Predná psychiatria, 2018; 9: 81.
Publikované online 2018 Mar 12. doi: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Park Yae Eun,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* a Yeun-Jun Chung1,2,3,*
abstraktné
pozadia
Návykové používanie internetu a online hier je potenciálna psychiatrická porucha nazývaná porucha hrania internetu (IGD). V krvi a mozgovom tkanive pacientov s určitými psychiatrickými poruchami boli hlásené zmenené profily expresie mikroRNA (miRNA) a boli navrhnuté ako biomarkery. Neexistujú však žiadne správy o profiloch krvnej miRNA v IGD.
Metódy
Na objavenie miRNA asociovaných s IGD sme analyzovali expresné profily miRNA vzoriek 51 (kontroly 25 IGD a 26) pomocou miRNA poľa TaqMan s nízkou hustotou. Na validáciu sme vykonali kvantitatívnu reverznú transkripciu PCR so vzorkami nezávislými od 36 (kontroly 20 IGD a 16).
výsledky
Prostredníctvom objavu a nezávislej validácie sme identifikovali tri miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p), ktoré boli významne znížené v skupine IGD. Jedinci so všetkými tromi zmenami miRNA mali oveľa vyššie riziko IGD ako tí, ktorí nemali zmeny [pravdepodobnosť (OR) 22, 95% CI 2.29 – 211.11] a OR sa zvyšovala v závislosti od počtu zmenených miRNA. Predpovedané cieľové gény troch miRNA boli spojené s nervovými dráhami. Preskúmali sme proteínovú expresiu troch downstream cieľových génov pomocou Western blotu a potvrdili sme, že expresia GABRB2 a DPYSL2 bola významne vyššia v skupine IGD.
záver
Zistili sme, že expresia hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p a hsa-miR-652-3p bola u pacientov s IGD znížená. Naše výsledky pomôžu pochopiť patofyziológiu IGD.
úvod
Návykové používanie internetu a hier založených na internete nie je len sociálnym javom v krajinách s rozsiahlou infraštruktúrou prístupu na internet, ale potenciálnou psychiatrickou poruchou nazývanou porucha hrania na internete (IGD) (1-3). Podľa epidemiologických správ sa miera prevalencie IGD u adolescentov v jednotlivých krajinách líši a pohybuje sa od 0.8 do 26.7% (4). Štúdie ukazujú najmä mieru prevalencie nad 10% u adolescentov v mnohých ázijských krajinách, ako je Južná Kórea, Čína, Taiwan, Hongkong a Singapur (4). IGD je spojená s poruchami kognície, psychosociálnych vzťahov a každodenného života; napríklad zníženie akademického alebo pracovného výkonu (4-7). IGD je teraz súčasťou oddielu III (Podmienky ďalšieho štúdia) piatej revízie Diagnostickej a štatistickej príručky duševných porúch (DSM-V) (8). Napriek klinicko-spoločenskému významu je však o molekulárno-genetickom mechanizme IGD známe málo.
Posledné rozsiahle twin štúdie naznačili genetické pozadie IGD (9, 10). Vink a kol. skúmali jednotlivé rozdiely v kompulzívnom používaní internetu s monozygotnými a dizygotickými dvojčatami adolescentov 5,247 v holandskom Twin Register a uviedli, že 48% rozdielov bolo vysvetlených genetickými faktormi (9). Li a kol. pozorovali dvojice čínskych dospievajúcich dvojčiat 825 a uviedli, že genetické faktory vysvetľujú 58 – 66% rozdielov (10). Polymorfizmy génov zapojených do neurotransmisie, kognície a pozornosti, ako je napríklad gén D2 dopamínového receptora (DRD2), katecholamín-O-metyltransferázový gén (COMT), gén pre transport serotonínu (5HTTLPR) a gén nikotínového alfa 4 cholinergného receptora (CHRNA4) bolo hlásené, že významne súvisia so závislosťou od internetu (11-13). Kim a kol. skrínované varianty viac ako 100 kandidátnych génov súvisiace s produkciou, účinkom a metabolizmom neurotransmiterov nasledujúcou generačnou analýzou a uviedli, že rs2229910 z NTRK3 gén je spojený s IGD (14).
Okrem genetických faktorov je tiež dobre známe, že neurobehaviorálne fenotypy sú epigeneticky kontrolované nekódujúcimi RNA vrátane mikroRNA (miRNA) (15, 16). miRNA sú malé nekódujúce jednovláknové molekuly RNA (dlhé približne 20 – 23 nukleotidov), ktoré negatívne regulujú expresiu proteínov kódujúcich gény degradáciou mRNA a hrajú rozhodujúcu úlohu v patofyziologickom procese rôznych chorôb (17). Vedecké dôkazy preukázali, že miRNA sú bohaté na ľudský centrálny nervový systém (CNS) a pôsobia tak, že jemne dolaďujú úrovne expresie svojich cieľových génov, ktoré sa podieľajú na vývoji a dozrievaní systému CNS (15). Nedávne štúdie skutočne odhalili, že expresné profily miRNA sa menia v mozgovom tkanive pacientov s psychiatrickými poruchami, čo naznačuje, že ich expresné profily by mohli byť biomarkermi psychiatrických porúch (15, 16, 18). Napríklad prostredníctvom postmortem analýzy Lopez a kol. uviedli, že expresia miR-1202, ktorá reguluje expresiu génu metabotropického glutamátového receptora-4 a predpovedá odpoveď na antidepresívum, bola v prefrontálnych tkanivách kortexu pacientov s depresívnou poruchou znížená (19). Pokiaľ ide o skríning biomarkerov, tento prístup má jasné obmedzenie, pretože uskutočnenie biopsie tkaniva CNS na skríning nie je možné. Pretože miRNA sa dajú detegovať v krvi (plazme alebo sére), cirkulujúce miRNA majú pri neuropsychiatrických poruchách jednoznačnú výhodu ako neinvazívne biomarkery. Doteraz však neexistovali štúdie o cirkulujúcich profiloch miRNA v IGD. Lepšie porozumenie profilov cirkulácie expresie miRNA by mohlo pomôcť objasniť mechanizmus rozvoja IGD a uľahčiť klinickú transláciu.
V tejto štúdii sme sa zamerali na identifikáciu miRNA markerov asociovaných s IGD pozorovaním rozdielne exprimovaných miRNA plazmy medzi IGD a kontrolnými skupinami a skúmali sme ich biologické implikácie.
Materiály a metódy
Študijné predmety
Zisťovali sme tínedžerov 3,166 (vo veku 12 – 18) pomocou bodovania DSM-V IGD. Spomedzi nich boli 251 (muži 168 a ženy 83) diagnostikované ako IGD podľa kritérií DSM-V (8). Informovaný súhlas s touto štúdiou poskytlo celkom 91 jednotlivcov (49 IGD a 42 kontroly). Spomedzi nich boli vylúčení štyria jednotlivci podľa kritérií vylúčenia. Nakoniec boli do tejto štúdie zaradení jednotlivci 87 (subjekty 45 IGD a zdraví kontrolní jedinci 42). Medzi nimi boli prijatí účastníci 51 (pacienti s 25 IGD a kontroly 26) ako súbor objavov od 2014 do 2016. Ostatní účastníci 36 (pacienti 20 IGD a kontroly 16) boli prijatí ako nezávislá validačná sada od 2016. Všetci účastníci boli kórejskí jednotlivci, ktorí boli zaradení do nemocnice Seoul St. Mary's Hospital (Soul, Južná Kórea) a Soulskej národnej univerzity Boramae Hospital (Soul, Južná Kórea). Všetci účastníci absolvovali štruktúrovaný rozhovor psychiatra na základe rozpisu afektívnych porúch a schizofrénie kórejských detí (K-SADS-PL) (20). Všetci účastníci ukončili subtesty blokového dizajnu a slovnej zásoby Kórejskej-Wechslerovej spravodajskej stupnice pre deti, 4th vydanie (K-WISC-IV) (21). Impulzívnosť sa hodnotila podľa Barrattovej stupnice impulzívnosti (BIS) (22). Na vyhodnotenie osobnostnej dimenzie boli merané škály behaviorálneho inhibičného systému (BInS) a behaviorálneho aktivačného systému (BAS).23). Kritériá vylúčenia zahŕňali minulé alebo súčasné hlavné zdravotné poruchy (napr. Diabetes mellitus), neurologické poruchy (napr. Záchvaty, poranenie hlavy), psychiatrické poruchy (napr. Závažné depresívne poruchy, úzkostné poruchy), mentálnu retardáciu alebo akékoľvek zneužívanie návykových látok (napr. , tabak, kanabis, alkohol). Všeobecné charakteristiky študovaných subjektov sú zhrnuté v tabuľke č Table1.1, Túto štúdiu schválila Inštitucionálna hodnotiaca rada Kórejskej lekárskej vysokej školy v Kórei (MC16SISI0120). Všetci účastníci a ich rodičia dali písomný informovaný súhlas.
Tabuľka 1
Všeobecné charakteristiky študijných predmetov.
| objav | Potvrdenie | Kombinované | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ovládanie | IGD | P-hodnota | ovládanie | IGD | P-hodnota | ovládanie | IGD | P-hodnota | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Vek (v rokoch) | |||||||||
| Medián (min – max) | 13 (12 - 17) | 13 (12 - 15) | 0.759 | 15 (13 - 18) | 14.5 (12 - 18) | 0.628 | 14 (12 - 18) | 14 (12 - 18) | 0.509 |
| Týždenné hodiny internetových hier (h) | |||||||||
| Medián (min – max) | 5.25 (2 - 17) | 18 (6 - 46) | 1.27-6a | 5.5 (2 - 23) | 8 (1 - 112) | 0.374 | 5.5 (2 - 23) | 14 (1 - 112) | 1.63-5a |
| Mesačný príjem domácnosti (v miliónoch KRW) | |||||||||
| Medián (min – max) | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.588 | 4 (4 - 4) | 2 (2 - 2) | 1.000 | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.460 |
| Vzdelanie (roky) | |||||||||
| Medián (min – max) | 8 (7 - 9) | 8 (7 - 9) | 0.584 | 12 (12 - 12) | 6 (6 - 13) | 0.305 | 8 (7 - 12) | 8 (6 - 13) | 0.269 |
| K-WISC: návrh blokov | |||||||||
| Medián (min – max) | 10.5 (4 - 17) | 10 (4 - 16) | 0.544 | 10 (3 - 16) | 12.5 (4 - 15) | 0.125 | 10 (3 - 17) | 11 (4 - 16) | 0.598 |
| K-WISC: slovná zásoba | |||||||||
| Medián (min – max) | 9 (5 - 17) | 7 (5 - 13) | 0.174 | 9.5 (8 - 15) | 11.5 (5 - 15) | 0.595 | 9 (5 - 17) | 9 (5 - 15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Medián (min – max) | 24 (17 - 36) | 37 (22 - 51) | 3.81-6a | 29 (17 - 34) | 59 (22 - 108) | 1.2-5a | 25 (17 - 36) | 40 (22 - 108) | 2.05-10a |
| BIS | |||||||||
| Medián (min – max) | 63 (35 - 75) | 67.5 (45 - 81) | 0.080 | 61 (45 - 79) | 63 (32 - 82) | 0.835 | 62 (35 - 79) | 65 (32 - 82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Medián (min – max) | 31 (15 - 40) | 31 (13 - 51) | 0.558 | 36.5 (22 - 48) | 34 (27 - 52) | 1.000 | 32 (15 - 48) | 34 (13 - 52) | 0.637 |
| koše | |||||||||
| Medián (min – max) | 18 (10 - 26) | 17.5 (13 - 27) | 0.642 | 18.5 (12 - 25) | 20 (13 - 21) | 0.138 | 18 (10 - 26) | 19 (13 - 27) | 0.302 |
IGD, pacienti s poruchami internetového hrania; KS, kórejská stupnica závislosti na internete; BIS, Barrattova stupnica impulzivity; BAS, behaviorálny aktivačný systém; BInS, behaviorálny inhibičný systém; KRW, kórejský vyhral.
aP <0.05 (Mann – Whitney – Wilcoxonov test).
Experimenty s miRNA Array (TLDA) s nízkou hustotou TaqMan
Od každého účastníka sa odobrala periférna krv a preniesla sa do laboratória v 4 h, aby sa minimalizovala lýza krvných buniek. Vzorka sa odstreďovala pri 3,000 rpm počas 10 min. Pri laboratórnej teplote. Potom bol odobratý supernatant (vrstva plazmy) bez kontaminácie krvných buniek. Cirkulujúce miRNA sa extrahovali s použitím purifikačnej súpravy TaqMan miRNA ABC (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) podľa pokynov výrobcu. Stručne, zmiešalo sa 50 ul vzorky plazmy a 100 ul ABC pufra. Po hybridizácii s cieľovo špecifickými anti-miRNA magnetickými guľôčkami sa z guľôčok eluovali viazané cirkulujúce miRNA s 100 ul elučného pufra. Vo fáze objavenia sa miRNA 381 skúmali zo vzoriek plazmy 51 (kontroly 25 IGD a 26) pomocou súpravy na čistenie miq ABC TaqMan (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) podľa pokynov výrobcu. Na zvýšenie množstva cDNA pre analýzu expresie miRNA sa uskutočnili reverzné transkripčné a pre-amplifikačné reakcie megaplexu s použitím megaplexPreAmp primérov Human Pool A a TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). TLDA panel A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) bol spustený na PCR systéme ViiA7 v reálnom čase (Thermo Fisher Scientific) na vyhodnotenie expresie miRNA. Surové údaje boli spracované pomocou softvéru ExpressionSuite v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific), aby sa stanovili hodnoty Ct pre každú miRNA.
Analýza údajov pre TLDA
Najprv sme zmerali prahové cykly (hodnotu Ct) každej miRNA. miRNA s hodnotou Ct> 35 sa považovali za nedetekovateľné a boli vylúčené z následnej analýzy. Všetky hodnoty Ct sa normalizovali na hodnotu Ct miR-374b (hodnota ACt), jednej z najstabilnejšie exprimovaných miRNA cirkulujúcich v ľudskej plazme (24). Pomer násobení log2 (hodnota ACt) expresie sa vypočítal s použitím stredných hodnôt kontrolných vzoriek ako kalibrátora v balení HTqPCR v Bioconductor (25). Relatívna kvantifikácia (RQ) každého cieľa miRNA bola definovaná ako 2-ΔΔCt, Pre hypotetické testovanie rozdielu v expresii medzi dvoma skupinami sme použili náhradnú analýzu premenných (SVA) na zachytenie heterogenít, ako sú šaržové účinky v experimentoch s použitím sva balíček v Bioconductor (26). miRNA s a P-hodnota <0.05 boli považované za signifikantne odlišné medzi dvoma skupinami.
Analýza obohatenia génovej sady
Na analýzu obohatenia génovej sady sme použili ToppFun v ToppGene Suite (27) odvodiť významne obohatenú génovú ontológiu (GO) (28) výrazy, dráha a choroba. Ako vstup pre tento prístup sme použili 1,230 predpovedané cieľové gény kandidátnych miRNA. Pathway analýza sa použila na nájdenie významných dráh predpovedaných cieľových génov podľa KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP a MSigDBin v ToppGene dráhach. Význam termínov funkčného obohatenia bol stanovený na základe Bonferroni-upraveného P-hodnota.
Kvantitatívna reverzná transkripčná PCR (qRT-PCR) Validácia a replikácia
Na validáciu miRNA 10, ktoré boli odlišne exprimované v štádiu objavu, sa uskutočnila qRT-PCR s použitím testu TaqMan MicroRNA (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3p # 000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423-5; -002340p, #483; a miR-5-002338p, #652) a systém ViiA3 (Life Technologies) podľa protokolu výrobcu. Desať nanogramov celkovej RNA sa konvertovalo na cDNA prvého vlákna s primérmi špecifickými pre miRNA s použitím súpravy TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (# 002352, Life Technologies), po ktorej nasledovala PCR v reálnom čase s TaqMan Probes. RQ každej miRNA bol definovaný ako 7-ΔCt, kde ΔCt je rozdiel v prahových cykloch pre príslušnú vzorku, normalizovaný proti endogénnej miRNA (miR-374b-5p, #001319). Všetky PCR reakcie sa uskutočňovali trojmo a ich Ct hodnoty sa spriemerovali. Vypočítali sme log2 násobok-zmena pomeru (ACt) každej miRNA rovnakým spôsobom ako v analýze založenej na poli. Vykonal sa neparametrický Mann-Whitney-Wilcoxonov test na testovanie rozdielov v hladinách expresie miRNA v dvoch skupinách s prahom. P- hodnota 0.05.
Western Blot Analysis
Každá vzorka séra sa najskôr vyčerpala z top 14 vysoko hojných proteínov (albumín, imunoglobulín G, imunoglobulín A, serotransferín, haptoglobín, alfa-1 antitrypsín, fibrinogén, alfa-2 makroglobulín, alfa-1 kyslý glykoproteín, imunoglobulín M, apolipoproteín A) , apolipoproteín A-II, komplement C3 a transtyretín) použitím kolóny MARS-14 (4.6 x 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) pred analýzou westernovým prenosom. Nenaviazaná frakcia získaná z kolóny MARS-14 sa skoncentrovala s použitím odstredivého filtra Amicon Ultracel-3 (medzná hodnota 3 kDa) a potom sa koncentrácia proteínu stanovila pomocou metódy kyseliny bicinchoninovej. Rovnaké množstvá (z 10 na 30 ug) kontrolných a IGD vzoriek séra sa separovali na prefabrikovanom géli 4-20% Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, CA, USA) a preniesli sa na polyvinylidén difluoridovú membránu. Ďalej bola membrána blokovaná v TBS-T (190 mM NaCI, 25 mM Tris-HCI, pH 7.5 a 0.05% Tween 20) pomocou 5% netučného sušeného mlieka pri laboratórnej teplote počas 30 min. Membrány sa potom inkubovali s primárnymi protilátkami proti DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) a CNR1 (1: 100, Santa Cruztechnology) , Inc., Santa Cruz, CA, USA), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) a PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) v TBS-T s 5 % netučného sušeného mlieka pri 4 ° C cez noc a potom s vhodnými sekundárnymi protilátkami buď hovädzí anti-myš (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) alebo kozie anti-králik (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA). ) konjugovaná s chrenovou peroxidázou pri teplote miestnosti počas 1 h. Detekcia signálu sa uskutočňovala pomocou chemiluminiscencie s činidlom ECL (GE zdravotníctvo, Piscataway, NJ, USA). Kvantifikovali sme výsledky westernového prenosu pomocou analytického softvéru TotalLab 1D (nelineárna dynamika, Newcastle upon Tyne, UK). Potom sa hodnota pomeru denzitometrie vypočítala vydelením hodnoty denzitometrie každej vzorky, ako je opísané inde (29). Ako kontrola pre normalizáciu sa pre každý experiment použila vzorka séra zhromaždená z 46 IGD a kontrolných vzoriek. Štatistická významnosť bola stanovená pomocou neparametrického Mann-Whitney-Wilcoxonovho testu s prahom P- hodnota 0.05.
výsledky
Charakteristika študijných predmetov
Demografické a klinické črty študovaných subjektov sú uvedené v tabuľke č Table1.1, Keď sme porovnávali IGD a kontrolné skupiny podľa stupnice kórejskej závislosti na závislosti na internete (K-Scale), ako je opísané inde (20, 30), skupina IGD vykázala významne vyššiu strednú hodnotu K-mierky ako kontrolná skupina (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Tabuľka č (Table1) .1). Medián týždenného času stráveného na internetových hrách v skupine IGD bol výrazne dlhší ako v prípade kontrol (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Zatiaľ čo medzi vekovými skupinami, mesačným príjmom domácnosti, dĺžkou vzdelávania, dizajnom blokov a najjemnejšími výsledkami K-WISC, BIS, BInS a BAS neexistoval žiadny významný rozdiel.
Diferenciálne exprimované miRNA medzi IGD a kontrolami
Aby sme objavili miRNA spojené s IGD, prijali sme prístup založený na dvoch krokoch (objav a nezávislá validácia). Dizajn štúdie a celková stratégia sú znázornené na obrázku S1 v doplnkovom materiáli. V štádiu objavenia sme analyzovali expresné profily miRNA vzoriek 51 (25 IGD a 26 kontroly) s použitím miRNA poľa obsahujúceho miRNA 384. Zistilo sa, že úrovne expresie miRNA 10u sú významne odlišné medzi IGD a kontrolnými skupinami (tabuľka 1) (Table2) .2). Relatívne hladiny expresie týchto 10 miRNA sú ukázané na obrázku Figure1.1, Medzi nimi boli dva (hsa-miR-423-5p a hsa-miR-483-5p) regulované a osem (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p-125p-5p hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411c-5p, hsa-miR-652-3P a hsa-miR-XNUMX-XNUMXp) boli downregulované v IG.
Tabuľka 2
Diferenciálne exprimované mikroRNA (miRNA) a násobné zmeny.
| miRNA | objav | Potvrdenie | Kombinované | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-hodnota | Zmena záhybu | P-hodnota | Zmena záhybu | P-hodnota | Zmena záhybu | |
| HSA-MIR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| HSA-MIR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| HSA-MIR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| HSA-MIR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| HSA-MIR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| HSA-MIR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| HSA-MIR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| HSA-MIR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| HSA-MIR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| HSA-MIR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNA sa významne zmenili v súboroch objavov aj validácie konzistentným spôsobom.
qRT-PCR Validácia kandidátnych miRNA
Na validáciu miRNAs 10, ktoré sme kandidovali, sme uskutočnili qRT-PCR s nezávislou validačnou sadou (20 IGD a 16 kontroly) (tabuľka S1 v doplnkovom materiáli). Tri z týchto miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p a hsa-miR-652-3p) boli významne znížené v skupine IGD validačnej sady (tabuľka) (Table2) .2). Tri iné miRNA (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b a hsa-miR-423-5p) boli tiež downregulované v skupine IGD, ale nie významne. Zostávajúce štyri miRNA (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p a hsa-miR-423-5p) sa exprimovali opačne v validačnej množine. Keď sme kombinovali zisťovacie a validačné sady (celkom 45 IGD subjektov a 42 kontrol), tri validované miRNA boli trvalo významné (tabuľka) (Table2) .2). Podrobné informácie, chromozomálne polohy, zrelé sekvencie a hladiny expresie v CNS týchto troch miRNA sú dostupné v tabuľke S2 v doplnkovom materiáli.
Synergický účinok simultánnej zmeny troch miRNA na riziko IGD
Na vyhodnotenie kombinovaného účinku troch miRNA sme pozorovali pravdepodobnostné pomery (OR) štyroch podskupín (s zmenami miRNA 0, 1, 2 alebo 3). Zmena miRNA bola definovaná hodnotou RQ, ako je opísané v časti „Materiály a metódy“Pretože všetky tri miRNAs markery boli downregulované v skupine IGD, miRNA, ktorej RQ hodnota bola nižšia ako jedna, bola deflovaná ako zmenená. Podrobné informácie o RQ hodnote každého študovaného subjektu pre tri miRNA sú dostupné v tabuľke S3 v doplnkovom materiáli. Pre každú podskupinu boli šance vypočítané ako pomer počtu kontrol k kontrolám IGD, potom bol každý OR vypočítaný vydelením pravdepodobnosti každej podskupiny pravdepodobnosťou podskupiny bez akýchkoľvek zmien miRNA. Jedinci s tromi zmenami miRNA vykázali riziko 22-krát vyššie ako u osôb bez zmeny miRNA (ALEBO 22, 95% CI 2.29 – 211.11). OR vykazovali rastúci trend s počtom zmenených miRNA z 0 na 3 (r2 = 0.996) (obrázok (Figure22).
GO a dráhová analýza cieľových génov kandidátnych miRNA
Aby sa získal prehľad o funkciách troch miRNA markerov významne znížených v skupine IGD, ich cieľové gény sa predpovedali pomocou databázy miRWalk 2.0 (31). Celkom 1,230 génov sa dôsledne predpovedali ako downstream ciele pomocou štyroch algoritmov (miRWalk, miRanda, RNA22 a Targetscan) pomocou databázy miRWalk (32-34(Tabuľka S4 v doplnkovom materiáli). Analýza obohatenia génov pomocou ToppFun v ToppGene Suite ukázala, že cieľové gény týchto miRNA boli významne asociované s dráhami nervového vývoja, ako napríklad „Axon vedenie“ a GO termíny ako „neurogenéza“ (tabuľka S5 v doplnkovom materiáli).
Vyjadrenie predpokladaných cieľových génov
Spomedzi cieľových génov troch miRNAs sa 140 predpovedal súčasne pre dve alebo viac miRNA (tabuľka S4 v doplnkovom materiáli). Aby sme preskúmali, či sú ich úrovne proteínovej expresie downstream cieľových génov odlišné medzi IGD a kontrolnými skupinami, vybrali sme gény 2 (DUSP4 a PI15), ktoré sa predpovedajú ako downstream ciele všetkých miRNA 3 a ďalších génov 3 (GABRB2, DPYSL2a CNR1) od tých, ktoré boli predpovedané na miRNAs 2 a vykonali analýzu westernovým prenosom so vzorkami plazmy z kontrolných vzoriek 28 IGD a 28, ktoré boli k dispozícii pre experiment. Porovnali sme výrazy piatich cieľov medzi IGD a kontrolnými skupinami meraním intenzity pásma a oblasti, ako je opísané inde (29). Medzi nimi úrovne expresie DPYSL2 (28 IGD a 28 kontroly, P = 0.0037) a GABBR2 (27 IGD a 28 kontrol, P = 0.0052) boli významne vyššie v skupine s IGD (obrázok (Figure3) .3). Nedokázali sme však pozorovať rozdielne výrazy CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) a PI15 (P = 0.6346).
Diskusia
Uvádza sa, že miRNA sa podieľajú na vývoji neurónov (35, 36) a diferenciálna expresia miRNA mozgu sa pozoruje pri psychiatrických ochoreniach, ako je schizofrénia (37). Preto je pravdepodobné, že cirkulujúce miRNA profily by mohli byť užitočnými biomarkermi pre IGD. Cirkulujúce miRNA boli navrhnuté ako biomarkery pre rôzne neuropsychiatrické poruchy (38-40); molekulárne mechanizmy rozvoja IGD sú však stále známe do značnej miery napriek klinickému a sociálnemu významu. Konkrétne sa neuskutočnili žiadne štúdie miRNA s IGD. Cieľ tejto štúdie bol dvojaký. Najprv sme sa pokúsili objaviť plazmatické miRNA spojené s IGD. Po druhé, hodnotili sme biologickú implikáciu kandidátov miRNA skúmaním proteínovej expresie a GO downstream cieľových génov. Skríningom miRNA expresných profilov a následnou validáciou kandidátov sme zistili, že expresia troch miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p a hsa-miR-652-3p) významne nižšia u pacientov s IGD ako u kontrol. Aj keď expresné vzorce ďalších siedmich kandidátov miRNA neboli pri validácii replikované, môže byť falošne negatívny kvôli malej veľkosti vzorky v tejto štúdii. Pokiaľ je nám známe, toto je prvá správa o možnosti, že expresné profily miRNA v krvi by mohli byť užitočnými biomarkermi pre IGD. Kombinácia troch miRNA markerov by mohla slúžiť ako minimálne invazívny nástroj na včasnú identifikáciu ľudí s rizikom IGD.
Uvádza sa, že miRNA identifikované v tejto štúdii sa podieľajú na rôznych neuropsychiatrických poruchách. Bolo hlásené, že expresia hsa-miR-200c v krvi bola downregulovaná pri niekoľkých psychiatrických poruchách, ako je schizofrénia (41) a veľké depresívne epizódy (42). Bolo hlásené, že miR-200c je viac exprimovaný v synaptických frakciách ako v celkovom prednom mozgu (43) a tiež súvisí so smrťou neuronálnych buniek (44). Na základe týchto predchádzajúcich správ sa miR-200c podieľa na vývoji neurónov a môže byť spojený s neuropsychiatrickými poruchami, ak je jeho expresia narušená. Niekoľko štúdií naznačilo súvislosť medzi miR-652 a rizikom neuropsychiatrických porúch. Podobne ako náš prístup, na identifikáciu biomarkerov krvi pre schizofréniu, Lai a kol. vykonal analýzu TLDA s pacientmi so schizofréniou a normálnymi kontrolami a zistil, že sedem miRNA vrátane hsa-miR-652 bolo odlišne exprimovaných u pacientov so schizofréniou (45). V následnej štúdii navrhli predikčný model s použitím údajov o expresii miRNA a úspešne odlíšili schizofréniu od normálnej kontroly (46). Zmenená expresia hsa-miR-652 sa pozorovala aj u alkoholikov (47). Zistilo sa, že Hsa-miR-26b je aktivovaný počas diferenciácie neuronálnych buniek (48). Perkins a kol. uviedli, že hsa-miR-26b bol downregulovaný v prefrontálnom kortexe pacientov so schizofréniou (49).
Aj keď neexistuje priamy dôkaz podporujúci vzťah medzi narušenou expresiou týchto miRNA a patofyziológiou IGD, môžeme odvodiť, že deregulácia týchto miRNA môže byť spojená s patofyziológiou IGD na základe rôznych predchádzajúcich správ o downstream génoch, ktoré sme predpovedali. , Niektoré z downstream génov troch miRNA, ako sú napr GABRB2, CNR1, NRXN1a DPYSL2 sa uvádza, že sú spojené s neuropsychiatrickými poruchami. Kyselina gama-aminomaslová (GABA) je hlavným inhibičným neurotransmiterom v CNS. Dysregulácia GABA receptora sa podieľa na neuropsychiatrických poruchách vrátane závislosti, úzkosti a depresie (50), ktoré sú tiež hlavnými črtami IGD (8). Uvádza sa, že genetické polymorfizmy v génoch GABA receptorov sú spojené so závislosťou od alkoholu a schizofréniou (51, 52). Dihydropyrimidinázový 2 (DPYSL2) je členom proteínovej rodiny mediátorov proteínov reagujúcich na kolapsín, ktorá hrá úlohu pri zostavovaní mikrotubulov, synaptickej signalizácii a regulácii rastu axónov. Preto bola táto molekula navrhnutá ako biomarker psychiatrických porúch (53, 54). Polymorfizmus v DPYSL2 gén bol tiež spojený s poruchou užívania alkoholu (55). Predchádzajúce správy a naše údaje naznačujú, že nadmerná expresia GABRB2 a DPYSL2, downstream cieľov downregulovaných miRNA, má dôsledky na patogenézu neuropsychiatrických porúch vrátane IGD. Kanabinoidný receptor typu 1 (CNR1) je presynaptický heteroreceptor, ktorý moduluje uvoľňovanie neurotransmiterov a poruchy kanabinoidnej signalizácie sú spojené s rôznymi neuropsychiatrickými poruchami (56). Genetický polymorfizmus CNR1 je známe, že gén súvisí s látkovou závislosťou na Kaukazoch (57). Na potkanom modeli aktivácia ventrálneho hipokampu CNR1 narúša normálne spoločenské správanie a kognitívne funkcie (58). Je známe, že genetická zmena v rodine NRXN sa podieľa na rôznych neuropsychiatrických poruchách vrátane závislosti (59).
Na priamejšie preskúmanie biologickej implikácie troch kandidátov na miRNA sme skúmali proteínovú expresiu ich downstream cieľových génov. Kvôli obmedzenej dostupnosti vzoriek plazmy, bežných kandidátov na 140 (predpovedaných ako downstream od 2 alebo viac miRNA), sme skúmali ciele 5 (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 a PI15) pomocou Western blotu a potvrdili sme túto expresiu GABXBUM a DPYSL2 boli významne vyššie v skupine IGD. Predchádzajúce správy a naše údaje naznačujú, že nadmerná expresia GABRB2 a DPYSL2, downstream ciele downregulovaných miRNA, môže mať dôsledky na patogenézu neuropsychiatrických porúch vrátane IGD. Výsledky GO a analýzy dráh nervových vývojových dráh tiež podporujú neurobiologickú implikáciu miRNA markerov. Ďalším zaujímavým nálezom bol synergický účinok simultánnej alterácie miRNA. Jedinci s down-reguláciou všetkých miRNA 2 vykazovali 3-krát vyššie riziko ako tí, ktorí nemajú down-reguláciu, a OR sa zvyšovali v závislosti od dávky. Hoci CI pre tieto tri zmeny boli široké kvôli obmedzenej veľkosti vzorky, jasná pozitívna korelácia (r2 = 0.996) podporuje synergický účinok troch miRNA.
Aj keď sme objavili markery miRNA asociované s IGD a jednotlivci so všetkými tromi zmenami miRNA mali riziko 22-krát vyššie ako u mien bez akýchkoľvek zmien miRNA, v tejto štúdii existuje niekoľko obmedzení. Po prvé, malá veľkosť vzorky zvýšila pravdepodobnosť chýbania ďalších významných miRNA markerov. Po druhé, pretože naše údaje nepostačovali na objasnenie toho, či sú profily plazmatickej miRNA buď príčinou alebo účinkom, nemôžeme potvrdiť biologické úlohy týchto neinvazívnych markerov v klinickom prostredí. Priama odpoveď môže poskytnúť ďalšie profilovanie miRNA a ich následná génová analýza s použitím ľudského mozgového tkaniva z banky mozgového tkaniva. Užitočná by bola aj analýza mozgového tkaniva so zvieracím modelom hernej poruchy. Po tretie, z dôvodu obmedzenej dostupnosti vzoriek plazmy sme skúmali iba päť downstream kandidátnych molekúl. Pre ďalšie pochopenie molekulárneho mechanizmu IGD bude užitočné preskúmať viac cieľových cieľov s väčším súborom vzoriek.
Stručne povedané, skríningom genómových skríningových profilov expresie miRNA a nezávislej validácie sme objavili tri miRNA spojené s IGD (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p a hsa-miR-652-3p). Uvádza sa, že mnoho z ich downstream génov sa podieľa na rôznych neuropsychiatrických poruchách a experimentálna validácia zmenenej expresie týchto downstream génov podporuje implikáciu miRNA identifikovaných v tejto štúdii. Zistili sme, že jedinci so zníženou reguláciou všetkých troch miRNA sú vystavení vysokému riziku IGD. Spolu so známymi klinickými alebo environmentálnymi rizikovými faktormi a diagnostickými kritériami môžu naše nálezy uľahčiť včasný zásah a pomôcť ľuďom s vyšším rizikom IGD.
Vyhlásenie o etike
Túto štúdiu schválila Inštitucionálna hodnotiaca rada Kórejskej lekárskej vysokej školy v Kórei (MC16SISI0120). Všetci účastníci a ich rodičia dali písomný informovaný súhlas.
Príspevky od autorov
ML a HC prispeli rovnako k tomuto dokumentu. Štúdiu navrhli ML, D-JK a Y-JC. SJ, S-MC, YP, DC a JL uskutočňovali experimenty a generovali údaje. J-WC, S-HP, J-SC a D-JK odobrali vzorky krvi a klinické informácie. Analyzované údaje ML, HC, S-HY a Y-JC. Rukopisy opisovali ML, HC, S-HY a Y-JC. Projekt Y-JC dohliadal.
Vyhlásenie o konflikte záujmov
Autori vyhlasujú, že výskum bol vykonaný bez obchodných alebo finančných vzťahov, ktoré by mohli byť interpretované ako potenciálny konflikt záujmov.
poznámky pod čiarou
Financovanie. Táto práca bola podporená grantom z programu na výskum mozgu prostredníctvom Národnej výskumnej nadácie v Kórei (NRF), ktorú financovalo ministerstvo vedy a IKT a plánovanie budúcnosti (NRF-2015M3C7A1064778).
Doplnkový materiál
Doplnkový materiál k tomuto článku nájdete na internetovej adrese http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Referencie
;
