Basal Ganglia dysfunktion bidrar till fysisk inaktivitet i fetma (2016)

Tillgänglig online 29 December 2016

Visa mer

http://dx.doi.org/10.1016/j.cmet.2016.12.001

Höjdpunkter

• Fetma är förknippat med fysisk inaktivitet

• Feta möss har mindre striatal D2R-bindning, vilket kan förklara deras inaktivitet

• Återställa G_i signalering i iMSNs räddar fysiska aktivitetsnivåer för feta möss

• Fysisk inaktivitet är mer en konsekvens än en orsak till viktökning

Sammanfattning

Fetma är förknippat med fysisk inaktivitet, vilket förvärrar hälsokonsekvenserna av viktökning. Emellertid är mekanismerna som förmedlar denna förening okända. Vi ansåg att underskott i dopaminsignalering bidrar till fysisk inaktivitet vid fetma. För att undersöka detta kvantifierade vi flera aspekter av dopamin-signalering hos mager och överviktiga möss. Vi fann att D2-receptor-typ (D2R) -binding i striatum, men inte D1-receptorbindning eller dopaminnivåer, minskades hos feta möss. Genetiskt avlägsnande av D2R från striatala medelstänkta nervceller var tillräckligt för att minska motorisk aktivitet hos magra möss, medan återställande av G_i signalering i dessa neuroner ökade aktiviteten hos feta möss. Överraskande, även om möss med låga D2R var mindre aktiva, var de inte mer sårbara för dietinducerad viktökning än kontrollmöss. Vi drar slutsatsen att underskott i striatal D2R-signalering bidrar till fysisk inaktivitet vid fetma, men inaktivitet är mer en konsekvens än en orsak till fetma.

Grafiskt abstrakt

Figuralternativ

Nyckelord

fetma;
dopamin;
fysisk aktivitet;
övning;
D2;
striatum;
fet;
viktminskning

Beskrivning

Fetma är förknippat med fysisk inaktivitet (Brownson et al., 2005 och Ekkekakis et al., 2016), som förenar de negativa hälsoeffekterna av typ II-diabetes och hjärt-kärlsjukdom (de Rezende et al., 2014 och Sharma et al., 2015). Mekanismerna som ligger till grund för denna förening är inte kända, vilket faktum återspeglas i bristen på effektiva interventioner för att förändra fysisk aktivitetsnivå i populationer med fetma (Ekkekakis et al., 2016). Intressant nog har fetma förknippats med förändringar i signalering av streatal dopamin (DA), vilket har lett till hypoteser om belöningsdysfunktion i fetma (Blum et al., 2011, Kenny, 2011 och Volkow och Wise, 2005). Även om striatal DA är starkt kopplat till motoreffekt har få studier undersökt hur dietinducerade dopaminerga förändringar kan bidra till fysisk inaktivitet. Vi antar att striatal DA-signalering försämras i fetma och att detta bidrar till fysisk inaktivitet. Att förstå de biologiska orsakerna till fysisk inaktivitet kan leda till effektiva insatser för att öka aktiviteten och därmed förbättra hälsan hos individer med fetma.

Striatal DA är kritiskt involverad i motorstyrning. Detta är tydligt i motoriska störningar såsom Parkinsons sjukdom, som kännetecknas av döden av dopaminerga nervceller i mellanhinnan och resulterande förlust av striatal DA (Hornykiewicz, 2010). De två populationerna av striatal projiceringsneuroner modulerade av DA är kända som de direkta och indirekta vägen med medelstora neuroner (dMSNs och iMSNs) (Alexander och Crutcher, 1990, DeLong, 1990 och Gerfen et al., 1990). dMSN uttrycker G_s-kopplad D1-receptor (D1R) och projicera till substantia nigra och internt segment av globus pallidus, medan iMSN: er uttrycker G_i-kopplat D2R och projekt till det yttre segmentet av globus pallidus (GPe) (Gerfen et al., 1990, Le Moine och Bloch, 1995 och Levey et al., 1993). Genetisk eliminering av D2R från iMSN, eller optogenetisk stimulering av iMSN, är tillräcklig för att minska rörelsen (Kravitz et al., 2010 och Lemos et al., 2016). Baserat på kopplingar mellan D2R-dysfunktion och fetma, antog vi att feta djur har förändrat iMSN-output, vilket resulterat i fysisk inaktivitet.

Här undersökte vi flera aspekter av DA-signalering hos mager och dietinducerade feta möss. D2R-bindning reducerades hos feta möss, medan D1R-bindning och extracellulära DA-nivåer förblev oförändrade. Fetma möss uppvisade också störningar vid avfyrning och hade minskat rörelse. Genetiskt eliminering av D2R från iMSN minskade aktiviteten hos magra möss medan återställande av G_i signalering i iMSN: s ökad aktivitet hos feta möss. Dessa resultat fastställer att D2R-signalering i iMSN: er kan i två riktningar modulera fysisk aktivitet. Vi frågade sedan om möss med låg D2R-signalering var mer sårbara för viktökning på en fettsnål diet på grund av deras låga aktivitet. För att göra detta undersökte vi viktökning med avseende på naturlig variation i D2R-bindning bland möss, liksom hos möss med genetisk eliminering av striatal D2R. Även om möss med låga nivåer av D2R hade låga nivåer av fysisk aktivitet, fick de vikt i samma takt som möss med intakta D2R. Detta argumenterar mot ett starkt orsakssamband mellan fysisk aktivitet och viktökning. Vi drar slutsatsen att försämringar i D2R-signalering bidrar till fysisk inaktivitet vid fetma men att inaktivitet inte nödvändigtvis leder till viktökning.

Resultat

Dietinducerad fetma förknippades med fysisk inaktivitet

C57BL6 / J-hanmöss (3–4 månader) utfodrades antingen som standard chow (magert, n = 8) eller fettrik kost (överviktig, n = 8) i 18 veckor (Figur S1A). Från och med vecka 2 och kvarstod fram till vecka 18 hade överviktiga möss signifikant högre kroppsvikt och fettmassa än magra möss (p <0.0001; Figurer 1A och S1B). Mager massa förändrades inte signifikant (Figur S1C). Vi mätte aktivitetsnivåer i ett öppet fält varannan vecka under 2 veckor (Ethovision; Noldus Information Technologies). Överviktiga möss hade lägre aktivitet än magra möss från och med vecka 18 och kvarstod fram till vecka 4 (p <18; Figurer 1B och 1C). Vid vecka 18 tillbringade överviktiga möss mindre tid på att röra sig (p = 0.005), hade färre rörelser (p = 0.0003) och hade lägre hastigheter när de rörde sig (p = 0.0002; Figur 1D) relativt mager möss. Uppfödning och skötsel ändrades inte signifikant (Figur 1D). Överviktiga möss sprang också mindre än magra möss när de fick tillgång till löparhjul för hemburar (p = 0.0005; Figur 1E). Vi testade om rörelserunderskott korrelerade med viktökning i den överviktiga gruppen. Även om viktökning korrelerades med kaloriintag av diet med hög fetthalt (Figur 1F), det var inte korrelerat med rörelsesnivåer i ett öppet fält eller med energi som spenderades under dieten med hög fetthalt (Figurer 1G och 1H). Intressant nog höll samma korrelationer när vi undersökte matintag under den första veckan av experimentet (Figurer 1I – 1K), vilket indikerar att initiala nivåer av högt fettintag (men inte rörelse eller energiförbrukning) var förutsägbara för senare viktökning.

Figur 1.

Kronisk diet med hög fetthalt ledde till fysisk inaktivitet

(A) Möss matade med en fetthaltig diet vägde mer än möss som matades med standardchow från och med vecka 2 och fortsätter till vecka 18 (F_(18,252) = 62.43, p <0.0001).

(B och C) (B) Exempel på banor med öppet fältaktivitet som visar att (C) feta möss har minskat fysisk aktivitet jämfört med magra möss som börjar vid vecka 4 och fortsätter till vecka 18 (F_(10,140) = 4.83, p <0.0001).

(D) Efter 18 veckor på fettrik kost hade överviktiga möss minskat tiden för att flytta (t₍₁₄₎ = 3.32, p = 0.005), minskad rörelsefrekvens (t₍₁₄₎ = 4.74, p = 0.0003) och minskad hastighet under rörelse (t₍₁₄₎ = 4.69, p = 0.0002) relativt mager kontroller. Överviktiga möss visade också en trend för minskad uppfödning (p = 0.07).

(E) När man fick tillgång till ett körhjul i hemmaburen hade feta möss färre hjulvarv i förhållande till magra möss (t₍₁₄₎ = 4.55, p = 0.0005).

(F – H) Total viktökning bildade en signifikant korrelation med (F) energiintag under experimentets gång (r = 0.74, p = 0.04), men inte (G) energiförbrukning (r = 0.52, p = 0.19) ej heller (H) öppen fälthastighet (r = 0.19, p = 0.65).

(I – K) Total viktökning bildade en signifikant korrelation med (I) genomsnittligt energiintag under den första veckan (r = 0.88, p = 0.004), men inte (J) energiförbrukning (r = -0.19, p = 0.66) inte heller (K) öppen fälthastighet (r = 0.36, p = 0.38).

Statistisk analys. (A och C) Tvåvägs upprepade mått ANOVA följt av post hoc t-test med Benjamini-Hochbergs falska upptäcktsfrekvens; (D och E) oparad Studentens t-test; (F – H) linjär regression; ^*p <0.05, ^**p <0.01, ^***p <0.0001 kontra magert. (I – K) linjär regression; ^***p <0.001 kontra magra möss.

Figuralternativ

Fetma förknippades med minskningar i Dopamine D2R-bindning

För att identifiera mekanismer som ligger bakom fysisk inaktivitet, kvantifierade vi flera aspekter av DA-signalering hos mager och överviktiga möss. I överensstämmelse med tidigare rapporter om gnagare, D2R-liknande receptorbindning (via autoradiografi med ³H-spiperon, hädanefter benämnd D2R-bindning) var lägre hos överviktiga möss i förhållande till magra möss (p <0.0001; Figurer 2A och 2B), ett resultat som var signifikant i alla tre striatala underavdelningarna (dorsomedial: p = 0.004; dorsolateral: p <0.0001; ventral: p <0.001; Siffror S2A och S2B). D2R-bindningen var emellertid inte korrelerad med kroppsfett i den magra eller överviktiga gruppen (p> 0.55 för båda; Figur 2C), vilket tyder på att även om D2R-bindning och fettlagring båda förändras av kronisk diet med hög fetthalt, kanske dessa variabler inte är kausalt relaterade till varandra.

Figur 2.

Diät med hög fetthalt nedsatt Striatal Dopamine D2R-bindning

(A) Bilder av striatal D2R-bindning mätt via ³H-spiperon autoradiografi.

(B) Striatal D2R-bindning minskades hos överviktiga relativt mager möss (t₍₂₅₎ = 5.02, p <0.0001).

(C) Striatal D2R-bindning var inte korrelerad med kroppsfettprocent hos magra (p = 0.95) eller överviktiga möss (p = 0.56).

(D – F) (D) Striatal D1R-bindning (t₍₂₄₎ = 1.31, p = 0.20), (E) total dopaminhalt (DA; t₍₁₃₎ = 0.85, p = 0.41) och (F) tyrosinhydroxylas (TH) densitet (t₍₁₄₎ = 0.48, p = 0.64) skilde sig inte mellan dietgrupper.

Statistisk analys. Medelvärde med enskilda möss; n = 8–19 möss / grupp; Studentens t-test (B och D-F) eller linjär regression (C); ^*p <0.01.

Figuralternativ

Vi försökte identifiera den mekanism som ligger bakom fetma-medierad reduktion av D2R-bindning. För att göra detta såg vi efter skillnader i Drd2 mRNA (via in situ-hybridisering) och fann det oförändrat i alla tre striatala underavdelningarna (dorsomedial: p = 0.92; dorsolateral: p = 0.90; ventral: p = 0.34; Figur S2C). Vi utförde western blots för att kvantifiera totala D2R-proteinnivåer och noterade ingen förändring i varken 50- eller 70-kDa-banden, trodde representera olika glykosyleringstillstånd för D2R (båda p> 0.95, Siffror S2D och S2E) (Johnson och Kenny, 2010). Slutligen utvärderade vi markörer för metabolisk dysfunktion hos mager och överviktiga möss för att se om de kan relatera till minskningen av D2R som tidigare rapporterats (Dunn et al., 2012). Överviktiga möss hade högre fastande kolesterol (p <0.0001), leptin (p <0.0001), glukos (p = 0.0002), insulin (p = 0.001) och resistensbaserad homeostatisk modellbedömning (HOMA-IR) (p <0.001) , men inte triglycerider eller fria fettsyror (Siffror S1D-S1J). Ingen av dessa faktorer korrelerade emellertid med D2R-bindning hos feta möss (data visas inte).

D1R-liknande bindning (via autoradiografi med ³H-SCH23390, hädanefter benämnd D1R-bindning) skilde sig inte mellan överviktiga och magra möss (p = 0.20; Figur 2D). Det fanns inga skillnader i striatal DA-halt, mätt via högpresterande vätskekromatografi (HPLC) av striatala vävnadsstansar (p = 0.41; Figur 2E), eller tyrosinhydroxylasimmunmärkning (p = 0.64; Figur 2F). Mot bakgrund av flera rapporter om skillnader i basal DA hos feta möss (Carlin et al., 2013, Davis et al., 2008, Vucetic et al., 2012 och Wang et al., 2014), undersökte vi vidare denna punkt med hjälp av flödesmikrodialys utan nät (nya möss, n = 6 per grupp). Vi observerade återigen inga skillnader i extracellulär DA (p = 0.99) eller någon av dess två metaboliter, 3,4-dihydroxifenylättiksyra (DOPAC) (p = 0.85) och homovanillinsyra (HVA) (p = 0.68, Figur S3), med denna metod, vilket indikerar att fetma inte var associerat med reduktioner i extracellulär DA-ton i dessa experiment.

Rörelserelaterade avfödda avbröts stördes hos överviktiga möss

Vi utförde in vivo elektrofysiologi för att undersöka hur reducerad striatal D2R-bindning kan förändra striatal neuronal produktion och därigenom bidra till minskad rörelse. Vi registrerade från dorsomedial striatum av magra och överviktiga möss (n = 3 möss per grupp, histologi i Figur 3F). Även om överviktiga möss rörde sig mindre totalt sett skilde sig inte hastigheten på de utförda rörelserna mellan dessa grupper (p = 0.55; Figur 3A), så att vi kan jämföra rörelserelaterad skjutning mellan magra och överviktiga möss. Basala spikningshastigheter med flera enheter skilde sig inte mellan de magra och överviktiga mössen (magra, 2.1 ± 0.4 Hz; överviktiga, 2.0 ± 0.7 Hz; p = 0.93). Förekomsten av rörelseaktiverade enheter (Figur 3B) var markant lägre hos överviktiga möss (p <0.0001; Figur 3C). Detta berodde inte på vår statistiska definition av "rörelseaktiverade" enheter, eftersom vi också observerade minskad spikning kring rörelser i det genomsnittliga svaret för alla registrerade enheter hos överviktiga mot magra möss (interaktion med ANOVA, p <0.0002; Figurer 3D och 3E). Vi drar slutsatsen att den totala spikfrekvensen i striatum inte skilde sig åt, men organisationen av spikar kring rörelse stördes hos feta möss.

Figur 3.

Rörelserelaterad skjutning i Striatum stördes hos feta möss

(A) Rörelsehändelser hade samma hastighet hos mager och överviktiga möss.

(B) Exempel på rörelseaktiverad och icke-responsiv avfyrning i striatal neuroner.

(D) Genomsnittlig rörelserelaterad avfyrning av alla inspelade neuroner.

(E) Rörelserelaterad avfyrning var signifikant lägre efter exponering för diet (diet × rörelseinteraktion, F_(1,171) = 14.77, p <0.0002).

(F) Schematisk (anpassad från Franklin och Paxinos, 1997) som illustrerar placeringen av elektroduppsättningen i magra och överviktiga inspelningsmöss (n = 3 vardera).

Statistisk analys. (C) Fishers exakta test. (D och E) Tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA.

Figuralternativ

Hämning av iMSN-utgången återställda aktivitetsnivåer hos feta möss

För att testa om att minska produktionen från iMSN: er kunde öka rörelsen hos feta möss, använde vi en Cre-rekombinas (Cre) beroende strategi för att uttrycka en hämmande G_i-kopplad modifierad kappa opioidreceptor designerreceptor uteslutande aktiverad av designerläkemedel (KOR-DREADD) i iMSN: er av feta möss (Figur 4EN). Även om adenosin 2A-receptorn Cre (A2A-Cre) musen tidigare har validerats med immunfärgning för att demonstrera att Cre-uttryck är specifikt för striatal iMSNs (Cui et al., 2013 och Lemos et al., 2016) utförde vi en ytterligare validering av denna linje med dubbel fluorescerande in situ hybridisering. Nästan alla nervceller (98.7% ± 0.6% av 1,301 räknade neuroner) uttryckte båda Cre och Drd2 mRNA, medan mycket få (1.3% ± 0.6%) uttryckte heller Cre or Drd2 mRNA, men inte båda, bekräftar att A2A-Cre-linjen troget riktar sig mot iMSN: er ( Figur S4).

Figur 4.

DREADD-medierad hämning av iMSN: s återställd fysisk aktivitet hos feta möss

(A) Fotografi av KOR-DREADD-uttryck och schematisk (anpassad från Franklin och Paxinos, 1997) illustrerar virala injektionsställen för alla KOR-DREADD i A2A-Cre-möss; opacitet indikerar antalet möss som uttrycker virus på en given plats.

(B) Feta möss rörde sig mer när de injicerades med SalB jämfört med DMSO (t₍₇₎ = 3.056, p = 0.02).

(C – G) Efter administration av SalB visade feta möss icke signifikanta förändringar i (C) rörelsefrekvens, (D) genomsnittlig rörelsetid och (E) rörelseshastighet i förhållande till vid administrering av DMSO. (F) Sal-B-administration ökade uppfödningsfrekvensen (t₍₇₎ = 3.116, p = 0.02), men (G) förändrade inte frekvensen av grooming.

(H) Mager möss rörde sig mer när de injicerades med SalB jämfört med DMSO (t₍₉₎ = 3.3, p = 0.01).

(I) SalB påverkade inte rörelsen hos vildtypsmöss som inte uttryckte KOR-DREADD (p = 0.77).

Statistisk analys. (B – I) Paired Student's t tests; medelvärde med enskilda möss; n = 6-10 möss / grupp.

Figuralternativ

Injektioner av KOR-DREADD-agonisten salvinorin-B (SalB) ökade sträckan med överviktiga möss som uttryckte KOR-DREADD (p = 0.02; Figur 4B). SalB ökade också uppfödningsfrekvensen (p = 0.02; Figur 4F) och orsakade en trend mot en frekvensökning (t₍₇₎ = 1.64, p = 0.12), men inte varaktighet eller hastighet, för rörelse (Figurer 4C – 4E). Injektioner av SalB ökade också rörelsen hos magra möss (p = 0.01; Figur 4H), men inte i vildtypsmöss som inte uttryckte KOR-DREADD (p = 0.73; Figur 4JAG). Vi drar slutsatsen att det är tillräckligt med att minska produktionen av iMSN: er för att öka rörlighetsnivån för både magra och feta djur.

Låga D2R-nivåer utsätter inte djur för framtida viktökning

Slutligen undersökte vi om befintliga skillnader i D2R-signalering kan predisponera enskilda möss för dietinducerad fetma. För att ta itu med denna fråga utförde vi mikro-positronemissionstomografi (mikro-PET) med ¹⁸F-fallypride för att bestämma baslinjen D2R tillgänglighet före exponering för hög fetthalt (Figur 5EN). Vi noterade en hög variansnivå i D2R-bindande potential hos möss, som andra har visat (Constantinescu et al., 2011). Individuella skillnader i D2R-tillgänglighet korrelerades positivt med rörelse i det öppna fältet (p = 0.045; Figur 5B), överensstämmer med D2R: s roll i rörelse. Efter mikro-PET-skanning hölls djuren på en fettrik diet i 18 veckor för att testa om möss med låga D2R skulle vara mer utsatta för dietinducerad viktökning. Överraskande hittade vi en trend mot a positiv förhållandet mellan initial D2R-tillgänglighet och viktökning över detta experiment (p = 0.10; Figur 5C). Även om denna korrelation inte var signifikant, argumenterar den mot hypotesen att låg tillgänglighet av D2R eller låg fysisk inaktivitet gör djur mer sårbara för viktökning. Detta var också i överensstämmelse med våra fynd att varken basal öppen fältaktivitet eller öppen fältaktivitet i hela experimentet korrelerade med viktökning (Figurer 1F-1K).

Figur 5.

Basal D2R-bindning förutsåg inte framtida viktökning

(A) Exempel D2R mikro-PET-tillgänglighetskurvor i striatum och cerebellum med användning av ¹⁸F-fallypride.

(B och C) (B) Bindningspotential korrelerad med basal öppen fältrörelse (r = 0.56, p = 0.045), och (C) trenderade mot ett positivt förhållande med högfettdietinducerad viktökning (r = 0.50, p = 0.10, n = 12-14 möss).

(D) Representativ D2R autoradiografi i möss med intakta D2R (överst) och iMSN-Drd2-KO möss (botten).

(E och F) (E) iMSN-Drd2-KO-möss hade minskat fysisk aktivitet i ett öppet fält (t₍₈₎ = 2.99, p = 0.02) och (F) på hemhjulets löpande hjul (p = 0.01, n = 5–19 möss / grupp).

(G) iMSN-Drd2-KO möss och Drd2-floxerade kullkamratkontroller fick liknande mängder vikt på fettsnål diet_(5,70) = 1.417, p = 0.23; n = 6-10 möss / grupp).

(H – J) (H) Det fanns ingen signifikant skillnad i normaliserat energiintag (p = 0.60), (I) energiförbrukning (p = 0.47) eller (J) RER (p = 0.17) mellan iMSN-D2R-KO möss och kullkamrater.

Statistisk analys. (B och C) Linjär regression; (E, F och H – J) oparad studentens t-test; (G) tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA, ^*p <0.05.

Figuralternativ

För att ytterligare undersöka förhållandet mellan befintliga skillnader i aktivitetsnivåer och viktökning utnyttjade vi en genetisk musmodell med riktad radering av Drd2 gen från iMSNs (iMSN-Drd2-KO) men bevarat uttryck i andra celltyper ( Dobbs et al., 2016 och Lemos et al., 2016). Som tidigare rapporterats, iMSN-Drd2-KO-möss rörde sig mindre än kullkamratkontroller i ett öppet fält (p = 0.02; Figur 5E) och på hemmabur löpande hjul (p = 0.01; Figur 5F). I överensstämmelse med ovanstående experiment, iMSN-Drd2-KO-möss fick inte mer vikt än sina kullkamratkontroller när de placerades på en fettrik diet (p = 0.23; Figur 5G). För att undersöka deras energianvändning närmare utförde vi indirekta kalorimetri-experiment för att jämföra iMSN-Drd2-KO-möss till kullkontroll. Vi upptäckte inte signifikanta skillnader i energiintag (p = 0.60), energiförbrukning (p = 0.47) eller andningsväxlingsförhållande (RER) (förhållande CO₂ produktion till O₂ konsumtion [VCO₂/ VO₂], p = 0.17) mellan iMSN-Drd2-KO-möss och deras kontrollkamrat, vilket indikerar att minskningen i rörelse hos IMSN-Drd2-KO-möss inte översattes till förändringar i energianvändningenFigurer 5H-5J). Slutligen undersökte vi i vilken utsträckning mindre minskningar av striatal D2R (som de som observerats i våra feta möss) kunde reglera rörelse och viktökning. För att göra detta använde vi en muslinje som resulterar i en 30% –40% minskning i striatal Drd2 mRNA (iMSN-Drd2-Het) ( Lemos et al., 2016). Dessa möss uppvisade också reducerad rörelse, vilket visade att en partiell knockdown av D2R är tillräcklig för att producera motoriska underskott (p = 0.04; Figur S5A). I likhet med iMSN-Drd2-KO-möss var iMSN-Drd2-het-mössen inte mer mottagliga för högfettdietinducerad viktökning (p = 0.89; Figur S5B). Vi drar slutsatsen att förändringar i striatal D2R är tillräckliga för att förändra rörelse, men inte kaloribalans eller kroppsvikt hos möss.

Diskussion

Fetma är förknippat med fysisk inaktivitet, som ofta tros bidra till viktökning. Dessutom antas ökad fettlighet för att bidra till låga aktivitetsnivåer hos personer med övervikt (Ekkekakis och Lind, 2006 och Westerterp, 1999), även om denna idé är svår att testa direkt. Intressant nog är människor som går ner i vikt antingen genom diet (de Boer et al., 1986, de Groot et al., 1989, Martin et al., 2007 och Redman et al., 2009) eller bariatrisk kirurgi (Berglind et al., 2015, Berglind et al., 2016, Bond et al., 2010 och Ramirez-Marrero et al., 2014) öka inte deras aktivitetsnivåer, argumenterar mot vikten av fett som orsakar deras inaktivitet. Här undersökte vi hypotesen att dietinducerad fetma orsakar fysisk inaktivitet via underskott i striatal DA-överföring. I överensstämmelse med tidigare arbete fann vi att kronisk fettrik diet minskade striatal D2R-bindning (Hajnal et al., 2008, Huang et al., 2006, Narayanaswami et al., 2013, van de Giessen et al., 2012 och van de Giessen et al., 2013). Vi observerade också ett underskott i motorrelaterad avfyring av striatala neuroner hos feta möss. Hämmar iMSN: er med en G_i-kopplade DREADD räddade aktivitet hos feta möss, vilket visar att möss med överflödigt fett kan röra sig normalt när basal ganglia-produktion återställs. Överraskande överensstämde emellertid varken basala D2R-mätningar eller fysisk aktivitet med viktökning, en punkt som vi observerade i flera experiment. Detta i motsats till en studie på råttor, som kan återspegla arter eller experimentella skillnader (Michaelides et al., 2012). Vi drar slutsatsen att minskningar av D2Rs och efterföljande fysisk inaktivitet är konsekvenser av fetma, men inte nödvändigtvis är kopplade till ytterligare viktökning hos möss.

En koppling mellan förändrad D2R-signalering och fetma identifierades först hos människor och replikerades initialt av andra (de Weijer et al., 2011, Kessler et al., 2014, Volkow et al., 2008 och Wang et al., 2001). Men nyare arbete har ifrågasatt detta konstaterande (Caravaggio et al., 2015, Cosgrove et al., 2015, Dunn et al., 2012, Guo et al., 2014, Karlsson et al., 2015, Karlsson et al., 2016, Steele et al., 2010 och Tuominen et al., 2015). Även om ytterligare forskning behövs för att förstå de avvikelser som observerats bland kliniska studier, kan de återspegla komplexiteten i kliniska studier och PET-avbildning. Exempelvis kan racloprid, radioliganden som används i många studier, förskjutas av endogen DA, och därför kan bindning påverkas av skillnader i basal DA-ton (Horstmann et al., 2015). Dessutom kan förhållandet mellan D2R-nivåer och fetma vara icke-linjära, så att förändringar i D2R kan uppstå annorlunda hos patienter med olika nivåer av fetma (Horstmann et al., 2015). Slutligen faktorer som sömnvaraktighet (Wiers et al., 2016) och koffeinintag (Volkow et al., 2015) kan också påverka D2R-bindning och rapporteras inte eller kontrolleras i de flesta kliniska studier. Dessa variationskällor kan mildras i djurstudier, som målar en konsekvent bild av reduktioner i D2R mRNA (Mathes et al., 2010 och Zhang et al., 2015), protein (Adams et al., 2015 och Johnson och Kenny, 2010) och receptorbindning (Hajnal et al., 2008, Huang et al., 2006, Narayanaswami et al., 2013, van de Giessen et al., 2012 och van de Giessen et al., 2013) i feta gnagare. Vårt arbete utvidgar denna grupp av litteratur genom att rapportera att andra aspekter av DA-signalering förblir oförändrade hos feta möss, även de med minskningar av D2R. Dessutom, med tanke på vår observerade reduktion i D2R-bindning av ³H-spiperon, men ingen förändring i totalt D2R-protein eller Drd2 mRNA, vi tror att förändringar av D2R kan involvera post-translationella förändringar, såsom receptorinternalisering. Även om våra data antyder att reducerad D2R-bindning är tillräcklig för att minska fysisk aktivitet i fetma, påverkas fysisk aktivitet av många faktorer inklusive genetik och miljö ( Bauman et al., 2012). Vi tror att det är osannolikt att D2R: erna är den enda neurologiska förändringen förknippad med fysisk inaktivitet vid fetma. Exempelvis verkar förändringar i cirkulerande hormoner som ghrelin, leptin och insulin på dopaminerga neuroner och kan påverka aktiviteten (Murray et al., 2014). Slutligen, även om vi inte observerade förändringar i D1R: er, kan vi inte utesluta förändringar i neuronal avfyrning av direktvägsneuroner som också kan påverka fysisk aktivitet.

Det är oklart om variationer i D2R-tillgänglighet förutsätter individer att gå upp i vikt. Människor med Drd2 Taq1A-allelen har minskat tillgängligheten till D2R och en ökad risk för fetma ( Blum et al., 1996, Carpenter et al., 2013, Noble et al., 1991, Stice et al., 2008 och Thompson et al., 1997). Dessutom fick möss med en global radering av D2R lättare vikt på en fettrik diet, som tillskrivs fysisk inaktivitet (Beeler et al., 2015). Däremot korrelerade individuell variation (naturlig eller genetiskt inducerad) i striatal D2R med aktivitetsnivåer i vår studie, men varken korrelerade med viktökning. En viktig skillnad i vår studie var att vår genetiska modell tog bort D2R endast från iMSN. Dessutom visade noggranna mätningar av matintag och energiförbrukning att manipulering av D2R på dessa neuroner inte förändrade energibalansen. Som sådan kan studier som visar kopplingar mellan global D2R-funktion och energibalans observera effekterna av D2R på andra celltyper. Våra experiment stöder slutsatsen att fysisk inaktivitet är en följd av fetma men i sig inte är tillräcklig för att orsaka viktförändringar.

Trots de växande bevisen på att fysisk aktivitet är förknippad med förbättringar i hjärt-kärlshälsa och minskad risk för flera andra kroniska sjukdomar, förblir fysisk aktivitet låg hos personer med fetma (Ekkekakis et al., 2016). Avsaknaden av effektiva interventioner för att öka fysiska aktivitetsnivåer återspeglas i bristen på förståelse för de cellulära och molekylära mekanismerna som ligger till grund för fysisk inaktivitet hos individer med övervikt. Här kopplar vi fysisk inaktivitet till förändringar i basal ganglia-funktion, vilket ger en biologisk förklaring till avsaknaden av fysisk aktivitet hos individer med fetma.

Experimentella procedurer

Ämnen och dieter

I alla studier hölls möss individuellt under standardförhållanden (12-timmars ljus / mörk cykel, 21-22 ° C), med ad libitum tillgång till mat och vatten. Möss tillhandahölls antingen standard chow-diet (5001 gnagare-diet; 3.00 kcal / g med 29% energi härrörande från protein, 13% från fett och 56% från kolhydrat; LabDiet) eller fettrik diet (D12492; 5.24 kcal / g med 20% energi härrörande från protein, 60% från fett och 20% från kolhydrat; forskningsdieter). Alla procedurer utfördes i enlighet med riktlinjerna från Animal Care and Use Committee från National Institute on Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

Transgen villkorlig knockout iMSN-Drd2-KO-möss genererades genom att korsa möss som uttryckte Cre drivna av reglerande element i adenosin 2A-receptorn (Adora2a) (B6.FVB (Cg) -Tg (Adora2a-Cre) KG139Gsat / Mmucd; GENSAT; 036158-UCD) med möss som bär villkorligt Drd2 null alleler B6.129S4 (FVB) -Drd2^{tm1.1Mrub / J}, JAX020631 (Bello et al., 2011).

Beräkningar av kroppssammansättning och energikostnader

Kroppssammansättning mättes varannan vecka med användning av ¹H-NMR-spektroskopi (EchoMRI-100H; Echo Medical Systems). Energiutgifterna bestämdes med hjälp av en energibalansberäkning (Guo et al., 2009 och Ravussin et al., 2013):

Energyexpenditure = Metabolizableenergyintake- (Δfatmass + Δfat-freemass).

Slå på MathJax

Öppen fältaktivitet

Öppetesttest genomfördes i PhenoTyper-burar (30 × 30 cm; Noldus IT) och EthoVision-videoanalysprogramvara (version 11; Noldus IT) användes för att spåra möss under hela testningen.

Hjulkörning

Hjulkörning mättes genom att placera trådlösa löparhjul med låg profil (Med Associates) i mössens hemburar i 72 timmar var tredje vecka (dietinducerad fetmaexperiment) eller kontinuerligt (iMSN-Drd2-KO-experiment).

Blodmått

Okulärt blod från avlivade djur användes för analys av serummetaboliter och hormoner efter 4-timmar snabbt.

Dopaminreceptor Autoradiografi

Höger hemisektioner kryosonerades vid nivån av striata (-0.22, 0.14, 0.62 och 1.18 mm från bregma, täckande hela striatums utsträckning) i 12 mm sektioner. Objektarna tinades och förinkuberades i analysbuffert (20 mM HEPES, 154 mM NaCl och 0.1% bovint serumalbumin [BSA]; pH 7.4) under 20 minuter vid 37 ° C. D1R-bindning bedömdes genom att inkubera objektglas i analysbuffert innehållande 1.5 nM tritiummärkt SCH-23390 (Perkin-Elmer) och 100 nM ketanserin under 60 minuter vid 37 ° C. D2R-bindning bedömdes genom inkubering av objektglas med 600 pM tritiummärkt spiperon (Perkin-Elmer) och 100 nM ketanserin under 100 minuter vid 37 ° C. Efter inkubering med lämplig radioligand tvättades objektglasen två gånger under 10 minuter vid 4 ° C i tvättbuffert (10 mM Tris-HCl, 154 mM NaCl) och doppades sedan i vatten (0 ° C) och fick torka över natten. Objektglas exponerades sedan för fosforavbildningsplattor under 7 (D1R-bindning) eller 11 dagar (D2R-bindning) och utvecklades med användning av en fosfoimager (cyklon; Perkin-Elmer). För analys beskrevs intresseområden och analyserades med Optiquant-bildanalysprogramvara (Perkin-Elmer).

Western Blotting

Western blots inkuberades med mus-anti-D2DR-antikropp (1: 500; Santa Cruz; sc-5303) eller mus-anti-GAPDH-antikropp (1: 1,000; Santa Cruz; sc-32233) och därefter med get-anti-mus-IgG- HRP (1: 1,000; Santa Cruz; sc-2005). Kemiluminescenssignal genererades med förbättrad kemiluminescens Western blotting-detekteringsreagens (Bio-Rad) och visualiserades med Chemidoc Imaging System (Bio-Rad).

In situ hybridisering

Ett RNAscope multiplex fluorescerande analyspaket användes för in situ hybridisering (Advanced Cell Diagnostics). Kortfattat dehydratiserades formalinfixerade sektioner i etanol följt av exponering av proteas. Sektioner hybridiserades sedan med RNAscope-oligonukleotidsonder mot Drd2. Efter sondhybridisering inkuberades objektglas med signalförstärkare enligt RNAscope-protokoll. Objektglas tvättades sedan med RNAscope-tvättbuffert. Slutligen monterades slides med DAPI-räckvidd.

Högpresterande vätskekromatografi med elektrokemisk detektion

Vänster hemisektioner behandlades för detektion av DA med användning av omvänd fas högeffektiv vätskekromatografi med elektrokemisk detektion (HPLC-EC), såsom tidigare beskrivits (Kilpatrick et al., 1986).

Tyrosinhydroxylasimmunohistokemi

Glidmonterade sektioner fixerades i 10% neutralt buffrat formalin, sköljdes i 0.1 M TBS (pH 7.5) och inkuberades i en primär antikroppslösning innehållande 3% normalt åsnarserum, 0.3% Triton X-100 och kanin-anti-tyrosinhydroxylas-antikropp (1: 1,000; Millipore; MAB152) över natten vid 23 ° C. Följande dag sköljdes vävnadssektioner i TBS och inkuberades i en sekundär antikroppslösning innehållande 3% normalt åsnaserum, 0.3% Triton X-100 och get-anti-kanin konjugerad till Alexa Fluor 555 (Millipore; AQ132F). För varje mus analyserades två striatala sektioner, förutom fyra möss (två HFD, två Chow) där endast en sektion analyserades på grund av dålig vävnad eller bildkvalitet.

Micro-PET

Möss injicerades med ¹⁸F-fallypride med en specifik aktivitet på 2.5 ± 0.34 mCi / nmol i en volym av 130 μL via svansvenen under isofluranbedövning. Mikro-PET-skanningen utfördes under 2 timmar, under vilken 25 ramar förvärvades för analys. Tidsaktivitetskurvorna för ¹⁸F-fallypride i regionerna av intresse (ROI) extraherades med användning av AFNI-programvara (https://afni.nimh.nih.gov/afnioch kinetiska parametrar passade till en fyra-facksmodell med användning av ett anpassat MATLAB-skript (med hjärnan som referensvävnad) för att bestämma D2R-bindningspotentialen (Lammertsma och Hume, 1996).

In Vivo elektrofysiologi

Inspelningar gjordes från en elektroduppsättning innehållande 32 teflonbelagda volframmikrokablar (35 mm diameter) implanterade ensidigt i det dorsomediala striatum (främre / bakre [A / P]: +0.8; medial / lateral [M / L]: +1.5 ; dorsal / ventral [D / V]: -2.6 mm per bregma), och bearbetas med kommersiell programvara (Offline Sorter och Neuroexplorer; Plexon).

Stereotaxisk viral vektorinjektion

Möss bedövades kortvarigt via isofluranexponering. En gång djupt bedövad gjordes ett enda snitt längs mittlinjen, skallen exponerades och en bilateral kraniotomi gjordes (A / P: +0.5; M / L: ± 1.5 mm per bregma). Viralvektor innehållande den hämmande KOR-DREADD (Syn-DIO-hKORD-IRES-mCit-WPRE; 0.5 μL) injicerades bilateralt i dorsomedial striatum (D / V, -2.8 mm från toppen av skallen) och fick uttrycka för 9 veckor före experimentet.

No-Net Flux Microdialysis och Dopamine Analys

Mätningar av basal extracellulär DA, DOPAC och HVA i dorsalt striatum hos möss utfördes genom mikrodialysmetod utan nätflöde. Ensidiga 2-mm-sonder (18-kDa-membranavbrott) implanterades stereotaxiskt 1 vecka efter kanylimplantation med kontinuerlig perfusion av artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) vid 1 μL / min under 4 timmar före provinsamling (se Kompletterande experimentella förfaranden). Inget nätflödeexperiment för att mäta extracellulära DA-nivåer utfördes genom att slumpmässigt perfusera sex olika koncentrationer av DA (0, 2.5, 5, 10, 20 och 40 nM) i aCSF genom dialysproben. Varje DA-koncentration perfunderades i 30 minuter och sedan samlades 2 x 10-min prover i 2.5 μL 100 mM HCl plus 1 mM EDTA för att förhindra katekolaminnedbrytning och frystes vid -80 ° C. För neurokemiska analyser användes isokratiskt HPLC-system kopplat till amperometrisk detektion (HPLC-EC; BASi LC-4C). Endast möss med korrekt sondplacering inkluderades i analysen (Figur S3E).

Statistik

Statistisk analys utfördes med hjälp av GraphPad Prism (version 6.07; GraphPad Software). Om inte annat anges användes tvåsidiga studentens t-tester. I annat fall användes tvåsidiga parade t-test, envägs upprepade mått ANOVAs eller tvåvägs upprepade mått ANOVA användes vid behov och som sagt. ANOVA följdes av t-tester för post-hoc-jämförelser. Resultaten ansågs signifikanta vid en alfa på p <0.05, eller med alfa bestämd av Bejamini-Hochberg-korrigering av falsk upptäckt (FDR), där så är lämpligt.

Författarbidrag

DMF, KD, TJO, MS, AK, IPSGRVAA, MR, KDH och AVK, designade experimenten. DMF, KD, TJO, MS och AVK, utförde och analyserade beteendexperiment. IP utförde western blotting-experiment. DMF och AVK utförde och analyserade in vivo elektrofysiologiska data. DMF, J.-SL, JG och AVK utförde och analyserade mikro-PET-experiment. DMF, KD, TJO och AVK skrev manuskriptet. Alla författare diskuterade resultat och kommenterade manuskriptet.

Erkännanden

Detta arbete stöds av det intramurala forskningsprogrammet för NIH, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidneys Disneys (NIDDK). Vi vill tacka Mouse Metabolism Core vid NIDDK för bedömningen av serummetaboliter och hormoner, Andres Buonanno med hans hjälp med att utforma dopamin-mikrodialysexperiment, och Dr. Judith Walters, Dr. Kristin Dupre och Dr. Claire Delaville för hjälp med HPLC dopaminvävnadsanalys. Vi vill också tacka Dr Scott Young för användningen av hans laboratorieutrustning och hjälp med bindande studier. Tack också medlemmarna i AVK-laboratoriet, Marc Reitman och Nick Ryba för inlägg om experimentell design och noggrann läsning av manuskriptet.

Kompletterande information

Dokument S1. Kompletterande experimentella förfaranden och figurer S1 – S5.

Hjälp med PDF-filer

Tillbehör

Dokument S2. Artikel plus kompletterande information.

Hjälp med PDF-filer

Tillbehör

Referensprojekt

Adams et al., 2015
WK Adams, JL Sussman, S. Kaur, AM D'souza, TJ Kieffer, CA Winstanley
Långtids kaloribegränsat intag av en fettsnål diet hos råttor minskar impulskontroll och ventral striatal D2-receptorsignalering - två markörer för missbrukssårbarhet
Eur. J. Neurosci., 42 (2015), sid. 3095-3104
CrossRef

Snabblänkar