Proc Natl Acad Sci US A. April 29, 2014; 111 (17): 6455 – 6460.
Online veröffentlicht im April 15, 2014. doi: X
PMCID: PMC4036004
Neuroscience
Teruko Danjo,a Kenji Yoshimi,b Kazuo Funabiki,a Satoshi Yawata,a und Shigetada Nakanishia,1
Dieser Artikel wurde zitiert von andere Artikel in PMC.
Welche Bedeutung hatte der Wiener Kongress?
Dopamin (DA) -Neuronen im ventralen Tegmentalbereich (VTA) reagieren auf aversive Stimuli meistens mit vorübergehender Stummschaltung. Es bleibt unklar, ob diese Reaktion beim Verhalten von Mäusen direkt aversive Reaktionen hervorruft. Wir untersuchten diese Frage durch optogenetische Kontrolle von DA-Neuronen in der VTA und fanden heraus, dass die Inaktivierung von DA-Neuronen zu aversivem Ansprechen und Lernen führte. Der Nucleus Accumbens (NAc), der Hauptausgangskern von VTA-DA-Neuronen, wurde als verantwortlich für diese Reaktion angesehen. Daher untersuchten wir, welche der grundlegenden Pfade in der NAc für dieses Verhalten kritisch waren, indem sie den D1- oder D2-Rezeptor verwenden. und fand heraus, dass der D2-Rezeptor-spezifische Weg für dieses Verhalten entscheidend ist.
Abstrakt
Die Übertragung von Dopamin (DA) aus dem ventralen Tegmentalbereich (VTA) ist für die Kontrolle von belohnendem und aversivem Verhalten von entscheidender Bedeutung. Das vorübergehende Stummschalten von DA-Neuronen ist eine der Antworten auf aversive Stimuli, aber ihre Folgen und neuronalen Mechanismen bezüglich aversiver Reaktionen und des Lernens sind weitgehend unerreichbar. Hier, Wir berichten, dass die optogenetische Inaktivierung von VTA-DA-Neuronen die DA-Spiegel rasch herunterreguliert und die Hochregulation der neuralen Aktivität im Nucleus accumbens (NAc) wie durch den Fos-Ausdruck ausgewertet. TSeine optogenetische Unterdrückung der DA-Neuronenzündung löste sofort aversive Reaktionen auf den zuvor bevorzugten dunklen Raum aus und führte zu aversivem Lernen in Richtung auf den optogenetisch bedingten Ort. Es ist wichtig, dass diese Ortsabneigung durch das Herunterfallen von Dopamin-D2-Rezeptoren, nicht aber durch die der D1-Rezeptoren in der NAc beseitigt wurde. Das Stummschalten von DA-Neuronen im VTA war daher für die Induktion aversiver Reaktionen und das Lernen durch Dopamin-D2-Rezeptoren in der NAc unabdingbar.
Das mesolimbische dopaminerge System spielt nicht nur eine entscheidende Rolle für ein breites Spektrum an Motivation und Lernen (1-3), aber seine Funktionsstörung ist auch bei schweren neuropsychiatrischen Erkrankungen, wie zum Beispiel bei Parkinson, Schizophrenie und Drogensucht, involviert. Dopamin (DA) -Neuronen im ventralen tegmentalen Bereich (VTA) reagieren auf Belohnungsreize durch phasisches Abfeuern, und die Hauptfunktion dieses Feuers besteht darin, "den Belohnungsvorhersagefehler" zu kodieren, den Unterschied zwischen der vorhergesagten Belohnung und dem tatsächliche Belohnung (4). Im Gegensatz zu der Reaktion auf belohnende Reize sind ihre Reaktionen auf aversive Reize alles andere als homolog; dh einige DA-Neuronen werden als Reaktion auf aversive Reize aktiviert, während die meisten anderen reagieren, indem sie ihre Schüsse vorübergehend unterdrücken (5-9). Aktuelle Studien haben gezeigt, dass die optogenetische Aktivierung von GABAergen Neuronen und die daraus resultierende Inaktivierung von DA-Neuronen den Belohnungsverbrauch unterdrücken und eine aversive Reaktion auslösen (10, 11). Es bleibt jedoch weitgehend unklar, welche Mechanismen in den neuronalen Schaltkreisen nach der Inaktivierung von DA-Neuronen in der VTA essentiell für das Erlernen aversiven Lernens sind und wie Verhaltensreaktionen gesteuert werden, um den Belohnungsverbrauch zu unterdrücken und aversives Verhalten zu induzieren.
Angenommene Beweise haben gezeigt, dass das motivationale und kognitive Lernen als Reaktion auf positive und negative Reize weitgehend durch die neuralen Schaltkreise einschließlich der Basalganglien reguliert wird (12), die einen großen Teil der dopaminergen Projektion aus dem Mittelhirn erhalten. Im Striatum bestehen zwei fundamentale neuronale Schaltkreise aus bestimmten mittelgroßen spinalen Neuronen (MSNs), die jeweils einen bestimmten Typ von DA-Rezeptor (13).
- Ein Kreislauf ist der direkte Weg, der aus den MSNs besteht, die direkt auf die Ausgangskerne der Basalganglien (Substitia nigra pars reticulata (SNr)) projizieren und hauptsächlich Dopamin-D1-Rezeptoren (D1Rs) exprimieren..
- Der andere ist der indirekte Weg, bestehend aus den MSNs, die indirekt durch den Globus pallidus zum SNr projizieren und hauptsächlich Dopamin-D2-Rezeptoren (D2Rs) exprimieren.
DA-Signale aus dem Mittelhirn modulieren diese beiden parallelen Pfade über D1Rs und D2Rs auf die entgegengesetzte Weise dynamisch, und diese Modulation soll motivationales Lernen erleichtern (3, 14).
- Bei den Belohnungsreizen wird davon ausgegangen, dass hochregulierte DA-Spiegel, die durch Belohnungssignale induziert werden, die D1R aktivieren und somit vorwiegend den direkten Weg im Nukleus accumbens (NAc) erleichtern..
- Andererseits verringert die Unterdrückung von DA-Neuronenzündungen als Reaktion auf aversive Stimuli die DA-Spiegel in der NAc; und diese Reaktion soll die Signalübertragung auf dem indirekten Weg durch aktivierte D2Rs gezielt fördern.
Obwohl Studien mit pharmakologischen Strategien und der Methode der reversiblen Neurotransmissionsblockierung (RNB) diesen Regulationsmechanismus in der NAc unterstützt haben (15, 16) ist nicht bekannt, ob die Unterdrückung des DA-Neuron-Feuerns ausreicht, um die Aktivität des indirekten Signalwegs zu fördern und anschließend das Vermeidungsverhalten zu induzieren. In dieser Studie beschäftigten wir uns mit dieser Frage, indem wir DA-Neuronen in der VTA durch optogenetische Manipulation des membranhyperpolarisierenden Arch-Proteins (17) und zeigte explizit, dass die Unterdrückung von DA-Neuronen in der VTA die DA-Spiegel in der NAc senkte und aversive Reaktionen und Lernen induzierte. Des Weiteren untersuchten wir die Mechanismen der Regulierung dieser Reaktion und gaben an, dass diese aversive Reaktion durch D2Rs in der NAc spezifisch kontrolliert wird.
Die Ergebnisse
Optogenetische Inaktivierung von DA-Neuronen blockiert die Präferenz im Dunklen Raum.
Um das Schießen von DA-Neuronen selektiv zu inaktivieren, injizierten wir ein Cre-induzierbares Adeno-assoziiertes virales Konstrukt, das für Arch-eGFP [AAV-doppelt floxierter invertierter offener Leserahmen (DIO) -Arch] kodiert.17) einseitig in die VTA von erwachsenen Tyrosinhydroxylase (TH) -Cre-Mäusen (18) und Wildtyp (WT) Wurfgeschwister und eine optische Faser über dem VTA (Abb. S1 A und C). Zwei Wochen nach der Operation wurde Arch-eGFP im VTA eingeschränkt nachgewiesen (Abb. S1B). Wir haben den hyperpolarisierenden Effekt des Arch-Proteins durch elektrophysiologische Aufzeichnung getestet und den Effekt der optischen Stimulation der VTA von TH-Cre-Mäusen, denen AAV-DIO-Arch injiziert wurde, gemessen. In vivo elektrophysiologische Aufnahmen der VTA von anästhesierten TH-Cre-Mäusen zeigten, dass die optische Stimulation von putativen DA-Neuronen deren Schüsse hemmt (Abb. S2), was darauf hinweist, dass die optische Stimulation das Membranpotential von Arch-exprimierenden DA-Zellen ausreichend hyperpolarisiert und somit deren spontanes Abfeuern verhindert.
Mit diesen Mäusen untersuchten wir als nächstes, ob die optische Inaktivierung von DA-Neuronen im VTA als aversives Signal für Verhaltenslernen dienen kann. Mäuse haben eine angeborene Neigung, eine dunkle Umgebung zu bevorzugen (19). Wir entwickelten ein Verhaltensapparat, in dem Mäuse den dunklen Raum und den offenen hellen Raum frei erkunden konnten (Abb.. 1A). Nach der Gewöhnung blieben die WT-Mäuse bevorzugt im dunklen Raum, entweder mit oder ohne optische Stimulation im dunklen Raum (Abb. S1D), um sicherzustellen, dass die optische Stimulation selbst keinen Einfluss auf ihr Dunkelkammer-Bevorzugungsverhalten hat. Wir haben das Verhaltensexperiment von Tieren geplant, um die Wirkung der optischen Inaktivierung von DA-Neuronen auf ihr Verhalten zu testen (Abb. S1E). Nach der Gewöhnung und dem Vortest wurden Mäuse konditioniert, indem sie die DA-Neuronen im VTA optisch stimulierten, wenn sie im dunklen Raum blieben. Selbst während der ersten 5-Minute der Konditionierung blieben die TH-Cre-Mäuse aus dem zuvor bevorzugten dunklen Raum und vermied den dunklen Raum nach und nach während der Konditionierung (Abb.. 1B). Die TH-Cre-Mäuse wendeten ihre Vermeidung gegen den dunklen Raum nicht auf, obwohl sie beim Posttest keine optische Stimulation erhielten (Abb.. 1C). Diese Daten zeigen, dass Hyperpolarisierung von DA-Neuronen nicht nur ein vorübergehendes aversives Verhalten induzierte, sondern auch als Signal für aversives Lernen gegen den dunklen Raum diente, und es zeigt sich auch, dass die Inaktivierung von DA-Neuronen eine kausale Rolle sowohl beim vorübergehenden aversiven Verhalten als auch beim länger andauernden aversiven Lernen spielte.
Optogenetische Herabregulierung der DA-Spiegel in der NAc.
Als nächstes untersuchten wir, ob die Inaktivierung von DA-Neuronen im VTA tatsächlich die Konzentration von DA in ihrer Hauptzielregion, der NAc, veränderte. Wir haben die DA-Werte in der NAc durch schnelle Scan-Cyclovoltammetrie (FSCV) in anästhesierten TH-Cre-Mäusen gemessen, denen AAV-DIO-Arch in ihr VTA injiziert worden war. Die DA-Spiegel in der NAc wurden durch elektrische Stimulation des VTA sofort erhöht, und die evozierte DA-Freisetzung wurde durch gleichzeitige optische Stimulation des VTA signifikant verringert (Abb. S3). Wir haben dann getestet, ob eine optische Stimulation von VTA den tonischen DA-Spiegel in der NAc reduzieren kann. In den gleichen experimentellen Einstellungen beobachteten wir, dass der DA-Spiegel in der NAc vorübergehend durch 20s der optischen Stimulation des VTA verringert wurde (Abb.. 2), was mit der berichteten FSCV-Reaktion gegen die aversiven Stimuli übereinstimmt (20). Diese Daten zeigen, dass die optische Stimulation des VTA wirksam genug war, um die VTA-DA-Neuronen zu inaktivieren und den DA-Spiegel im NAc während des Verhaltensexperiments zu verringern.
Hochregulierung der Fos-Genexpression durch optische Inaktivierung von DA-Neuronen im VTA.
Die Verhaltensänderung, die durch die konditionierte Inaktivierung von DA-Neuronen im VTA verursacht wurde, legte nahe, dass die optische Stimulation die neuronale Aktivität direkt veränderte und zu einer Verschiebung der Verhaltensleistung führte. Als nächstes untersuchten wir die Regionen, in denen die neuronale Aktivität durch die konditionierte Inaktivierung von DA-Neuronen erhöht wurde, indem die Expression von Fos, einem unmittelbar frühen Gen, untersucht wurde. Bald nachdem die Konditionierung im Dunkelraumtest durchgeführt worden war, wurden Mäuse schnell verarbeitet, um die Menge an Fos-Expression durch quantitative In-situ-Hybridisierungsanalyse zu bestimmen (Abb.. 3 und Abb. S4). Die NAc, die Region, die eine große Menge an dopaminergen Projektionen vom VTA erhält, zeigte eine signifikant erhöhte Menge an Fos-Expression in den TH-Cre-Mäusen (Abb.. 3). Diese Aufwärtsregulierung wurde auch auf der kontralateralen Seite der optischen Stimulation festgestellt, die angeblich durch eine geringe Menge Virusinfektion in diese Seite verursacht wurde. Die Hochregulierung war jedoch auf der ipsilateralen Seite viel höher als auf der kontralateralen Seite der optischen Stimulation, was darauf hindeutet, dass die optische Inaktivierung von DA-Neuronen die neurale Aktivität der NAc direkt hochreguliert. Die erhöhte Fos-Expression wurde auch in anderen Gehirnregionen beobachtet, einschließlich des Septums, der periventrikulären Regionen des Striatum, der basolateralen Amygdala (BLA) und des lateralen Hypothalamus, jedoch nicht in der lateralen Habenula oder im medialen präfrontalen Kortex (mPFC; Abb. S4). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Regionen, die durch optische Inaktivierung von DA-Neuronen aktiviert wurden, nicht auf die direkten Zielregionen von VTA-DA-Neuronen beschränkt waren, sondern die Regionen enthielten, die indirekt in Abhängigkeit von einem neuronalen Schaltkreis aktiviert werden konnten. Diese Beobachtung legt nahe, dass die optische Inaktivierung von DA-Neuronen die neuronale Aktivität im Kreislauf modifiziert und nicht nur eine aversive Reaktion hervorrufen kann, sondern auch verschiedene andere Gehirnfunktionen auslösen kann, z. B. Angstzustände, Angstzustände und Stressreaktionen (21).
DA-Signalisierung durch D2R ist kritisch für die optogenetisch induzierte konditionierte Ortsversion.
Die Mehrheit der dopaminergen Signale vom VTA wird über DA-Rezeptoren, D1R und D2R, an die MSNs in der NAc übertragen. D1R wird fast ausschließlich in der Substanz P (codiert durch das Tac1-Gen) exprimierende MSNs exprimiert, und D2R wird vorwiegend in den Enkephalin (codiert durch das Penk-Gen) exprimierende MSNs exprimiert. Jeder MSN-Typ stellt die direkten und indirekten Pfade in der NAc dar (3). Da die Affinität für DA für D2R (nM-Ordnung) viel höher ist als für D1R (µM-Ordnung) (22, 23Man nimmt an, dass eine Verringerung der DA-Spiegel zu einer Inaktivierung von G führti-gekoppelter D2R, jedoch keinen nennenswerten Einfluss auf den D1R (3, 24), wodurch die neuronale Aktivität spezifisch auf dem indirekten Weg hochreguliert wird. Darüber hinaus wurde die Aktivierung von Fos in Penk- oder Drd2 (D2R) -exprimierenden Zellen stärker beobachtet als in den Tac1- oder Drd1a (D1R) -exprimierenden Zellen (Abb. S5). Basierend auf diesen Beobachtungen stellten wir die Hypothese auf, dass die DA-Signalisierung durch D2R eine wichtige Rolle bei der beobachteten aversiven Konditionierung spielen könnte.
Um diese Hypothese zu testen, haben wir den Test der Testung der konditionierten Ortsabweichung (CPA) durchgeführt (Abb. S6). Wir haben einen Verhaltensapparat vorbereitet, der zwei Kammern mit nahezu identischen Umständen und einem kleinen Korridor enthält. Diese unvoreingenommene Umweltbedingung im CPA-Test ermöglichte uns weiter zu untersuchen, ob die Inaktivierung von VTA-DA-Neuronen in der Lage ist, aversive Reaktionen und Lernen zu induzieren und zusätzlich die Präferenz im Dunklen Raum zu blockieren. Wenn sich Tiere frei um den gesamten Apparat bewegen konnten, blieben die meisten von ihnen in zwei Kammern ohne typische Verhaltensunterschiede beim Vortest. Die optische Konditionierung wurde dann durch Paarung der optischen Stimulation mit einer festen Kammer durchgeführt. Selbst wenn eine der beiden Kammern zur Konditionierung verwendet wurde, vermieden die TH-Cre-Mäuse während der Konditionierung und beim Posttest (sieheAbb. S6 B-E). Die statistische Analyse bestätigte eine signifikante Reduktion der Verweildauer der TH-Cre-Mäuse in der optisch konditionierten Kammer beim Posttest im Vergleich zur Verweildauer der WT-Mäuse (Abb. S6F).
Wir haben dann versucht, DA-Rezeptor-Subtypen zu spezifizieren, die an diesem aversiven Verhalten beteiligt sind, indem jeder der DA-Rezeptoren in der NAc spezifisch unterdrückt wird (Abb.. 4 und Abb. S7). Wir haben lentivirale Vektoren entwickelt und validiert, die für jeden DA-Rezeptor spezifische kurze Haarnadel-RNA (shRNA) mit konstitutiver Expression von mCherry enthalten. Drei Wochen nach der Injektion des Lentivirus in den NAc wurde eine robuste Expression von mCherry im NAc lokalisiert (Abb.. 4B). Die effektive Unterdrückung der mRNA-Expression jedes Rezeptors wurde durch quantitative Echtzeit-PCR-Analyse bestätigt (Abb. S7A). Die Messung der Proteingehalte durch Western-Blotting zeigte auch, dass die Injektion von Lentiviren selektiv das Zielproteinprodukt reduzierte, ohne die Expression des anderen Subtyps des DA-Rezeptors zu beeinträchtigen (Abb.. 4C und Abb. S7 B-G). Die shD1R- und shD2R-exprimierenden Lentiviren senkten ihren Zielproteinspiegel auf 46.2 ± 1.1% bzw. 38.4 ± 4.9%, verglichen mit dem Kontrollvirus (Abb.. 4C). Diese Ergebnisse bestätigten, dass die lentiviralen Vektoren, die shRNA exprimieren, die für D1R und D2R spezifisch ist, ihre Ziel-RNAs selektiv und ausreichend unterdrücken und die Menge der jeweiligen Proteinprodukte herunterregulieren. Wir haben auch bestätigt, dass die Virus-vermittelte Expression von mCherry nicht in der VTA nachgewiesen wurde, mit Ausnahme der Möglichkeit, dass die Lentivirus-vermittelte shRNA die VTA direkt beeinflusst.
Mit diesen Lentiviren, die shRNA enthielten, wurde getestet, welcher Typ von DA-Rezeptor für das durch die optogenetische Inaktivierung von DA-Neuronen induzierte aversive Verhalten verantwortlich ist. Wir injizierten shRNA-haltiges Lentivirus oder Kontroll-Lentivirus zusammen mit AAV-DIO-Arch in die linke VTA der TH-Cre-Mäuse. Die optische Faser wurde auch über dem VTA eingefügt (Abb.. 4A). Als der Drei-Kammer-CPA-Test drei Wochen nach der Operation durchgeführt wurde, zeigten die TH-Cre-Mäuse, denen lenti: shD1R-mCherry injiziert wurde, immer noch eine explizite CPA gegen die mit optischen Stimulationspaaren vergleichbare Kammer, die mit der der TH-Cre-Mäuse vergleichbar war Kontroll-Lentivirus (lenti: mCherry). Im Gegensatz dazu zeigten die TH-Cre-Mäuse, denen lenti: shD2R-mCherry injiziert wurde, keine offensichtliche CPA während der Konditionierung (Abb.. 4D). Das ausschließliche Lerndefizit der TH-Cre-Mäuse, denen lenti injiziert wurde: shD2R-mCherry, wurde durch Analyse des aversiven Lernens beim Posttest weiter untermauert (Abb.. 4E). Diese Ergebnisse zeigen, dass das aversive Verhalten gegenüber der durch die DA-Neuron-Inaktivierung bedingten Stelle spezifisch durch D2R und nicht durch D1R in der NAc hervorgerufen wurde.
Diskussion
Im Striatum haben Studien gezeigt, dass die Aktivierung des Gs-gekoppeltes D1R erleichtert das Abfeuern, während die Aktivierung des Gi-gekoppeltes D2R führt zu einer verringerten Schusseffizienz (25). AcEntsprechend der Spezifität der DA-Rezeptor-Expression aktivieren phasische Zündungen von DA-Neuronen hauptsächlich den direkten Weg durch D1R, wohingegen eine vorübergehende Abnahme der DA-Neuronenfeuerung vorwiegend die indirekte Stoffwechselkompetenz durch D2R fördert (3, 26). Basierend auf diesem Regulationsmechanismus wurde vorgeschlagen, dass das Stummschalten von DA-Neuronen als Reaktion auf aversive Stimuli hauptsächlich über den indirekten Weg erfolgt und zu aversivem Verhalten führt (3). Kürzlich durchgeführte Studien haben gezeigt, dass die Blockade der synaptischen Übertragung des indirekten Weges die durch einen elektrischen Schock ausgelöste aversive Verhaltensweise beeinträchtigt (15) und dass diese Beeinträchtigung durch die Hemmung der D2R-vermittelten Signalübertragung verursacht wird (16). ichAußerdem bewirkt die optogenetische Hochregulierung von D2R-exprimierenden MSNs auf dem indirekten Weg eine Verhaltensvermeidung (27). Da DA-Neuronen jedoch in Reaktion auf aversive Stimuli sowohl verstärkte als auch unterdrückte Zündungen zeigen und da gleichzeitig andere schockbedingte sensorische Informationen im Gehirn verarbeitet werden, muss noch geklärt werden, ob das Stummschalten von DA-Neuronen eine aversive Reaktion und das Lernen direkt auslösen kann. und ob diese Reaktion durch D2R-exprimierende MSNs auf dem indirekten Weg reguliert wird.
In dieser Studie haben wir die optogenetische Kontrolle von DA-Neuronenzündungen in den beiden Verhaltenstests verwendet: dem Dunkelkammer-Präferenztest und dem Dreikammer-CPA-Test. Unsere optogenetische Manipulation zeigte eine effiziente Unterdrückung von DA-Neuronenfeuerungen in der VTA und eine Herabregulierung der DA-Spiegel in der NAc. Unsere genaue optogenetische Inaktivierung von DA-Neuronenzündungen nur während der Zeit, in der sich die Tiere in der konditionierten Kammer aufhielten, löste explizit eine aversive Reaktion und das Lernen aus, was zeigt, dass das vorübergehende DA-Stummschalten direkt zu passivem Vermeidungsverhalten führte. Darüber hinaus hat diese Untersuchung gezeigt, dass die D2R-vermittelte Signalverarbeitung eine entscheidende Determinante für die Induktion dieser aversiven Reaktion und des Lernens ist.
Obwohl unsere Daten zeigten, dass D1R in den Verhaltensexperimenten keine Auswirkung auf die CPA hatte, dokumentierten mehrere Studien, dass ein phasisches Feuern von DA-Neuronen für Angstreaktionen und aversives Lernen erforderlich ist (28, 29). Dieser Unterschied ist auf die experimentelle Einstellung zurückzuführen. Unser optogenetischer Ansatz schloss die Möglichkeit der Signalisierung durch aktivierte DA-Neuronen aus, um aversives Verhalten hervorzurufen, was darauf hinweist, dass die Inaktivierung von DA-Neuronen ausreichend ist, um aversives Verhalten und Lernen zu induzieren. Die Funktion und Signalverarbeitung des aktivierten DA-Feuers, das durch aversive Stimuli hervorgerufen wird, hätte einen anderen Beitrag zu aversivem Verhalten als die hier untersuchten und müssen in der Zukunft geklärt werden.
DA-Neuronen projizieren auch auf verschiedene andere Regionen, einschließlich mPFC, Amygdala und Hippocampus. Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass Optogenetische Aktivierung von lateralen Habenula-Neuronen, die auf DA-Neuronen im VTA projizieren, können aversives Verhalten induzieren, und diese DA-Neuronen zielen hauptsächlich und spezifisch auf die mPFC ab (30), obwohl ihre optogenetische Konditionierung sich von der in unserer aktuellen Studie unterscheidet, da ihre optogenetische Stimulation für eine ganze Konditionierungssitzung verlängert wurde. Es wurde berichtet, dass der dopaminerge Input des mPFC nicht nur durch aversive Stimuli aktiviert wird, sondern auch durch chronischen Stress (31, 32) ist es möglich, dass ihre kontinuierliche Aktivierung von mPFC-projizierenden DA-Neuronen als Signale aus einer stark belastenden Umgebung wahrgenommen wird; und als Folge der Anhäufung einer stressigen Konditionierung würden sich die Tiere gegenüber der konditionierten Kammer aversiv verhalten. Im Gegensatz dazu hemmten wir das Abfeuern von DA-Neuronen nur, während sich die Tiere in der konditionierten Kammer aufhielten. Die Ergebnisse unserer Verhaltensexperimente mit zeitlich angepasster Konditionierung zeigten, dass eine plötzliche Unterdrückung des DA-Signals als plötzliche aversive Eingabe wahrgenommen wird, was zu einer schnellen aversiven Reaktion führt.
DA-Neuronen projizieren auch auf die Amygdala, die Region, die maßgeblich zur Angstreaktion beiträgt. In der Tat ist das Signalisieren der DA an die Amygdala in die Angstreaktion und den Erwerb von Angstgedächtnis verwickelt (33, 34). In unserer Studie identifizierte DA-Neuronen im VTA eine Gruppe von DA-Neuronen, die auf die BLA projizieren, aber der Umfang dieser Projektionen war viel geringer als derjenige, der auf die NAc projiziert wurde. Obwohl wir einen subtilen Effekt von Amygdala-projizierten DA-Signalen auf unser beobachtetes aversives Verhalten nicht ausschließen konnten, sollte der hauptsächliche Effekt unserer optogenetischen Inaktivierung von DA-Neuronen auf die NAc sein, da unsere Experimente mit spezifischem Knockdown der D2R in der NAc dramatisch abnahmen das aversive Verhalten. Zukünftige Untersuchungen, die sich mit zielspezifischer DA-Signalisierung befassen, sind erforderlich, um die Auswirkungen der schaltungsweiten Modifikation von DA-Neuronen auf die aversiven Stimuli und die Angstkonditionierung aufzuklären.
Materialen und Methoden
Themen.
Tyrosinhydroxylase :: IRES-Cre (TH-Cre) Knock-In-Mäuse (EM: 00254) (18) wurden vom European Mouse Mutant Archive erhalten. Alle Versuchstiere wurden seit mehr als 57-Generationen mit dem C6BL / 10J-Stamm rückgekreuzt. Die Mäuse wurden mit den C57BL / 6J-WT-Mäusen verpaart und in einem Standard-12-h-Licht / 12-h-Dunkelzyklus untergebracht und Futter und Wasser nach Belieben gegeben. Cre+ und Cre- Für die Experimente wurden Mäuse aus den gleichen Würfen (3-6, Alter) verwendet. Alle Tierversuche wurden vom Tierausschuss des Osaka Bioscience Institute gemäß den Richtlinien für Tierversuche genehmigt.
Verhaltenstests.
Bei allen Verhaltenstests wurden Mäuse mit einer optischen Faser verbunden und konnten sich im gesamten Gerät bewegen. Die Bewegung der Mäuse wurde überwacht, so dass sie sich auch ohne Hindernisse bewegen konnten, wenn sie mit einem Lichtleiter auf dem Kopf verbunden waren. Die Position einer Maus wurde von einer Videokamera erfasst, die über dem Verhaltensapparat aufgehängt war, und mit einem benutzerdefinierten Programm unter Verwendung der Labview-Software analysiert.
Dunkler Raumpräferenztest.
Das maßgeschneiderte Verhaltensgerät, das im Test verwendet wurde, bestand aus einem dunklen Raum (15 × 9.5 cm) und einem hellen offenen Raum (15 × 11 cm). Der dunkle Raum hatte Wände, einen Boden und ein Dach, die alle schwarz gefärbt waren und einen Eingang (4.5 cm lang) zum offenen hellen Raum hatten. Der offene helle Raum hatte die Form einer Ellipse und hatte einen Metallgitterboden und klare Wände ohne Dach. Vor dem Test wurden alle Mäuse für 10 min im Apparat gewöhnt. Der Test bestand aus drei Sitzungen: In der frühen Hälfte des Tages 1 (Vortest: 5 min) durften Mäuse den gesamten Apparat erkunden. Von der späten Hälfte des Tages 1 bis zum Tag 4 (Konditionierung: 35 Min. Insgesamt) erhielten Mäuse optische Stimulation, wenn sie im dunklen Raum blieben. Am Tag 5 wurde die Dunkelraumpräferenz ohne optische Stimulation getestet (Posttest: 5 min; Abb. S1E).
Dreikammer-CPA-Test.
Die maßgeschneiderte, mit drei Kammern versehene, klimatisierte 3-Kammer-Platzpräferenz- / CPA-Vorrichtung, die im Test verwendet wurde, bestand aus zwei Kammern (10 × 17 cm) und einem Verbindungsgang. Der Test bestand aus drei Sitzungen. Tag 1 (Vortest: 15 min): Die Mäuse durften den gesamten Apparat frei erkunden. Mäuse, die in einer Kammer 1.5-Zeiten länger als in der anderen Kammer waren, wurden vom Test ausgeschlossen. Tage 2 und 3 (Konditionierung: jeweils 15 min): Mäuse erhielten eine optische Stimulation, wenn sie in der Lichtpaar-Kammer blieben. Die Auswahl der Lichtpaarkammer wurde ausgeglichen. Tag 4 (Posttest: 15 min): Der Test wurde unter den gleichen Bedingungen wie im Vortest durchgeführt (Abb. S6A).
In der Konditionierungssitzung wurde die optische Stimulation für 30s gestoppt, wenn die Mäuse ständig im Dunkeln oder in der Lichtpaarkammer über 30s blieben, um eine Überhitzung zu vermeiden. Die Laserleistung wurde in allen Verhaltenstests auf ungefähr 5 mW an der Spitze der optischen Faser gesteuert.
In-vivo-Schnellabtastungs-Voltametrie.
FSCV-Experimente wurden unter Verwendung der in früheren Studien beschriebenen Methode durchgeführt (35-37). Die Mäuse wurden mit einer Ketamin / Xylazin-Mischung wie in beschrieben anästhesiert SI Materialien und Methoden und in einem stereotaktischen Rahmen platziert. In der Nähe der Stimulationselektrode befand sich eine optische Faser, die zum Stimulieren von bogenexprimierenden DA-Neuronen verwendet wurde. Die stimulierende Optrode wurde dann in die VTA platziert (von Bregma: anterior-posterior, -3.2 mm; lateral, 0.5 mm und dorsal-ventral, 3.5 mm) und in 0.25-mm-Intervallen abgesenkt. Eine Kohlefaser-Mikroelektrode (300 µm Länge) für die voltammetrische Aufzeichnung wurde in den NAc abgesenkt (von Bregma: anterior-posterior 1.0 mm; lateral 1.0 mm und dorsal-ventral 3.5 mm). Voltammetrische Messungen wurden alle 100 ms durchgeführt, indem eine Dreieckswellenform (-0.4 V an + 1.3 V an -0.4 V gegen Ag / AgCl bei 400 V / s) an die Kohlefaser-Mikroelektrode angelegt wurde. Ein kundenspezifischer Potentiostat wurde für die Wellenformisolierung und Stromverstärkung verwendet. Die DA-Freisetzung wurde durch elektrische Stimulation von DA-Neuronen unter Verwendung der 24-Impulsstimulation (100 µA, 5 ms Dauer, 30 Hz) hervorgerufen. Eine optische Stimulation von DA-Neuronen (532 nm, ∼5 mW Leistung an der Faserspitze) wurde für 10s 5-Starts vor dem Beginn einer elektrischen Stimulation angewendet. Kohlefaser-Mikroelektroden wurden in einer Lösung mit bekannten Konzentrationen von DA (0.2 µM, 0.5 µM und 1.0 µM) kalibriert. Alle Voltammetriedaten wurden mit Hilfe von Labview- und Matlab-Software in kundenspezifischen Programmen analysiert. Die Reduktion der DA-Spiegel durch optische Stimulation wurde mit der Hauptkomponentenanalyse beseitigt, indem die aus elektrischen VTA-Stimulationen stammenden DA-Wellenformen verwendet wurden, um die Dopaminsignale zu trennen (35, 36).
Statistische Analyse.
Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software) durchgeführt. Die Daten wurden durch wiederholte Messungen der ANOVA (Feigen. 1B, , 4D,4D und Abb. S6 D und E) oder Einweg-ANOVA (Feigen. 1C, , 3D,3D, 4 C und E und Fig. S4 K-M, S6F und S7A) und Post-hoc-Analysen wurden mit dem Bonferroni-Test durchgeführt. Alle Markierungen / Spalten und Balken repräsentierten den Mittelwert bzw. ± SEM.
Andere experimentelle Verfahren, einschließlich Viruspräparation und -injektion, elektrophysiologisches Aufzeichnen sowie immunhistochemische und mRNA-Analyse, sind ausführlich in beschrieben SI Materialien und Methoden.
Anerkennungen
Wir danken E. Boyden für das Arch-Konstrukt, R. Matsui für technische Beratung bei der Produktion und Reinigung von Lentiviren und Y. Hayashi für technische Beratung bei der Programmierung von Datenanalysen. Diese Arbeit wurde von den Forschungsbeihilfen 22220005 (an SN), 23120011 (an SY und SN), 24700339 (an TD) und 25871080 (an SY) des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Medizin unterstützt Technologie aus Japan und ein Stipendium der Takeda Science Foundation (an SN).
Fußnoten
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Dieser Artikel enthält ergänzende Informationen online unter www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
Bibliographie
;
