Dekoding av neurala kretsar som kontrollerar kompulsiv sackarosökning (2015) (BINGE MECHANISM)

För att identifiera LH-neuroner som ger monosynaptisk input till VTA in vivo och observera deras aktivitet under fritt rörliga beteenden använde vi en dubbel-virusstrategi för att selektivt uttrycka channelrhodopsin-2 (ChR2) i LH-neuroner som ger monosynaptisk input till VTA (Figurer 1A och S1). Vi injicerade en adenoassocierad viral vektor (AAV)₅) att bära ChR2-eYFP i en Cre-rekombinasberoende dubbelinverterad öppen läsram (DIO) -konstruktion i LH för att infektera lokal somata och injicerade ett retrogradalt resande herpes simplex-virus (HSV) som bär Cre-rekombinas i VTA. Efterföljande rekombination tillät opsin och fluoroforexpression selektivt i LH-nervceller som ger monosynaptisk input till VTA. För att bekräfta vårt tillvägagångssätt utförde vi ex vivo helcells patch-clamp-inspelningar i horisontella hjärnskivor innehållande LH och spelades in från neuroner som uttrycker ChR2-eYFP, samt närliggande LH-neuroner som var ChR2-eYFP-negativa (Figur 1B). Ljusframkallade spetsfördröjningar, mätt från ljuspulsstart till toppen av åtgärdspotentialen, varierade från 3–8 ms (Figur 1C). Vi fann också att ingen av de inspelade icke-uttryckande (ChR2-negativa) cellerna visade exciterande svar på fotostimulering (n = 14; Figur 1C) trots deras närhet till ChR2-uttryckande celler.

För att utföra optogenetiskt medierad fotoidentifiering in vivo implanterades en optrode i LH för att registrera neuronal aktivitet under en sackaros-sökande uppgift. I samma inspelningssession gav vi flera mönster för fotostimulering för att identifiera ChR2-uttryckande LH-VTA-neuroner (Figurer 1D och S1). Vi undersökte fördelningen av exciterande fotorespons-latenser över alla LH-neuroner som visade en tidslåst förändring i avfyrningshastighet som svar på belysning och observerade en bimodal fördelning (Figur 1E). Vi observerade en population av nervceller under in vivo-inspelningar med latenser i intervallet 3-8 ms. Detta var identiskt med det latensintervall som hittades i ChR2-uttryckande LH-VTA-nervceller när vi registrerade ex vivo. Vi kallade dessa enheter för ”typ 1” -enheter (Figurer 1C, 1E och 1F). Dessutom fanns en distinkt population av celler med ~ 100 ms fotoresponslatenser (Figurer 1E och 1G), och vi kallade dessa "Typ 2" -enheter. Vi observerade också neuroner som hämmades som svar på fotostimulering av LH-VTA-neuroner (Figur S2), och vi kallade dessa "Type 3" -enheter. Vi jämförde åtgärdspotentialens varaktighet (mätt från topp till tråg) och medelvärden för avfyrning av enheterna 1 och Type 2 samt de som inte visade ett fotorespons (Figur 1H). Fördelningen av handlingspotentiella varaktigheter av typ 1 (Figur 1I) och typ 2 (Figur 1J) enheter visar att majoriteten av typ 1-enheter har en åtgärdspotentialvaraktighet mindre än 500 μs (84%; n = 16/19, binomial fördelning, p = 0.002).

Även om typ 1-enheter uppfyller standardkriterier för att klassificeras som ChR2-uttryckande (Cohen et al., 2012, Zhang et al., 2013), var det oklart om den längre latensfotoresponsen av typ 2-enheter var en indikation på ChR2-uttryckande neuroner som svarade långsammare till fotostimulering, eller om denna effekt berodde på nätverksaktivitet. Med tanke på att de ChR2-uttryckande (typ 1) LH-neuronerna projicerar direkt till VTA, var en möjlighet att typ 2-neuroner fick feedback från VTA (Figur 1K). En annan möjlighet var att typ 2-nervceller aktiverades av axons kollateraler från typ 1-neuroner (Figur 1L). För att skilja mellan dessa två möjliga kretsmodeller inhiberade vi VTA i samband med fotoidentifiering i LH.

Baserat på våra kretsmodeller kan vi förvänta oss att distal hämning inte skulle ha någon effekt på fotoresponserna av ChR2-uttryckande LH-neuroner. Men om fotoresponsiva, men icke-uttryckande, LH-neuroner förlitade sig på feedback från VTA för att framkalla ett tidslåst svar på belysning (Figur 1K), vi kan förvänta oss en dämpning av fotoresponser i dessa neuroner efter VTA-hämning. Vi uttryckte ChR2 i LH-VTA-celler som ovan, men denna gång uttryckte också förbättrad halorhodopsin 3.0 (NpHR) i VTA och implanterade en optisk fiber i VTA utöver optroden i LH (Figur 2EN). Vi levererade samma blåljusbelysningsmönster i LH för alla tre epokarna men fotohämmade också VTA med gult ljus i den andra epoken (Figur 2EN).

Fotoresponserna av typ 1-enheter till blålysbelysning i LH påverkades inte av fotoinhibition av VTA, vilket överensstämmer med ChR2-uttrycket i typ 1 LH-VTA-neuroner (Figur 2B). Däremot visade majoriteten av typ 2-enheter (87%; n = 13/15, binomial fördelning, p = 0.004) en signifikant dämpning av fotoresponser till blå-ljuspulser levererade i LH vid fotoinhibering av VTA-neuroner. Svaren från typ 1- och typ 2-enheter under VTA-fotoinhibition var signifikant olika (chi-kvadrat = 7.64, p = 0.0057; Figurer 2B och 2C). Dessa skillnader kan också ses i max Z-poäng under individuella epoker (Figur 2D) och med den gul-ON-epoken normaliserad till den gul-OFF-epoken (Figur 2E). Dessa data antyder att typ 2 LH-neuroner mottar input (antingen direkt eller indirekt) från VTA (Figur 1K) snarare än via lokala axon-säkerheter (Figur 1L).

Efter att ha identifierat dessa två distinkta typer av LH-neuroner i LH-VTA-slingan, ville vi undersöka naturligt förekommande nervaktivitet under en sackaros-självadministrationsuppgift (Figur 3A). Möss tränades för att utföra nosepoke-svar för en ledtråd som förutsäger sackarosleverans i en intilliggande hamn (som i Tye et al., 2008). För att tillåta oss att differentiera neurala reaktioner på nosepoke och cue, levererades cue och sackaros på ett partiellt förstärkningsschema, varvid 50% av nosepokes parades med en cue och sackarosleverans.

Typ 1-enheter visade fasrespons på inmatning av sackarosport, sett i en representativ typ 1-enhet (Figur 3B), såväl som befolkningsdata för alla typ 1-enheter (Figur 3C). De fasiska svaren för enheter av typ 2 återspeglade emellertid huvudsakligen svar på belöningsförutsägbar signal (Figurer 3D och 3E). De normaliserade avfyrningsmönstren för alla inspelade nervceller (n = 198, uppdelade i typ 1, 2, 3 och icke-responsiva enheter) visas för varje uppgiftskomponent: nosepoke ihopkopplad med cue, nosepoke i frånvaro av cue, och sackarosportinmatning (Figur 3F). Alla typ 1-enheter som visade uppgiftsrelevanta fasförändringar i aktivitet (74%; n = 14/19) antingen fasades exakt eller inhiberades av sackarosportinmatning, med ett litet antal som också visade fasinhibering av belöningsförutsägande ledtråd (Figurer 3B, 3C och 3G). Däremot var typ 2-enheter mer heterogena, med uppdragsresponsiva neuroner som kodar cue selektivt (35%), sackarosport-posten selektivt (26%), eller både signalen och portinmatningen (12%; Figurer 3D, 3E och 3H). För att illustrera styrkan hos svar från enheter 1 och Type 2 på uppdragsrelaterade händelser, planerade vi varje cell på en tredimensionell plott enligt Z-poäng (Figur 3JAG). För att visa fördelningen av fasiska förändringar i avfyrning till flera uppgiftsrelaterade händelser på en kvalitativ nivå, planerade vi antalet celler av varje fotoresponsstyp som föll in i en viss kategori (Figur 3J).

Med tanke på VTA: s väldefinierade roll i belöningsförutsägningsfel (t.ex. fasreduktion av DA-neuronavfyring som svar på det oväntade utelämnandet av en belöning och den fasiska exciteringen som svar på oväntad belöningsleverans) (Schultz et al., 1997) undersökte vi huruvida LH-neuroner skulle koda för oväntat utelämnande av en sackarosbelöning. För att göra detta registrerade vi den neurala aktiviteten hos fotoresponsiva nervceller under samma köbelöningsuppgift hos välutbildade djur men slumpmässigt utelämnade 30% av sackarosleveranserna efter köen (Figur 4EN).

Majoriteten av typ 1-enheter (88%; n = 15/17, binomial fördelning, p = 0.001) var okänsliga för utelämnande av belöningar (Figurer 4B och 4D), medan en stor delmängd av typ 2-enheter (67%; n = 12/18) visade ett signifikant annorlunda svar på belöningspresenterade och belönningsundantagna försök (Figurer 4C och 4D). Vi drog slutsatsen att LH-VTA (typ 1) neuroner kodade handlingen för att komma in i porten, eftersom dessa port-entry-svar var ihållande även efter belöningsundersökning (Figur 4D), i motsats till typ 2-enheter (chi-kvadrat = 10.9804, p = 0.0009).

För att avgöra om typ 1-svar på portinträde verkligen kodade det konditionerade svaret (CR), i motsats till generellt belöningssökande eller utforskande beteende, registrerade vi i utbildade möss som ännu inte hade fått uppgiften. I uppdragsniva möss levererade vi sackaros till hamnen i frånvaro av en prediktiv signal (oförutsedd belöningsleverans) och fann att typ 1-enheter inte visade fasiska svar på portinmatning (Figurer 4E, 4F och 4I), i överensstämmelse med modellen som typ 1-neuroner kodar för CR (Figur 4J).

För att avgöra om typ 2-enhetsaktivitet är förenlig med en felaktig liknande svarsprofil med belöningsförutsägelse, registrerade vi även dessa neuroner i vältränade djur under oförutsedd belöningstillförsel (Figur 4G). Vi fann att en delmängd av typ 2-enheter svarade på oförutsedda leveranser av sackaros (50%; Figurer 4G-4I). Sammantaget är delmängder av typ 2-enheter känsliga för oväntade belöningsundersökningar (Figurer 4C och 4D) och oförutsedd belöningsleverans (Figurer 4G – 4I), i överensstämmelse med en felprofilliknande svarsprofil som belöningsförutsägelse.

Som vi har visat ovan representerar typ 1-enheter ett neuralt korrelat av CR. Det är viktigt att ökningen av avfyrningshastigheten börjar före CR, och fortskrider tills CR är avslutad (Figurer 3B, 3C och 4B). För att bestämma om aktivering av LH-VTA-vägen skulle kunna främja CR, ville vi testa förmågan hos LH-VTA-aktivering för att driva CR inför en negativ konsekvens. I vildtypsmöss uttryckte vi ChR2-eYFP eller eYFP enbart i LH-cellkroppar och implanterade en optisk fiber över VTA (Figurer 5A och S4). Omvänt, för att testa rollen för LH-VTA-vägen vid förmedling av CR eller utfodringsrelaterat beteende, uttryckte vi bilateralt NpHR-eYFP eller eYFP enbart i LH-celler och implanterade en optisk fiber ovanför VTA (Figurer 5A och S4).

Vi designade en pavlovsk konditioneringsuppgift där möss berövade möss var tvungna att korsa ett chockraster för att få en sackarosbelöning (Figur 5B). Under den första "baslinjetiden" (med chockgallret av), verifierade vi att varje mus hade förvärvat den Pavlovian konditionerade uppgiften. I den andra ("Shock") epoken levererade chocknätet milda fotchocker varje sekund. Slutligen fortsatte vi under den tredje epoken ("Shock + Light") att leverera fotchocker men också upplysta LH-terminaler i VTA med blått ljus (10 Hz) hos möss som uttryckte ChR2 och matchade eYFP-kontroller och gult ljus (konstant) för möss som uttrycker NpHR och deras eYFP-kontroller (Figur 5B).

Vi observerade ett signifikant högre antal portinmatningar per cue under Shock + Light-epoken och ett signifikant högre skillnadsresultat (Shock + Light-epok - Shock-only epoch) i ChR2-möss i förhållande till eYFP-möss (Figur 5C och Film S1). Däremot resulterade fotoinhibition av LH-VTA-vägen i en signifikant minskning av portinmatningar per ledning och skillnadsresultat i NpHR-möss i förhållande till eYFP-möss (Figur 5D och Film S2). Experiment inom extensionsutrotning under vilka cue-presentationer inte följdes av sackarosleveranser visade liknande trender i effekt (Figur S4).

Det är viktigt att vi ville bestämma om förändringarna i sockerosökande som vi hade fått orsakades av förändringar i matningsrelaterat beteende eller känslighet för smärta. Vi observerade att fotoaktivering av LH-VTA-projektionen signifikant ökade den tid som spenderades på välfodrade möss i gruppen ChR2 (Figur 5E). Fotoinhibition av LH-VTA-vägen reducerade emellertid inte signifikant utfodring (Figur 5F), även om dessa djur var livsmedel som berövades för att förbättra vår förmåga att upptäcka en minskning i förhållande till baslinjeepoken (jämför med sated djur i Figur 5E). I varken ChR2 (Figur 5G) eller NpHR-grupp (Figur 5H) observerade vi en skillnad i latens till svansuttag från varmvatten (Ben-Bassat et al., 1959, Grotto och Sulman, 1967), vilket indikerar att manipulering av LH-VTA-projektionen inte förändrade analgesi.

För att studera sammansättningen av de snabba överföringskomponenterna av LH-ingångar till VTA som framkallade dessa effekter utförde vi helcellspatch-inspelningar från VTA-neuroner i en akut skivpreparering medan vi optiskt aktiverade LH-ingångar som uttrycker ChR2-eYFPFigurer 6A och S5). Med tanke på att det finns väletablerad heterogenitet inom VTA, inklusive ~ 65% DA-neuroner, ~ 30% GABA-neuroner och ~ 5% glutamatneuroner (Margolis et al., 2006, Nair-Roberts et al., 2008, Yamaguchi et al., 2007) fyllde vi celler med biocytin under inspelning för att möjliggöra identifiering av celltyp med post-hoc immunhistokemi för tyrosinhydroxylas (TH; Figur 6B) förutom att registrera den hyperpolarisationsaktiverade katjonströmmen (I_h) och kartlägga cellplats (Figurer 6B och S5).

Först registrerade vi i strömklämma under fotostimulering av ChR2-uttryckande LH-ingångar och observerade att 23 av 27-neuroner visade ett tidslåst svar på fotostimulering av LH-ingångar (Figur 6C). Majoriteten av DA-neuroner som togs in i VTA fick en nettocitatorisk inmatning från LH (56%), medan en annan delmängd visade nettoinhibering (30%; Figur 6C). Den rumsliga fördelningen av dessa DA-neuroner kartläggs på en atlas för horisontella skivor innehållande VTA (Figur 6D).

För att fastställa det monosynaptiska bidraget från LH-ingångar till VTA DA-nervceller använde vi ChR2-assisterad kretskartläggning, där inspelningar av spänningsklämmor utfördes i närvaro av tetrodotoxin (TTX) och 4-aminopyridin (4AP; Petreanu et al., 2007) . I överensstämmelse med våra observationer från inspelningar med nuvarande klämma observerade vi att majoriteten av inspelade VTA DA-neuroner exklusivt fick excitatorisk monosynaptisk input från LH (67%), jämfört med VTA DA-neuroner som exklusivt fick inhiberande monosynaptisk input (11%), eller båda (22%; Figurer 6E och S6).

Vi identifierade VTA GABA-nervceller genom att injicera en Cre-beroende fluorofor (AAV)₅-DIO-mCherry) i VTA för VGAT :: Cre-möss och använt mCherry-uttryck för att styra inspelningen av VTA GABA-neuroner (n = 24; Figur 6F). Fyrtiosex procent av VTA-GABA-neuroner svarade med nettocitation, medan 54% svarade med netthämning, till fotostimulering av ChR2-uttryckande LH-ingångar (Figur 6G). Den rumsliga fördelningen av dessa celler visas i Figur 6H. Vid undersökning av den monosynaptiska inmatningen från LH (såsom beskrivits ovan) fann vi att 18% av de provade GABA-neuronerna uteslutande fick excitatorisk inmatning och 9% fick uteslutande hämmande inmatning (Figur 6I). I förhållande till VTA DA-neuroner fann vi dock att fler VTA GABA-neuroner fick både exciterande AMPAR-medierad och hämmande GABA_AR-medierad monosynaptisk inmatning från LH (73%; chi-kvadrat = 5.0505, p = 0.0246; Figurer 6jag och S6).

Med tanke på att våra ex vivo-inspelningar gav bevis som stöder robust input från både GABAergic och glutamatergic LH-prognoser till VTA, undersökte vi nästa roll för varje komponent oberoende. För att göra detta använde vi transgena muslinjer som uttrycker Cre-rekombinas i nervceller som uttryckte antingen vesikulär glutamattransportör 2 (VGLUT2) eller vesikulär GABA-transportör (VGAT). Vi injicerade AAV₅-DIO-ChR2-eYFP eller AAV₅-DIO-eYFP in i LH för VGLUT2 :: Cre och VGAT :: Cre-möss och implanterade en optisk fiber över VTA (Figur S7). Dessa djur kördes sedan på varje beteendeanalys som visas i Figur 5.

Vi observerade inga påvisbara skillnader i antalet portinmatningar som gjordes per cue mellan möss som uttrycker ChR2 eller eYFP i LH^glut-VTA-projektion (Figur 7A) eller i LH^GABA-VTA-projektion (Figur 7B). Men vid videoanalys märkte vi avvikande gnagningsbeteenden i LH^GABA-VTA: ChR2-grupp vid belysning av blått ljus (se Filmer S3 och S4). I LH^glut-VTA-möss, även om det fanns en trend mot en minskning av utfodring vid fotostimulering i ChR2-gruppen jämfört med eYFP-gruppen, var detta inte statistiskt signifikant (Figur 7C). Däremot observerade vi en kraftig ökning av tiden för matning i mättade möss efter belysning i LH^GABA-VTA: ChR2-grupp i förhållande till kontroller (Figur 7D och Film S3). I ingen av djurgrupperna fanns det en effekt av ljusstimulering i analysen med svansavlägsnande (Figurer 7E och 7F).

Under utfodringsuppgiften, som vi gjorde under den sackarosökande uppgiften, märkte vi återigen avvikande matningsrelaterade motorsekvenser som inte var riktade mot mat. Vi filmade en representativ mus i LH^GABA-VTA: ChR2-grupp i en tom genomskinlig kammare och vid 20 Hz fotostimulering observerade vi ovanliga aptitfulla motorsekvenser som att slicka och gnugga golvet eller tomt utrymme (Film S4). Vi kvantifierade dessa "gnagande" beteenden under utfodringsuppgiften i vildtyp LH-VTA (Figur 7GL H^glut-VTA (Figur 7H) och LH^GABA-VTA (Figur 7I) grupperade och visade att LH^GABA-VTA: ChR2-möss gnuggade mer än vildtyp eller LH^glut-VTA: ChR2-möss när de fotostimuleras, jämfört med deras respektive eYFP-grupper (Figur 7J). Vi övervägde om det avvikande utfodringsrelaterade beteendet kan separeras från lämpligt riktad matning vid lägre frekvenser. Men när vi testade LH^GABA-VTA: ChR2-grupp med 5 Hz och 10 Hz-tåg av blått ljus, vi observerade ett proportionellt samband mellan stimuleringsfrekvens och både utfodring och gnagande (Figur 7K).

LH-projektionen till VTA har undersökts med elektriska stimuleringskollisionsstudier (Bielajew och Shizgal, 1986) och har länge antagits för att spela en roll i belöningsbearbetning (Hoebel och Teitelbaum, 1962, Margules and Olds, 1962) men ändå redogör för detta roll har varit en utmaning. Här tillhandahåller vi en detaljerad dissektion av hur enskilda komponenter i LH-VTA-loopen bearbetar olika aspekter av en belöningsrelaterad uppgift.

Genom användning av optogenetik-medierad fototagging (Figur 1), har vi identifierat två separata populationer av LH-neuroner: celler som skickar projektioner till VTA (typ 1) och celler som får feedback från VTA (typ 2; Figur 2) - Även om dessa populationer inte behöver vara uteslutande, eftersom det är möjligt att LH-neuroner både kan skicka och ta emot insatsvaror till och från VTA. Intressant nog fann vi att relativt få fotoresponsiva neuroner föll utanför den bimodala distributionen som omsluter dessa två populationer (Siffror S2B och 1E). Med tanke på detta, i kombination med den långa latensfördröjningen i typ 2-fotosvar (~ 100 ms), spekulerar vi i att det kan finnas en dominerande väg som bidrar till aktiviteten hos typ 2-nervceller. Dessutom, eftersom DA binder G-proteinkopplade receptorer, är kinetiken långsammare än de flesta glutamatergiska synapser (Girault och Greengard, 2004) och kan förklara detta kluster av 100 ms latens fotoresponsiva enheter. Det är också möjligt att VTA kan ge indirekt återkoppling genom andra distala regioner, via exciterande mellanregioner såsom amygdala, eller med desinhibition via nucleus accumbens (NAc) eller bäddkärnan i stria terminalis (BNST).

Intressant, medan fotostimulering av typ 1-enheter framkallar exciterande svar i typ 2-enheter, visar typ 1 och 2-enheter tydliga beteendekodningsegenskaper. Exempelvis är antalet typ 1- och typ 2-enheter som selektivt kodar den belöningsförutsägande signalen signifikant olika (n = 0/19 typ 1 kontra n = 12/34 typ 2, chi-kvadrat = 8.67, p = 0.003) . Detta paradoxala svarmönster kan bero på beräkningsförfaranden vid ett mellanliggande kretselement, såsom VTA, som kan spela en aktiv roll under beteendeuppgiften men inaktiv under fotomärkning. Dessutom kan djurets beteendestatus påverka hur dessa uppgifter behandlas.

Våra försöksundersökningsförsök tillät oss att skilja mellan LH-neuralkodning av CR och konsumtion av den okonditionerade stimulansen (US). I dessa experiment svarade en delmängd av typ 2-enheter på belöningsprediktiv cue (CS) och USA och visade också en minskning i skjutfrekvensen när förväntade belöningar utelämnades. Dessutom visar en delmängd av typ 2-enheter också fasisk excitation vid oväntad belöningstillförsel (Figurer 4G och 4H). Dessa data påminner om hur DA-neuroner i VTA kodar för belöningsförutsägningsfel (Cohen et al., 2012, Schultz et al., 1997). Vi spekulerar i att VTA-neuroner kan överföra belöningsförutsägelsefelsignaler till en delmängd av LH-neuroner, som är väl positionerade för att integrera dessa signaler för bestämning av en lämplig beteendeutgång. Specifikt är LH robust sammankopplat med en mängd andra hjärnområden (Berthoud och Münzberg, 2011) och har kausalt kopplats till homeostatiska tillstånd som sömn / upphetsning och hunger / mättnad (Carter et al., 2009, Jennings et al. , 2013).

Tvångsmässigt belöningssökande beteende har primärt diskuterats i samband med drogberoende, där ett klassiskt paradigm för tvångssökande har varit att undersöka i vilken grad drogsökande beteende kvarstår inför en negativ konsekvens, såsom en fotchock (Belin et al., 2008, Pelloux et al., 2007, Vanderschuren och Everitt, 2004). Vi anpassade denna uppgift för sackaros som försökte låta oss undersöka om aktivering av LH-VTA-vägen var tillräcklig för att främja tvångssackarosökande. Med tanke på att en tydlig skillnad mellan läkemedel och naturlig belöning är att läkemedelsbelöningar inte är nödvändiga för överlevnad, finns det kontroverser om vad beteenden skulle utgöra tvångssackaros- eller livsmedelssökande beteende. En alternativ tolkning av våra data är att aktivering av LH-VTA-vägen helt enkelt ökar motiveringsdriften eller lusten att söka aptitliga förstärkare. I takt med att fetma har ökat de senaste decennierna (Mietus-Snyder och Lustig, 2008) är tvångsmässigt överätande och sockerberoende vanliga tillstånd som utgör ett stort hot mot människors hälsa (Avena, 2007). Matningsbeteendet hos mättade (fullmatade) möss efter aktivering av LH-VTA-vägen påminner om ätbeteenden som ses hos människor diagnostiserade med tvångsmässig överätningsstörning (eller binge-eating disorder) (DSM-V).

Det har föreslagits att upprepade handlingar leder till bildning av vanor, som själva leder till den tvångsmässiga belöningssökande som kännetecknar missbruk (Everitt och Robbins, 2005). Vårt konstaterande att LH-VTA-neuroner endast kodar portinträde efter konditionering tyder på att denna väg selektivt kodar ett konditionerat svar, inte bara en motiverad handling. Detta överensstämmer med våra iakttagelser att att optisk aktivering av denna projektion kan främja tvångsmässig belöningssökning inför en negativ konsekvens (Figur 5C) såväl som i frånvaro av behov (som ses hos mättade möss, Figur 5E). Denna tolkning bekräftas vidare av vårt konstaterande att fotoinhibition av LH-VTA-vägen selektivt minskar tvångssackarosökning (Figur 5D) men minskar inte utfodring hos matbegränsade möss (Figur 5F). En av de största utmaningarna vid behandling av tvångsmässig överätning eller ätstörningar är risken för försämrad matningsbeteende i allmänhet. Ur ett översättningsperspektiv kan vi ha identifierat en specifik nervkrets som ett potentiellt mål för utvecklingen av terapeutiska ingrepp för tvångsmässig överätning eller sockerberoende utan att offra naturligt foderbeteende.

Vi visar att förutom en glutamatergisk LH-VTA-komponent (Kempadoo et al., 2013) finns det också en signifikant GABAergisk komponent i projektionen (Leinninger et al., 2009), och att LH-neuroner synapsar direkt på både DA och GABA-nervceller i VTA (Figur 6). Det finns emellertid en skillnad i balansen mellan den exciterande / hämmande inmatningen till VTA DA och GABA-neuroner.

Medan vi använde immunhistokemisk behandling för att verifiera identiteten hos VTA-neuroner, mätte vi också I_h, en hyperpolarisationsaktiverad inre korrigerande icke-specifik katjonström (Lacey et al., 1989, Ungless and Grace, 2012). Närvaron av denna ström har använts i stor utsträckning i elektrofysiologiska studier för att identifiera DA-neuroner, men det har visat sig att det endast finns närvarande i delpopulationer av DA-neuroner, avgränsade av projektionsmål (Lammel et al., 2011). Även om det tidigare har föreslagits i en granskning av Fields och kollegor att "LH-neuroner synapsar på VTA-projektionerna till PFC, men inte de som projicerar till NAc" (Fields et al., 2007), föreslår våra data att denna kontrovers öppnas igen. för vidare utredning. Även om vi observerade en delmängd av DA-neuroner som fick netto excitation från LH och hade ett mycket litet jag_h (i överensstämmelse med mPFC- eller NAc-medialskal-projicering av DA-neuroner) såg vi också en delmängd av DA-neuroner som fick netto excitatorisk input och visade en stor I_h (överensstämmer med egenskaperna hos DA-nervceller som projicerar till NAc: s laterala skal; Figur S5; Lammel et al., 2011). Omvänt visade VTA DA-nervceller som fick en nettoinhiberande ingång ett mycket litet jag_h eller saknade denna ström, vilket överensstämmer med uppfattningen att LH överväger huvudsakligen hämmande input på VTA DA-neuroner som skjuter ut till mPFC eller NAc: s medialskal. Vi visar också att LH-ingångar kan observeras i både medial och lateral VTA, vilket tyder på att LH ger ingångar på VTA-neuroner med olika projektionsmål, eftersom det är känt att VTA-projektionsmål motsvarar något av rumslig plats längs en medial-lateral axel ( Lammel et al., 2008).

Rollen för LH-VTA-vägen för att främja belöning har tidigare tillskrivits glutamatergisk överföring i VTA (Kempadoo et al., 2013), eftersom CaMKIIa-promotorn ofta anses vara selektiv för exciterande projektionsneuroner. Våra data visar dock tydligt att uttryck av ChR2 under kontroll av CaMKIIa-promotorn också riktar sig mot GABAergiska projektionsneuroner i LH (Figur 6).

Det beteende som framkallas genom fotostimulering av LH^GABA-VTA-vägen var vanvidd, missriktad och missanpassad (Film S4). En tolkning är att aktiveringen av LH^GABA-VTA-vägen skickar en signal till musen som orsakar erkännande av en aptitretande förstärkare. En alternativ tolkning är att LH^GABA-VTA-vägen kan leda till stimulansförmåga eller en intensiv "vilja", i överensstämmelse med en signal som ligger bakom konditionerat tillvägagångssätt, men på en icke-fysiologisk nivå som ger detta avvikande utfodringsrelaterat beteende (Berridge och Robinson, 2003). I överensstämmelse med detta är det möjligt att aktivering av LH^GABA-VTA-projektion ger faktiskt intensiva känslor av begär eller uppmanar att matas. Men våra experiment visar att aktivering av LH^GABA-VTA producerar inte en ökning av tvångssockerosökning, men detta beror troligen på överdrivet gnagande och avvikande aptitligt beteende fokuserat på icke-livsmedelsföremål i testkammaren. Även om det är svårt att bestämma upplevelsen av musen under denna manipulering, är det uppenbart att lämpligt riktade matningsrelaterade beteenden kräver en samordnad aktivering av både GABAergic och glutamatergic komponenter i LH-VTA-vägen.

Optogenetiska och farmakogenetiska manipulationer är kraftfulla verktyg för att upprätta orsakssamband, men de avslöjar inte de endogena, fysiologiska egenskaperna hos nervkretselement. Vår studie förenar information om den synaptiska anslutningen, den naturligt förekommande endogena funktionen och kausalrollen för LH-VTA-vägen, vilket ger en ny nivå av insikt om hur information integreras i denna krets. Dessa resultat belyser vikten av att undersöka neurons funktionella roll genom anslutning, utöver genetiska markörer. LH-VTA-neuroner kodade selektivt handlingen för belöningssökande men kodade inte miljöstimuli, medan givande stimuli och belöningsprediktiva signaler kodades av en diskret population av LH-neuroner nedströms VTA. Dessutom har vi identifierat en specifik projektion som är kausalt kopplad till tvångssockerosökande och utfodringsbeteende. Heterogeniteten i LH-VTA-projektionen är nödvändig för att tillhandahålla en anpassningsbar balans mellan drivmotivation och reglering av lämpligt riktade aptitliga beteenden. Dessa fynd ger insikter som är relevanta för patologiska tillstånd såsom tvångsmässig ätätningsstörning, sockerberoende och fetma