Odstúpenie vyvoláva odlišné vzory expresie FosB / ΔFosB u šialených švajčiarskych myší klasifikovaných ako citlivé a odolné voči etnómom indukovanej pohybovej senzibilizácii (2014)

---

Kľúčové slová

• FosB;
• DeltaFosB;
• Lokomotorická senzibilizácia;
• Odňatie;
• Variabilita správania;
• Myši

---

1. Úvod

Výzvou súčasného neurobiologického výskumu drogovej závislosti je pochopiť mechanizmy neuronálnej plasticity, ktoré sprostredkovávajú prechod od rekreačného užívania k strate behaviorálnej kontroly nad vyhľadávaním a užívaním drog. Jedna z najdôležitejších teórií drogovej závislosti, nazývaná „temná stránka závislosti“, naznačuje, že existuje progresia od impulzivity (súvisiacej s pozitívnym posilňovaním) k kompulzivity (súvisiacej s negatívnym posilňovaním). Táto progresia v kolapsovanom cykle zahŕňa nasledujúce stavy: preokupácia/očakávanie, intoxikácia záchvatmi a abstinenčné príznaky/negatívny afekt ( Koob a Le Moal, 2005 , Koob a Le Moal, 2008 a Koob a Volkow, 2010 ). Od tohto scenára sa štúdie drogovej závislosti zameriavajú na neurobiologické mechanizmy súvisiace s negatívnymi emocionálnymi stavmi vyplývajúcimi z akútnej aj dlhotrvajúcej abstinencie. Podľa teórie „temnej stránky závislosti“ sa zdá, že dochádza k dlhodobým a pretrvávajúcim zmenám plasticity v neurónových obvodoch, ktorých cieľom je obmedziť odmenu. Tieto zmeny plasticity však vedú k negatívnemu emocionálnemu stavu, ktorý sa objaví, keď je prístup k droge zabránený. Tento mechanizmus poskytuje silný motivačný impulz pre vznik závislosti, ako aj pre jej udržanie ( Koob a Le Moal, 2005 a Koob a Le Moal, 2008 ).

Lokomotorická senzibilizácia je užitočný zvierací model založený na skutočnosti, že zvýšenie subjektívnych účinkov drog počas ich opakovanej expozície je podobné zvýšeniu stimulačných lokomotorických účinkov drogy ( Vanderschuren a Kalivas, 2000 a Vanderschuren a Pierce, 2010 ). Hoci lokomotorická senzibilizácia nenapodobňuje niektoré správanie súvisiace so závislosťou od drog, jej časové morfologické a neurochemické znaky sú paralelné s tými, ktoré vedú k prechodu od rekreačného užívania k samotnej drogovej závislosti ( Robinson a Kolb, 1999 , Vanderschuren a Kalivas, 2000 a Vanderschuren a Pierce, 2010 ). Tradične protokol lokomotorickej senzibilizácie pozostáva z troch fáz: akvizícia (opakovaná expozícia droge), abstinenčné obdobie a výzva (nový kontakt s drogou po abstinenčnom období). Väčšina štúdií využívajúcich lokomotorickú senzibilizáciu sa bohužiaľ zamerala iba na fázu akvizície a výzvy, pričom sa prekrývala s abstinenčným obdobím.

Je dobre známe, že opakované vystavenie drogám ( Perrotti a kol., 2008 ) a chronickému stresu ( Perrotti a kol., 2004 ) zvyšuje expresiu transkripčného faktora fosB/deltafosB v kortikolimbickom systéme. Predpokladá sa, že akumulácia FosB/DeltaFosB v týchto oblastiach zohráva ústrednú úlohu v odolnosti voči stresu ( Berton a kol., 2007 a Vialou a kol., 2010 ) a v odmeňujúcich účinkoch kokaínu ( Harris a kol., 2007 a Muschamp a kol., 2012 ), etanolu ( Kaste a kol., 2009 a Li a kol., 2010 ) a opioidov ( Zachariou a kol., 2006 a Solecki a kol., 2008 ). Preto je možné, že FosB/DeltaFosB moduluje niektoré udalosti neuronálnej plasticity súvisiace s lokomotorickou senzibilizáciou indukovanou etanolom, ako aj s abstinenčnými príznakmi, ktoré nasledujú po fáze akvizicie lokomotorickej senzibilizácie.

Je pozoruhodné, že počas prechodu z rekreačného užívania na drogovú závislosť sa pozorujú individuálne rozdiely ( Flagel a kol., 2009 , George a Koob, 2010 a Swendsen a Le Moal, 2011 ). Napríklad myši DBA/2 J sú náchylnejšie reagovať na etanolom indukovanú lokomotorickú senzibilizáciu ako myši C57BL/6 J ( Phillips a kol., 1997 a Melón a Boehm, 2011a ). U outbredných švajčiarskych myší bola variabilita správania týkajúca sa etanolom indukovanej lokomotorickej senzibilizácie prvýkrát opísaná Masurom a dos Santosom (1988) . Odvtedy ďalšie štúdie preukázali dôležité neurochemické znaky súvisiace s variabilitou správania pri získavaní lokomotorickej senzibilizácie indukovanej etanolom ( Souza-Formigoni a kol., 1999 , Abrahão a kol., 2011 , Abrahão a kol., 2012 , Quadros a kol., 2002a a Quadros a kol., 2002b ). Tieto štúdie sa však nezaoberali vplyvom variability správania počas abstinenčného obdobia po fáze získavania lokomotorickej senzibilizácie. V nedávnej štúdii naše laboratórium opísalo významný rozdiel medzi senzibilizovanými a nesenzibilizovanými outbrednými švajčiarskymi myšami, pokiaľ ide o expresiu kanabinoidného receptora typu 1 (CB1R) počas abstinenčného obdobia. V tejto štúdii mali senzibilizované (ale nie nesenzibilizované myši) zvýšenú expresiu CB1R v prefrontálnom kortexe, ventrálnej tegmentálnej oblasti, amygdale, striate a hipokampe ( Coelhoso a kol., 2013 ).

Vzhľadom na dobre zavedenú variabilitu správania u pôvodných švajčiarskych myší, pokiaľ ide o lokomotorickú senzibilizáciu vyvolanú etanolom, a že táto variabilita je sprevádzaná zreteľnými neurochemickými vlastnosťami počas následného vysadenia, skúmala táto štúdia expresiu FosB / DeltaFosB u senzibilizovaných a nesenzibilizovaných myší na začiatku (18 h) a po 5 dňoch od odstúpenia.

2. materiál a metódy

2.1. predmety

Boli použité samce outbredných myší kmeňa Swiss Webster (EPM-1 Colony, São Paulo, SP, Brazília), pôvodne odvodené z línie Albino Swiss Webster z Centra pre vývoj zvieracích modelov v biológii a medicíne na Federálnej univerzite v São Paule. Myši mali na začiatku testovania 12 týždňov (30 – 40 g). Skupiny po 10 myšiach boli umiestnené v klietkach (40 × 34 × 17 cm) s podstielkou z drevených štiepok. Kolónia zvierat s kontrolovanou teplotou (20 – 22 °C) a vlhkosťou (50 %) sa udržiavala v cykle svetlo/tma (12/12 h) so zapnutým svetlom o 7:00 h, s granulovaným krmivom pre myši a vodou z vodovodu ad libitum, s výnimkou obdobia testovania. Myši boli v týchto podmienkach chované najmenej 07 dní pred začiatkom liečby liekmi a behaviorálnych testov. Starostlivosť o zvieratá a experimentálne postupy sa vykonávali podľa protokolov schválených Etickou komisiou pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie univerzity (číslo protokolu: 2043/09) v súlade so smernicou EÚ 2010/63/EÚ o pokusoch na zvieratách ( http://ec.europa.eu/environmental/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm ).

2.2. Lokomotorická senzibilizácia

Protokol lokomotorickej senzibilizácie bol založený na predchádzajúcej štúdii z nášho vlastného laboratória ( Coelhoso a kol., 2013 ). Na začiatku protokolu boli všetky zvieratá intraperitoneálne (ip) injekčne podané soľným roztokom a okamžite boli testované v automatizovanom aktivitnom boxe (Insight, Brazília) počas 15 minút na stanovenie bazálnej lokomócie. O dva dni neskôr boli zvieratá denne injekčne podávané etanolom (2 g/kg, 15 % hm./obj. v 0.9 % NaCl, ip – skupina s EtOH, N = 40) alebo soľným roztokom (podobný objem, ip, – kontrolná skupina, N = 12) počas 21 dní. Hneď po 1., 7., 14. a 21. injekcii boli zvieratá umiestnené na 15 minút do aktivačnej klietky. Horizontálna lokomócia v každej situácii bola meraná systémom behaviorálnej analýzy (Pan Lab, Španielsko). Ako sa očakávalo ( Masur a dos Santos, 1988 a Coelhoso a kol., 2013 ), variabilita správania v lokomotorickej aktivite v 21. deň akvizície nám umožňuje rozdeliť zvieratá zo skupiny EtOH do 2 podskupín: EtOH_Vysoká (z horných 30 % distribúcie) a EtOH_Nízka (z dolných 30 % distribúcie). Do analýzy bolo teda zahrnutých iba 60 % zvierat. Táto stratégia je identická so stratégiami použitými v štúdiách skúmajúcich individuálnu variabilitu v rámci paradigmy senzibilizácie na etanol ( Masur a dos Santos, 1988 , Souza-Formigoni a kol., 1999 , Quadros a kol., 2002a , Quadros a kol., 2002b , Abrahão a kol., 2011 , Abrahão a kol., 2012 a Coelhoso a kol., 2013 ).

Po klasifikácii definujúcej experimentálne skupiny sme vykonali 2 nezávislé experimenty podľa časových kritérií abstinenčného obdobia: (i) zvieratá podrobené akvizícii a usmrtené po 18 hodinách od vysadenia a (ii) zvieratá podrobené akvizícii a usmrtené po 5 dňoch od vysadenia. Táto štúdia teda zahŕňala 3 experimentálne skupiny (kontrolná, EtOH_High a EtOH_Low), ktoré boli rozdelené do 2 podskupín (18 hodín a 5 dní od vysadenia) ( N = 6 na podskupinu). Voľba týchto dvoch časových značiek v rámci abstinenčného obdobia bola spôsobená kinetickými aspektmi expresie FosB a DeltaFosB po 18 hodinách od vysadenia (ako je vysvetlené v diskusnej časti) a po 5 dňoch od vysadenia, na základe predchádzajúcich štúdií z nášho laboratória, ktoré skúmali niektoré neurochemické vlastnosti týkajúce sa abstinenčného obdobia v rámci paradigmy lokomotorickej senzibilizácie ( Fallopa a kol., 2012 a Escosteguy-Neto a kol., 2012 ). Nakoniec, aby sme vykonali korelácie medzi lokomotorickou senzibilizáciou a expresiou FosB/DeltaFosB, vypočítali sme skóre lokomotorickej senzibilizácie pre každé zviera pomocou vzorca: skóre = (Lokomócia v 21. deň − Lokomócia v 1. deň) * 100 / Lokomócia v 1. deň.

2.3. imunohistochémia

Po príslušnom ochrannom období boli zvieratá hlboko anestetizované kokteilom obsahujúcim ketamín (75 mg / kg, ip) a xylazín (25 mg / kg, ip). Po strate rohovkového reflexu boli transkardiálne premyté 100 ml fosfátového tlmivého roztoku 0.1 M [fosfátom pufrovaný soľný roztok (PBS)], potom 100 ml 4% paraformaldehydu (PFA). Mozgy sa vybrali okamžite po perfúzii, uložili sa do PFA na 24 hodín a potom sa držali v 30% roztoku sacharózy / PBS po dobu 48 hodín. Sériové koronálne rezy (30 μm) boli narezané pomocou mraziaceho mikrotómu a ponechané vo vnútri nemrznúceho roztoku, ktorý bol použitý v imunohistochemických postupoch voľne plávajúcim farbením.

Pre imunohistochémiu sa použila konvenčná technika avidín-biotín-imunoperoxidáza. Do rovnakého pokusu boli zahrnuté mozgové rezy všetkých experimentálnych skupín, ktoré boli predbežne ošetrené peroxidázou vodíka (3%) počas 15 minút a potom premývané PBS počas 30 minút. Potom boli všetky rezy exponované počas 30 minút v PBS-BSA, 5%, aby sa zabránilo nešpecifickým reakciám. Potom boli rezy inkubované cez noc s králikom primárnej protilátky anti-FosB / DeltaFosB (1: 3,000 32519; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA, kat. Číslo AV30) v roztoku PBS-T (300 ml PBS, 100 μl Tritonu X-2). Následne boli rezy inkubované 1 hodiny v biotinylovanej kozej anti-králičej IgG sekundárnej protilátke (600: 90; Vector, Burlingame, CA, USA) pri teplote miestnosti. Na rezy sa potom pôsobilo XNUMX minút komplexom avidín-biotín (súprava Vectastain ABC Standard; Vector, Burlingame, CA, USA) a podrobili sa diaminobenzidínovej reakcii zosilnenej niklom. Medzi krokmi boli rezy opláchnuté v PBS a trepané na rotátore. Rezy sa pripevnili na podložné sklíčka potiahnuté želatínou, vysušili, dehydratovali a prikryli krycím sklíčkom.

Analyzovali sa nasledujúce encefalické oblasti: prefrontálny kortex [predný cingulárny kortex (Cg1), prelimbický kortex (PrL) a infralimbický kortex (IL)], motorický kortex [primárny (M1) a sekundárny (M2)], dorzálne striatum [dorzomediálne striatum (DmS) a dorzolaterálne striatum (DlS)], ventrálne striatum [nucleus accumbens core (Acbco) a shell (Acbsh), ventrálne pallidum (VP)], hipokampus [pyramídová vrstva Cornus Ammong 1 a 3 (CA1 a CA3), granulovaná vrstva gyrus dentate (DG)], amygdala [bazolaterálne jadro (BlA) a centrálne jadro (CeA)], ventromediálne jadro hypotalamu (VMH) a ventrálna tegmentálna oblasť [predná (VTAA) a zadná (VTAP) časť] (pozri obr. 1 ). Na zachytenie snímok z každej sekcie pri 20-násobnom zväčšení sa použil mikroskop Nikon Eclipse E200 pripojený k počítaču. Snímky sa uložili ako archívy .tiff pre následnú analýzu imunoreaktivity FosB/DeltaFosB. Imunoreaktívne bunky sa spočítali pomocou softvéru ImageJ (NIH Image, Bethesda, MD, USA). Oblasti mozgu boli na každej fotografii vyznačené podľa Stereotaxického atlasu mozgu myší ( Franklin a Paxinos, 1997 ⁾ . Keďže mikrofotografie zhotovené mikroskopom predstavujú 2.5 × 10³ ^μm² pri 20-násobnom zväčšení, kvantifikácia buniek označených FosB/DeltaFosB sa vyjadruje ako priemer imunofarbených buniek na 2.5 × 10³ ^μm² . Hodnoty získané v skupinách s EtOH ^sa normalizovali na kontrolné hodnoty a vyjadrili sa v %. (Kontrola = 100 %).

2.4. Štatistická analýza

Spočiatku sa na overenie normality distribúcie všetkých premenných použil Shapiro-Wilkov test. Výsledky správania sa analyzovali jednofaktorovou ANOVA pre opakované meranie, pričom sa ako faktor bral do úvahy 5 období lokomotorickej senzibilizácie: bazálne, 1. deň, 7. deň, 14. deň a 21. deň. Histologické výsledky sa analyzovali dvojfaktorovou ANOVA, pričom sa ako faktory brali do úvahy: obdobie vysadenia (18 hodín a 5 dní) a experimentálna skupina (kontrola, EtOH_High a EtOH_Low). Neparametrické premenné boli štandardizované do Z-skóre, aby sa znížil rozptyl údajov, a následne boli použité v dvojfaktorovej ANOVA, ako bolo opísané predtým. V prípade potreby sa použil Newman-Keulsov post-hoc test. Nakoniec sme skúmali možné korelácie medzi bunkami pozitívnymi na FosB/DeltaFosB a skóre lokomotorickej senzibilizácie. Tieto korelácie sa vypočítali iba pre jadrá, kde sa zistili štatistické rozdiely medzi experimentálnymi skupinami. Keďže tieto rozdiely boli obmedzené na 5 dní po vysadení (pozri časť s výsledkami), hodnoty FosB/DeltaFosB uvažované v týchto koreláciách sa vzťahujú na toto konkrétne obdobie po vysadení. Keďže tieto rozdiely boli obmedzené na 5 dní po vysadení (pozri časť s výsledkami), hodnoty FosB/DeltaFosB uvažované v týchto koreláciách sa vzťahujú na tento konkrétny čas po vysadení. Hladina významnosti bola stanovená na 5 % ( p < 0.05).

3. výsledok

3.1. Lokomotorická senzibilizácia

ANOVA pre opakované merania zistila významné rozdiely v skupinovom faktore [F_(2,32) = 68.33, p <0.001], v období protokolu [F_(4,128) = 9.13, p <0.001] a interakcia medzi nimi [F_(8,128) = 13.34, p <0.001]. Neboli zistené žiadne rozdiely v bazálnej lokomócii a obe skupiny EtOH mali podobné zvýšenie lokomócie v prvý deň akvizície v porovnaní s kontrolnou skupinou (p <0.01). Avšak EtOH_High (ale nie EtOH_Low) predstavoval progresívne zvýšenie lokomočnej aktivity počas akvizičnej fázy (p <0.01, vo vzťahu ku skupinám Control a EtOH_Low, v posledný deň akvizície; p <0.01 vo vzťahu k jeho pohybovej aktivite v prvý deň nadobudnutia) ( Obr). Tieto údaje potvrdzujú výsledky pôvodnej štúdie (\ t Masur a dos Santos, 1988) az našej predchádzajúcej správy ( Coelhoso a kol., 2013) týkajúce sa behaviorálnej variability u outbredných švajčiarskych myší, ktoré boli podrobené etanolom indukovanej lokomotorickej senzibilizácii.

3.2. Expresia FosB / DeltaFosB

Ilustratívne fotomikrografie imunoreaktivity FosB/DeltaFosB sú znázornené na obr. 3 a normalizované hodnoty sú uvedené na obr. 4 , obr. 5 , obr. 6 a obr. 7. Obojsmerná ANOVA zistila významné rozdiely v M1, M2, DmS, DlS, Acbco, Acbsh, VP a VTA (nenormalizované hodnoty imunoreaktivity FosB/DeltaFosB a štatistické analýzy všetkých štruktúr sú uvedené v dodatku 1 a tabuľke 1 ). V štruktúrach, kde bolo možné pozorovať štatistické rozdiely, existovali štyri rôzne vzorce expresie FosB/DeltaFosB. V prvom z nich, pozorovanom v M1 a M2, došlo k zvýšeniu expresie FosB/DeltaFosB v piaty deň po vysadení etanolu iba v skupine EtOH_High (v porovnaní s hodnotami EtOH_High po 18 hodinách po vysadení, ako aj s kontrolnou skupinou a skupinou EtOH_Low po 5 dňoch po vysadení) (pozri obr. 4 ). V druhom vzorci pozorovanom vo VTAA, sa expresia FosB/DeltaFosB zvýšila v 5 dňoch po vysadení etanolu iba v skupine EtOH_Low (v porovnaní s hodnotami EtOH_Low po 18 hodinách po vysadení, ako aj s kontrolnou skupinou po 5 dňoch po vysadení) (pozri obr. 5 ). V treťom vzore pozorovanom v skupinách DmS, Acbco a Acbsh sa expresia FosB/DeltaFosB zvýšila po 5 dňoch od vysadenia etanolu v skupinách EtOH_High aj EtOH_Low (v porovnaní s ich príslušnými hodnotami po 18 hodinách od vysadenia), avšak iba skupina EtOH_Low sa líšila od kontrolnej skupiny (pozri obr. 6 ). Nakoniec, vo štvrtom vzore pozorovanom v skupinách DlS a VP sa expresia FosB/DeltaFosB zvýšila po 5 dňoch od vysadenia etanolu v skupinách EtOH_High aj EtOH_Low (v porovnaní s ich príslušnými hodnotami po 18 hodinách od vysadenia), hoci toto zvýšenie bolo štatisticky výraznejšie v skupine EtOH_Low ako v skupine EtOH_High a iba skupina EtOH_Low sa líšila od kontrolnej skupiny (pozri obr. 7 ).

Aby sa potvrdilo, že zmeny v expresii FosB / DeltaFosB boli spôsobené abstinenciou, a nie vystavením etanolu, vykonali sme korelácie medzi skóre lokomotorickej senzibilizácie a imunoznačenými bunkami FosB / DeltaFosB v 5 deň odobratia v uvedených jadrách (M1, M2, Acbco, Acbsh, DmS, DlS, VP, VTAA). Ako sa dalo očakávať, neboli žiadne významné korelácie pre žiadne z týchto jadier (M1 - r² = 0.027862, p = 0.987156; M2 - r² = 0.048538, p = 0.196646; Acbco - r² = 0.001920, p = 0.799669; Acbsh - r² = 0.006743, p = 0.633991; DmS - r² = 0.015880, p = 0.463960; DlS - r² = 0.023991, p = 0.914182; VP - r² = 0.002210, p = 0.785443; VTAA - r² = 0.001482, p = 0.823630).

4. diskusia

Výsledky pozorované v tejto štúdii naznačujú, že zvýšená expresia FosB/DeltaFosB pozorovaná v paradigme lokomotorickej senzibilizácie indukovanej etanolom pravdepodobne súvisí skôr s abstinenčnými príznakmi než s chronickou expozíciou lieku. Variabilita správania vo vývoji lokomotorickej senzibilizácie však bola sprevádzaná odlišnými vzormi expresie FosB/DeltaFosB počas abstinenčných príznakov. Úloha motorickej kôry, ventrálnej tegmentálnej oblasti a striata pri získavaní a expresii paradigmy lokomotorickej senzibilizácie je dobre známa ( Vanderschuren a Pierce, 2010 ). Okrem toho je deregulácia mezolimbickej dráhy jedným z ústredných neurobiologických znakov abstinenčného obdobia spolu so vznikom predĺženej amygdaly ( Koob a Le Moal, 2005 a Koob a Le Moal, 2008 ). Avšak len málo štúdií skúmalo abstinenčné obdobie paradigmy lokomotorickej senzibilizácie. Naše výsledky preukázali zaujímavé zmeny v expresii FosB/DeltaFosB v motorickej kôre, ventrálnej tegmentálnej oblasti a striate v tomto období.

cDNA FosB kóduje expresiu proteínov s molekulovou hmotnosťou 33, 35 a 37 kDa. Vystavenie akútnym stimulom vedie k silnej indukcii 33- a diskrétnych 35- a 37-kDa proteínov FosB. V dôsledku toho je pri akútnej aktivácii prevládajúca expresia FosB spojená s 33 kDa ( McClung a kol., 2004 a Nestler, 2008 ). Medzi týmito proteínmi existuje ďalší pozoruhodný rozdiel: iba 35–37 kDa proteíny sú vysoko stabilné izoformy. Vďaka tejto vysokej stabilite sa tieto skrátené formy FosB, nazývané aj DeltaFosB, akumulujú v mozgu a sú vysoko exprimované v reakcii na chronické stimuly, ako je liečba psychotropnými liekmi, chronické elektrokonvulzívne záchvaty a stres ( Kelz a Nestler, 2000 , Nestler a kol., 2001 a McClung a kol., 2004 ). V dôsledku toho sa DeltaFosB považuje za trvalý molekulárny prepínač sprostredkujúci formy dlhotrvajúcej neurálnej a behaviorálnej plasticity. Je zaujímavé, že elegantná štúdia s použitím myších línií s diferencovanou expresiou FosB a DeltaFosB ukázala, že FosB je nevyhnutný pre zvýšenie tolerancie stresu a tiež neutralizuje koreláciu medzi lokomotorickou senzibilizáciou vyvolanou psychostimulantmi a akumuláciou DeltaFosB v striate ( Ohnishi a kol., 2011 ). Preto by oba proteíny mohli hrať dôležitú úlohu v experimentálnom protokole použitom v tejto štúdii. Je pozoruhodné, že použitá protilátka FosB rozpoznáva FosB aj DeltaFosB. Keďže FosB klesá na východiskové hladiny do 6 hodín po akútnom stimule ( Nestler a kol., 2001 ) a DeltaFosB sa akumuluje po opakovaných expozíciách stimulom, rozhodli sme sa zvieratá usmrtiť 18 hodín po fáze akvizicie, aby sme sa vyhli možnému skresleniu liečby etanolom oproti expresii FosB. Napriek tomu, aby sme boli technicky presní, budeme v tejto štúdii označovať expresiu FosB/DeltaFosB. Je dôležité poznamenať, že táto stratégia bola použitá aj v iných štúdiách, vrátane tých, ktoré použili rovnakú primárnu protilátku opísanú v tomto dokumente ( Conversi a kol., 2008 , Li a kol., 2010 , Flak a kol., 2012 a García-Pérez a kol., 2012 ). V dôsledku toho, okrem týchto experimentálnych obmedzení, budeme diskutovať o našich výsledkoch s ohľadom na úlohu DeltaFosB v neuronálnej plasticite.

Je dobre známe, že chronická expozícia lieku zvyšuje expresiu FosB / DeltaFosB v niekoľkých oblastiach mozgu (Nestler a kol., 2001 a Perrotti a kol., 2008). Je zaujímavé, že v predloženej štúdii sa ani myši senzibilizované na etanol, ani myši nesenzibilizované na etanol nelíšili od myší liečených chronickým soľným roztokom, pokiaľ ide o expresiu FosB / DeltaFosB 18 hodín po fáze akvizície. Ďalej neexistovala významná korelácia medzi expresiou FosB / DeltaFosB a skóre lokomotorickej senzibilizácie. Túto odchýlku možno aspoň čiastočne vysvetliť rozdielmi zistenými v experimentálnom protokole. Napríklad, vzhľadom na expozíciu etanolu, v dvoch štúdiách bola použitá paradigma voľby dvoch fliaš pri 15 prerušovaných sedeniach (Li et al., 2010) alebo nutrične kompletná tekutá strava podávaná automaticky počas 17 dní (ak zvieratá konzumujú etanol v dávkach od 8 do 12 g / kg / deň) (Perrotti a kol., 2008). V inej štúdii, hoci autori odkazujú na chronickú liečbu, protokol pozostával len z expozícií etanolu 4 (Ryabinin a Wang, 1998). Takže protokoly použité na inom mieste sú úplne odlišné od protokolov použitých tu, ktoré pozostávali z 21 dní liečby, kedy boli denné injekcie etanolu podávané experimentátorom. Napriek týmto rozdielom existuje niekoľko štúdií zahŕňajúcich intraperitoneálne injekcie, ktoré hlásia zvýšenie expresie FosB / DeltaFosB po protokoloch pohybovej senzibilizácie vyvolaných psychostimulanciami (Brenhouse a Hviezdna, 2006, Conversi a kol., 2008 a Vialou a kol., 2012) a opiáty (Kaplan a kol., 2011). Avšak protokoly lokomotorickej senzibilizácie v týchto štúdiách zahŕňajú omnoho menej ako 21 expozície liečivám a v niektorých z nich sa liek podáva prerušovane. Na rozdiel od toho, náš protokol použil rovnakú liečbu opísanú v predchádzajúcich štúdiách zahŕňajúcich denné injekcie etanolu 21 (Masur a dos Santos, 1988, Souza-Formigoni a kol., 1999, Quadros a kol., 2002a, Quadros a kol., 2002b, Abrahão a kol., 2011 a Abrahão a kol., 2012). Existujú dôkazy, že hoci chronické podávanie kokaínu podporuje akumuláciu expresie DeltaFosB v nucleus accumbens, podporuje aj toleranciu k indukcii mRNA DeltaFosB vo ventrálnej aj dorzálnej striate (Larson a kol., 2010). Preto sme predpokladali, že nedostatok rozdielov v našich experimentálnych skupinách v akvizičnej fáze môže byť spôsobený toleranciou voči indukcii FosB / DeltaFosB, pretože v tomto protokole existovala väčšia doba akvizičnej fázy v porovnaní s obdobiami používanými pre psychostimulanty a opioidy. v iných štúdiách.

Štúdie s knockout a transgénnymi myšami ukázali, že myši s mutantným génom FosB majú zvýšenú behaviorálnu reakciu na kokaín, ako sú stimulačné lokomotorické účinky a podmienená preferencia miesta. Okrem toho u týchto mutantných myší chýba expresia bazálneho aj kokaínom indukovateľného DeltaFosB ( Hiroi a kol., 1997 ). Naproti tomu transgénne myši s indukovateľnou nadmernou expresiou DeltaFosB vykazujú zvýšenú citlivosť na odmeňujúce účinky kokaínu a morfínu ( Muschamp a kol., 2012 ). Tieto výsledky poskytli priamy dôkaz úzkej korelácie medzi DeltaFosB a procesom odmeňovania. Okrem opakovaných expozícií drogám zvyšuje expresiu DeltaFosB v kortikolimbických okruhoch aj chronický stres ( Perrotti a kol., 2004 ). Je zaujímavé, že transgénne myši s nadmernou expresiou DeltaFosB sú menej citlivé na prodepresívne účinky kappa-opioidného agonistu, o ktorom je známe, že u hlodavcov vyvoláva dysfóriu a stresu podobné účinky ( Muschamp a kol., 2012 ). Takže okrem procesu odmeňovania hrá DeltaFosB kľúčovú úlohu aj v emocionálnych aspektoch tohto javu. V tomto scenári by abstinenčné príznaky mohli tiež spustiť expresiu FosB/DeltaFosB, pretože stres je kľúčovou zložkou abstinenčných príznakov po vysadení drogy. Táto perspektíva je v súlade s našimi výsledkami, pretože neexistovali žiadne korelácie medzi expresiou FosB/DeltaFosB a skóre senzibilizácie a navyše zvýšenie expresie FosB/DeltaFosB bolo pozorované až na piaty deň po vysadení.

Je zaujímavé, že v niektorých štruktúrach sa pozorovalo zvýšenie FosB/DeltaFosB v skupine s vysokým aj nízkym obsahom EtOH, hoci v prvej skupine bolo výraznejšie, čo naznačuje, že toto zvýšenie by mohlo mať rôzne funkčné dôsledky v závislosti od ich intenzity. Túto hypotézu by bolo možné vysvetliť niekoľkými odlišnými funkčnými úlohami FosB/DeltaFosB. Napríklad potkany chronicky vystavené kokaínu mali zvýšenú expresiu DeltaFosB v nucleus accumbens počas abstinenčného obdobia, čo pozitívne korelovalo s preferenciou kokaínu, ale negatívne s preferenciou novosti. Okrem toho stres počas abstinenčných príznakov zvyšuje behaviorálnu reakciu na psychostimulanciá zvýšením expresie DeltaFosB v kortikolimbických neurónoch ( Nikulina a kol., 2012 ). DeltaFosB by teda mohol predpovedať dysreguláciu hedonistického spracovania, ku ktorej dochádza počas dlhotrvajúceho abstinenčného syndrómu ( Marttila a kol., 2007 ). Na druhej strane, odolnosť voči stresu aj antidepresívne reakcie súvisia s vyššou expresiou DeltaFosB v striate ( Vialou a kol., 2010 ). Preto predpokladáme, že zvýšené hladiny FosB/DeltaFosB na striate v skupine s vysokým obsahom etanolu (EtOH_High) mohli zosilniť odmeňujúce účinky etanolu, čo viedlo k vyššej náchylnosti na následné vystavenie sa liekom. Na druhej strane, intenzívnejšie zvýšenie hladiny FosB/DeltaFosB pozorované v skupine s nízkym obsahom etanolu mohlo znížiť citlivosť na dysfóriu aj stresové účinky, minimalizovať negatívne posilňujúce účinky následného vystavenia liekom a v dôsledku toho vysvetľovať vyššiu rezistenciu v tejto skupine. Je zaujímavé, že tento paradox mal neurochemický základ. Napríklad transgénne myši s nadmernou expresiou FosB v GABAergných neurónoch strednej časti chrbtice v nucleus accumbens mali zvýšené hladiny mu- aj kappa-opioidných receptorov ( Sim-Selley a kol., 2011 ) a tieto receptory zvyšujú a inhibujú mezolimbický tonus ( Manzanares a kol., 1991 a Devine a kol., 1993 ). Okrem toho, expresia bunkového typu mohla drasticky zmeniť funkčné dôsledky zvýšeného FosB/DeltaFosB. V elegantnej štúdii s použitím myší s nadmernou expresiou DeltaFosB v neurónoch exprimujúcich D1 alebo D2 v nucleus accumbens sa zistilo, že DeltaFosB v neurónoch D1 (ale nie v D2) zvyšuje behaviorálne reakcie na kokaín ( Grueter a kol., 2013 ).

Je zaujímavé, že pokiaľ ide o motorickú kôru, zvýšenie expresie FosB/DeltaFosB sa prejavilo iba v skupine s EtOH_High a bolo obmedzené na 5. deň po vysadení. Absencia zvýšenia po 18 hodinách po vysadení by sa dala vysvetliť možným mechanizmom tolerancie v expresii FosB/DeltaFosB v tejto oblasti po chronickej expozícii etanolu. Naše výsledky ďalej naznačujú, že počas obdobia vysadenia dochádza k aktívnym neurochemickým zmenám v motorickej kôre, a to aj napriek tomu, že zvieratá neboli počas tohto obdobia manipulované. To je zaujímavé, pretože táto plasticita by mohla zohrávať úlohu, aspoň čiastočne, pri udržiavaní lokomotorickej senzibilizácie. Hoci pretrvávajúca hyperlokomócia po niekoľkých dňoch od vysadenia sa tu neskúmala, existuje niekoľko štúdií, vrátane predchádzajúcich z nášho laboratória, ktoré ukazujú, že senzibilizované myši (ale nie nesenzibilizované) mali zlepšenú lokomóciu po vystavení etanolu po danom období odstavenia ( Masur a dos Santos, 1988 , Souza-Formigoni a kol., 1999 , Quadros a kol., 2002a , Quadros a kol., 2002b , Abrahão a kol., 2011 , Abrahão a kol., 2012 , Fallopa a kol., 2012 a Coelhoso a kol., 2013 ).

Nakoniec je potrebné poznamenať, že iba skupina EtOH_Low vykazovala zvýšenú expresiu FosB/DeltaFosB v prednej (ale nie zadnej) časti ventrálnej tegmentálnej oblasti. Tieto časti majú odlišné projekcie a neurochemické profily a ich účasť v procese odmeňovania závisí od niekoľkých faktorov ( Ikemoto, 2007 ). Napríklad, samopodávanie etanolu u potkanov súvisí so zadnou, ale nie s ventrálnou časťou ventrálnej tegmentálnej oblasti ( Rodd-Henricks a kol., 2000 a Rodd a kol., 2004 ). Okrem toho, endokanabinoidný systém, ako aj GABA-A, dopaminergné D1-D3 a serotonínové 5HT3 receptory, zohrávajú dôležitú úlohu v správaní pri vyhľadávaní etanolu ( Linsenbardt a Boehm, 2009 , Rodd a kol., 2010 , Melón a Boehm, 2011b a Hauser a kol., 2011 ). GABA-B v prednej časti ventrálnej tegmentálnej oblasti je však dôležitý z hľadiska odmeňovania ( Moore a Boehm, 2009 ) a stimulačných lokomotorických účinkov ( Boehm a kol., 2002 ) etanolu. Okrem toho sú cholinergné nikotínové receptory v prednej časti zapojené do zvýšených hladín dopamínu v akumbe vyvolaných etanolom ( Ericson a kol., 2008 ). Preto bez ohľadu na odlišný profil týchto častí je možné, že zmeny pozorované v skupine s nízkou dávkou EtOH v predných častiach by mohli súvisieť s procesom odmeňovania. Chronická konzumácia kokaínu, ale nie chronická expozícia morfínu alebo chronického stresu, zvyšuje DeltaFosB vo ventrálnej tegmentálnej oblasti, konkrétne v populácii buniek s kyselinou gama-aminomaslovou (GABA) ( Perrotti a kol., 2005 ). Táto skutočnosť by mohla vysvetliť normálne hladiny FosB/DeltaFosB počas abstinenčných príznakov, ktoré sa vyskytujú vo ventrálnej tegmentálnej oblasti myší s vysokou dávkou EtOH, bez ohľadu na predpokladaný zážitok z vysokého stresu v tomto období. Tieto údaje ďalej aspoň čiastočne potvrdzujú hypotézu, že zvýšenie expresie FosB/DeltaFosB počas vysadenia v EtOH_Low by sa dalo charakterizovať ako adaptívna reakcia.

Individuálne rozdiely pozorované počas prechodu z rekreačného užívania na drogovú závislosť sú pozoruhodné ( Flagel a kol., 2009 , George a Koob, 2010 a Swendsen a Le Moal, 2011 ). V dôsledku toho je nevyhnutné študovať neurobiologické znaky súvisiace s individuálnou variabilitou. Behaviorálna senzibilizácia je zvierací model bežne používaný na skúmanie neurobiologických znakov drogovej závislosti. Základom tohto modelu je, že subjektívne účinky drog sa zvyšujú s ich opakovanou expozíciou. Po získaní je lokomotorická senzibilizácia dlhodobá a je v priamom časovom vzťahu s morfologickými a neurochemickými zmenami v mezolimbickej dráhe a niekoľkých encefalických jadrách súvisiacich s emocionalitou a motorickým správaním ( Robinson a Kolb, 1999 a Vanderschuren a Pierce, 2010 ). Priekopnícka štúdia, ktorú vykonali Masur a dos Santos (1988), preukázala, že u outbredných švajčiarskych myší existuje veľká behaviorálna variabilita, pokiaľ ide o lokomotorickú senzibilizáciu indukovanú etanolom. Odvtedy ďalšie štúdie preukázali dôležitú koreláciu medzi neurochemickými znakmi a variabilitou správania, najmä tie, ktoré súvisia s dopaminergným ( Abrahão a kol., 2011 , Abrahão a kol., 2012 a Souza-Formigoni a kol., 1999 ) a glutamátergným systémom ( Quadros a kol., 2002a a Quadros a kol., 2002b ). Okrem toho predchádzajúca štúdia z nášho laboratória s použitím paradigmy lokomotorickej senzibilizácie indukovanej etanolom ukázala, že senzibilizované (ale nie nesenzibilizované) myši vykazovali počas abstinenčného obdobia pozoruhodný nárast kanabinoidného receptora typu 1 (CB1R) ( Coelhoso a kol., 2013 ). Tu sme identifikovali rôzne vzorce expresie FosB/DeltaFosB počas abstinenčných príznakov medzi skupinami s vysokým a nízkym obsahom EtOH.

Aby sme to zhrnuli, behaviorálna variabilita pozorovaná v akvizičnej fáze lokomotorickej senzibilizácie vyvolanej etanolom je sprevádzaná výraznou neuronálnou plasticitou počas vysadenia. Zaujímavé je, že naše výsledky naznačujú, že rôzne vzory expresie FosB / DeltaFosB detegované u senzibilizovaných a nesenzibilizovaných myší sú skôr spojené s obdobím vysadenia než s chronickou expozíciou liečiva, pravdepodobne kvôli tolerancii transkripcie FosB / DeltaFosB indukovanej liečivom.

Nasledujú doplňujúce údaje týkajúce sa tohto článku.

Referencie

• Nikulina a kol., 2012
• EM Nikulina, MJ Lacagnina, S. Fanous, J. Wang, RP Hammer Jr.
• Prerušovaný sociálny porážkový stres zvyšuje mezokortikolimbickú osFosB / BDNF koexpresiu a trvalo aktivuje kortikotegmentálne neuróny: implikácia pre zraniteľnosť voči psychostimulanciám
• Neuroscience, 212 (2012), str. 38 – 48
• Článok

  |

   PDF (1552 K)

  |

  Zobraziť záznam v Scopus

   | 

  Citované články (12)
•  
• Vialou a kol., 2012
• V. Vialou, J. Feng, AJ Robison, SM Ku, D. Ferguson, KN Scobie, et al.
• Na indukciu kokaínu AFosB sú obidva potrebné faktory faktora odozvy na sérum a väzbový proteín cAMP
• J Neurosci, 32 (2012), str. 7577 – 7584
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (17)
• Vanderschuren a Pierce, 2010
• LJ Vanderschuren, RC Pierce
• Senzibilizačné procesy v drogovej závislosti
• Mena Top Behav Neurosci, 3 (2010), str. 179 – 195
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (53)
• Vanderschuren a Kalivas, 2000
• LJ Vanderschuren, PW Kalivas
• Zmeny v dopaminergnom a glutamatergickom prenose v indukcii a expresii behaviorálnej senzibilizácie: kritický prehľad predklinických štúdií
• Psychofarmakológia (Berl), 151 (2000), s. 99 – 120
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (884)
• Swendsen a Le Moal, 2011
• J. Swendsen, M. Le Moal
• Individuálna zraniteľnosť voči závislosti
• Ann NY Acad Sci, 1216 (2011), str. 73 – 85
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (35)
• Souza-Formigoni a kol., 1999
• ML Souza-Formigoni, EM De Lucca, DC Hipólide, SC Enns, MG Oliveira, JN Nobrega
• Senzibilizácia na stimulačný účinok etanolu je spojená s lokálnym zvýšením väzby receptora D2 v mozgu
• Psychofarmakológia, 146 (1999), str. 262 – 267
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (54)
• Solecki a kol., 2008
• W. Solecki, T. Krowka, J. Kubik, L. Kaczmarek, R. Przewlocki
• Úloha fosb v správaní súvisiacom s odmenou morfínu a priestorovou pamäťou
• Behav Brain Res, 190 (2008), s. 212 – 217
• Článok

  |

   PDF (328 K)

  |

  Zobraziť záznam v Scopus

   | 

  Citované články (7)
• Sim-Selley a kol., 2011
• LJ Sim-Selley, MP Cassidy, A. Sparta, V. Zachariou, EJ Nestler, DE Selley
• Účinok nadmernej expresie ΔFosB na signalizáciu sprostredkovanú opiátmi a kanabinoidmi v nucleus accumbens
• Neurofarmakológia, 61 (2011), pp. 1470 – 1476
• Článok

  |

   PDF (446 K)

  |

  Zobraziť záznam v Scopus

   | 

  Citované články (10)
• Ryabinin a Wang, 1998
• AE Ryabinin, YM Wang
• Opakované podávanie alkoholu odlišne ovplyvňuje imunoreaktivitu proteínu c-Fos a FosB u myší DBA / 2 J
• Alkohol Clin Exp Res, 22 (1998), str. 1646 – 1654
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (33)
• Rodd-Henricks a kol., 2000
• ZA Rodd-Henricks, DL McKinzie, RS Crile, JM Murphy, WJ McBride
• Regionálna heterogenita pre intrakraniálne podávanie etanolu v rámci ventrálnej tegmentálnej oblasti samíc potkanov Wistar
• Psychofarmakológia (Berl), 149 (2000), s. 217 – 224
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (130)
• Rodd a kol., 2010
• ZA Rodd, RL Bell, SM Oster, JE Toalston, TJ Pommer, WJ McBride, et al.
• Receptory serotonínu-3 v zadnej ventrálnej tegmentálnej oblasti regulujú etanolové samodávkovanie potkanov preferujúcich alkohol (P)
• Alkohol, 44 (2010), s. 245 – 255
• Článok

  |

   PDF (604 K)

  |

  Zobraziť záznam v Scopus

   | 

  Citované články (19)
• Rodd a kol., 2004
• ZA Rodd, RI Melendez, RL Bell, KA Kuc, Y. Zhang, JM Murphy, et al.
• Intrakraniálne podávanie etanolu v rámci ventrálnej tegmentálnej oblasti samcov potkanov Wistar: dôkaz pre zapojenie dopamínových neurónov
• J Neurosci, 24 (2004), str. 1050 – 1057
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (111)
• Robinson a Kolb, 1999
• TE Robinson, B. Kolb
• Zmeny v morfológii dendritov a dendritických spinov v nucleus accumbens a prefrontálnom kortexe po opakovanej liečbe amfetamínom alebo kokaínom
• Eur J Neurosci, 11 (1999), str. 1598 – 1604
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (427)
• Quadros a kol., 2002b
• IM Quadros, JN Nóbrega, DC Hipolide, EM de Lucca, ML Souza-Formigoni
• Rozdielny sklon k senzibilizácii voči etanolu nie je spojený so zmenenou väzbou na receptory D1 alebo transportéry dopamínu v mozgu myši.
• Addic Biol, 7 (2002), str. 291 – 299
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (21)
• Quadros a kol., 2002a
• IM Quadros, DC Hipólide, R. Frussa Filho, EM De Lucca, JN Nóbrega, ML Souza-Fomigoni
• Rezistencia na senzibilizáciu na etanol je spojená so zvýšenou väzbou NMDA receptora v špecifických oblastiach mozgu
• Eur J Pharmacol, 442 (2002), str. 55 – 61
• Článok

  |

   PDF (128 K)

  |

  Zobraziť záznam v Scopus

   | 

  Citované články (36)
• Phillips a kol., 1997
• TJ Phillips, AJ Roberts, CN Lessov
• Behaviorálna senzibilizácia na etanol: genetika a účinky stresu
• Pharmacol Biochem Behav, 57 (1997), str. 487 – 493
• Článok

  |

   PDF (186 K)

  |

  Zobraziť záznam v Scopus

   | 

  Citované články (101)
• Perrotti a kol., 2008
• LI Perrotti, RR Weaver, B. Robison, W. Renthal, I. Maze, S. Yazdani, et al.
• Odlišné vzorce indukcie DeltaFosB v mozgu drogami zneužívania
• Synapse, 62 (2008), str. 358 – 369
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (79)
• Perrotti a kol., 2004
• LI Perrotti, Y. Hadeishi, PG Ulery, M. Barrot, L. Monteggia, RS Duman, et al.
• Indukcia deltaFosB v mozgových štruktúrach súvisiacich s odmenou po chronickom strese
• J Neurosci, 24 (2004), str. 10594 – 10602
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (148)
• Perrotti a kol., 2005
• LI Perrotti, CA Bolaños, KH Choi, SJ Russo, S. Edwards, PG Ulery, et al.
• DeltaFosB sa akumuluje v populácii GABAergných buniek v zadnej časti ventrálnej tegmentálnej oblasti po psychostimulačnej liečbe.
• Eur J Neurosci, 21 (2005), str. 2817 – 2824
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (85)
• Ohnishi a kol., 2011
• YN Ohnishi, YH Ohnishi, M. Hokama, H. Nomaru, K. Yamazaki, Y. Tominaga, et al.
• FosB je nevyhnutný pre zvýšenie tolerancie stresu a antagonizuje lokomotorickú senzibilizáciu AFosB
• Biol Psychiatry, 70 (2011), s. 487 – 495
• Článok

  |

   PDF (2016 K)

  |

  Zobraziť záznam v Scopus

   | 

  Citované články (13)
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  
•  

• Vialou a kol., 2010
• V. Vialou, AJ Robison, QC Laplant, HE Covington III, DM Dietz, YN Ohnishi, et al.
• DeltaFosB v okruhoch odmeňovania mozgu sprostredkováva odolnosť voči stresu a antidepresívnym reakciám
• Nat Neurosci, 13 (2010), str. 745 – 752
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (141)
•  
• Zachariou a kol., 2006
• V. Zachariou, CA Bolanos, DE Selley, D. Theobald, MP Cassidy, MB Kelz, et al.
• Podstatná úloha pre deltaFosB v nucleus accumbens pri účinku morfínu
• Nat Neurosci, 9 (2006), str. 205 – 211
• Zobraziť záznam v Scopus

  |

  Plný text cez CrossRef

   | 

  Citované články (138)

•  
• Zodpovedajúci autor na adrese: Rua Cesário Mota Jr, 61, 12 andar, São Paulo, SP 01221-020, Brazília. Tel./fax: + 55 11 33312008.
• 1
• Na tejto štúdii sa rovnako podieľali aj títo autori.