En ghrelinreceptor (GHS-R1A) -antagonist dämpar morfinens givande egenskaper och ökar opioidpeptidnivåerna i belöningsområden hos möss (2015)

Akut såväl som kronisk exponering av beroendeframkallande droger påverkar djupt det mesolimbiska dopaminsystemet, en viktig nyckelkrets i hjärnans belöningssystem (Nestler, 2005). Dessa effekter har föreslagits ligga bakom, åtminstone delvis, utvecklingen av drogberoende (Wise, 2004). Narkotikaberoende orsakar ett brett spektrum av skadliga effekter på såväl individen som samhället och nya farmakologiska insatser, som behandlar detta stora folkhälsoproblem, är motiverade (Koob och Le Moal, 2001). Genom att förtydliga de signalsystem som förmedlar beroendeframkallande läkemedels förmåga att aktivera det mesolimbiska dopaminsystemet, kan unika behandlingsstrategier för missbruksrubbningar identifieras.

Forskning har visat att vanliga neurobiologiska mekanismer reglerar intaget av och belöning inducerad av mat och beroendeframkallande droger (Morganstern et al., 2011), vilket föreslår att rollen för de livsmedelsreglerande tarm-hjärnpeptider som ghrelin inkluderar belöningsförmedling. Initialt visades det att ghrelin orsakar frisättning av tillväxthormon (Kojima et al., 1999) och inducerar fett hos råttor (Tschop et al., 2000). Hittills är det välkänt att ghrelin ökar matintaget, hungern samt stimulerar aptiten via hypotalamiska kretsar (för granskning se Egecioglu et al. (2011)). Förutom hypotalamus uttrycks ghrelinreceptorer (GHS-R1A) i belöningsrelaterade områden som amygdala, striatum, prefrontal cortex, ventral tegmental area (VTA) och hippocampus (för granskning se Engel och Jerlhag (2014)) vilket antyder att ghrelins fysiologiska roll sträcker sig bortom reglering av energihomoeostas. Den orexigena peptiden ghrelin visade sig faktiskt vara en aktivator av det mesolimbiska dopaminsystemet såväl som en regulator av belöning, motivation och intag av alkohol, nikotin, amfetamin och kokain hos möss (för granskning se Engel och Jerlhag (2014)).

Opioider, liksom andra beroendeframkallande droger, aktiverar det mesolimbiska dopaminsystemet vilket orsakar ackumbal dopaminfrisättning via aktivering av μ- och/eller δ-opioidreceptorer i nucleus accumbens (NAc) (Hirose et al., 2005, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999) och i VTA, förmodligen genom att minska GABA -inhibering av dopaminneuroner (Johnson och North, 1992). Dessutom reglerar ackumbala K-opioidreceptorer aktiviteten av mesolimbiska dopaminsystem (Chefer et al., 2005, Spanagel et al., 1992). Upprepad exponering för opioider producerar adaptiva förändringar av flera neurotransmittorer, inklusive opioidpeptider, i belöningsområden, vilket bidrar till utvecklingen av beroende (De Vries och Shippenberg, 2002). Hos råttor dämpar farmakologisk undertryckning av GHS-R1A morfininducerad ackumbal dopaminfrisättning såväl som stereotypa beteenden (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Syftet med den första delen av föreliggande experimentserie var att undersöka den akuta effekten av en GHS-R1A-antagonist, JMV2959, på morfins förmåga att orsaka rörelsestimulering, ackumbal dopaminfrisättning och betingad platspreferens hos möss. Syftet med den andra delen av denna studie var att utvärdera effekten av upprepad JMV2959- eller ghrelinbehandling på opioidpeptidnivåer (Met-enkephalin-Arg)⁶phe⁷ (MEAP), dynorfin B (DynB) och Leu-enkefalin-Arg⁶ (LeuArg)) i belöningsrelaterade områden inklusive amygdala, striatum, prefrontal cortex, VTA och hippocampus.

Vuxna post-pubertala åldersmatchade NMRI-hanmöss (8–12 veckor gamla och 25–40 g kroppsvikt; Charles River, Sulzfeld, Tyskland) användes. I korthet inhystes alla möss i grupp och hölls i en 12/12 timmars ljus/mörkercykel (ljus tänds klockan sju på morgonen). Kranvatten och mat (Normal chow; Harlan Teklad, Norfolk, England) tillhandahölls AD libitum, förutom under experimentuppsättningarna. Nya möss användes för varje enskilt beteendetest såväl som för opioidpeptidanalysen. Försöken godkändes av Djuretiska kommittén i Göteborg. Alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande och för att minska antalet använda djur. Alla djur fick acklimatisera sig minst en vecka innan experimentets början.

Morfinhydroklorid (Apoteksbolaget Sahlgrenska sjukhuset; Göteborg, Sverige) löstes i vehikel (0.9 % natriumkloridlösning) och administrerades ip i en dos av 20 mg/kg 10 minuter innan experimentet påbörjades. Denna dos valdes eftersom en lägre dos (10 mg/kg, ip) inte orsakade en rörelsestimulering hos våra möss (data visas inte). Den valda dosen (6 mg/kg, ip) av JMV2959 (syntetiserad vid Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR5247, CNRS, Montpellier 1 och 2 universitet, Frankrike), en GHS-R1A-antagonist, bestämdes tidigare och har ingen effekt på rörelseaktivitet, ackumbal dopaminfrisättning och betingad platspreferens hos möss (Jerlhag et al., 2009). JMV2959 löstes i vehikel (0.9 % natriumkloridlösning) och administrerades alltid tjugo minuter före morfinexponering eller halshuggning för analys av opioidpeptidnivåer. Den valda dosen av JMV2959 påverkade inte mössens grova beteende i något experiment. För beteendetesterna administrerades JMV2959 akut eftersom våra tidigare studier visar att en enda injektion av JMV2959 dämpar läkemedelsinducerad belöning (för granskning se Engel och Jerlhag (2014)). JMV2959 administrerades subkroniskt under fem efterföljande dagar för opioidpeptidanalysen för att öka möjligheten att upptäcka en robust effekt. Dessutom undviker du med upprepade injektioner den eventuella förvirrande effekten av akut injektionsstress på peptider. Acylerat råttghrelin (Bionuclear; Bromma, Sverige) späddes ut i 0.9 % natriumklorid och den valda dosen ghrelin (0.33 mg/kg, ip) har tidigare visat sig ge belöning hos möss (Jerlhag, 2008). En balanserad design användes för alla drogutmaningar.

Tidigare studier har visat att morfin orsakar en rörelsestimulering hos gnagare (Wise och Bozarth, 1987). Rörelseaktivitet registrerades i åtta ljuddämpade, ventilerade och svagt upplysta rörelseboxar (420×420×200 mm, Kungsbacka mät- och reglerteknik AB; Fjärås, Sverige). Fem gånger fem rader av fotocellsstrålar, på golvnivå i lådan, skapade fotocellsdetektering tillät ett datorbaserat system att registrera mössens aktivitet. Lokomotorisk aktivitet definierades som det ackumulerade antalet nya fotocellstrålar avbrutna under en 60-minutersperiod. I alla experiment fick mössen vänja sig vid den rörelsedrivande aktivitetsboxen en timme före drogutmaningen. Det fanns inga skillnader mellan tillvänjning i någon av behandlingsgrupperna (data visas inte).

I den första experimentserien undersöktes effekterna av JMV2959 (6 mg/kg, ip) på morfininducerad (20 mg/kg, ip) rörelsestimulering. JMV2959 administrerades 20 minuter före morfin och aktivitetsregistreringen startade tio minuter efter den sista injektionen. Varje mus fick en behandlingskombination (vehikel/vehikel, JMV2959/vehikel, morfin/vehikel eller JMV2959/morfin; n=8 per behandlingskombination) och utsattes endast för en experimentell prövning.

För att utvärdera effekterna av JMV2959 på de givande effekterna av morfin i nya möss, utfördes konditionerade platspreferenstest på möss som tidigare beskrivits (Jerlhag, 2008). I korthet användes en tvåkammar CPP-apparat, med 45 lx belysning och distinkta visuella och taktila signaler. Det ena facket definierades av svart- och vitrandiga väggar och av ett mörkt laminerat golv medan det andra hade ett vitmålat trägolv och väggar av trästruktur. Proceduren bestod av förkonditionering (dag 1), konditionering (dag 2–5) och efterkonditionering (dag 6). Vid förkonditionering injicerades möss ip med vehikel och placerades i kammaren med fri tillgång till båda avdelningarna under 20 minuter för att bestämma den initiala platsen (eller sido) preferensen. Konditionering (20 min per session) gjordes med användning av en partisk procedur där morfin (20 mg/kg) parades med den minst föredragna avdelningen och vehikel med den föredragna avdelningen. Alla möss fick en injektion av morfin såväl som av vehikel varje dag och injektionerna ändrades mellan morgon och eftermiddag i en balanserad design. Vid efterkonditionering av mössen (n=16) injicerades med JMV2959 (6 mg/kg, ip) eller en lika stor volym vehikellösning och placerades 20 minuter senare på mittlinjen mellan de två avdelningarna med fri tillgång till båda avdelningarna under 20 min (vilket skapade följande behandlingsgrupper; Morph-Veh och Morph-JMV2959).

Tillståndsplatspreferens beräknades som skillnaden i % av den totala tiden som spenderades i den drogparade (dvs.. minst föredraget) under postkonditioneringen och förkonditioneringssessionen.

Med tanke på att JMV2959 dämpar morfininducerad rörelsestimulering och konditionerad platspreferens hos möss, undersöktes effekten av JMV2959 (6 mg/kg, ip) på morfininducerad (20 mg/kg, ip) ackumbal dopaminfrisättning med användning av in vivo- mikrodialys hos fritt rörliga möss. För mätningar av extracellulära dopaminnivåer implanterades möss ensidigt med en mikrodialysprob placerad i nucleus accumbens. Därför sövdes mössen med isofluran (Isofluran Baxter; Univentor 400 Anesthesia Unit, Univentor Ldt., Zejtun, Malta), placerades i en stereotaktisk ram (David Kopf Instruments; Tujunga, CA, USA) och hölls på en värmedyna för att förhindra hypotermi. Xylocain adrenalin (5 μg/ml; Pfizer Inic; New York, USA) användes som lokalbedövningsmedel och karprofen (Rimadyl, 5 mg/kg ip) (Astra Zeneca; Göteborg, Sverige) användes för att lindra eventuell smärta. Skalbenet exponerades och ett hål för sonden och ett för förankringsskruven borrades. Sonden alternerades slumpmässigt till antingen vänster eller höger sida av hjärnan. Koordinaterna 1.5 mm anteriort till bregma, ±0.7 lateralt till mittlinjen och 4.7 mm under ytan av hjärnans yta användes för nucleus accumbens (Franklin och Paxinos, 1997). Den exponerade spetsen på dialysmembranet (20,000 310 kDa avskuren med ett od/id på 220/1 μm, HOSPAL, Gambro, Lund, Sverige) på sonden var XNUMX mm. Alla prober implanterades kirurgiskt två dagar före experimentet. Efter operationen hölls mössen i individuella burar fram till testdagen (Macrolon III).

På testdagen kopplades sonden till en mikroperfusionspump (U-864 Syringe Pump; AgnThós AB) och perfunderades med Ringer-lösning med en hastighet av 1.5 μl/min. Efter en timmes tillvänjning till mikrodialysuppsättningen, samlades perfusionsprover var 20:e minut. Baslinjedopaminnivån definierades som medelvärdet av tre på varandra följande prover före den första läkemedels-/vehikelutmaningen, och ökningen av ackumbaldopamin beräknades som den procentuella ökningen från baslinjen. Efter baslinjeproverna (-40 min till 0 min) injicerades möss med JMV2959 eller vehikel (vid 0 min), vilket följdes av en morfin- eller vehikelinjektion (vid 20 min). Efter dessa läkemedelsadministrationer samlades ytterligare åtta 20 min prover. Tillsammans följande behandlingsgrupper (n=8 i varje grupp) skapades: fordon-fordon (Veh-Veh), fordon-morfin (Veh-Morph), JMV2959-vehikel (JMV2959-Veh) och JMV2959-morfin (JMV2959-Morph).

Dopaminnivåerna i dialysaterna bestämdes med HPLC med elektrokemisk detektion. En pump (Gyncotec P580A; Kovalent AB; V. Frölunda, Sverige), en jonbytarkolonn (2.0×100 mm, Prodigy 3 μm SA; Skandinaviska GeneTec AB; Kungsbacka, Sverige) och en detektor (Antec Decade; Antec Leyden; Zoeterwoude , Nederländerna) utrustad med en VT-03 flödescell (Antec Leyden) användes. Den mobila fasen (pH 5.6), bestående av sulfonsyra 10 mM, citronsyra 200 mM, natriumcitrat 200 mM, 10 % EDTA, 30 % MeOH, vakuumfiltrerades med ett 0.2 μm membranfilter (GH Polypro; PALL Gelman Laboratory; Lund, Sverige). Den mobila fasen levererades med en flödeshastighet av 0.2 ml/min genom att passera en avgasare (Kovalent AB), och analyten oxiderades vid +0.4 V.

Efter att mikrodialysexperimenten hade slutförts halshöggs mössen och prober perfuserades med pontamin himmelsblått 6BX för att underlätta sondlokalisering. Hjärnorna monterades på en vibroslice-anordning (752 M Vibroslice; Campden Instruments Ltd., Loughborough, Storbritannien) och skars i 50 μm sektioner. Placeringen av sonden bestämdes genom grov observation med användning av ljusmikroskopi. Den exakta positionen för sonden verifierades (Franklin och Paxinos, 1997) och endast möss med korrekta placeringar användes i den statistiska analysen.

Effekterna av JMV2959-behandling på nivåerna av MEAP, DynB och LeuArg i belöningsrelaterade områden undersöktes. Möss injicerades med antingen JMV2959 (6 mg/kg, ip, n=8) eller en lika stor volym fordon (ip, n=8) under fem efterföljande dagar. 20 minuter efter den sista injektionen avlivades mössen och hjärnorna från dessa möss samlades upp. Separata möss injicerades med antingen ghrelin (0.33 mg/kg, ip, n=8) eller en lika stor volym fordon (ip, n=8) under fem efterföljande dagar. Fem minuter efter den sista injektionen avlivades mössen och hjärnorna från dessa möss samlades upp. Amygdala, striatum, prefrontal cortex, VTA och hippocampus dissekerades snabbt och lades omedelbart på torris och lagrades sedan vid -80 ° C tills vidare bearbetning.

Homogeniserings- och peptidextraktionsprocedurerna följde en standardprocedur, som tidigare beskrivits i detalj (Nylander et al., 1997). Kort sagt tillsattes varm (95 °C) ättiksyra (1 M) till de frysta proverna. Proverna värmdes i ett vattenbad (95 °C) i 5 minuter, kyldes på is och homogeniserades sedan med en Branson Sonifier (Danbury, CT, USA). Homogenatet återupphettades vid 95 °C i 5 minuter och kyldes på is före centrifugering i 15 minuter vid 4 °C och 12,074 XNUMX×g i en Beckman GS-15R-centrifug (Fullerton, CA, USA). Extrakten renades ytterligare enligt en tidigare beskriven procedur (Nylander et al., 1997). Två fraktioner uppsamlades: fraktion III (Leu-Arg och MEAP) och fraktion V (DynB). Proverna torkades i en vakuumcentrifug (Savant SpeedVac Plus SC210A; Thermo Scientific Inc., Waltham, MA USA) och förvarades i frysen (-20 °C) tills peptidanalys.

De immunoreaktiva (ir) nivåerna av DynB, LeuArg och MEAP analyserades med väletablerade radioimmunoanalyser och protokollen har beskrivits i detalj på annat håll (Nylander et al., 1997). I DynB-analysen användes get-anti-kanin-IgG (GARGG; Bachem, Bubendorf, Schweiz) för att separera fri och antikroppsbunden peptid. Dyn-antiserumet (113+) användes i en slutlig utspädning av 1:600000. Korsreaktiviteten med big Dyn var 100 % och med DynB (1–29) 1 %. Ingen korsreaktivitet med andra opioidpeptider observerades. I LeuArg- och MEAP-analyserna användes en kolsuspension för att separera fri och antikroppsbunden peptid. För LeuArg-antiserumet (91:6D+, slutspädning 1:60000) var korsreaktiviteten mindre än 0.01% för Leu-enkefalin och MEAP, 0.02% för DynB, 0.04% för DynA och 0.08% för alfa-neoendorfin. MEAP-antiserumet 90:3D (II) användes i en slutlig utspädning av 1:160 000. Korsreaktivitet med Met-enkefalin, Met-enkefalin-Arg⁶Met-enkefalin-Arg⁶gly⁷leu⁸Leu-enkefalin och Leu-enkefalin-Arg⁶ var <0.1 %

En övergripande huvudeffekt av behandlingen hittades på rörelseaktivitet hos möss efter systemisk administrering av morfin (20 mg/kg) och JMV2959 (6 mg/kg) (F(3,27)=7.409, P= 0.0009; n=8 för Veh–Veh, JMV2959-Veh, JMV2959-Morph och n=7 för Veh-Morph). Som visas i Figur 1En posthoc analys visade att förbehandling med en enda injektion av JMV2959 (P<0.001) försvagade signifikant den morfininducerade rörelsestimuleringen (P<0.01 Veh–Veh vs Veh–Morph). Den valda dosen av JMV2959 hade ingen effekt på rörelseaktiviteten jämfört med vehikelbehandling (P>0.05). Det fanns ingen skillnad i rörelseaktivitetssvar hos vehikelbehandlade möss och JMV2959-morhpinbehandlade möss (P> 0.05).

  

Figur 1

GHS-R1A-antagonisten JMV2959 dämpar morfininducerad rörelsestimulering, ackumbal dopaminfrisättning och konditionerad platspreferens hos möss. (A) Morfininducerad (20 mg/kg ip) rörelsestimulering dämpades genom en enda injektion av JMV2959 (6 mg/kg ip) (n=7–8 i varje grupp; **P<0.01, ***P<0.001 enkelriktad ANOVA följt av ett Bonferroni post-hoc-test). (B) Den morfininducerade (20 mg/kg ip) tillståndsplatspreferens (CPP) försvagades genom en akut enstaka injektion av JMV2959 (6 mg/kg ip) i möss (n=8 i varje grupp, *P<0.05, oparat t-test). (C) Först visade vi en signifikant effekt av morfin (20 mg/kg ip) för att öka dopaminfrisättningen i jämförelse med vehikelbehandling (tidsintervall 40–180 min (P<0.001), Veh–Veh vs Veh–Morph). Som visas i (C) försvagade förbehandling med JMV2959 (6 mg/kg ip) den morfininducerade ökningen av dopaminfrisättning jämfört med vehikelförbehandling vid tidsintervall 40–100 och 140–180 min (^##P<0.01, ^{# # #}P <0.001, JMV2959-Morph jämfört med Veh–Morph-behandling). Den valda dosen av JMV2959 hade ingen signifikant effekt på ackumbal dopaminfrisättning jämfört med vehikelbehandling vid något tidsintervall (P>0.05, Veh–Veh vs JMV2959-Veh). JMV2959 reducerade, men blockerade inte helt, den morfininducerade ackumbala dopaminfrisättningen vid tidsintervall 60-140 (*P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001, JMV2959-Morph jämfört med Veh–Morph-behandling). Pilar representerar tidpunkter för injektion av JMV2959, vehikel och morfin. Data analyserade med en tvåvägs ANOVA följt av ett Bonferroni post-hoc test (n=8 i varje grupp). Veh–veh (kvadrat), Veh–Morph (romb), JMV2959-Veh (triangel), JMV2959-Morph (cirkel). Alla värden representerar medelvärde±SEM.

Visa Stor Bild | Visa Hi-Res-bild | Ladda ner PowerPoint Slide

Den morfininducerade (20 mg/kg) (Morph–Veh) konditionerade platspreferensen försvagades signifikant av en akut enstaka injektion av JMV2959 (6 mg/kg) (Morph-JMV2959) på dagen efter konditionering (P= 0.025, n=8 i varje grupp; Figur 1B).

Ackumbal mikrodialysmätningar av dopamin hos möss avslöjade en övergripande huvudeffekt av behandlingen (F(3,33) = 24.15, P<0.0001), tid F(11,308) = 7.05, P<0.0001) och behandling×tidsinteraktion (F(11,308) = 8.63, P<0.0001)(Figur 1C; n=8 i varje grupp). Morfin ökade ackumbal dopaminfrisättning i förhållande till vehikelbehandling med tidsintervall 40–180 min (P<0.001). Som visas i Figur 1C denna effekt reducerades genom förbehandling med JMV2959 vid tidsintervall 40–80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) och 160–180 min (P<0.001). JMV2959 minskade, men blockerade inte helt, morfininducerad ackumbal dopaminfrisättning eftersom det fanns en skillnad mellan vehikelbehandling och JMV2959-morfinbehandling vid tidsintervall 60–80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) och 160 min (P<0.05). Den valda dosen av JMV2959 hade ingen signifikant effekt på ackumbal dopaminfrisättning jämfört med vehikelbehandling vid något tidsintervall (P> 0.05).

Den föreliggande studien stöder ytterligare hypotesen att den orexigena peptidens fysiologiska roll inkluderar belöningsreglering. Vi visade faktiskt att perifer administrering av en GHS-R1A-antagonist dämpar morfins förmåga att orsaka en rörelsestimulering, öka dopaminnivåerna i NAc och att inducera en betingad platspreferens hos möss. Vi fann också att subkronisk behandling med JMV2959, men inte ghrelin, ökade ir-vävnadsnivåerna av MEAP i VTA, DynB i hippocampus och LeuArg i striatum, vilket ger det första beviset att förmågan hos ghrelinsignalering att reglera förstärkning kan involvera opioidpeptider .

De data som presenteras häri visar att GHS-R1A-antagonism påverkar förmågan hos morfin att aktivera det mesolimbiska dopaminsystemet hos möss. I enlighet med resultaten som visar att JMV2959 blockerar förmågan hos morfin att öka de extracellulära nivåerna av ackumbal dopamin och att orsaka ett stereotypt beteende hos råttor (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Som stöd förstärker central administrering av ghrelin brytpunkten, men inte antalet aktiva spaktryckningar, i schemat för förstärkning av progressivt förhållande hos råttor som själv administrerar heroin (Maric et al., 2012). Påståendet att ghrelinsignalering ligger till grund för drogberoende stöds ytterligare av resultaten som visar att JMV2959 minskar intaget såväl som motivationen att konsumera alkohol hos råttor och att amfetamin-, kokain- och nikotininducerad belöning blockeras av GHS-R1A-antagonismen hos gnagare ( för granskning se Engel och Jerlhag (2014)) och att polymorfismer i ghrelinrelaterade gener är associerade med intag av alkohol, rökning och amfetamin (för granskning se Engel och Jerlhag (2014)).

De nuvarande fynden med ökade nivåer av opioidpeptider i striatum, VTA och hippocampus efter subkronisk JMV2959-behandling tyder för första gången på interaktioner mellan opioidpeptider och ghrelinsignalering. De endogena opioiderna är inblandade i givande effekter, inte bara inducerade av opioider utan även andra missbruksdroger och naturliga belöningar, och i adaptiva processer som ses efter upprepad drogexponering (Trigo et al., 2010, Van Ree et al., 2000). Faktum är att aktiviteten hos det mesolimbiska dopaminsystemet regleras av endogena opioider på både nivån av VTA och NAc (Hirose et al., 2005, Spanagel et al., 1992) och verkningarna har visat sig vara antingen direkta eller indirekta genom modulering av andra sändare (Charbogne et al., 2014).

Vi fann här att subkronisk JMV2959-behandling ökade nivåerna av MEAP i VTA. MEAP är uteslutande härlett från proenkefalin och användes som en markör för proenkefalinpeptider som huvudsakligen aktiverar δ-opioidreceptorer. Vi antar att de ökade nivåerna av endogent MEAP i VTA efter JMV2959-behandling kan förhindra morfins förmåga att minska GABA-hämningen av mesoackumbala dopaminneuroner (Johnson och North, 1992), vilket kan bidra till de minskade morfininducerade effekterna som ses efter JMV2959. Understödjande är GHS-R1A lokaliserade på GABAergiska interneuroner i VTA (Abizaid et al., 2006). Dessutom har tidigare studier visat att intra-VTA-infusion av JMV2959, via okända mekanismer, dämpar ghrelin-inducerad belöning (Jerlhag et al., 2011) såväl som ghrelin-medierat sackarosintag hos gnagare (Skibicka et al., 2011), tyder på att ventral tegmental GHS-R1A är viktig för belöningsreglering. Till stöd för ett sådant påstående är resultaten som visar att andra hungerreglerande peptider, såsom galanin och orexin, förmedlar morfinets givande egenskaper. via lokala mekanismer inom VTA (Narita et al., 2006, Richardson och Aston-Jones, 2012).

I striatum fann vi att subkronisk JMV2959 ökade ir-nivåerna av LeuArg, vilket tyder på att förmågan hos JMV2959 att dämpa morfininducerad betingad platspreferens, dopaminfrisättning och rörelsestimulering, åtminstone delvis, beror på ökad ackumbal δ- opioidreceptoraktivitet. Ökade LeuArg-nivåer kan vara resultatet av ökad enzymatisk omvandling av dynorfinpeptider till enkefaliner eller från ökad Dyn-frisättning i NAc som ett svar på ökat dopamin, följt av nedbrytning till LeuArg. Även om tidigare studier har visat att aktiviteten hos det mesolimbiska dopaminsystemet regleras via κ-opioidreceptorer i NAc (Spanagel et al., 1992) och endogena κ-opioidreceptorer ger en tonisk hämning av mesoackumbal dopamin-neurotransmission och dämpar kokain-inducerad frisättning av dopamin i NAc (Chefer et al., 2005), vi gjorde inte det. visar att JMV2959 ändrar ir DynB-nivåerna i striatum. Därför är ytterligare studier berättigade på prodynorfinpeptider för att belysa interaktionerna mellan GHS-R1A-antagonism och dynorfiner.

I den aktuella studien visade vi också att JMV2959-behandling signifikant ökar nivåerna av hippocampus DynB. Ghrelin ökar minneskonsolidering såväl som dendritisk ryggradsbildning, genererar långsiktig potentiering och inducerar minnesfacilitering via hippocampus GHS-R1A hos gnagare (Carlini et al., 2010, Diano et al., 2006). Dessutom visar GHS-R1A knockoutmöss ett förbättrat rumsminne i Morris vattenlabyrinttest och ett stört kontextuellt minne i rädslakonditioneringsparadigmet jämfört med vildtypsmöss (Albarran-Zeckler et al., 2012). Dynorfinpeptider, inklusive DynB, är rikligt förekommande i hippocampus och de dämpar långtidspotentieringen (Chavkin et al., 1985, Wagner et al., 1993) samt försämrar rumslig inlärning hos råttor (Sandin et al., 1998). Vi antar därför att GHR-R1A-antagonisten kan dämpa minnet av belöning genom att hämma hippocampus långsiktig potentiering via aktivering av DynB. Tillsammans ger dessa data en ny potentiell mekanism genom vilken JMV2959 via opioidpeptider kan förändra förstärkningen. Emellertid är opioidreceptorer brett distribuerade i hjärnan, vilket tyder på att andra områden, som inte ingår i denna studie, kan vara involverade i GHS-R1A-reglerad morfininducerad belöning. Till exempel reduceras ghrelin-inducerat födointag såväl som spakpressning för sackaros genom central eller intrahypotalamus administrering av en κ-opioidreceptorantagonist (Romero-Pico et al., 2013). Men opioidpeptidernas roll inom andra områden måste belysas i kommande studier.

De endogena μ-receptorliganderna, endomorfiner och beta-endorfin, analyserades inte häri så vi kan inte utesluta en möjlig effekt av JMV2959 på dessa peptider. De givande egenskaperna hos morfin involverar faktiskt μ-opioidreceptorer i VTA såväl som NAc (Hirose et al., 2005, Johnson och North, 1992, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999). En μ-receptorantagonist försvagar dock inte ghrelin-inducerat födointag (Naleid et al., 2005) eller ghrelin-inducerad rörelsestimulering och ackumbal dopaminfrisättning (Jerlhag et al., 2011), vilket antyder att förmågan hos GHSR- 1A-antagonist för att reglera förstärkning inkluderar inte μ-receptorer. Å andra sidan påverkade JMV2959 opioidpeptider härledda från proenkefalin och prodynorfin, vilket visar att de kan vara involverade i effekterna inducerade av GHSR-1A-antagonister.

Medan tidigare studier har visat att systemisk administrering av ghrelin ger belöning (Jerlhag, 2008) samt förbättrar de givande egenskaperna hos beroendeframkallande läkemedel (för översikt se Engel och Jerlhag (2014)), visar vi här att subkronisk ghrelinbehandling inte förändrades ir vävnadsnivåerna av opioider peptider i något av de studerade belöningsrelaterade områdena. Systemisk ghrelinadministrering aktiverar c-fos-uttryck i hypotalamusområden, men inte i mesolimbiska och hippocampala områden (Pirnik et al., 2011) och bindningen av fluorescensmärkt ghrelin är begränsad till livsmedelsreglerande neuroner i hypotalamus (Schaeffer et al., 2013) ). Sammantaget med fynden som visar att ghrelin, förutom spårmängder i hypotalamus, inte kan detekteras i djupare områden i hjärnan efter perifer ghrelinadministrering (Furness et al., 2011, Grouselle et al., 2008, Sakata et al., 2009 ), ökar möjligheten att systemiskt ghrelin aktiverar belöningssystemet via indirekta mekanismer oberoende av endogena opioider. Understödjande kräver ghrelin-inducerad ackumbal dopaminfrisättning uppströms orexigen hypotalamisk signalering (Cone et al., 2014), perifer ghrelinadministrering förändrar inte alkoholintaget hos möss (Lyons et al., 2008) och att neutralisering av perifert ghrelin inte dämpar alkohol -inducerad belöning hos möss eller alkoholintag hos råttor (Jerlhag et al., under press). Möjligheten att sub-kronisk administrering av ghrelin ökar irvävnadsnivåerna av opioider peptider bör övervägas, men detta måste undersökas i detalj i kommande studier.

Förmågan hos beroendeframkallande droger att orsaka stimulering, frisättning av dopamin och att inducera en betingad platspreferens är intimt förknippad med de förstärkande egenskaperna hos beroendeframkallande droger och dessa parametrar anses utgöra en del av beroendeprocessen (Wise, 2004). Med tanke på att vi här fann att JMV2959 dämpar dessa belöningsparametrar hos möss antar vi att GHS-R1A kan spela en viktig roll i beroendeprocesser, och att endogena opioider är involverade i dessa processer. Sammantaget indikerar dessa data att GHS-R1A-antagonister bör belysas som behandling av drogberoende.

JE och EJ stöds av anslag från Vetenskapsrådet (Anslag nr 2011-4646, 2009-2782 och 2011-4819 ), Svenska hjärnstiftelsen, LUA/ALF (Anslag nr 148251 ) från Sahlgrenska Universitetssjukhuset, Alkohol forskningsrådet för det svenska alkoholhandelsmonopolet och Adlerbertskas, Fredrik och Ingrid Thurings stiftelser, Tore Nilsson, Längmanska, Torsten och Ragnar Söderberg, Wilhelm och Martina Lundgren, NovoNordisk, Knut och Alice Wallenberg, Magnus Bergvall, Anérs, Jeansons, Åke Wiberg , Svenska Läkaresällskapet, Svenska Sällskapet för Medicinsk Forskning och Göteborgs Psykiatriforskningsstiftelse. Alkoholforskningsrådet vid Svenska Alkoholhandelsmonopolet och Vetenskapsrådet (K2012-61X-22090-01-3) stödde IN. Finansieringskällorna hade ingen roll i studiedesignen, i insamlingen, analysen och tolkningen av data, i skrivandet av rapporten och i beslutet att publicera data