Proc Natl Acad Sci US A. 2005 Február 1; 102(5): 1737-1742.
abstraktné
Kokaín, droga zneužívania, zvyšuje synaptické hladiny dopamínu v striate tým, že blokuje spätné vychytávanie dopamínu na termináloch axónov. Bolo zistené, že cyklín-dependentná kináza 5 (Cdk5) a jej aktivátor p35, proteíny podieľajúce sa na fosforylácii substrátov v postmitotických neurónoch, sú po chronickom vystavení kokaínu zvýšené. Na ďalšie skúmanie účinkov indukcie Cdk5 a p35 na striatálnu dopamínovú signalizáciu sme vytvorili dve nezávislé transgénne myšacie línie, v ktorých Cdk5 alebo p35 boli nadmerne exprimované špecificky v neurónoch. Uvádzame tu, že zvýšená aktivita Cdk5, ako výsledok p35, ale nie nadmernej expresie Cdk5, vedie k zmierneniu dopamínovej signalizácie sprostredkovanej kokaínom. Zvýšená fosforylácia dopamínu a cAMP-regulovaného fosfoproteínu sprostredkovaná Cdk5, molekulová hmotnosť 32 kDa (DARPP-32) v Thr-75, bola sprevádzaná zníženou fosforyláciou DARPP-32 v Thr-34. Zvýšená Cdk5-sprostredkovaná fosforylácia kinázy kinázy 1 riadenej extracelulárnym signálom riadeným kinázou 286 pri Thr-1 bola sprevádzaná zníženou aktiváciou extracelulárnej signálne regulovanej kinázy 2 / 5. Tieto účinky prispeli k zmierneniu fosforylácie proteínu viažuceho element cAMP vyvolaného kokaínom, ako aj k nižšej indukcii c-fos v striate. Tieto výsledky podporujú myšlienku, že aktivita CdkXNUMX sa podieľa na zmenenej expresii génu po chronickej expozícii kokaínu, a teda ovplyvňuje dlhodobé zmeny v neurónovej funkcii, ktorá je základom závislosti na kokaíne.
Kokaín zvyšuje synaptické hladiny dopamínu v striate a mení expresiu génu v dopaminoceptívnych neurónoch aktiváciou intracelulárnych dráh, ktoré šíria počiatočný signál z dopamínového receptora D1 do jadra (1). Chronické vystavenie účinkom kokaínu reguluje niekoľko transkripčných faktorov, čo má za následok dlhotrvajúce zmeny v expresii génov, o ktorých sa predpokladá, že sú základom pre adaptáciu neurónov pri závislosti od kokaínu (2). AFosB, identifikovaný ako taký transkripčný faktor (3), preukázalo, že zvyšuje schopnosť zvierat reagovať na kokaín (\ t4, 5). Preto sa očakáva, že identifikácia cieľových génov, ktoré sú regulované indukciou AFosB, prispeje k väčšiemu pochopeniu molekulárneho mechanizmu, ktorý je základom závislosti od kokaínu. Nedávno sa ukázalo, že chronická liečba zvierat kokaínom zvyšuje expresiu cyklín-dependentnej kinázy 5 (Cdk5) a jej aktivátora p35 v striate prostredníctvom indukcie AFosB (6, 7).
Cdk5 je členom rodiny Cdk serín / treonínkináz. Na rozdiel od iných Cdks, ktoré sú hlavnými regulátormi progresie bunkového cyklu, Cdk5 sa podieľa hlavne na fosforylácii substrátov v postmitotických neurónoch (8). Neuronálna špecificita aktivity Cdk5 sa dosahuje prostredníctvom asociácie s jej aktivátormi, buď p35 alebo p39, ktoré sú prevažne exprimované v postmitotických neurónoch (8). Okrem základnej úlohy Cdk5 v rozvoji mozgu (9, 10), it sa tiež podieľa na dopaminergnom prenose v postnatálnom mozgu (11, 12). Inhibícia aktivity Cdk5 má za následok zvýšené uvoľňovanie dopamínu v striate, čo indikuje presynaptickú funkciu Cdk5 ako negatívneho regulátora uvoľňovania dopamínu. (11). Okrem toho Cdk5 moduluje účinnosť postsynaptickej dopamínovej signalizácie fosforyláciou fosfoproteínu regulovaného dopamínom a cAMP, molekulovej hmotnosti 32 kDa (DARPP-32) v Thr-75, ktorý konvertuje DARPP-32 na inhibítor cAMP-dependentnej kinázy (PKA) (12).
Tieto pozorovania naznačujú, že Cdk5 a p35 sú následnými regulátormi dlhodobej aktivácie dopamínovej signalizácie po chronickej expozícii kokaínu a teda aj závislosti od kokaínu. Na ďalšie riešenie úlohy Cdk5 na striatálnu dopamínovú signalizáciu sme vytvorili dve transgénne myšacie línie, v ktorých buď Cdk5 alebo p35 boli nadmerne exprimované špecificky v neurónoch pod kontrolou promótora p35. Naše zistenia ukázali, že aktivita Cdk5 bola up-regulovaná zvýšenými hladinami proteínu p35, ale nie proteínom Cdk5, čo naznačuje, že hladina proteínu p35 obmedzuje rýchlosť aktivity Cdk5. Poskytujeme tu in vivo dôkaz, že zvýšená aktivita Cdk5, ako výsledok nadmernej expresie p35, vedie k oslabeniu signalizácie dopamínu sprostredkovanej kokaínom do jadra prostredníctvom inhibície kaskád PKA a extracelulárnej signálne regulovanej kinázy (ERK).
Materiály a metódy
Protilátky. Polyklonálne protilátky proti Cdk5 (C-8) a p35 (C-19) boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology. Protilátky závislé od fosforylácie a nezávislé na ERK kináze (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 a proteíne viažucom element cAMP (CREB) boli získané od Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Protilátky proti fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), celkom DARPP-32 (12) a c-fos (14), ako je opísané. Protilátka proti aktínu bola zakúpená od Sigma.
Experimentálne Zvieratá. Predtým sme klonovali myšací p35 gén Cdk5r1, ktorý kóduje proteín p35 a charakterizuje jeho genómovú štruktúru (15). Na generovanie transgénnej myši s nadmernou expresiou p35 (Tgp35), 6-kb EcoRI-EcoFragment RI obsahujúci promótorovú oblasť 1.2-kb bol subklonovaný do plazmidu pGEM9Z (-) a značka 45-bp odvodená od SV40 bola vložená do KPNI miesto za poly (A)+) signál (Obr. 1A). Značka obsahovala a SpeI miesto pre genotypizáciu zvierat. Fragment 6-kb bol vyrezaný z plazmidu a purifikovaný, nasledovaný pronukleárnou injekciou transgénu za vzniku transgénnych myší. Skúmať profil expresie transgénu pod regulačnou kontrolou promótora p1.2 35-kb in vivodvojitá transgénna myš (Tgp35; p35 - / -) bola ďalej generovaná s použitím dvojstupňovej stratégie šľachtenia, pomocou ktorej bola myš Tgp35 regenerovaná v endogénnom pozadí p35-null. Ďalšie myšacie modely použité v tejto štúdii zahŕňali p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/– a transgénnu myš s nadmernou expresiou neurónov Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotypy týchto myší sa stanovili buď analýzou Southern blot alebo PCR na genómovej DNA izolovanej z chvostovej biopsie. Myši boli umiestnené v cykle 12-h light / 12-h dark. Všetka starostlivosť bola poskytnutá v súlade s pokynmi Národného ústavu zdravotníctva o starostlivosti a používaní laboratórnych a experimentálnych zvierat.
Analýza Southern Blot. Genomická DNA extrahovaná z chvostovej biopsie sa rozštiepi EcoRl a SpeI, elektroforézou na 0.9% agarózovom géli a prenesie sa na nylonovú membránu. Membrána bola hybridizovaná s náhodným primérom 32P-značená sonda pri 42 ° C cez noc. Sonda 485-bp na genotypovanie p35 knockout (p35 - / -) a myší Tgp35 bola generovaná pomocou PCR s použitím nasledujúcich primérov: 5-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 a 5-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3. Hybridizovaná membrána bola dvakrát premytá v 2 × SSC / 0.1% SDS pri 42 ° C pre 10 min. A dvakrát v 0.1xSSC / 0.1% SDS pri 65 ° C pre 20 min. A vystavená rôntgenovému filmu.
Liečba liečiv. Kokaín (Sigma) sa rozpustil v sterilnom fyziologickom roztoku. Zvieratám bol ip-injikovaný kokaín (15 mg / kg) alebo rovnaký objem fyziologického roztoku vo veku 3 mesiacov a bol usmrtený dekapitáciou v rôznych časových bodoch (15, 30, 60 a 120 min) po injekcii. Mozgy sa rýchlo odstránili a ochladili v ľadovo studenom PBS. Striata sa potom oddelili a podrobili sa Northern alebo Western blot analýze. Na imunohistochemickú analýzu sa získali striatálne rezy od myší 2 h po injekcii.
Analýza Northern Blot. Celková RNA bola extrahovaná zo striata s činidlom TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) a podrobená Northern blot analýze, ako je opísané (18). Na detekciu c-fos mRNA sa ako sonda použil 189-bp fragment myšej c-fos cDNA.19). Hladiny c-fos mRNA boli kvantifikované meraním optickej hustoty špecifického pásu pomocou systému na analýzu obrazu s nih obrazovým softvérom, verzia 1.62.
Analýza Western Blot. Striatálne tkanivá boli sonikované v 1% SDS a varené pre 10 min. Koncentrácia proteínu v každej vzorke bola stanovená BCA proteínovým testom (Pierce). Pred prenesením na nitrocelulózovú membránu boli rovnaké množstvá proteínu oddelené SDS / PAGE. Membrány boli blokované v 1x PBS obsahujúcom 5% odstredené mlieko a 0.05% Tween 20 a inkubované s primárnymi protilátkami cez noc pri 4 ° C. Inkubácia s peroxidázou konjugovanou anti-myšou alebo králičou IgG (Sigma) sa uskutočnila pri teplote miestnosti pre 60 min. Signál bol detegovaný zvýšenou chemiluminiscenciou (Pierce) a optické hustoty pásov boli kvantifikované, ako je opísané vyššie.
Test Cdk5 kinázy. Striatálne lyzáty sa pripravili s lýznym pufrom obsahujúcim 50mM Tris-HCl, pH 7.4 / 50mM NaCl / 5mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1mM fenylmetylsulfonylfluorid / 1 μg / ml aprotinínu / 1 μg / ml ml inhibítorov leupeptínu / fosfatázy (zmes inhibítorov fosfatázy I a II, Sigma). Lyzáty boli imunoprecipitované buď anti-Cdk5 (C-8) alebo anti-p35 (C-19) protilátkami. Imunoprecipitáty Cdk5 sa pripravili inkubáciou 300 μl lyzátu (zodpovedajúceho 300 μg proteínu) s anti-Cdk5 protilátkou (3 μg) cez noc pri 4 ° C, po čom nasledovala ďalšia inkubácia s 25 μl proteínových agarózových perličiek (50) Suspenzia v lyzačnom pufri, Santa Cruz Biotechnology) pre 3 h pri 4 ° C. Na prípravu imunoprecipitátov p35 sa 500 μl lyzátu (zodpovedajúci 1 mg proteínu) inkuboval s anti-p35 protilátkou (3 μg), ako je opísané vyššie. Imunoprecipitáty boli dvakrát premyté lyzačným pufrom a dvakrát kinázovým pufrom obsahujúcim 50 mM Tris HCI, pH 7.4 / 5 mM MgCl.2/ 1mM EDTA / 1mM EGTA / 1mM DTT, resuspendovaný v 60 μl kinázového pufra. Aktivita kinázy bola meraná s použitím histónu H1 ako substrátu (18).
Imunohistochémia. Myši sa anestetizovali ip injekciami avertínu (250 mg / kg, Fluka) a perfundovali sa transkardiálne s pufrom 0.1 M fosfát sodný, pH 7.4, po ktorom nasledoval Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE). Rozštiepené mozgy sa ďalej fixovali v rovnakom fixačnom činidle cez noc pri 37 ° C. Potom boli mozgy zapustené do parafínu, narezané na koronálne rezy hrubé 5-um a podrobené imunohistochémii použitím komplexnej techniky avidín-biotín-peroxidáza (Vector Laboratories) s diaminobenzidínom ako substrátom. Rezy boli inkubované s afinitne purifikovanou polyklonálnou protilátkou proti c-fos cez noc pri 4 ° C. Špecifickosť zafarbenia bola hodnotená vynechaním primárnej protilátky.
výsledky
Generovanie transgénnych myší s neurónovou nadmernou expresiou p35. Transgén použitý na dosiahnutie zvýšenej neuronálnej expresie p35 obsahoval 6-kb fragment klonovaného myšieho p35 génu obsahujúceho 1.2-kb promótor a celú kódujúcu sekvenciu p35 (Obr. 1 A). Genotypy myší sa určili analýzou Southern blot s použitím sondy, ktorá bola navrhnutá na rozlíšenie myší p35 - / - a Tgp35 od myší divokého typu (Obr. 1 A a B), Na preskúmanie expresie transgénu pod kontrolou promótora p1.2 s 35-kb sme vytvorili dvojité transgénne myši (Tgp35; p35- / -), v ktorých expresia p35 bola riadená len z transgénu. Expresia p35 v Tgp35, p35 - / - myši bola pozorovaná len v mozgu (Obr. 1C), kde vzor priestorovej expresie bol podobný ako u myší divokého typu (Obr. 1D). Preukázalo sa, že nedostatok p35 má za následok abnormálnu štruktúru vrstvenia v mozgovej kôre a hipokampe myší (10). Avšak myši Tgp35, p35 - / - vykazovali úplnú záchranu fenotypu p35 - / - mozgu (Obr. 1E). Tieto údaje naznačujú, že promótor p1.2 35-kb riadil expresiu transgénu s podobným profilom expresie ako p35 z endogénneho génu p35.
Proteínová hladina p35 je limitujúca pre zvýšenie aktivity Cdk5. Skúmali sme účinky génov na dávkovanie génov kódujúcich p35 a Cdk5 na expresiu proteínu v striatálnych extraktoch z myší p35 - / -, p35 +/–, divokého typu, Tgp35, Cdk5 +/– a TgCdk5 vo veku 3 mesiacov. Hladiny proteínu p35 a Cdk5 korelovali dobre s dávkami génu, resp.Obr. 2 A a B). Myši Tgp35 vykazovali -1.6-násobné zvýšenie hladiny proteínu p35 v porovnaní s myšami divokého typu, zatiaľ čo hladiny proteínu Cdk5 neboli ovplyvnené rôznymi hladinami proteínu p35. Myši TgCdk5 vykazovali -1.9-násobné zvýšenie hladiny proteínu Cdk5 v porovnaní s myšami divokého typu, zatiaľ čo hladiny proteínu p35 neboli ovplyvnené rôznymi hladinami proteínu Cdk5. Na preskúmanie účinkov rôznych množstiev proteínu p35 na aktivitu Cdk5 sa Cdk5 imunoprecipitoval zo striatálnych extraktov s anti-Cdk5 protilátkou a merala sa aktivita kinázy. Podobne, aby sa preskúmali účinky rôznych množstiev Cdk5 proteínu na kinázovú aktivitu, p35 bol imunoprecipitovaný zo striatálnych extraktov s anti-p35 protilátkou a merala sa kinázová aktivita. Aktivita Cdk5 korelovala s hladinou proteínu p35, ale nie s hladinou proteínu Cdk5 (Obr. 2 C a D). Tieto výsledky ukázali, že množstvo proteínu p35 je faktorom obmedzujúcim rýchlosť aktivity Cdk5. Preto sme použili myši Tgp35 na skúmanie účinkov zvýšenej aktivity Cdk5 na signalizáciu striatálneho dopamínu.
Fosforylácia DARPP-32 indukovaná kokaínom na Thr-34 je oslabená v myšiach Tgp35. Funkcia DARPP-32 závisí od stavu fosforylácie na viacerých miestach (20). PKA fosforyluje DARPP-32 v Thr-34, zatiaľ čo Cdk5 fosforyluje DARPP-32 v Thr-75. Skúmali sme teda stav fosforylácie DARPP-32 v striatálnych extraktoch myší divokého typu a myší Tgp35. Hladina fosfo-Thr-75 DARPP-32 bola vyššia u myší Tgp35 (Obr. 3A; 1.6 ± 0.2-násobok hodnoty myší divokého typu). Ďalej sme hodnotili účinky zvýšenej aktivity Cdk5 na signalizáciu striatálneho dopamínu. Skúmali sme aktiváciu PKA indukovanú kokaínom u myší Tgp35 analýzou fosforylačného stavu DARPP-32 v Thr-34. Hladina fosfo-Thr-34 DARPP-32 bola zvýšená u myší divokého typu 15 min po injekcii kokaínu (Obr. 3B; 1.8 ± 0.2-násobok nad bazálnou hladinou). Avšak účinok kokaínu na Thr-34 fosforyláciu DARPP-32 bol oslabený u myší Tgp35 (1.2 ± 0.3-násobok nad bazálnou hladinou). Tieto výsledky ukázali, že zvýšenie aktivity Cdk5 zmiernilo aktiváciu PKA indukovanú kokaínom pravdepodobne prostredníctvom fosforylácie DARPP-32 v Thr-75 (6, 12). Je tiež možné, že zvýšenie presynaptickej aktivity Cdk5 vedie k zníženiu uvoľňovania dopamínu a že to prispieva k zníženému účinku kokaínu. Jedna injekcia kokaínu neovplyvnila hladinu proteínu p35 a Cdk5, ako aj aktivitu kinázy (Obr. 3 C a D). To je v protiklade s predchádzajúcou štúdiou, v ktorej sa ukázalo, že chronická expozícia kokaínu reguluje expresiu p35 a Cdk5 (6).
Up-regulácia aktivity Cdk5 Zosilňuje aktiváciu ERK1 / 2 indukovanú kokaínom. Nedávne dôkazy ukazujú, že aktivácia dopamínových receptorov v striate tiež aktivuje iné signálne kaskády, vrátane ERK dráhy (21, 22), ktorá má dôležitú úlohu v reakcii na správanie kokaínu (\ t23). Preto sme skúmali, či aktivita Cdk5 môže ovplyvniť aktiváciu ERK dráhy indukovanú kokaínom. Aktivácia dráhy ERK bola pozorovaná po injekcii kokaínu v striatálnych extraktoch z myší divokého typu, čo je zrejmé zo zvýšenej fosforylácie MEK1 / 2 na Ser-217 a Ser-221 (1.5 ± 0.2-násobok nad bazálnou hladinou) a ERK1 / 2 pri Thr-202 a Tyr-204 (fosforylácia ERK2: 1.5 ± 0.2-násobok nad bazálnou hladinou) (Obr. 4 A a B). Avšak aktivácia MEK1 / 2 indukovaná kokaínom (1.2 ± 0.2-násobne nad bazálnou hladinou) a ERK1 / 2 (fosforylácia ERK2: 1.2 ± 0.2-násobok nad bazálnou hladinou) bola u myší Tgp35 oslabená (Obr. 4 A a B). Okrem toho bazálne hladiny fosfo-ERK1 / 2 boli nižšie u myší Tgp35 (0.8 ± 0.2-násobne pod hodnotou myší divokého typu), zatiaľ čo tento trend nebol štatisticky významný. Tento druhý výsledok možno pripísať fosforylácii MEK5 závislej od Cdk1 v Thr-286, čo má za následok zníženie katalytickej aktivity (24). Na posúdenie tejto možnosti sme skúmali stav fosforylácie MEK1 v Thr-286 a zistili, že vyššie hladiny fosfo-Thr-286 MEK1 boli prítomné v striatálnych extraktoch z myší Tgp35 (Obr. 4C; 1.3 ± 0.1-násobok hodnoty myší divokého typu). Fosforylačný stav MEK1 pri Thr-286 sa nezmenil ani jednorazovou injekciou kokaínu, čo je v súlade so zistením, že liečba Cdk5 nebola liečbou ovplyvnená (Obr. 3D).
Propagácia dopamínovej signalizácie do jadra je oslabená zvýšenou aktivitou Cdk5. Kokaínom indukovaná aktivácia viacerých signálnych kaskád zahŕňajúcich PKA a ERK vedie k následnej aktivácii transkripčného faktora CREB v jadre prostredníctvom jeho fosforylácie na Ser-133 (22, 25). Na zistenie, či Cdk5-sprostredkované inhibičné účinky na aktivačné kaskády PKA a ERK môžu konvergovať na fosforyláciu CREB v jadre, sme skúmali fosforylačný stav CREB na Ser-133 v striatálnych extraktoch myší divokého typu a myší Tgp35. Bazálna hladina fosfo-CREB bola nižšia u myší Tgp35 (0.7 ± 0.1-násobok hodnoty divokých myší) (Obr. 5). V reakcii na injekciu kokaínu bola hladina fosfo-CREB zvýšená v striatu myší divokého typu (1.5 ± 0.1-násobne nad bazálnu úroveň), ale táto odpoveď na kokaín bola u myší Tgp35 oslabená (1.2 ± 0.1- nad bazálnu úroveň) (Obr. 5).
Fosforylácia CREB na Ser-133 zvyšuje svoju transkripčnú aktivitu prostredníctvom cAMP responzívneho elementu v promótorovej oblasti určitých génov, vrátane c-fos génu (26). Preto sme skúmali indukciu c-fos v striatu myší divokého typu a myší Tgp35 po injekcii kokaínu. U myší divokého typu sa hladina c-fos mRNA zvýšila na maximálnu hodnotu (1.8 ± 0.2-násobok nad bazálnu hladinu) 30 min po injekcii kokaínu a následne sa 120 min po injekcii vrátil na základnú úroveň (Obr. 6 A a B). Avšak hladiny c-fos mRNA boli o -30% nižšie u myší Tgp35 ako u myší divokého typu až do 30 min po injekcii (Obr. 6 A a B). Menšia indukcia c-fos u myší Tgp35 bola ďalej potvrdená imunohistochémiou (Obr. 6 C-F). Podávanie kokaínu zvýšilo imunoreaktivitu c-fos, silne v dorsomediálnych dorsocentrálnych častiach striatu a slabo v laterálnych častiach u myší divokého typu aj u myší Tgp35. Zvýšenie počtu c-fos-imunopozitívnych buniek indukované kokaínom však bolo v striatu myší Tgp35 (pozri vyššie) výrazne oslabené (Obr. 6G). Tieto výsledky spoločne ukázali, že u myší Tgp35 bolo inhibované kokaínom sprostredkované zvýšenie signalizácie striatálneho dopamínu do jadra, čo je pravdepodobne výsledkom zvýšenej aktivity Cdk5.
Diskusia
Cdk5 a jeho aktivátor p35 boli identifikované ako cieľové gény, ktoré sú up-regulované chronickou expozíciou kokaínu. (6). Uvádzame tu dôkaz, že zvýšená aktivita Cdk5, ako výsledok up-regulácie p35 namiesto Cdk5 up-regulácie, vedie k zmierneniu dopamínovej signalizácie sprostredkovanej kokaínom v striatálnych neurónoch. Na preskúmanie následkov zvýšenej expresie buď Cdk5 alebo p35 na striatálnu dopamínovú signalizáciu boli analyzované dve transgénne myšacie línie, TgCdk5 a Tgp35 myši. Zistili sme, že aktivita Cdk5 bola up-regulovaná v pomere k zvýšenej hladine proteínu p35, ale nebola ovplyvnená zvýšenou hladinou proteínu Cdk5. Naša predchádzajúca správa tiež ukázala, že aktivita Cdk5 v mozgu myši TgCdk5 bola nižšia ako v mozgu divého typu myší, keď sa aktivita merala s použitím imunoprecipitátov Cdk5 (17), čo naznačuje, že nadmerná expresia Cdk5 vedie k zvýšenej hladine monomérneho Cdk5, ak sa hladina p35 nezvýši. Tieto výsledky ukázali, že hladina proteínu p35 je faktorom obmedzujúcim rýchlosť aktivity Cdk5.
Myši Tgp35 vykazovali nižšiu indukciu fosforylácie CREB a c-fos v striate po akútnej injekcii kokaínu, čo naznačuje, že striatálna reakcia na kokaín bola inhibovaná zvýšenou aktivitou Cdk5. Zoslabenie kokaínom sprostredkovanej dopamínovej signalizácie u myší Tgp35 sa pravdepodobne dosiahlo prostredníctvom Cdk5-sprostredkovanej inhibície viacerých signálnych kaskád zahŕňajúcich DARPP-32, PKA a ERK. Podávanie kokaínu zvýšilo fosforyláciu PKA DARPP-32 pri Thr-34 u myší divokého typu, zatiaľ čo táto odpoveď bola u myší Tgp35 oslabená. Bolo preukázané, že fosforylácia DARPP-32 v Thr-34 fosforyláciou PKA inhibuje aktivitu proteínovej fosfatázy 1 (PP1), enzýmu zodpovedného za defosforyláciu Ser-133 CREB (27). Aktivita PP1 by teda nebola antagonizovaná prostredníctvom DARPP-32 / PP1 dráhy u myší Tgp35.
Aktivácia ERK1 / 2 vyvolaná kokaínom bola tiež oslabená u myší Tgp35. Existuje niekoľko rôznych mechanizmov, ktorými by Cdk5 mohol inhibovať aktiváciu ERK1 / 2 indukovanú kokaínom. Po prvé, Cdk5-dependentná fosforylácia DARPP-32 v Thr-75 by mohla inhibovať PKA, čo by viedlo k následnej inhibícii akejkoľvek PKA-sprostredkovanej MEK1 / 2 aktivácie, ktorá je potrebná na aktiváciu ERK1 / 2. Nedávna štúdia tiež zistila, že fosforylácia DARPP-32 v Thr-34 je potrebná na aktiváciu ERK1 / 2 sprostredkovanú kokaínom viacerými dráhami zahŕňajúcimi nepriamu reguláciu aktivácie MEK, ako aj reguláciu fosfatázy obohatenej o striatal, tyrozín fosfatázy, ktorá pôsobí priamo na ERK1 / 2 (28). Podporu pre túto možnosť svedčí zistenie, že fosforylácia MEK1 / 2 indukovaná kokaínom na Ser-217 a Ser-221 bola u myší Tgp35 zrušená. Ďalšia pravdepodobná cesta je prostredníctvom Cdk5-dependentnej fosforylácie MEK1 v Thr-286, čo by malo za následok zníženie jeho katalytickej aktivity a viedlo by k inhibícii aktivity ERK1 / 2 (24).
Ukázalo sa, že inhibícia aktivity Cdk5 v striate podporuje potencionálne účinky chronickej liečby kokaínom u zvierat (6). V súlade s hypotézou, že up-regulácia aktivity Cdk5 môže prispievať k neuronálnej adaptácii na potlačenie účinkov opakovaného podávania kokaínu (6), zistili sme, že fosforylácia DARPP-5 sprostredkovaná Cdk32 a MEK1 prispeli k zmierneniu aktivácie ERK1 / 2 indukovanej kokaínom, čo viedlo k nižšej indukcii fosforylácie CREB a c-fos v striate. Naše zistenia podporujú myšlienku, že zvýšená aktivita Cdk5, ako výsledok p35 up-regulácie, môže zmeniť chronickú expresiu v striate po chronickej expozícii kokaínu. K tomu môže dôjsť prostredníctvom zmien v aktivitách transkripčných faktorov, ako sú CREB a c-fos. Aktivátor pdNXX, Cdk5, môže vďaka svojim účinkom obmedzujúcim rýchlosť na aktivitu Cdk35 prispievať k dlhodobým zmenám v neuronálnej funkcii, ktorá je základom závislosti na kokaíne..
Poďakovanie
Ďakujeme Drs. Mary Jo Danton, Philip Grant a Sashi Kesavapany na kritické čítanie rukopisu. Táto práca bola podporená Národnými inštitútmi zdravia Grant Z01DE00664-05 (pre ABK), Grant DA10044 pre verejné zdravotníctvo USA a granty Nadácie Simons, Nadácie Petra J. Sharpa a Nadácie Picower (PG).
Poznámky
Skratky: Cdk5, kináza závislá od cyklínu 5; ERK, extracelulárnej kinázy riadenej signálom; DARPP-32, dopamín a fosfoproteín regulovaný cAMP, molekulová hmotnosť 32 kDa; PKA, kináza závislá od cAMP; MEK, ERK kináza; CREB, proteín viažuci element cAMP-odozvy.
Referencie
;
