコア内のFos（a、d、g、j）、pERK（b、e、h、k）、および二重（c、f、i、l）ラベル付きセルの平均数±sem（a、d、g、j） ...

予想外の観察結果は、性行動がメス誘発pERKに影響を与えたということでした。 Metはメイティングおよび非メイティングの両方のメス注射群で有意にpERKレベルを誘導したが、NAc、BLA、およびACAでは、メイトのメト注射男性のメト注射雄のpERK標識は非メイトメス注射男性と比較して有意に低かった。 (図2b、e、h、k; p = 0.017- <0.001）。 この知見は、性別と薬物が同じニューロンに作用するという仮説をさらに裏付けるかもしれないが、それはまた、薬物摂取または代謝における交配誘発性の変化を示し、それが今度はMethに対する変化した神経反応を引き起こす。 性行動が薬物誘発活性化の異なる時間的パターンを引き起こすかどうかを調べるために、薬物投与後の遅い時点（15分）に屠殺した男性についてNAc、BLA、およびACAの切片を染色した（実験2）。

実験ＸＮＵＭＸ：一重標識細胞および二重標識細胞の分析により、性行動およびその後の屠殺の数分前のＭｅｔｈ ＸＮＵＭＸへの曝露により、ＮＡｃコアおよびシェル、ＢＬＡ、ならびにＡＣＡにおけるＦｏｓおよびｐＥＲＫ免疫標識が有意に増加した。 さらに、交配誘導性FosおよびMeth誘導性pERKの有意な同時発現がこれらの領域でも見られた（図4; 交配効果：F（1,12）= 15.93–76.62; p = 0.002- <0.001; 薬効：F（1,12）= 14.11–54.41; p = 0.003- <0.001）。 交尾した覚醒剤を注射した雄の二重標識ニューロンの数は、交尾していない覚醒剤で治療した（p <0.001）または交尾した生理食塩水で治療した（p <0.001）雄と比較して有意に多かった。 データが薬物活性化ニューロンのパーセンテージとして表された場合、活性化されたニューロンの47.2±5.4％（NAcコア）、42.7±7.6％（NAcシェル）、36.7±3.7％（BLA）、および59.5±5.1％（ACA）交配によってもメスによって活性化されました。 さらに、薬物誘発性のpERKは、交配した動物と交配していない動物の間で異ならなかった（図4b、e、h、k）、ACAを除くすべての領域で（p <0.001）。 これらのデータは、性行動が実際にメスによるpERK誘導の時間的パターンの変化を引き起こすことを示しています。

図4      

15 mg / kg Meth投与後、NAc、BLA、およびACAニューロン4での性誘導FosおよびMeth誘導pERK発現。 NAcコア内のFos（a、d、g、j）、pERK（b、e、h、k）、および二重（c、f、i、l）ラベル付きセルの平均数±sem（a、d、g、j） ...

性行動と1 mg / kg Methに続く神経活性化

これまでの結果は、性行動と4 mg / kg MethがNAcコアとシェル、BLAとACAのニューロンの重複集団を活性化することを明らかにした。 T活性化におけるこの重複に対する薬物投与量の影響を調べるために、低用量のＭｅｔｈを用いて神経活性化のパターンも調べた。 ＮＡｃコアおよびシェル、ＢＬＡ、およびＡＣＡを性別およびＭｅｔｈによって誘導される活性化について分析した。 実際、性行動とそれに続くMethへの曝露により、NAcコアとシェルのサブ領域、BLA、およびmPFCのACA領域のニューロンでFosとpERKの免疫標識が大幅に増加した（図5） 興味深いことに、低用量のＭｅｔｈは、分析した４つの脳領域において、ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ Ｍｅｔｈにより誘導されたものと同数のｐＥＲＫ標識ニューロンをもたらした。 さらに重要なことに、NAcコアおよびシェル、BLA、およびACAは、二重標識細胞の数の有意な増加を示した（図5c、f、i、l）交尾していないメタンフェタミンを注射したオスと比較した（p = 0.003- <0.001）。 データを薬物活性化ニューロンのパーセンテージとして表すと、NAcコアとシェルでそれぞれ21.1±0.9％と20.4±1.8％、BLAで41.9±3.9％、ACAニューロンの49.8±0.8％が性別によって活性化されましたとメス。

図5      

15 mg / kg Meth投与後、NAc、BLA、およびACAニューロン1での性誘導FosおよびMeth誘導pERK発現。 NAcコア内のFos（a、d、g、j）、pERK（b、e、h、k）、および二重（c、f、i、l）ラベル付きセルの平均数±sem（a、d、g、j） ...

性行動およびd-アンフェタミン投与後の神経活性化

上記の結果がＭｅｔｈに特異的であるかどうかを試験するために、交配およびＡｍｐｈ誘導性神経活性化を研究するためにさらなる実験を行った。 pERKおよびFosについての一重および二重標識細胞の分析は、性行動およびその後のAmphへの曝露が、NAcコアおよびシェルならびにBLAにおけるFosおよびpERK免疫標識の有意な増加をもたらすことを示した（図6; 交配効果：F（1,15）= 7.38–69.71; p = 0.016- <0.001; 薬効：F（1,15）= 4.70–46.01; p = 0.047- <0.001）。 さらに、二重標識ニューロンの数は、交配されていないAmph処理（p = 0.009- <0.001）または交配された生理食塩水処理（p = 0.015- <0.001）のオスと比較して交配されたAmph処理で有意に高かった（図6c、f、i） データを薬物活性化ニューロンのパーセンテージとして表した場合、それぞれNAcコアおよびシェルにおける25.7±2.8％および18.0±3.2％、ならびにBLAニューロンの31.4±2.0％は、交配およびAmphの両方によって活性化された。 ｍＰＦＣのＡＣＡ領域は、有意なレベルの交配誘導性Ｆｏｓを示した（図6j; F（1,15）= 168.51; p <0.001）。 ただし、覚醒剤とは異なり、AmphはACAにおける薬物誘発性pERKレベルの有意な増加をもたらさなかった（図6kACA内の二重標識ニューロンの数図61）交配および非交配の食塩水を注射した雄と比較した場合。

図6      

15 mg / kg Amph投与後、NAc、BLA、およびACAニューロン5における性誘導FosおよびAmph誘導pERK発現。 NAcコア内のFos（a、d、g、j）、pERK（b、e、h、k）、および二重（c、f、i、l）ラベル付きセルの平均数±sem（a、d、g、j） ...

考察

現在の研究は、細胞レベルで、天然の強化剤の性行動による神経活性化と精神刺激薬Ｍｅｔｈとの間の重複を示している。 したがって、これらのデータは、薬物が自然の報酬を調節する同じ脳領域に作用するだけでなく、実際には、薬物は自然の報酬の調節に関与する同じ細胞を活性化することを示している。 具体的には、性行動とＭｅｔｈがｍＰＦＣのＮＡｃコアおよびシェル、ＢＬＡ、およびＡＣＡ領域のニューロン集団を共活性化し、Ｍｅｔｈが性行動に影響を及ぼし得る潜在的な部位を同定することがここに示された。

性行動およびMethの投与がNAc、BLA、およびACAのニューロンの重複集団を活性化するという現在の知見は、NAcニューロンの異なる集団が薬物および自然の報酬をコードすることを示す他の研究からの知見とは対照的である。

具体的には、自然の報酬（食物と水）の自己投与中の神経活性化と静脈内コカインを比較した電気生理学的研究は、コカイン自己投与が一般的に水に反応するオペラント中に反応しなかったニューロンの異なる非重複集団を活性化したことを示したそして食品強化（92％）。 側頭部ニューロンの8％のみがコカインと自然報酬の両方による活性化を示した (Carelliら、2000).

対照的に、NAcの細胞の大部分（65％）は、たとえ1人の強化剤がより美味しかったとしても（スクロース）、異なる自然の報酬（食物と水）による活性化を示した。 (Roopら、2002).

いくつかの要因が現在の結果との食い違いの原因となっている可能性があります。 第一に、神経活動を調査するために異なる技術的アプローチが使用された。 現在の研究は、FosとpERKの二重蛍光免疫細胞化学を用いた2つの異なる刺激による同時神経活性化の検出のための神経解剖学的方法を利用し、脳領域の広い範囲にわたる単一細胞活性化の調査を可能にした。 対照的に、Carelliとその共同研究者らによる研究は、虐待の薬物の自己投与が自然の報酬によって使用されるのと同じ神経回路を活性化するかどうかに対処するために行動動物のNAcに限定した電気生理学的記録を使用した。

第二に、現在の研究は、制限されたラットで食物と水を使用した以前の研究と比較して、異なる自然の報酬、すなわち性行動を調査しました。 (カレリ、2000). 食料と水は交配よりも価値がないかもしれません。 性行動は非常にやりがいがあり、ラットは交尾に対してCPPを容易に形成します。 (アグモとベレンフェルド、1990, マルチネスとパレデス、2001, Tenk、2008). しかし、食事制限ラットは水に対してCPPを形成する (Agmoら、1993, 特典とクリフトン、1997) と食べ物 (特典とクリフトン、1997）、ｄ制限されていないラットは、口当たりの良い食べ物のためにCPPを消費して形成することが好ましい（Jaroszら、2006, Jaroszら、2007).

第三に、我々の研究ではコカインの代わりにメタンフェタミンとアンフェタミンを利用した、以前の研究とは異なる乱用薬物が含まれていました. 本結果は、特にＭｅｔｈ、そしてより少ない程度ではあるがアンフェタミンが、性行動によっても活性化されるニューロンの活性化をもたらしたことを実証する。 我々の調査結果では、薬物経験も要因となっている可能性があります。 現在の研究では、性的には経験があるが薬物未経験の動物が利用されていた。 対照的に、Carelliとその共同研究者の電気生理学的研究は、コカインへの反復暴露を受けた「よく訓練された」動物を使用しました。

それ故、性行動によって活性化されるニューロンのＭｅｔｈ誘導性活性化は薬物経験のあるラットにおいて変化することが可能である。 しかしながら、我々の研究室からの予備研究は、Methで慢性的に治療された男性における性行動とMeth治療が現在の研究で報告されたのと同じ割合の薬物活性化ニューロンを共活性化したので薬物経験が大きな要因ではないことを示唆する （NAcコアでは20.3±2.5％、NAcシェルでは27.8±1.3％、FrohmaderおよびCoolen、未発表の観察）。

最後に、現在の研究は受動投与を利用した薬物の「直接」作用を調査した。 したがって、現在の分析は、薬物探索に関与する神経回路に関する情報または薬物報酬に関連する合図を明らかにせず、むしろ薬物の薬理学的作用によって引き起こされる神経活動を明らかにする。。 以前の電気生理学的研究では、強化された反応から数秒以内に起こるNAc神経活動はコカインの薬理学的作用の結果ではなく、自己投与パラダイム内の関連因子に大きく依存しています（カレリ、2000, カレリ、2002） 具体的には、NAc神経活動は、この行動パラダイムに内在する器用な偶発事象（すなわち、レバーを押すこと）と同様に、静脈内コカイン送達に関連する刺激の反応非依存性提示によって影響を受ける（カレリ、2000, CarelliとIjames、2001, カレリ、2002, カレリとワイトマン、2004). 要約すると、自然および薬物報酬による共活性化の我々の知見は、性行動による活性化および受動的に投与されたMethおよびAmphに特異的であり得る。

方法と性別は用量依存的にNAcコアとシェルのニューロンの重複集団を活性化した。 NAcの損傷は性行動を混乱させるので、NAcの共活性化ニューロンは、性行動の動機づけおよびやりがいのある性質に対するMethの潜在的な影響を媒介するかもしれない（Liuら、1998, Kippinら、2004） さらに、低用量のMeth（1 mg / kg）は高用量のMeth（50 mg / kg）と比較して二重標識細胞の数を4％減少させたため、これらのニューロンは交配に対する用量依存的な薬物効果の可能性がある。 kg）。 この研究では共活性化ニューロンの化学表現型は特定されていないが、以前の研究では、NAcにおける薬物誘発pERKおよびFos発現はドーパミン（DA）およびグルタミン酸受容体の両方に依存することが示されている。Valjentら、2000, Fergusonら、2003, Valjentら、2005, Sunら、2008） ＮＡｃにおける交配誘発神経活性化がこれらの受容体に依存するかどうかは明らかではないが、これは他の脳領域、特に内側視索前野で実証されている（ラムリーアンドハル、1999, Dominguezら、2007). Tそのため、Methはドーパミンおよびグルタミン酸受容体の活性化を介して性行動中に活性化されるニューロンにも作用する可能性があります。 性行動におけるNAcグルタメートの役割は現在不明であるが、DAが性行動の動機づけにおいて重要な役割を果たすことは十分に確立されている。 (ハル他、2002, ハル他、2004, Pfaus、2009） 微量透析の研究では、男性の性行動の嗜好期および完了期におけるNAc DA流出の増加が報告されている（フィオリノとフィリップス、1999a, Lorrainら、1999）中辺縁系DA流出は、ラットの性行動の開始および維持の促進と相関している（Pfaus and Everitt、1995). さらに、DA操作研究は、NAcのDA拮抗薬が性行動を阻害するのに対して、作動薬は性行動の開始を促進することを示しているr（Everittら、1989, ファウスとフィリップス、1989） したがって、MethはDA受容体の活性化を介して性行動の動機づけに影響を与える可能性があります。

ＮＡｃとは対照的に、ＢＬＡおよびＡＣＡ中の二重標識細胞の数は、Ｍｅｔｈ投与量にかかわらず比較的変わらないままであった。 BLAは離散的連想学習に不可欠であり、機器反応中の条件付き強化および報酬評価に強く関与しています（Everittら、1999, Cardinalら、2002, 2002を参照してください。） BLA損傷ラットは食物と対になった条件刺激に対するレバー押圧の減少を示す（Everittら、1989）または性的強化（Everittら、1989, エヴェリット、1990） これとは対照的に、この操作は摂食の最終段階や性行動に影響を与えません（Cardinalら、2002). ＢＬＡはまた、薬物刺激と関連する条件刺激の記憶において重要な役割を果たす。 (グレースアンドローゼンクランツ、2002, ラビオレットとグレース、2006） BLAの病変または薬理学的不活性化は、獲得を妨げる（Whitelawら、1996）と式（グリムアンドシー、2000）薬物投与の過程には影響を与えないが、条件付き手がかりコカインの回復。 さらに、 BLAに直接注入されたAmphは、調整された合図の存在下で増強された薬物回復をもたらす (他、2003を参照のこと。). それゆえ、BLAにおける精神刺激薬増強DA伝達は、感情的な顕著性を高め、探索を促す可能性がある。 (Ledfordら、2003) 性的報酬の提供、したがって、Methの虐待者によって報告された性的欲求および欲求の向上に貢献 (Semple et al。、2002, グリーン＆ハルキティス、2006).

ACAでは、性活性化ニューロンの神経活性化は用量に依存せず、Amphでは観察されなかったのでMethに特異的でした。 ＭｅｔｈとＡｍｐｈは類似の構造的および薬理学的特性を有するが、ＭｅｔｈはＡｍｐｈよりもより持続的な効果を有する強力な精神刺激薬である（ＮＩＤＡ、ＸＮＵＭＸ）。 Goodwinらによる研究。 Methは、AmphよりもラットNAcにおいて、より多くのDA流出を生じ、局所的に投与されたDAのクリアランスをより効果的に阻害することを示した。 これらの特徴は、Amphと比較してMethの習慣性に寄与する可能性があります。Goodwinら、2009そしておそらく2つの薬の間で観察された神経活性化の違い。 しかしながら、異なるパターンの結果が薬物間の有効性の違いに起因するのか、あるいは採用された用量に関連した効力の問題に起因するのかは不明であり、さらなる調査が必要である。

Ｍｅｔｈおよび性による共活性化は、ｍＰＦＣの他の小領域（ＩＬおよびＰＬ）では観察されなかった。 ラットでは、ACAは食欲をそそるタスクを用いて広範囲に研究されており、刺激と強化の関係における役割を支持しています（Everittら、1999, 2002を参照してください。, Cardinalら、2003). mPFCがヒトとラットの両方において薬物渇望および薬物探索行動および薬物探索行動への再発に関与しているという十分な証拠がある。 (Grantら、1996, チルドレス他、1999, Capriles他、2003, マクローリンアンドシー、2003, Shahamら、2003, カリヴァスとボルコウ、2005） 私これに沿って、乱用薬物への反復暴露によって引き起こされるmPFC機能不全は、多くの常習者で観察されるように、衝動制御の減少および薬物指向行動の増加の原因となり得ることが提案されている。 (イェンシュ・アンド・テイラー、1999). 我々の研究室からの最近のデータは、これが嫌悪的刺激と関連していたときにmPFC病変が性的行動の継続的な探求をもたらすことを証明した (Davis他、2003） この研究はACAを調査しなかったとしても、それはmPFC（そして具体的にはACA）がMeth虐待者によって報告されたように性行動に対する抑制制御の喪失に対するMethの効果を媒介するという仮説を支持する。Saloら、2007).

結論として、これらの研究は一緒になって、乱用薬物が通常自然な報酬を媒介する神経経路にどのように作用するかをよりよく理解するための重要な第一歩を形成します。 さらに、これらの調査結果は、乱用薬物は自然報酬と同じ中辺縁系の同じ細胞を活性化しないという現在の考えとは対照的に、Meth、そしてより少ない程度ではAmphは性行動と同じ細胞を活性化する。 言い換えると、これらの共活性化神経集団は、薬物曝露後の自然な報酬の探索に影響を及ぼし得る。 最後に、この研究の結果は、一般的な中毒の根拠の理解に大きく貢献するかもしれません。 類似点と相違点の比較、性的行動と虐待薬によって誘発される中側辺縁系の神経活性化の変化は、物質濫用とそれに関連する自然の報酬の変化をよりよく理解することにつながるかもしれません。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所のR01 DA014591およびカナダの衛生研究所のRN 014705からLMCへの助成金によって支援されました。

略語

  • ABC
  • アビジン - ビオチン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体
  • ACA
  • 前帯状領域
  • アンフ
  • d-アンフェタミン
  • BLA
  • 側底扁桃体
  • BNSTpl
  • 終末条の後外側床核
  • BNSTpm
  • 終末条の後内側床核
  • BT
  • ビオチン化チラミド
  • CeA
  • 中心扁桃体
  • CPP
  • 条件付き場所の設定
  • E
  • 射精
  • EL
  • 射精潜伏期
  • IF
  • 下縁領域
  • IL
  • 挿入待ち時間
  • IM
  • 挿入
  • M
  • mount
  • MAPキナーゼ
  • マイトジェン活性化プロテインキナーゼ
  • MEApd
  • 後外側内側扁桃体
  • メタ
  • メタンフェタミン
  • ML
  • マウント待ち時間
  • mPFC
  • 内側前頭前野
  • MPN
  • 内側視索前核
  • NAc
  • 側坐核
  • PB
  • リン酸緩衝液
  • PBS
  • リン酸緩衝食塩水
  • PEI
  • 射精後の間隔
  • PERK
  • リン酸化MAPキナーゼ
  • PL
  • 予備区域
  • VTA
  • 腹側被蓋領域

脚注

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