Dopamin D2-receptorer i beroende-liknande belöningsdysfunktion och tvångsmätning i fetma råttor (2010)

Kommentar: Denna studie visar att när ett djur får obegränsad tillgång kan en stark naturlig förstärkare (mycket stimulerande mat) orsaka en nedgång i D2-receptorer. Denna nedgång sågs hos nästan alla råttor och inträffade ganska snabbt. När "mycket välsmakande" mat togs bort vägrade råttorna att äta normal chow. Råttorna fortsatte att bugna (när de kunde) trots att para ihop elektriska stötar med den "mycket välsmakande" matförbrukningen.

• Fullständig studie

Nat Neurosci. 2010 maj; 13(5): 635-641. Publicerad online 2010 March 28. doi:  10.1038 / nn.2519

Abstrakt

Vi fann att utvecklingen av fetma var kombinerad med uppkomsten av ett successivt försämrat underskott i neurala belöningssvar. Liknande förändringar i belöningshostostas som induceras av kokain eller heroin anses vara avgörande för att utlösa övergången från tillfälligt till tvångsmässigt narkotikamissbruk. Följaktligen upptäckte vi tvångsmässigt utfodringsbeteende hos feta men inte magra råttor, mätt som smaklig matkonsumtion som var motståndskraftig mot störningar genom en aversiv betingad stimulans. Striatal dopamin D2-receptorer (D2Rs) nedreglerades hos feta råttor, vilket har rapporterats hos människor beroende av droger. Dessutom påskyndade lentivirusmedierad knockdown av striatal D2R snabbt utvecklingen av beroende-liknande belöningsunderskott och början av tvångsmässig mat som söker hos råttor med utökad tillgång till smakrik fetthaltig mat. Dessa data visar att överförbrukning av smakliga livsmedel utlöser beroende-liknande neuroadaptiva svar i hjärnans belöningskretsar och driver utvecklingen av tvångsmässigt ätande. Vanliga hedoniska mekanismer kan därför ligga till grund för fetma och drogberoende.

Beskrivning

Matningen påverkas av nöje och belöning, och att få matbelöning kan kraftfullt motivera konsumtion1, 2. Ändå förblir de hedoniska mekanismerna som bidrar till fetma dåligt. Hos hyperfagiska människor med medfödd leptinbrist ökar aktiviteten i rygg- och ventralt striatum, som är kärnkomponenter i hjärnbelöningskretsar markant som svar på bilder av mat3, och leptinersättningsterapi försvagar både striatal aktivitet och självrapporterad 'smak' av mat3 . Detta tyder på att striatum är viktigt i hedoniska aspekter av utfodringsbeteende. Det visades nyligen att aktivering av striatum som svar på mycket välsmakande mat är trubbig hos överviktiga individer jämfört med magra kontroller4. Dessutom är hypofunktion av dorsal striatum och långvarig viktökning mest uttalad hos individer med TaqIA-allelen av DRD2 – ANKK1-genläget, vilket resulterar i minskat striatal D2R-uttryck och har visats predisponera individer för substansberoende störningar4, 5 Dessa och liknande observationer har lett till förslaget att underskott i belöningsprocessen kan vara en viktig riskfaktor för utvecklingen av fetma och att överviktiga individer tvångsmässigt kan konsumera välsmakande mat för att kompensera för överkänslighet för belöning6. I synnerhet är det oklart om underskott i belöningsprocessen är konstituerande och föregår fetma, eller om överdriven konsumtion av smaklig mat kan leda till belöningsfunktion och därmed bidra till dietinducerad fetma.

Ett avgörande kännetecken för överviktiga och feta individer är att de fortsätter att äta för mycket trots de välkända negativa hälso- och sociala konsekvenserna. Faktum är att många överviktiga individer uttrycker en önskan att begränsa sin livsmedelskonsumtion, men kämpar ändå för att kontrollera sitt intag och konsumerar upprepade gånger utöver sina energikrav7, 8. Utveckling av matningsbeteende som är okänsligt för negativt resultat är analogt med det tvångsmässiga läkemedelsuppträdandet som ses hos mänskliga narkotikamissbrukare, vilket är likvärdigt ogenomträngligt för negativa konsekvenser. Här undersökte vi effekterna av utökad tillgång till en smakrik diet med hög fetthalt på känsligheten hos hjärnbelöningssystem hos råttor. Vi undersökte också sambandet mellan dietinducerad hedonisk dysregulation och uppkomsten av tvångsmatlig matsökning. Slutligen undersökte vi rollen för striatal D9R i dessa beroende-liknande beteendespons.

Beroendeformiga belöningsunderskott hos feta råttor

För att testa effekterna av begränsad eller utökad tillgång till en välsmakande diet med hög fetthalt förberedde vi Wistar-hanråttor (300-350 g) med en bipolär stimulerande elektrod i lateral hypotalamus och tränade dem i 10–14 d i en diskret prövning nuvarande tröskelvärde för hjärnstimuleringsbelöning (BSR) tills stabila belöningströsklar fastställdes4. I BSR-förfarandet svarar råttor kraftigt för att få givande elektrisk självstimulering genom den bostadsstimulerande elektroden, med den minimala stimuleringsintensiteten som upprätthåller självstimuleringsbeteendet kallas belöningströskeln10. Eftersom belöningströsklar förblir stabila och oförändrade under långa tider under basförhållanden, ger denna procedur ett känsligt mått på hur bra hjärnbelöningssystem är. Efter fastställande av stabila BSR-trösklar (definierade som <10% variation i trösklar över tre på varandra följande sessioner), tilldelade vi råttor till tre grupper som inte visade några skillnader i medelkroppsvikt eller belöningströsklar mellan grupper. De tre grupperna fick differentierad tillgång till en "cafeteria-stil" diet bestående av smakliga energitäta livsmedel som var tillgängliga för konsumtion (se Online Methods). Råttor hade 0 h (endast chow-råttor; n = 9), 1 h (råttor med begränsad åtkomst; n = 11) eller 18-23 h (råttor med utökad access; n = 11) tillgång till kosten per dag under 40 dagar i rad. Kafeteridieter är kända för att resultera i dietinducerad fetma hos råttor. Alla råttor hade också ad libitum tillgång till standard laboratorium chow, med belöning trösklar, viktökning och kaloriintag registreras hela tiden.

Vikten ökade markant hos råttor med utökad tillgång till cafeteridieten jämfört med chow-endast eller grupper med begränsad åtkomst (Fig. 1a). Vikt tenderade också att öka i de råttor med begränsad åtkomst jämfört med råttor med endast chow, men denna effekt nådde inte statistisk betydelse. Utvecklingen av fetma hos råttor med utökad åtkomst var nära förknippad med ett försämrat underskott i hjärnbelöningsfunktionen, vilket återspeglas i gradvis förhöjda BSR-trösklar (Fig. 1b). Eftersom inga skillnader i svarslatenser för BSR observerades bland de tre grupperna (kompletterande fig. 1), kan underskott i beteendeprestanda inte redogöra för denna observation. Liknande underskott i hjärnbelöningsfunktionen har rapporterats hos råttor med utökad men inte begränsad tillgång till intravenös kokain eller heroin-självadministrering12, 13, 14. Således kan utökad tillgång till smakrik fetthaltig mat leda till missbrukliknande underskott i hjärnans belöningsfunktion, som anses vara en viktig källa till motivation som kan driva överätande och bidra till utvecklingen av fetma1, 6.

Bild 1: Viktökning och belöningsdysfunktion hos råttor med utökad tillgång till en cafeteridiet.

(a) Genomsnittlig (± sem) viktökning hos råttor med endast chow, begränsad åtkomst och utökad åtkomst (access × day-interaktion: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 jämfört med enbart chow-grupp, post hoc-test). (b) Genomsnittlig (± sem) procentuell förändring från basbelöningströsklar (åtkomst × tidsinteraktion: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 jämfört med enbart chow-grupp, post-hoc-test).

När vi undersökte utfodringsbeteendet i detalj (Fig. 2), fann vi att det totala dagliga kaloriintaget var lika mellan råttor med endast chow och begränsad åtkomst (Fig. 2a, d). Däremot var det totala kaloriintaget hos råttor med utsträckt tillträde nästan dubbelt så mycket som för råttor med begränsad åtkomst och endast chow (Fig. 2a, d). Även om råttorna med begränsad åtkomst och endast chow bibehöll ungefär samma dagliga kaloriintag (fig. 2a, d), erhöll råttor med begränsad åtkomst endast ~ 33% av sina dagliga kalorier från chow (fig. 2b, d), vilket indikerar att de utvecklade binge-liknande utfodringsbeteende och konsumerade ~ 66% av sitt dagliga kaloriintag under deras 1 h åtkomstsession till cafeteria diet15 (Fig. 2d). Råttor med utökad åtkomst erhöll endast en liten fraktion (~ 5%) av deras totala kaloriintag från chow (fig. 2b); de konsumerade cafeteridieten nästan uteslutande (Fig. 2d). Förändringen i dietpreferens i grupperna med begränsad och utökad åtkomst återspeglades också i en markant ökning av fettintaget jämfört med råttor som bara var chow (fig. 2c och kompletterande fig. 2). I överensstämmelse med tidigare rapporter16 fanns det en tendens att konsumtionen av cafeteria-dieten skulle minska över tiden hos råttorna med utökad åtkomst. Detta kan återspegla utvecklingen av tolerans för smakligheten hos matvarorna som tillhandahålls som en del av cafeteridieten över tid. Icke desto mindre förblev preferensen för cafeteria-diet jämfört med standard chow konsekvent hög hos dessa råttor (Kompletterande Fig. 3). Dessa data visar att utökad men inte begränsad tillgång till en smakrik fetthaltig diet inducerar beroende-liknande belöningsunderskott, överätande och förlust av homeostatisk energibalans. Däremot ger begränsad tillgång till smaklig mat upphov till binge-liknande konsumtionsmönster, men stör inte den homeostatiska energibalansen eller hjärnans belöningsfunktion. Det är emellertid möjligt att begränsad tillgång till cafeteridieten under mer än 40 på varandra följande dagar skulle orsaka betydande viktökning och störning av hjärnans belöningsfunktion.

Bild 2: Konsumtionsmönster hos råttor med utökad tillgång till en cafeteridiet.

(a) Genomsnittligt (± sem) dagligt kaloriintag hos råttor med endast chow, begränsad åtkomst och utökad åtkomst (åtkomst: F1,324 = 100.6, P <0.0001; tid: F18,324 = 7.8, P <0.0001; åtkomst × tidsinteraktion: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 jämfört med enbart chow-grupp, post-hoc-test). (b) Genomsnittligt dagligt kaloriintag (± sem) från chow (åtkomst: F2,504 = 349.1, P <0.0001; tid: F18,504 = 5.9, P <0.0001; åtkomst × tidsinteraktion: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 jämfört med enbart chow-grupp, post-hoc-test). (c) Genomsnittligt dagligt kaloriintag (± sem) från fett (tillgång: F2,486 = 118.7, P <0.0001; tid: F18,486 = 8.8, P <0.0001; åtkomst × tidsinteraktion: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 jämfört med enbart chow-grupp, post-hoc-test). (d) Jämförelse av genomsnittligt (± sem) totalt kaloriintag och kalorier som konsumeras uteslutande från chow under hela 40-dagars åtkomstperioden (åtkomst: F2,54 = 25.0, P <0.0001; kalorikälla: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; åtkomst × kalorikällainteraktion: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 jämfört med totala kalorier i enbart chow-grupp, ### P <0.001 jämfört med totala kalorier i samma grupp av råttor, post hoc-test).

Efter 40 d fick råttor inte längre åtkomst till den välsmakande kosten utan fortsatte att ha ad libitum-tillgång till standardlaboratoriet. Vi bedömde belöningströsklar och chowkonsumtion dagligen under denna tvingade 'avhållsamhetsperiod'. Höjningarna i belöningströsklar kvarstod i minst 2 veckor hos råttorna med utökad åtkomst när de inte längre hade tillgång till den välsmakande dieten (fig. 3a). Detta står i kontrast till de relativt övergående (~ 48 timmarna) underskotten i belöningsfunktionen som rapporterats hos råttor som avstår från självadministrerad kokain13. Det fanns också en markant minskning av kaloriintaget (Fig. 3b) och en gradvis minskning av kroppsvikt (Fig. 3c) hos råttor med förlängd åtkomst och i mindre utsträckning hos råttor med begränsad åtkomst under denna avhållsamhetsperiod, i överensstämmelse med tidigare rapporter11, 15. Efter 14 d avhållsamhet dödades råttor och elektrodplaceringar bestämdes genom kresylviolettfärgning (Fig. 3d).

Bild 3: Ihållande belöningsdysfunktion och hypofagi under avhållsamhet hos råttor med utökad tillgång till en cafeteridiet.

(a) Genomsnittlig procentuell förändring från belöningströsklar vid baslinjen (± sem) under avhållsamhet från en smaklig diet med hög fetthalt (tillgång: F2,112 = 3.7, P <0.05; tid: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 jämfört med enbart chow-grupp, post-hoc-test). (b) Genomsnittligt kaloriintag (± sem) den sista dagen för åtkomst till fettrik diet (baslinje) och under 14 d avhållsamhet när endast standard chow var tillgänglig (tillgång: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; tid: F6,168 = 65.6, P <0.0001; åtkomst × tidsinteraktion: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 jämfört med enbart chow-grupp, post hoc-test). (c) Förändring i genomsnittlig kroppsvikt (± sem) jämfört med kroppsvikt den sista dagen för tillgång till den fettrika dieten (baslinjen) och under 14 dagars avhållsamhet när endast standard chow var tillgängligt (åtkomst: F1,126 = 37.2, P <0.0001; tid: F7,126 = 3.1, P <0.01; åtkomst × tidsinteraktion: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 jämfört med enbart chow-grupp, post hoc-test). (d) Histologisk rekonstruktion av placeringen av BSR-stimulerande elektroder i den laterala hypotalamusen hos endast chow (trianglar), begränsad åtkomst (kvadrater) och utökad åtkomst (cirklar) råttor.

Striatal D2R hos feta råttor: roll i belöningsunderskott

Vi testade därefter hypotesen att överkonsumtion av en välsmakande cafeteriadiet kan minska striatal D2R-densitet, vilket bidrar till utvecklingen av beroende-liknande belöningskänslighet. En ny kohort av råttor med endast chow, begränsad åtkomst och utökad åtkomst tilläts till kafeteria-dieten tills det fanns en statistiskt signifikant ökning av kroppsvikten hos råttorna med utökad åtkomst jämfört med gruppen med endast chow (P <0.05 ; Fig. 4a). Striatalt uttryck av den enligt uppgift kraftigt glykosylerade (~ 70 kDa) membranbundna formen av D2R var lägre i råttorna med utökad åtkomst än i råttor med begränsad åtkomst eller endast chow (Fig. 4b; se Online-metoder). När vi delade råttorna i varje åtkomstgrupp i två undergrupper på basis av en median delning av kroppsvikt (lätt eller tung), fann vi ett tydligt omvänt förhållande mellan kroppsvikt och striatal D2R-uttryck (fig. 4a, c). Vi upptäckte inga statistiskt signifikanta minskningar i uttryck av de oglykosylerade omogna (~ 39 kDa) och mellanliggande glykosylerade cytoplasmatiska (~ 51 kDa) former av D2R (kompletterande figur 4) 17, vilket indikerar att striatalt D2R-uttryck i råttor med utökad åtkomst troligen är regleras genom post-transkriptionsmekanismer.

Figur 4: Viktökning är omvänt relaterad till striatal D2R-nivåer.

(a) Råttor med endast chow, begränsad åtkomst och utökad åtkomst delades in i två grupper per tillträdesförhållande baserat på en median delning av kroppsvikt: lätt (L) eller tung (H). (b) Hela striatalkomplexet uppsamlades från alla råttor och D2R-nivåer i varje grupp mätt med western blotting. Det membranassocierade D2R-bandet upplöstes vid 70 kDa, och proteinbelastningskontrollen visas nedan (β-aktin, 43 kDa). Fullängdsimmunblottar visas i kompletterande figur 12. (c) Relativa mängder av D2R i striatum av endast råttor med begränsad åtkomst och utökad åtkomst kvantifierades genom densitometri (F2,6 = 5.2, P <0.05, huvud effekt av åtkomst; * P <0.05 och ** P <0.01 jämfört med endast chow-L-gruppen).

För att testa den funktionella relevansen av dietinducerade reduktioner i striatal D2R till hjärnbelöningsfunktion, designade och validerade vi en lentiviral vektor för att leverera en kort hårnålstörande RNA (shRNA) för att slå ner D2R (Lenti-D2Rsh; Fig. 5 och kompletterande bild 5). Belöningströsklarna började öka hos råttor behandlade med Lenti-D2Rsh nästan omedelbart efter tillåtet utökad åtkomst till cafeteria-dieten, medan belöningströsklarna förblev oförändrade i råttor med utökad åtkomst behandlade med en tom lentivirusvektor (Lenti-kontroll) under den relativt korta perioden av åtkomst till cafeteridieten (14 d; Fig. 6a). Svarsfördröjningar var oförändrade i båda grupperna av råttor, vilket visade att denna effekt inte var sekundär till underskott i arbetsuppgift (Kompletterande Fig. 6). Belöningströsklarna var också oförändrade hos råttor behandlade med Lenti-D2Rsh eller Lenti-kontroll som hade tillgång till chow endast under samma period (Fig. 6b).

Trösklarna förblev ständigt förhöjda under en extra 15 d avhållsamhet när alla råttor hade tillgång endast till standard chow (Kompletterande Fig. 7). Nedslagning av striatal D2R ökade därför sårbarheten för dietinducerad belöningshypofunktion men ändrade inte baslinjeaktiviteten för hjärnbelöningssystem.

Figur 5: Lentivirusmedierad knockdown av striatal D2R-uttryck.

(a) Grafisk representation av de striatala områden där Lenti-D2Rsh överuttrycktes. Gröna cirklar på den vänstra striatala halvklotet representerar de platser där virusinfusioner riktades. Grön färgning i höger striatal halvklot är en representativ immunokemi färgning för grönt fluorescerande protein (GFP) från hjärnan hos en Lenti-D2Rsh råtta. (b) Representativ immunoblot av det minskade D2R-uttrycket i striatum av Lenti-D2Rsh-råttor. Fullängdsimmunblottar visas i kompletterande figur 13. (c) Relativa mängder av D2R i striatum av Lenti-kontroll- och Lenti-D2Rsh-råttor, kvantifierade med densitometri (* P <0.05 jämfört med Lenti-kontrollgruppen, post hoc-test ). (d) Infektion av gliaceller i striatum med Lenti-D2Rsh-vektorn detekterades inte. Grön färgning är GFP från virus; rött är astrocytmarkör glial fibrillärt surt protein (GFAP); cellkärnor markeras med DAPI-färgning i blått. Vita pilar indikerar ett lokaliserat område med glios som endast finns på platsen för virusinjektion i striatum och inte i de omgivande vävnaderna i vilka viruset har diffunderat. Även inom detta område är ingen av astrocyterna GFP-positiva. De gula pilarna i den förstorade bilden markerar de typiska GFP-negativa astrocyterna som upptäcktes. (e) Höga nivåer av neuronal infektion i striatum av Lenti-D2Rsh-vektorn. Grön färgning är GFP från virus; rött är den neuronala kärnmarkören NeuN; cellkärnor markeras med DAPI-färgning i blått. De gula pilarna i den förstorade bilden markerar GFP-positiva och NeuN-positiva nervceller i striatum. (f) En högre förstoringsbild av ett virusinfekterat (GFP-positivt) neuron i striatum av Lenti-D2Rsh-råttor som visar de typiska morfologiska egenskaperna hos medelstaka nervceller.

Figur 6: Knockdown av striatal D2R ökar sårbarheten för att belöna dysfunktion hos råttor med utökad tillgång till en cafeteridiet.

(a) Genomsnittlig (± sem) procentuell förändring från belöningströsklar vid baslinjen i Lenti-kontroll- och Lenti-D2Rsh-råttor som hade utökad tillgång till cafeteridieten i 14 på varandra följande dagar (virus: F1,156 = 5.9, P <0.05; tid: F13,156 = 2.2, P <0.05; virus × tidsinteraktion: F13,156 = 2.2, P <0.05; # P <0.05, interaktionseffekt). (b) Genomsnittlig (± sem) procentuell förändring från basbelöningströsklar i Lenti-kontroll- och Lenti-D2Rsh-råttor som hade endast chow-åtkomst. (c) Medelvärde (± sem) kaloriintag av råttor under 14 d endast chow eller utökad åtkomst (åtkomst: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (d) Genomsnittlig (± sem) viktökning under 14 d endast chow eller utökad åtkomst (åtkomst: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, huvudeffekt av åtkomst).

Vi fann att kaloriintaget (Fig. 6c) och viktökning (Fig. 6d) var liknande i Lenti-D2Rsh och motsvarande Lenti-kontrollgrupper under chow-endast eller förlängda åtkomstvillkor (Kompletterande Fig. 8 och 9). Således förändrade striatal D2R knockdown varken preferensen för cafeteria diet eller totalt kaloriintag när den smakliga maten var fritt tillgänglig för konsumtion.

Tvångsmat ätande hos feta råttor: roll för striatal D2R

Vi testade därefter hypotesen att tvångsmässigt ätande kan dyka upp hos råttor med utökad tillgång till cafeteridieten och att underskott i striatal D2R-signalering kan bidra till denna effekt. En ny kohort av råttor med enbart chow, begränsad åtkomst och utökad åtkomst fick tillgång till cafeteridieten i> 40 d tills statistiskt signifikanta viktökningar inträffade hos de utökade råttorna (P <0.05 jämfört med endast chow-råttor; data ej visad). Alla tre grupper av råttor tilläts sedan endast 30 minuters tillgång per dag till cafeteridieten i 5-7 d i en operantkammare tills stabilt intag uppnåddes (definierat som <10% variation i det dagliga intaget). Halva råttorna i varje åtkomsttillstånd exponerades sedan för ett ljus (konditionerad stimulans) parat med leverans av fotchocker (bestraffad grupp), medan de återstående råttorna i varje grupp exponerades för signalljuset i frånvaro av fotchock (ostraffad grupp ). På testdagen undersökte vi effekterna av enbart exponering för cue-ljus på välsmakande matkonsumtion (fig. 7; se onlinemetoder). Vi fann att det genomsnittliga kaloriintaget under 30 minuters baslinjesessioner var högre hos råttor med endast chow och begränsad åtkomst än hos råttor med utökad åtkomst (fig. 7a, b). Detta tyder på att råttorna med endast chow och begränsad åtkomst bingade på den välsmakande maten under de intermitterande 30-minutersåtkomstsessionerna, vilket återspeglades i det faktum att dessa råttor konsumerade ~ 40-50% av deras dagliga kaloriintag, vanligtvis ~ 100 kCal, under dessa sessioner (fig. 7a, b). Däremot verkar råttor med utökad åtkomst motståndskraftiga mot att utveckla detta binge-liknande utfodringsbeteende, kanske för att deras historia med nästan obegränsad tillgång till den välsmakande maten under> 40 dagar i följd etablerade ätmönster som var relativt oflexibla att förändras. På testdagen observerade vi inga statistiskt signifikanta effekter av cue-ljusuppspelning på matkonsumtion hos de ostraffade råttorna från grupperna med endast chow, begränsad åtkomst eller utökad åtkomst jämfört med intag under baslinjen (Fig. 7a). Kölampan ensam hade därför ingen motivationsförmåga. Hos straffade råttor minskade det chockparade signalljuset signifikant välsmakande matintag hos råttorna med endast chow och begränsad åtkomst. Cue-ljuset hade emellertid ingen effekt på välsmakande matintag hos råttorna med utökad åtkomst, vilket visade att deras konsumtion var okänslig för aversiva miljömässiga signaler som förutspådde motgång. Basintag av energiintag i råttorna med utökad åtkomst var lägre än i de andra grupperna. Men eftersom chowintaget under liknande tidsperioder var mycket lägre (fig. 7d) är det osannolikt att detta representerar en "golveffekt" som förvirrar våra resultat. Tillsammans stöder våra data tanken att tvångsmässigt ätbeteende kan framträda hos råttor med utökad åtkomst på ett sätt som är analogt med det tvångsmässiga kokainintaget hos råttor med en historia av utökad tillgång till läkemedlet18.

Bild 7: Tvångsliknande svar på smaklig mat.

(a) Genomsnittlig (± sem) smaklig dietkonsumtion hos ostraffade råttor under 30-minuters baslinjesessionerna och på testdagen när råttor exponerades för en neutral konditionerad stimulans som inte tidigare var parat med skadlig fotchock (åtkomst: F2,20 = 5.2, P <0.05; # P <0.05 jämfört med endast chow-råttor). (b) Genomsnittlig (± sem) välsmakande dietkonsumtion hos straffade råttor under 30 minuters baslinjesessioner och på testdagen när råttor exponerades för en konditionerad stimulans som tidigare var parat med skadlig fotchock (tillgång: F2,21 = 3.9 , P <0.05; kö: F1,21 = 8.6, P <0.01; åtkomst × köinteraktion: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 jämfört med intaget under baslinjesessionen, # P <0.05 jämfört med bara råttor). (c) Genomsnittlig (± sem) smaklig dietkonsumtion under 30 minuters baslinjesessioner och på testdagen i Lenti-kontroll- och Lenti-D2Rsh-råttor som tidigare hade enbart chow eller utökad tillgång till en cafeteriediet (cue: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 jämfört med intaget under baslinjesessionerna, post-hoc-test). (d) Genomsnittlig (± sem) chow-konsumtion under 2-minuters baslinjesessioner och på testdagen i Lenti-control och Lenti-D1,26Rsh-råttor som tidigare hade enbart chow eller utökad tillgång till en cafeteriadiet (kö: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX jämfört med intaget under baslinjesessionerna, post-hoc-test).

Slutligen undersökte vi effekterna av den straffparade konditionerade stimulansen på matintag i Lenti-kontroll- och Lenti-D2Rsh-råttor som tidigare hade tillgång till enbart chow eller utökad tillgång till cafeteriedieten (råttor från fig. 6). Vi fann att det smakliga matintaget vid baslinjen under 30-minuters baslinjesessionerna var lika högt (~ 40 kCal) i alla fyra grupperna (Fig. 7c). Dessutom var den totala dagliga chow-konsumtionen (i hemmaburen) lika mellan alla fyra grupper av råttor under konditioneringssessionerna och på testdagen (kompletterande figur 10). 14 d av tidigare åtkomst till cafeteridieten var därför inte tillräcklig för att blockera binge-liknande ätbeteende på ett sätt som liknar det som ses hos råttor som hade> 40 d utökad tillgång till cafeteriedieten (fig 7a, b). Den aversiva cue-ljusstimulansen störde smakligt intag av mat i Lenti-kontroll- och Lenti-D2Rsh-råttor som tidigare hade endast chow-åtkomst (fig. 7c). På liknande sätt störde den aversiva konditionerade stimulansen smaklig matintag hos Lenti-kontrollråttorna som tidigare hade 14 d utökad tillgång till cafeteridieten. Däremot hade den aversiva konditionerade stimulansen ingen inverkan på den välsmakande matkonsumtionen i Lenti-D2Rsh-råttorna som tidigare hade 14 d utökad tillgång till cafeteriedieten (fig. 7c). BSR-trösklar förblev signifikant förhöjda i dessa råttor när de registrerades 48 timmar efter testsessionen, medan trösklarna förblev stabila och oförändrade i de andra tre råttgrupperna

(Kompletterande bild 11). För att verifiera att resistens mot konditionerad stimulusinducerad undertryckning av smakligt livsmedelsintag i Lenti-D2Rsh råttor med utökad åtkomst inte var sekundär till försämringar i klassiska konditioneringsprocesser testade vi effekterna av den aversiva konditionerade stimulansen på konsumtion av mindre smakliga standardchow i alla fyra grupper av råttor. I motsats till den binge-liknande konsumtionen av smakrik mat, fann vi att alla fyra grupper av råttor konsumerade lite chow (~ 2 kCal) under 30 min baslinjesessioner (Fig. 7d) och att chowintaget avbröts i alla fyra grupperna av en liknande storlek vid exponering för den aversiva betingade stimulansen (Fig. 7d). Dessa data visar att nedslagning av striatal D2R markant påskyndade uppkomsten av tvångsmässigt ätande av smakrik mat, men endast hos råttor med en historia av utökad tillgång. Eftersom tvångsmatande ätning detekterades endast i Lenti-D2Rsh-råttor som hade förhöjda BSR-tröskelvärden, kan dietinducerad belöningshypofunktion vara ett nödvändigt föregång för uppkomsten av tvångsmat som söker efter mat.

Diskussion

Enkel åtkomst till smakrik fetthaltig mat anses vara en viktig miljöriskfaktor för fetma19. Vi fann att utökad tillgång till en mycket smaklig kost i cafeteria-stil resulterade i överätning och viktökning i kombination med gradvis höjning av BSR-trösklar hos råttor. Denna effekt på BSR-trösklar kan förklaras genom att gradvis minska lyhördheten för hjärnbelöningskretsar, en tolkning som överensstämmer med det faktum att matbegränsning och viktminskning kan öka20, medan akut övermatning kan övergående minska21, svarar på BSR hos råttor. Denna upptäckt representerar en förlängning av arbetet som visar att akut övermatning av råttor genom ett intragastriskt matningsrör 21 och gastrisk distention eller intravenös glukagoninfusion som härmar postprandial mättnad 22, 23, 24, minskar svarande för att belöna lateral hypotalamisk BSR och ökar aversionsliknande svar på stimulation25. Tidigare arbete har också visat att upprepade gånger tvingar matning av råttor genom intragastriska rör tills deras vikt har ökat med ~ 200 g på liknande sätt minskar hastigheterna för att svara på BSR, en effekt som kvarstår tills kroppsvikt har normaliserats23. Liksom i dessa fynd hos råttor, inhiberades svaret hos katter för lateral hypotalamisk BSR av tidigare utfodring till mättnad26, vilket visade att interaktioner mellan hjärnbelöningsfunktion och metabola tillstånd bevaras och därför sannolikt kommer att inträffa också hos människor. Enkel åtkomst och därmed överätande dieter i cafeterian stil hos människor anses vara en viktig miljöbidragare till den nuvarande fetmaepidemin i västerländska samhällen19. Våra data visar att belöningshypofunktion uppstår hos råttor som volontärt äter en ätbar cafeteridiet som liknar den som konsumeras av människor och att denna effekt gradvis blir sämre när de får större vikt. Noterbart hade alla råttor med belöningströskelhöjningar ≥20% BSR-elektroder belägna inom ~ 500 mikrometer från fornix dorsolateralt. Känsligheten för belöningsrelaterade neuroner i detta område ökas genom matbegränsning på ett sätt som är känsligt för det fett-härledda hormonet leptin, och detta hjärnregion anses vara ett viktigt underlag för matbelöning27. Hjärnkretsarna som reglerar mathedonik hämmas därför genom postestiva signaler som förutsäger mättnad, i överensstämmelse med nyligen genomförda studier av mänsklig avbildning som visar att gastrisk distention28 och tarm-härledd postprandial faktorpeptid YY3-36 (PYY) 29 modulerar aktiviteten i regionerna i hjärnan involverad i belöningsbearbetning. Dessutom hämmas belöningssystem också av överdriven viktökning. Nya rapporter visar att cirkulerande leptin, en nyckelregulator för energibalans, kan tränga in i hjärnvävnader och hämma aktiviteten hos belöningskretsar 3, 27, 30, 31.

Belöningsunderskott hos överviktiga råttor kan återspegla kontradaptiva minskningar i baskänsligheten hos hjärnbelöningskretsar för att motsätta sig deras överstimulering med smaklig mat. Sådan dietinducerad belöningshypofunktion kan bidra till utvecklingen av fetma genom att öka motiveringen att konsumera "obesogena" dieter med hög belöning för att undvika eller lindra detta tillstånd av negativ belöning6, 32. Detta kan redogöra för hypofagin vi observerade vid utökad åtkomst råttor och i mindre grad hos råttor med begränsad åtkomst när den välsmakande maten togs bort och endast den mindre välsmakande chowen var tillgänglig. Ett sådant scenario överensstämmer också med data från mänskliga hjärnbildningsstudier där trubbig aktivering av striatum som svar på mycket välsmakande mat, särskilt hos individer med genetiska polymorfismer som tros minska striatalt D2R-uttryck, är associerat med långvarig viktökning4. Det har varit oklart om sådan belöningskänslighet hos överviktiga individer manifesteras före utvecklingen av fetma och enbart relaterad till genetiska faktorer ('belöningsbristsyndrom') eller om överätning kan orsaka störningar i belöningsprocessen. Våra data visar att utökad tillgång till välsmakande mat med hög energi och efterföljande överätande stumpar belönar känslighet och kan därför representera en viktig hedonisk mekanism som främjar utvecklingen av fetma. Liknande belöningsdysfunktion som den som rapporterats här hos överviktiga råttor detekteras också hos råttor med en historia av utökad tillgång till intravenös kokain eller heroin självadministrering, men inte hos dem med en historia med begränsad åtkomst12, 13, 14. Dessutom är övergången från tillfällig till tvångssökande har föreslagits för att bero på ett försök att lindra det ihållande tillståndet av minskad belöning som orsakas av denna läkemedelsinducerade belöningsdysfunktion12, 32, 33. Våra data tyder således på att fetma och drogberoende kan dela underliggande hedoniska mekanismer.

Nedregleringen av striatal D2R-uttryck är ett anmärkningsvärt neuroadaptivt svar på överförbrukning av smakrik mat. Faktum är att minskningar av striatal D2R-densitet ses hos överviktiga individer4, 34 och gnagare35, 36. Omvänt har individer med anorexia nervosa förhöjd striatal D2R37, och viktminskning hos överviktiga individer efter bariatrisk (gastrisk bypass) operation är associerad med förhöjd striatal D2R densitet28. Genpolymorfismen som kallas TaqIA A1-allelen resulterar i minskad striatal D2R-densitet, och individer som har denna allel är överrepresenterade i feta populationer4. TaqIA-allelen ökar också sårbarheten för alkohol-, opioid- och psykomotorisk stimulansberoende38. Minskningar av striatal D2R-täthet som uppstår antingen genom konstitutiva genetiska faktorer eller som en följd av överätande kan därför bidra till de neurobiologiska mekanismerna för fetma. Vi fann att striatalnivåer av 70 kDa D2R-isoformen, tänkt att återspegla den membranassocierade D2R, var omvänt relaterade till kroppsvikt hos råttor från chow-endast, begränsad åtkomst och utvidgad åtkomstgrupp (fig. 4). Knockdown av striatal D2R-uttryck, mest framträdande i det dorsolaterala striatum (fig. 5), fick BSR-trösklarna att öka nästan omedelbart efter exponering för cafeteriet. Minskningar i striatal D2R-uttryck påskyndade därför snabbt uppkomsten av belöningshypofunktion hos råttor med utökad tillgång till mycket smakrik mat, ett resultat som överensstämmer med mänskliga hjärnavbildningsdata som indikerar att underskott i striatal D2R-täthet bidrar till att belöna hypofunktion hos feta individer4.

Tre funktioner hos Lenti-D2Rsh-råttorna är också anmärkningsvärda. Först, även om striatal D2R-knockdown kombinerat med utökad tillgång till den smakliga dieten resulterade i höjning av BSR-trösklar, fanns det inga skillnader i kaloriintag eller viktökning hos dessa råttor jämfört med kontrollråttor. Detta kan återspegla det faktum att råttor endast hade 14 d åtkomst till cafeteridieten; längre tillträdesperioder kan ha resulterat i högre viktökning över tid, liknande den högre känsligheten för viktökning som ses hos människor med underskott i striatal D2R-signalering4. Fördelen med att begränsa tillgången till cafeteridieten till endast 14 d är emellertid att knockdown-råttorna med utökad åtkomst var den enda gruppen som visade förhöjda BSR-trösklar, och detta tillät oss att bedöma den potentiella rollen som belöningshypofunktion i utvecklingen av tvångsmässiga äta (se nedan). För det andra förblev BSR-trösklarna stabila och oförändrade i knockdown-råttorna som endast hade tillgång till chow. Detta indikerar att reducerat striatal D2R-uttryck ensamt inte var tillräckligt för att inducera belöningshyposensitivitet; istället verkade det interagera med överförbrukning av smakrik mat för att påskynda uppkomsten av detta tillstånd med reducerad belöningskänslighet. Andra adaptiva svar i belöningskretsar i hjärnan kan därför utlösa belöningshyposensitivitet hos råttor med utökad tillgång till cafeteridieten. Med detta i åtanke noterar vi att D2R-agonisten bromokriptin minskar cirkulerande nivåer av leptin39, och leptin hämmar matningen åtminstone delvis genom att hämma de striatala regionerna som kontrollerar hedoniska responser på mat3, 30, 31. Således är det möjligt att nedreglering av striatal D2R som svar på ökande kroppsvikt ökar leptinsignaleringen och därmed ökar de hämmande effekterna av detta adipokin på hjärnbelöningssystem. Slutligen noterar vi att vi riktade våra lentivirusvektorer mot det dorsolaterala striatum. Detta var främst av tekniska skäl, eftersom lateral placering av kanyler för virusleverans i striatum gjorde det möjligt för oss också att rymma den inbyggda hypotalamiska stimulerande elektroden för BSR-tröskelbestämning. Således är det möjligt att inriktning av D2Rs för knockdown i andra områden av striatum, särskilt de dorsomediala och ventrala områdena (nucleus accumbens core and shell), kan ha förhöjda BSR-trösklar även i frånvaro av den smakliga dieten.

Det dorsolaterala striatumet har varit starkt inblandat i inlärning av vanligt typ av stimulus-respons, vilket återspeglas i utvecklingen av fulländat beteende som är okänsligt för devalvering genom föregående matning till mättnad eller genom att para ihop med skadliga stimuli40. Genom att rikta huvudsakligen in på det dorsolaterala striatumet kan vi ha slagit ner populationer av D2R som reglerar råttans sårbarhet för utvecklingen av tvångsmässigt ätande. I linje med en roll för striatala D2R i tvångsmässigt beteende är TaqIA-allelen av det humana DRD2 – ANKK1-genlokuset - vilket resulterar i låg striatal D2R-densitet5, trubbig striatalaktivering som svar på välsmakande mat4 och höjer sårbarheten för fetma4 - också associerad med brister i att lära sig att undvika handlingar med negativa konsekvenser41. Förlust av hämmande kontroll över beteende som kan ha ett negativt resultat är ett karakteristiskt inslag i både fetma och drogberoende, där fullbordande beteenden kvarstår trots negativa sociala, hälsofrämjande eller ekonomiska konsekvenser. Kokaintagande beteende hos råttor med en historia av omfattande läkemedelsintag kan bli oflexibel och motståndskraftig mot störningar av en aversiv konditionerad stimulans som förutsäger ett negativt resultat (fotchock) 18. På liknande sätt kommer möss som tidigare haft tillgång till en smaklig diet med hög fetthalt att spendera mer tid i en aversiv miljö (starkt upplyst) för att få den smakliga maten än möss som inte hade någon erfarenhet av kosten42. Vi fann att välsmakande matkonsumtion hos råttor med utökad tillgång till cafeteridieten var på samma sätt okänslig för en aversiv konditionerad stimulans. I överensstämmelse med en roll för striatala D2R i denna effekt hittades tvångsmässigt ätande i striatala D2R-knockdown-råttor som tidigare hade 14 d utökad tillgång till cafeteriedieten men inte i kontrollgrupperna. Ur ett neurokretsperspektiv kan utökad tillgång till välsmakande mat utlösa plasticitet i kortikostriatala vägar, vilket gör djur mer sårbara för utveckling av tvångsmässigt beteende, med underskott i striatal D2R-signalering som förbättrar denna process. Faktum är att reducerad striatal D2R-densitet hos överviktiga individer är korrelerad med minskad metabolism i prefrontala och orbitofrontala kortikala områden43 som utövar hämmande kontroll över beteende44.

Anmärkningsvärt detekterades tvångsliknande konsumtion av smakrik mat endast i knockdown-råttorna som tidigare hade utökat tillgång till cafeteria-dieten, inte hos kontrollråttor som hade utökat tillgång till cafeteria-diet under samma tidsperiod, inte heller i knockdown-råttor som hade endast chow-åtkomst. Den huvudsakliga skillnaden mellan knockdown-råttorna med tidigare utökad åtkomst och till de andra grupperna var deras ihållande förhöjda BSR-trösklar. Detta kan återspegla vanliga neurobiologiska ursprung till belöningshypofunktion och uppkomsten av tvångsmässigt ätande, som är tillfälligt sammanfallna men oberoende fenomen. Alternativt kan dietinducerad belöningshypofunktion tjäna som ett underlag för negativ förstärkning som underlättar utvecklingen av tvångsliknande ätande14, 32, 33. Oavsett vilka underliggande mekanismer, våra resultat visar att beroende-liknande kompulsiv reagerar på smaklig mat kan uppstå hos feta råttor, och indikerar att underskott i striatal D2R signalering ökar sårbarheten för utvecklingen av detta beteende.

Sammanfattningsvis fann vi att överstimulering av belöningssystem i hjärnan genom överdriven konsumtion av smaklig, energität mat framkallar ett djupgående tillstånd av belöningens överkänslighet och utveckling av tvångsmässigt ätande. Dessa maladaptiva beteendesponser hos feta råttor beror troligen på dietinducerade underskott i striatal D2R-signalering. Överförbrukning av missbruk av droger minskar på liknande sätt striatal D2R-densitet, inducerar en djup tillstånd av belöningshypofunktion och utlöser uppkomsten av tvångsmässigt läkemedelsbeteende. Våra resultat stöder därför tidigare arbete4, 19, 42, 45, 46, 47 för att indikera att fetma och drogberoende kan uppstå från liknande neuroadaptiva svar i hjärnans belöningskretsar.

Metoder

Råttor.

Wistar-råttor av han han som väger 300 – 350 g i början av experimenten erhölls från Charles River. Vid ankomsten hölls råttor individuellt vid konstant temperatur på en 12-timmars ljus-mörk cykel (ljus tänd vid 2200 h). Råttor tilläts ad libitum tillgång till standardlaboratorium och vatten under experimentets längd. Alla procedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of Scripps Florida, och råttor behandlades i enlighet med de riktlinjer som anges av National Institute of Health om principerna för djuromsorg.

Kirurgiska ingrepp.

Råttor beredda med BSR-stimulerande elektroder bedövades först genom inandning av 1 – 3% isofluran i syre och placerades i en stereotaxisk ram (Kopf). Bipolära BSR-elektroder (11 mm långa) implanterades i den bakre laterala hypotalamus (anteroposterior, −0.5 mm från bregma; mediolaterala, ± 1.7 mm från mittlinjen; dorsoventral, 8.3 mm från dura; förspänningsstång justerades till 5 mm ovanför mellanlinjen ) 47. Råttor som erhöll virusinjektioner bereddes också med bilaterala ledkanyler (23 mätare, 14 mm långa) placerade ovanför striatum (anteroposterior, 2.8 mm från bregma; mediolaterala, ± 3.1 mm från mittlinjen; dorsoventral, 2.4 mm från dura) 48 och fylld med 14-mm-styletter. Fyra skalskruvar i rostfritt stål och tand akryl höll elektroden och kanylerna på plats. Det kirurgiska såret behandlades med aktuellt antibiotikum en gång var 12 h för 5 d efter operationen. Råttor fick 7 – 10 d återhämta sig efter operationen och utbildades sedan i BSR-tröskelproceduren.

BSR-förfarande.

Råttor tränades för att svara för BSR-stimulering enligt en diskret prövning av nuvarande tröskelprocedur liknande den som beskrivs på annat håll 10, 14. Kortfattat varierade BSR-strömnivåerna i växlande fallande och stigande serier i 5-μA-steg. I varje testsession presenterades fyra alternerande fallande / stigande serier. Tröskeln för varje serie definierades som mittpunkten mellan två på varandra följande strömintensiteter för vilka råttor svarade i minst tre av de fem försöken, och två på varandra följande strömintensiteter för vilka råttor inte svarade i tre eller fler av de fem försöken. Den totala tröskeln för sessionen definierades som medelvärdet för trösklarna för de fyra individuella serierna. Varje testsession var ungefär 30 min i varaktighet. Stabila BSR-trösklar definierades som ≤10% variation i trösklar under 5 på varandra följande dagar, vanligtvis fastställda efter 10 – 14 d träning. Svarslatensen för varje testsession definierades som den genomsnittliga svarstiden för alla försök under vilka ett positivt svar inträffade.

Viral förpackning och leverans.

Kort hårnåls-RNA levererades och uttrycktes konstitutivt med användning av pRNAT-U6.2 / Lenti-vektorsystemet (GenScript). Viruspartiklar bereddes enligt tillverkarens protokoll. Kortfattat transfekterades HEK 293FT-celler med vektor innehållande shRNA-insatsen (5'-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCGAG-3 ') eller den tomma vektorn plus ViraPower Packaging Mix (h). Supernatanten uppsamlades sedan och koncentrerades genom ultracentrifugering (72 24 g, Beckman Coulter SW 76,755 TI-rotor., 32 min, 90 ° C) och viraltiter bestämdes genom fluorescensaktiverad cellsortering enligt tillverkarens instruktioner. Virus delades upp och förvarades i ljusskyddade lådor vid -4 ° C fram till användning.

Råttor med stabila BSR-trösklar fick bilaterala virala injektioner på tre ställen i striatum för varje hjärnhalvkula (2 μl per injektion, 1 μl min − 1, 1 min mellan injektioner, totalt sex injektioner per råtta). Råttor tilläts åtminstone 2 – 3 d återhämtning från intrastriatala injektioner innan BSR-tröskelvärderingen återupptogs. Daglig BSR-tröskelvärdering fortsatte för 33 d efter virusinjektioner för att säkerställa maximal striatal D2R-knockdown uppnåddes innan man tillät råttor tillgång till cafeteriedieten. Det fanns inga skillnader i BSR-trösklar mellan Lenti-kontrollen och Lenti-D2Rsh-råttorna under dessa 33 d (data visas inte).

Immunoblotting.

Råttor dödades ungefär 1 timmar efter deras regelbundna tillträde till cafeteridieten och hjärnor avlägsnades snabbt. Hjärnavsnitt med ~ 1 – 2 mm tjocklek framställdes med användning av en koronal hjärnmatris (1-mm skivintervall; Plastics One) på ett isblock, och vävnadsstansar av ryggstratum (bregma: ~ 2.2 till X0.26 mm) togs. Striatal vävnadsstämplar samlades snabbt, fästes fryst och förvarades vid -80 ° C tills användning. Enskilda prover tinades på is och lika stora mängder striatal vävnad slogs samman på basis av en viktberoende medianuppdelning av åtkomstgrupper (7 – 10 råttor per pool). Vävnad återsuspenderades i 500 μl iskall RIPA-buffert (Thermo Scientific) innehållande natriumortovanadat, fosfatas-cocktail-hämmare 1 och 2 (Sigma-Aldrich), leupeptin och pepstatin före homogenisering. Vävnadslysat kokades under 10 min i provbuffert och laddades på 4% –20% eller 10% Tris-glycin SDS-geler (Invitrogen). Protein överfördes till nitrocellulosamembran, blockerades under 1 h vid ~ 23 – 25 ° C (5% icke-fett torrmjölk och 0.2% Tween-20 i PBS, pH 7.4) och inkuberades i primär antikropp över natt vid 4 ° C. Följande primära antikroppar utspäddes i blocklösning: D2R mus monoklonal (Santa Cruz, 1: 100) eller p-aktin mus monoklonal (Santa Cruz, 1: 200). Kemiluminescerande ECL-reagens tillsattes efter inkubering med pepparrotsperoxidas-konjugerade sekundära antikroppar (Amersham, 1: 2,000). Den mogna membranassocierade formen av D2DR (~ 70 kDa) 17, 49 normaliserades till en proteinbelastningskontroll (ß-aktin; 43 kDa) och kvantifierades med densitometri med användning av NIH Image J-programvara.

Immunokemisk analys.

Råttor bedövades och perfekterades transkardiellt med 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7.6). Hjärnor avlägsnades, efterfixerades över natt och lagrades i sackaros (30% -lösning i PBS, pH 7.4) under minst 72 timmar. Frysta vävnadssektioner (30 μm tjocklek) uppsamlades från en mikrotom och blockerades (3% BSA, 5% normalt getserum och 0.3% Triton X-100 i PBS) för 1 h vid ~ 23 – 25 ° C. Följande primära antikroppar sattes till blocklösningen och inkuberades över natten vid 4 ° C: kyckling polyklonal till GFP (Abcam, 1: 1,000); kanin monoklonalt till GFAP (Millipore, 1: 1,000); mus monoklonalt till NeuN (Millipore, 1: 1,000). Sektioner inkuberades med fluorescerande färgämne-konjugerade sekundära antikroppar vid ~ 23 – 25 ° C: anti-chicken – 488-nm färgämne (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), anti-rabbit – 594-nm färgämne (Invitrogen, 1: 1,000: ) och anti-mus – 594-nm färgämne (Invitrogen, 1: 1000). Sektioner monterades med Vectashield-monteringsmedium innehållande DAPI (Vector Labs) och täckglas. Bilder togs med ett Olympus BX61 fluorescensmikroskop (× 2-mål) eller ett Olympus-konfokalt mikroskop (× 10 och × 100-mål).

Matningsförfarande.

Råttor hölls individuellt på papperssängkläder (alfakuddar; Shepherd Special Papers) för att förhindra att matprodukter smutsades med lösa sängkläder. Kafeteridieten bestod av bacon, korv, ostkaka, pundkaka, frosting och choklad, som vägdes individuellt innan de blev tillgängliga för råttorna. Matvaror för cafeteriadiet levererades i små metallbehållare. Alla matvaror, inklusive standardlaboratorium, vägdes igen efter avslutad utfodringssession. Kaloriintaget från de olika makronäringsämnena beräknades med hjälp av näringsinformationen från tillverkaren.

Cue-inducerad undertryckning av matningsbeteende.

Matningsprocedurer ägde rum i ljuddämpade operatorkammare som var identiska i dimensioner som de som användes i BSR-experimenten. Råttor placerades i en operatörskammare och hade tillgång till cafeteriadieten eller chow i 30 minuter. Livsmedelsprodukterna levererades i små metallbehållare. Alla matvaror vägdes före och efter utfodring, som utfördes under råttornas normala utfodringsperiod. Chow-konsumtion bedömdes genom konsumtion av 45 mg chow-pellets som var identiska i sammansättning med chow som tillhandahölls i råttornas hemburar. Råttor tilläts sedan 30 minuters tillgång per dag till cafeteridieten tills stabilt intag uppnåddes (definierat som <10% variation i dagligt intag), vilket krävde 5-7 d. Efter stabilisering av det välsmakande matintaget under denna basperiod fördelades råttor i varje tillgångstillstånd till två grupper: straffade (de som fick fotchock) och ostraffade (fick inte fotchock). Råttor utsattes sedan för fyra konditioneringssessioner på varandra följande dagar i samma operativa kammare där de tidigare hade tillgång till den välsmakande maten. Under 30 minuters konditioneringssessioner aktiverades en signalljus (konditionerad stimulans) i 10 minuter, stängdes av i 10 minuter och tänds sedan igen i 10 minuter. Straffade råttor fick fotchock endast under presentationen av signalljuset (0.5 mA under 1.0 s; 10 stimuleringar med intervaller på ~ 1 minut). De ostraffade råttorna presenterades med signalljuset på samma sätt, men utan tillförsel av fotchock. På testdagen, dagen efter den sista konditioneringssessionen, fick råttor i de straffade grupperna intermittent fotchock (totalt fem stimuleringar) parat med aktivering av signalljuset i 5 minuter. De ostraffade råttorna exponerades åter för signalljuset i avsaknad av fotchock. Efter straffperioden på 5 minuter fick alla råttor tillgång till den välsmakande maten under en 30-minuters session med den konditionerade stimulansen aktiverad intermittent (10 min cue-lampa på, 10 min cue-ljus av, 10 min cue-ljus på).

Statistiska analyser.

Baslinjetrösklar definierades som det genomsnittliga tröskelvärdet för 5 d före tillgång till cafeteridieten för varje individ. Belöningströsklarna uttrycktes som den procentuella förändringen från baslinjetröskelvärdet. Data om procentandel av basbelöningströskelvärdena, viktökning, kaloriförbrukning och kaloriförbrukning från fett analyserades med tvåfaktors, upprepad mätningsanalys av varians, med åtkomst (endast chow, begränsad åtkomst eller utökad åtkomst), kalorikälla ( standard chow- eller cafeteria-diet), virus (Lenti-kontroll eller Lenti-D2Rsh) och cue (parat eller parat med bestraffning) som faktorer mellan ämnen och tiden som faktorn inom ämnen. När så är lämpligt analyserades huvudeffekter i variansanalyserna ytterligare med Bonferroni post hoc-test. Alla statistiska analyser utfördes med hjälp av programvaran GraphPad Prism.

Referensprojekt

Referensprojekt

Korrespondens till:

· Paul J Kenny ([e-postskyddad])