Dopamin belebt das Belohnungssuchen, indem es die cue-evozierte Erregung im Nucleus Accumbens (2014) fördert

Einleitung

Die Dopaminprojektion vom ventralen tegmentalen Bereich (VTA) zum NAc ist ein wesentlicher Bestandteil des neuronalen Kreislaufs, der das Belohnungsverhalten fördert (Nicola, 2007). Wenn die NAc-Dopamin-Funktion experimentell reduziert wird, ist es weniger wahrscheinlich, dass sich Tiere anstrengen, um eine Belohnung zu erhalten (Salamone und Correa, 2012) und reagieren oft nicht auf prädikative Hinweise (Di Ciano et al., 2001; Yun et al., 2004; Nicola, 2007, 2010; Saunders und Robinson, 2012). Diese Defizite sind auf die Beeinträchtigung einer spezifischen Komponente der Belohnungssuche zurückzuführen: Die Latenzzeit, um das Annäherungsverhalten zu initiieren, ist erhöht, während die Geschwindigkeit der Annäherung, die Fähigkeit, das Ziel zu finden und das erforderliche operante Verhalten, um Belohnung zu verdienen, und die Fähigkeit zu erreichen Verzehr Belohnung sind nicht betroffen (Nicola, 2010). Dopamin muss den Ansatz fördern, indem es die Aktivität von NAc-Neuronen beeinflusst, aber die Art dieses Einflusses bleibt unklar. Große Anteile von NAc-Neuronen werden durch belohnungs-prädikative Hinweise (Nicola et al., 2004a; Roitman et al., 2005; Ambroggi et al., 2008, 2011; McGinty et al., 2013), und die Erregungen beginnen vor dem Beginn des Cue - Annäherungsverhaltens und sagen die Latenz voraus, um die Fortbewegung einzuleiten (McGinty et al., 2013). Daher weist diese Aktivität die erforderlichen Eigenschaften eines dopaminabhängigen Signals auf, das eine gezielte Annäherung fördert. Ob dies jedoch der Fall ist, ist unbekannt.

Neuronen in zwei Strukturen, die glutamaterge Afferenzen an den NAc, den BLA und den dorsalen medialen PFC senden (Brog et al., 1993), sind von belohnungsvorhersagenden Hinweisen begeistert (Schoenbaum et al., 1998; Ambroggi et al., 2008) und reversible Inaktivierung einer dieser Strukturen (Ambroggi et al., 2008; Ishikawa et al., 2008) oder der VTA (Yun et al., 2004) reduziert die Stärke der durch Reize hervorgerufenen Erregungen im NAc. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die durch NAc-Signale hervorgerufenen Erregungen durch glutamaterge Inputs gesteuert werden, aber ohne NAc-Dopamin reichen selbst diese starken erregenden Inputs nicht aus, um durch das Signal hervorgerufene Feueranstiege auszulösen. Diese Schlussfolgerung ist jedoch dürftig. Viele NAc-Neuronen werden durch Signale gehemmt (Nicola et al., 2004a; Ambroggi et al., 2011) und es ist nicht bekannt, ob Erregungen oder Hemmungen für die Aktivierung des Annäherungsverhaltens wichtiger sind. Darüber hinaus könnte die VTA-Inaktivierung die durch diskriminierende Reize (DS) hervorgerufenen Erregungen durch mehrere Dopamin-unabhängige Mechanismen reduzieren: reduzierte Cue-Kodierung im BLA und PFC, die Projektionen vom VTA erhalten (Swanson, 1982); reduziertes Feuern von GABAergen VTA-Neuronen, die zum NAc projizieren (Van Bockstaele und Pickel, 1995); oder verringerte Freisetzung von Glutamat aus dopaminergen Neuronen (Stuber et al., 2010). Schließlich reduziert die VTA-Inaktivierung nicht nur das durch NAc DS hervorgerufene Feuern, sondern auch das durch DS hervorgerufene Annäherungsverhalten (Yun et al., 2004), könnte die DS-Erregung eher eine sekundäre als eine notwendige Bedingung für eine zielgerichtete Bewegung sein.

Um die Rolle von NAc-Dopamin bei der durch Signale hervorgerufenen Zündung direkt zu testen, haben wir eine neuartige Sonde für den Einsatz bei sich verhaltenden Nagetieren entwickelt: eine kreisförmige Elektrodenanordnung, die eine zentrale Injektionskanüle umgibt und die gleichzeitige Aufzeichnung der Zündaktivität der Einheit und die Infusion von Dopaminrezeptor-Antagonisten ermöglicht in den extrazellulären Raum, der die aufgezeichneten Neuronen umgibt (du Hoffmann et al., 2011). Diese Anordnung ermöglicht es uns, Verbindungen zwischen der Dopaminrezeptoraktivierung, dem neuronalen Feuern von NAc und belohnungssuchendem Verhalten herzustellen: Wenn die Blockade von NAc-Dopaminrezeptoren sowohl durch Signale hervorgerufene Signale als auch die Einleitung einer Annäherung hemmt, wäre dies ein starker Beweis dafür, dass die neuronale Reaktion davon abhängt endogenes Dopamin und dass dieses Signal für das Annäherungsverhalten erforderlich ist.

Materialen und Methoden

Tiere.

Fünfzehn männliche Long-Evan-Ratten (275–300 g bei Ankunft) wurden aus Charles River gewonnen und einzeln gehalten. Eine Woche nach ihrer Ankunft wurden die Ratten drei Tage lang täglich mehrere Minuten lang behandelt, um sie an den Experimentator zu gewöhnen. Nach der Gewöhnung erhielten die Ratten eine eingeschränkte Diät von 3 g Rattenfutter pro Tag. Nach Belieben Nach der Operation wurde 7 Tage lang Futter bereitgestellt, danach wurden die Tiere wieder auf die eingeschränkte Diät umgestellt. Die Tierversuche entsprachen dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Albert Einstein College of Medicine genehmigt.

Operative Kammern.

Alle Verhaltensexperimente und Verhaltenstrainings fanden in maßgeschneiderten Plexiglaskammern (40 cm im Quadrat, 60 cm hoch) statt. Diese befanden sich in Metallschränken, die als Faradaysche Käfige dienten; Die Schränke waren mit Akustikschaum ausgekleidet und weißes Rauschen wurde kontinuierlich über einen speziellen Lautsprecher abgespielt, um die Hörbarkeit von Außengeräuschen im Inneren der Kammer zu minimieren. Operantenkammern waren mit einem Belohnungsbehälter an einer Wand und einziehbaren Hebeln auf beiden Seiten davon ausgestattet. Ein Fotostrahl an der Vorderseite des Behälters wurde verwendet, um die Eintritts- und Austrittszeiten des Behälters zu messen. Die zeitliche Auflösung des Verhaltenskontrollsystems (Med Associates) betrug 1 ms.

DS-Aufgabe.

Die Tiere wurden auf die DS-Aufgabe nach ähnlichen Verfahren wie zuvor trainiert (Nicola et al., 2004a,b; Ambroggi et al., 2008, 2011; Nicola, 2010; McGinty et al., 2013). Es wurden jeweils zwei Hinweise präsentiert, entweder ein belohnungsvorhersagender DS oder ein neutraler Reiz (NS). Die akustischen Hinweise bestanden aus einem Sirenenton (dessen Frequenz über 4 ms von 8 auf 400 kHz wechselte) und einem intermittierenden Ton (6-kHz-Ton für 40 ms an, für 50 ms aus); Die Zuordnung eines bestimmten Tons zum DS oder NS wurde bei den Ratten randomisiert. Die Intervalle zwischen den Versuchen (ITIs) wurden zufällig aus einer abgeschnittenen Exponentialverteilung mit einem Mittelwert von 30 s und einem Maximum von 150 s ausgewählt. Die NS wurde immer 10 s lang präsentiert; Hebeldrücke während der NS wurden aufgezeichnet, hatten aber keine programmierte Konsequenz. „Aktive“ und „inaktive“ Hebel wurden zu Beginn des Trainings zufällig den linken und rechten Hebeln jeder Ratte zugewiesen und veränderten sich anschließend nicht. Eine Hebelreaktion am aktiven Hebel während des DS beendete den Hinweis, und der erste nachfolgende Behältereintritt führte zur Abgabe von 10 % Saccharose als Belohnung in eine Vertiefung im Behälter. DS-Präsentationen, bei denen das Tier nicht reagierte, wurden nach 10 s beendet. Reaktionen während des ITI (zwischen den Cue-Präsentationen) und Reaktionen auf den inaktiven Hebel wurden aufgezeichnet, führten jedoch nicht zu einer Belohnungszustellung. Die Tiere wurden auf die DS-Aufgabe trainiert, bis sie in zweistündigen Trainingseinheiten auf >80 % der DSs und <20 % der NSs reagierten.

Kanülierte Mikroelektroden-Arrays.

Nach dem ersten Training wurden den Ratten kanülierte Mikroarrays implantiert, die aus acht Wolfram-Mikrodrahtelektroden bestanden, die eine zentrale Mikroinjektionsführungskanüle umgaben. Diese wurden wie zuvor beschrieben konstruiert und in maßgeschneiderten Mikroantrieben montiert (du Hoffmann et al., 2011). Eine vollständige Drehung der Antriebsschraube im Uhrzeigersinn bewegte die Elektroden und die Kanüle als Einheit um 300 μm nach ventral (ohne Drehung der Sonden), was uns die Aufzeichnung mehrerer einzigartiger Neuronenpopulationen im selben Tier ermöglichte.

Um die kanülierten Arrays zu implantieren, wurden Ratten für die Operation vorbereitet und wie zuvor beschrieben in ein stereotaktisches Instrument gelegt (du Hoffmann et al., 2011; McGinty et al., 2013). Die Anästhesie wurde mit Isofluran (0.5–3 %) eingeleitet und aufrechterhalten. Die Tiere erhielten unmittelbar vor der Operation und 24 Stunden nach der Operation ein Antibiotikum (Baytril). Kanülierte Arrays wurden bilateral in den dorsalen NAc-Kern implantiert (1.4 mm anterior und 1.5 mm lateral vom Bregma und 6.5 mm ventral vom Schädel). Elektroden und Mikroantriebe wurden mit Knochenschrauben und Zahnkunststoff am Schädel befestigt und Drahtobturatoren wurden in die Führungskanülen eingeführt, sodass die Enden der Obturatoren bündig mit den Enden der Führungskanülen waren. Nach der Operation wurde die Kopfhaut mit Neo-Predef behandelt, um eine Infektion zu verhindern, und den Tieren wurde eine Woche Erholung gewährt, bevor sie mit den Experimenten fortfuhren. Zur postoperativen Analgesie erhielten die Tiere 1 mg/kg des nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneimittels Ketoprofen.

Drogen.

SCH23390 und Racloprid wurden von Sigma bezogen. An Testtagen wurden die Medikamente frisch zubereitet, indem sie in 0.9 %iger steriler Kochsalzlösung gelöst wurden. Die Arzneimittel wurden in Dosen von 1.1 μg SCH233390 in 0.55 μl Kochsalzlösung pro Seite und 6.4 μg Racloprid in 0.8 μl Kochsalzlösung pro Seite verabreicht. SCH233390 und Racloprid wurden über 12 bzw. 17.5 Minuten infundiert. In Pilotversuchen stellten wir fest, dass bilaterale Racloprid-Infusionen über eine Dauer von 12 Minuten signifikante, aber vorübergehende Auswirkungen auf das DS-Antwortverhältnis hatten. Um die Wirkung zu verlängern, verlängerten wir daher die Dauer der Racloprid-Infusion, sodass das zeitliche Profil seiner pharmakologischen Wirkungen dem von SCH23390 ähnelte. Pro Aufnahmesitzung (eine Sitzung pro Tag) wurde nur eine bilaterale oder einseitige Injektion durchgeführt. Alle Tiere erhielten mindestens eine einzige bilaterale Injektion eines Antagonisten und eine (oder mehrere) einseitige Antagonisteninjektionen. Während einiger Experimente mit einseitigen Antagonisten infundierten wir gleichzeitig Kochsalzlösung als Vehikelkontrolle kontralateral zur Hemisphäre, die den Antagonisten erhielt.

Mikroinjektions- und Aufzeichnungsverfahren.

Das Gerät zur gleichzeitigen Mikroinjektion und Aufzeichnung wurde bereits beschrieben (du Hoffmann et al., 2011). Das von der Kopfstufe ausgehende Aufzeichnungskabel endete in einem 24-kanaligen elektrischen Kommutator mit zentraler Bohrung (Moog), der die Signale an das elektrophysiologische Aufzeichnungssystem weiterleitete. Zwei Spritzen wurden in einer einzelnen Spritzenpumpe außerhalb der Kammer montiert; Flüssigkeitsleitungen von den Spritzen führten zu einem Zweikanal-Flüssigkeitsdrehgelenk (Instech Laboratories), das über dem Kommutator montiert war. Flüssigkeitsleitungen führten vom Drehgelenk durch das Bohrloch des Kommutators, verliefen entlang des Aufzeichnungskabels und endeten an zwei 33-Gauge-Mikroinjektoren.

Vor der Aufnahmesitzung wurden die Mikroinjektoren mit Arzneimittellösung aufgefüllt und dann in die Führungskanülen des Tieres eingeführt. Die Mikroinjektorspitzen ragten 0.5 mm über die Führungskanülen hinaus, sodass sich die Spitze des Mikroinjektors unterhalb der Elektrodenspitzen und etwa 670 μm von der Mitte jeder Elektrode entfernt befand. Vor dem Nachfüllen mit Arzneimittel wurden die Flüssigkeitsleitungen und Mikroinjektoren mit Mineralöl gefüllt und der Füllstand der Öl-Wasser-Grenzfläche zur Erleichterung markiert Post-hoc- Bestätigung, dass das Medikament injiziert wurde. Schließlich wurde der Kopftisch mit dem Tier verbunden und die Flüssigkeitsleitungen fest am Aufzeichnungskabel befestigt, um die Mikroinjektoren für die Dauer des Experiments an Ort und Stelle zu halten. Auf diese Weise vorbereitete Tiere durften die DS-Aufgabe für einen Basiszeitraum von mindestens 45 Minuten ausführen, während der die neuronale Aktivität aufgezeichnet wurde; Anschließend wurde die Spritzenpumpe aus der Ferne eingeschaltet, um die Medikamente in das Gehirn zu injizieren. Für die Injektion war keine Handhabung des Tieres oder Öffnen der Kammertür erforderlich, und die Verhaltenssitzung wurde während der gesamten Baseline-, Infusions- und Postinfusionsperiode ununterbrochen fortgesetzt.

Neuronale Spannungssignale wurden mit einem Kopfstufenverstärker (Verstärkung eins) aufgezeichnet, 10,000-fach verstärkt und mit kommerzieller Hardware und Software (Plexon) digitalisiert. Wir haben 379 Neuronen in 38 Aufzeichnungs-/Injektionssitzungen bei 15 Ratten aufgezeichnet. Von den 38 Sitzungen wurden 7 aufgrund schlechten Verhaltens während der Basisperiode vor der Injektion oder weil keine Neuronen zuverlässig isoliert werden konnten, verworfen. Daher konzentrierte sich unsere neuronale Analyse auf 31 Aufzeichnungs-/Injektionssitzungen, in denen wir 322 gut isolierte Neuronen in 12 Ratten aufzeichneten. Nach jeder Aufzeichnungs-/Injektionssitzung wurde der Mikroantrieb mit den Elektrodenanordnungen um ca. 150 μm vorgeschoben (eine halbe Umdrehung der Mikroantriebsschraube), um die Elektroden nach ventral zu bewegen und von einer neuen Neuronenpopulation aufzuzeichnen. Wenn nur wenige (oder keine) Neuronen beobachtet wurden, wurde das Array jeden zweiten Tag weiterbewegt, bis Neuronen erkannt wurden.

Analysis.

Die Daten wurden in Vorinjektions-, Nachinjektions- und Erholungszeiträume unterteilt, die jeweils als 45 Minuten vor der Infusion der Antagonisten, 40 Minuten ab dem Ende der Injektion und die letzten 33 Minuten (2000 Sekunden) definiert wurden jede Sitzung (die insgesamt 2–3 Stunden dauerte). Die Zeit nach der Injektion entspricht der Zeit, in der die Medikamente bei bilateraler Injektion ihre größten Verhaltenseffekte entfalten (Abb.. 1C).

 

Abbildung 1.

Auswirkungen von Dopaminrezeptorantagonisten auf das DS-gesteuerte Annäherungsverhalten. A, Schematische Darstellung der DS-Aufgabe. B, Median (Punkt) und mittlere Quartile (vertikale Linien) der DS- (orange) und NS- (blau) Antwortverhältnisse im Zeitraum vor der Injektion für alle Verhaltenssitzungen ...

Die Isolierung einzelner Einheiten wurde offline mit dem Offline Sorter (Plexon) unter Verwendung der Hauptkomponentenanalyse durchgeführt. In die nachfolgenden Analysen wurden nur Geräte mit klar definierten Wellenformen (>100 μV) einbezogen, die sich deutlich vom Rauschpegel (<20–50 μV) unterschieden. Interspike-Intervallverteilungen und Kreuzkorrelogramme wurden verwendet, um sicherzustellen, dass einzelne Einheiten gut voneinander und vom Hintergrundrauschen isoliert waren (Neural Explorer-Software; Nex-Tech). Zeitstempel verifizierter Spitzen wurden mit benutzerdefinierten Routinen in der R-Softwareumgebung analysiert. Peristimulus-Zeithistogramme, die um DS und NS herum in 50-ms-Zeitintervallen erstellt wurden, wurden verwendet, um durch Reize hervorgerufene Erregungen zu quantifizieren und zu erkennen Figuren 2A, , 3,3, , 4,4, , 55A, , 66A, , 77A, , 88A und Und1010A-C. Um festzustellen, ob ein Neuron eine signifikante durch DS hervorgerufene Erregung aufwies, wurde die Poisson-Wahrscheinlichkeitsverteilungsfunktion für die 10-s-Basisperiode vor jedem Hinweis berechnet. Ein Neuron galt als DS-erregt, wenn es durchschnittliche Spitzenzahlen oberhalb des oberen 99 %-Konfidenzintervalls der Verteilung der Basisfeuerraten in einem oder mehreren 50-ms-Bins zwischen 50 und 200 ms nach Beginn des Signals aufwies. Für Neuronen mit signifikanten durch DS hervorgerufenen Erregungen in der Basisperiode vor der Injektion wurde für jede Periode in jeder Sitzung die durchschnittliche Feuerrate in 50-ms-Bins ermittelt, die an den DS- und NS-Beginn gebunden waren, und der Durchschnitt und der Median (Feigen. 2C – E, , 55A, , 66A, , 77A, , 88A, , 1010B,C) wurden die Feuerraten verschiedener Neuronen verglichen. Da Neuronen mit statistisch nachweisbarer NS-Erregung fast ausnahmslos auch durch die DS erregt wurden [nicht gezeigt, aber zuvor berichtet (Ambroggi et al., 2011)] analysierten wir die NS-Reaktionen für alle Neuronen mit einer signifikanten DS-Reaktion. Sofern nicht anders angegeben, wurden für alle statistischen Vergleiche Wilcoxon-Rangsummentests innerhalb des Neurons verwendet.

 

Abbildung 2.

Durch DS hervorgerufene Erregungen sagen nachfolgendes belohnungssuchendes Verhalten voraus und kodieren die Nähe zum Hebel. A, Durchschnittliche Peri-Event-Zeithistogramme vor der Injektion, ausgerichtet auf den Beginn des DS (orangefarbene Kurve) oder NS (blaue Kurve) für 145 Neuronen mit signifikanter Erregung ...

 

Abbildung 3.

Beispielneuronen zeigen, dass D1- und D2-Antagonisten die durch DS hervorgerufene Erregung reduzieren. Raster und entsprechende Histogramme zeigen das Feuern von vier verschiedenen DS-erregten Neuronen, die auf den Beginn des DS ausgerichtet sind. Die Daten stammen aus den letzten 40 Versuchen unmittelbar vor dem Start ...

 

Abbildung 4.

Die Auswirkungen der bilateralen Dopaminantagonisten-Injektion auf die durch Reize hervorgerufene Erregung sagen die Verhaltenseffekte auf einer Versuchsbasis voraus. A, C, Versuch-für-Versuch-Analyse der neuronalen Kodierung der Latenzzeit der Ratte, um den Hebel für die gleichen gezeigten Neuronen zu erreichen ...

 

Abbildung 5.

Für die durch DS hervorgerufene Erregung ist die Aktivierung des D1-Rezeptors erforderlich. A, Peri-Ereignis-Zeithistogramme ausgerichtet auf DS-Beginn für Neuronen mit signifikanter DS-induzierter Erregung in der Zeit vor der Injektion. Spuren und Wolken zeigen die durchschnittliche ±SEM-Feuerrate an ...

 

Abbildung 6.

Die Aktivierung des D2-Rezeptors ist für die durch DS hervorgerufene Erregung erforderlich. A, Peri-Ereignis-Zeithistogramme, abgestimmt auf den DS-Beginn für Neuronen mit signifikanter DS-induzierter Erregung im Zeitraum vor der Racloprid-Injektion. Durch DS hervorgerufene Erregungen wurden durch bilaterale Maßnahmen reduziert ...

 

Abbildung 7.

Für eine NS-induzierte Erregung ist keine Aktivierung des D1-Rezeptors erforderlich. A, Peri-Ereignis-Zeithistogramme, abgestimmt auf den NS-Beginn für Neuronen mit signifikanter DS-induzierter Erregung in der Zeit vor der Injektion. Diese Populationen überlappen vollständig, also die gleichen Neuronen ...

 

Abbildung 8.

Die Aktivierung des D2-Rezeptors ist für die durch NS hervorgerufene Erregung erforderlich. A, Peri-Ereignis-Zeithistogramme, abgestimmt auf den NS-Beginn für Neuronen mit signifikanter DS-induzierter Erregung in der Zeit vor der Injektion. Die NS-Erregung war im bilateralen und ipsilateralen Zustand reduziert ...

 

Abbildung 10.

Die Infusion von Kochsalzlösung hat keinen Einfluss auf die durch DS oder NS hervorgerufene Erregung und zur Aufrechterhaltung der Grundfeuerraten ist weder eine D1- noch eine D2-Rezeptoraktivierung erforderlich. A, Einzelnes DS-erregtes Neuron, aufgezeichnet während der Infusion von Kochsalzlösung. Die Konventionen sind mit diesen identisch ...

Aussichten für Figure 4Wir haben von Versuch zu Versuch festgestellt, ob die Auswirkungen der bilateralen Antagonisteninjektion auf die Latenzzeit bis zum Erreichen des Hebels mit den Auswirkungen der Antagonisten auf das Ausmaß der durch DS hervorgerufenen Erregung korrelieren. Zunächst berechneten wir die durchschnittliche Feuerrate von 100 bis 400 ms nach DS-Beginn in jedem Versuch für alle aufgezeichneten Neuronen, die vor der bilateralen Infusion der Antagonisten eine signifikante DS-Erregung zeigten. Als nächstes berechneten wir für jedes Neuron den Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman, indem wir die Größe der durch DS hervorgerufenen Erregung von Versuch zu Versuch und die Latenzzeit der Ratte, den Hebel bei entsprechenden Versuchen zu erreichen, verglichen. Diese Korrelationen wurden in Histogrammen dargestellt Figure 4B,D. Alle DS-Studien wurden in diese Analyse einbezogen; Wenn das Tier den Hebel nicht drückte, wurde diesem Versuch eine Latenz von 10 s (die maximale Länge der Signalpräsentation) zugewiesen. Wir haben diese Korrelationskoeffizienten für den Zeitraum vor der Einspritzung wie oben definiert berechnet; Wir haben den Zeitraum nach der Injektion um 1000 s verlängert, um eine breitere Stichprobe von Latenzen bei Versuchen zu erhalten, bei denen die Tiere nach bilateraler Infusion reagierten. Um die Signifikanz der einzelnen Korrelationen zu beurteilen, verwendeten wir eine zweiseitige Asymptotik t-Näherung, weil eine exakte p Der Wert kann nicht berechnet werden, wenn in den Rangdaten Unentschieden vorhanden sind. Dann verwendeten wir gepaarte Wilcoxon-Tests, um die Mediane der Verteilungen der Korrelationskoeffizienten vor und nach der Antagonisteninfusion zu vergleichen.

Da NAc-Neuronen niedrige Basisfeuerungsraten aufweisen und die unteren Grenzen des Konfidenzintervalls sehr oft über Null liegen, sind Hemmungen weitaus schwieriger zu erkennen und zu quantifizieren als Erregungen. Daher verwendeten wir zusätzlich zu dem oben beschriebenen Verfahren, das zur Erkennung der Erregung verwendet wurde, auch die ROC-Analyse (Receiver Operating Characteristic), eine empfindlichere Methode, um die Wahrscheinlichkeit zu quantifizieren, dass die Feuerrate in aufeinanderfolgenden 50-ms-Zeitintervallen nach dem Einsetzen des Signals auftritt unterschied sich von der Feuerrate in der 10-s-Precue-Grundlinie. Diese Analyse wurde getrennt für die Zeiträume vor und nach der Einspritzung durchgeführt. Für jeden Abschnitt haben wir die Fläche unter der ROC-Kurve (AUC) berechnet. AUC-Werte von 0.5 weisen auf keinen Unterschied zum Precue-Feuer hin, wohingegen Werte näher bei 0 oder 1 auf eine größere Wahrscheinlichkeit hinweisen, dass das Neuron gehemmt bzw. erregt ist. Um die Postcue-Neuronenaktivität in der gesamten Population aufgezeichneter Neuronen unvoreingenommen darzustellen, wurden Feuerraten und AUC-Werte für 50-ms-Bins berechnet. Um die Daten zu glätten, wurden die Bins für aufeinanderfolgende AUC-Berechnungen um 10 ms vorgerückt. Die geglätteten AUC-Werte wurden dann als Wärmekarten mit einer Auflösung von 10 ms dargestellt (wobei jeder Wert die AUC in den nächsten 50 ms darstellt). Figuren 5B, , 66B, , 77B, , 88B und Und1010D,E.

Als nächstes haben wir quantifiziert, ob die in nicht überlappenden 50-ms-Bins berechneten AUC-Werte einen signifikanten Unterschied beim Feuern widerspiegeln. Für jeden Bin haben wir zunächst 10,000 Bootstrapping-AUC-Werte aus zufälligen Mischungen der Precue-Basislinienfeuerrate und der Feuerrate im entsprechenden Postcue-Bin generiert. Anschließend haben wir die zweiseitige Wahrscheinlichkeit ermittelt, dass der tatsächliche AUC-Wert aus der Verteilung der Bootstrapping-Werte ermittelt wurde. Wenn die Wahrscheinlichkeit <0.05 war, gingen wir davon aus, dass sich das Abfeuern im Behälter deutlich von der Precue-Grundlinie unterscheidet. Schließlich haben wir die Anzahl der Neuronen gezählt, deren Feuerungsraten in jedem Bin deutlich größer oder kleiner als die Precue-Basislinienfeuerung waren, und diese Werte als Anteile der Gesamtpopulation grafisch dargestellt (Feigen. 5C, , 66C, , 77C, , 88C, , 99B,D, , 1010F,G).

 

Abbildung 9.

Die neuronale Aktivität, die auf den Eintritt in das Belohnungsgefäß ausgerichtet ist, wird durch die ipsilaterale oder kontralaterale Injektion von D1- oder D2-Antagonisten nicht beeinflusst. A, C, ROC-AUC-Werte werden wie in beschrieben berechnet und angezeigt Figure 5B, außer dass die Zeitintervalle länger (200 ms) und ausgerichtet sind ...

Um die Anteile der in den Zeiträumen vor und nach der Injektion angeregten oder gehemmten Neuronen zu vergleichen, verwendeten wir einen Datenreduktionsansatz. Zuerst berechneten wir den Anteil der 50-ms-Bins zwischen 0 und 1 s nach Beginn des Signals, in denen jedes Neuron eine signifikante Erregung oder Hemmung zeigte. Als nächstes verglichen wir diese Anteile in den Zeiträumen vor und nach der Injektion mit einem gepaarten Wilcoxon-Test. Neuronen, die in keinem Bin sowohl vor als auch nach der Injektion eine signifikante Modulation zeigten, wurden von dieser Analyse ausgeschlossen und nicht in die Diagramme einbezogen, die den mittleren Anteil signifikanter Bins zeigen (Punkt- und Whisker-Plots auf der rechten Seite jedes Teils in). Feigen. 5C, , 66C, , 77C, , 88C, , 1010F,G). Dieses Verfahren eliminierte den Einfluss der großen Neuronenpopulation, ohne dass sich die Aktivität zwischen dem Post-DS-Fenster und der Prä-DS-Basislinie unterschied; Diese Population ist von geringem Interesse, trägt jedoch eine große Anzahl von Nullwerten bei, die die mittlere Anzahl signifikanter Klassen in Richtung 0 verschieben und sowohl Abnahmen als auch Zunahmen im Anteil signifikanter Klassen nach der Infusion verschleiern.

Ähnliche Analysen wurden für verbrauchsbedingte Schüsse nach Eintritt in das Belohnungsgefäß durchgeführt. Die Tiere blieben tendenziell länger als 5 Sekunden im Behälter. Um diese relativ langen Zeitintervalle zu erfassen, zeigen wir die Ergebnisse daher mit 200-ms-Bins (Abb.. 9). Das Zeitfenster für den Vergleich der Anteile von Neuronen, die in den Zeiträumen vor und nach der Injektion erregt wurden, betrug 0 bis 1.5 s, während es für Hemmungen 0 bis 5 s betrug; Für Anregungen wurde ein kürzeres Analysefenster verwendet, da diese tendenziell transienter waren. ROC-Analysen wurden auf dem High Performance Computing Cluster des Albert Einstein College of Medicine unter Verwendung des pROC-Pakets für R durchgeführt.

Um die „Grundlinien“-Feuerraten zu vergleichen, die außerhalb von Aufgabenereignissen auftreten, haben wir die durchschnittliche Feuerrate in 10-s-Bins vor jeder DS-Vorinjektion und -Nachinjektion der Antagonisten verglichen. Dieses Verfahren ist funktionell äquivalent zu einer Zufallsstichprobe der Grundfeuerraten, da DSs zu jedem Zeitpunkt einer Verhaltenssitzung mit nahezu gleicher Wahrscheinlichkeit präsentiert werden. Neuronen wurden danach klassifiziert, ob sie eine signifikante durch DS hervorgerufene Erregung aufwiesen (vor der Arzneimittelinfusion) oder nicht, und dann wurden die Basisfeuerungsraten in den Zeiträumen vor und nach der Injektion innerhalb dieser Gruppen mit einem gepaarten Wilcoxon-Test verglichen (Abb.. 10H,I). Wir haben auch eine lineare Anpassung für DS-erregte Neuronen durchgeführt und die Steigung dieser Linie mit der Einheitslinie (Steigung von 1) verglichen.

Wenn mehrere Vergleiche mit Teilmengen von Daten durchgeführt wurden, die von demselben Subjekt stammten (Feigen. 2C – E, , 55A,C, , 66A,C, , 77A,C, , 88A,C, , 99B,D, , 1010B,C,F,G), p Werte wurden Bonferroni-korrigiert; dh, die p Der Wert wurde mit der Anzahl der durchgeführten Vergleiche multipliziert. Korrigiert p Werte wurden als signifikant angesehen, wenn p < 0.05. Alle Korrekturen wurden mit dem Faktor 3 vorgenommen, außer Figure 2C – E, wobei der Faktor 2 war.

Videoverfolgung.

In einer Untergruppe von Experimenten wurde die Position der Ratte mithilfe einer Overhead-Kamera (30 Bilder/s) und einem computergestützten Trackingsystem (Cineplex; Plexon) gemessen. Das System verfolgte die x und y Positionen von zwei unterschiedlich farbigen LEDs, die an der Aufnahmekopfbühne angebracht sind. Wie zuvor beschrieben (McGinty et al., 2013) haben wir einen Schwerpunkt berechnet, der den Mittelpunkt zwischen den LED-Positionen für jedes Videobild beschreibt. Fehlende Datenpunkte in bis zu 10 aufeinanderfolgenden Bildern wurden durch lineare Interpolation aufgefüllt; In den seltenen Fällen, in denen mehr als 10 Frames fehlten, wurden die Daten verworfen. Für jedes Videobild haben wir die SD der Abstände zwischen der Schwerpunktposition in diesem Bild und in einem Zeitfenster von ±200 ms berechnet. Diese SD-Messungen bilden den Bewegungsindex (LI) für diesen Frame des Videos. Logarithmisch transformierte LIs waren bimodal verteilt, wobei ein unterer Peak Epochen mit geringer oder keiner Bewegung darstellte und ein oberer Peak Fortbewegung darstellte (Drai et al., 2000). Anschließend haben wir zwei Gaußsche Funktionen an die Verteilung der LIs angepasst und die Bewegungsschwelle als den Punkt bestimmt, an dem sich diese Funktionen am wenigsten überlappten.

Bewegungen wurden als mindestens acht aufeinanderfolgende Frames mit LIs über der Bewegungsschwelle definiert. Um den Zeitpunkt des Beginns der Bewegung zu bestimmen, beschränkten wir die Analyse auf DS-Versuche, in denen sich das Tier noch beim Beginn des Signals befand, und berechneten dann die Latenz zwischen dem Beginn des Signals und dem ersten Frame, in dem der LI die Bewegungsschwelle überschritt (Feigen. 1D-F, , 22B,D). Wenn bei einem Versuch keine erkennbare Bewegung gemessen wurde, wurde die Latenz bei diesem Versuch als >10 s definiert (die Länge der Cue-Präsentation, Abb.. 1D). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn solche Versuche in der Analyse weggelassen wurden (Daten nicht gezeigt). Die DS-basierten Bewegungslatenzverteilungen wurden dann über die Ratten hinweg zusammengefasst und die Mediane mit einem Wilcoxon-Test verglichen. Um die Latenzzeit bis zur maximalen Geschwindigkeit und die mittlere Geschwindigkeit DS-gesteuerter hebelgesteuerter Bewegungen zu quantifizieren, verwendeten wir alle Versuche, die mit einem Hebeldrücken endeten, selbst wenn sich die Ratte zu Beginn des DS bewegte (Abb.. 1E,F).

Histologie.

Die Tiere wurden mit Euthasol tief anästhesiert und intrakardial mit Kochsalzlösung und 4 % Formalin perfundiert. Gleichstrom (15 μA) wurde ca. 30 s lang durch jede der Elektroden in den Arrays geleitet, um Läsionen zu erzeugen. Die Gehirne wurden entnommen und bis zur Verarbeitung in Formalin gelagert. Vor dem Schneiden mit einem Kryostat wurden die Gehirne mehrere Tage lang durch Eintauchen in 30 % Saccharose kryogeschützt. Schnitte (50 μm) wurden auf Nissl-Substanz gefärbt, um Kanülen- und Elektrodenspuren und Läsionen sichtbar zu machen (Abb.. 11).

 

Abbildung 11.

Histologische Rekonstruktion der Injektionsstellen des Antagonisten. Die Abbildung zeigt zwei koronale Abschnitte des Rattenhirns, die den Großteil der anterior-posterioren Ausdehnung des NAc umfassen (0.8 mm–2.8 mm vor dem Bregma). Schwarze Punkte repräsentieren ...

Die Ergebnisse

Wir präsentierten Ratten zwei Hörreize in variablen Abständen von durchschnittlich 30 s: einen belohnungsvorhersagenden DS und einen NS (Abb.. 1A; Nicola et al., 2004a,b; Ambroggi et al., 2008, 2011; McGinty et al., 2013). Durch Drücken des Hebels während des DS wurde der Hinweis beendet, und beim Eintritt in den Belohnungsbehälter wurde ein Tropfen Saccharose abgegeben. Wenn die Tiere nicht innerhalb von 10 s reagierten, wurde der Hinweis ohne Belohnungsabgabe beendet und das Intervall zwischen den Versuchen begann. Reaktionen während dieses Intervalls und während der NS hatten keine programmierten Konsequenzen. NSs waren immer 10 s. Trainierte Tiere, die auf die meisten DSs, aber nur wenige NSs reagierten (Abb.. 1B), wurden mit kanülierten Arrays gezielt auf den NAc-Kern implantiert. Während der Experimente führten die Tiere die Aufgabe zunächst 45 Minuten lang vor der Injektion durch, während der die neuronale Aktivität von NAc aufgezeichnet wurde. Als nächstes wurde der D1-Rezeptorantagonist SCH23390 oder der D2/3-Antagonist Racloprid bilateral oder unilateral in das NAc infundiert; Die Tiere blieben während der gesamten Infusion und für mindestens 75 Minuten danach in der Kammer und hatten Aufgabenkontingente in Kraft.

Im Einklang mit früheren Studien (Yun et al., 2004; Nicola, 2010) reduzierten bilaterale Infusionen beider Antagonisten in den NAc-Kern den Anteil der DSs, auf die das Tier reagierte, signifikant (Abb.. 1C, dunkelgraue Spuren) und erhöhte die Latenz bis zur Einleitung der Fortbewegung, gemessen durch Videoverfolgung in einer Untergruppe von Sitzungen (Abb.. 1D, graue gestrichelte Spuren). Im Gegensatz dazu hatten einseitige Infusionen der gleichen Dosen keinen Einfluss auf das DS-Antwortverhältnis (Abb.. 1C, hellgraue Spuren), Latenz bis zur Bewegungsinitiierung nach DS-Beginn (Abb.. 1D, gestrichelte hellorangefarbene Linien) und Latenz bis zum Erreichen des Hebels oder Bewegungsgeschwindigkeit bei Hebelannäherungen (Abb.. 1E,F). Diese Verhaltensdaten zeigen, dass NAc-Dopamin in einer einzelnen Hemisphäre ausreicht, um das Verhalten aufrechtzuerhalten, auch wenn die Blockierung der D1- oder D2/3-Rezeptoren in beiden Hemisphären die Reaktionsfähigkeit stark beeinträchtigt. Diese Dissoziation bietet einen entscheidenden experimentellen Vorteil, da sie es uns ermöglicht, die Auswirkungen von Dopaminantagonisten auf die neuronale Aktivität zu testen, wenn das Verhalten beeinträchtigt ist (bilaterale Injektion) und wenn dies nicht der Fall ist (einseitige Injektion), wodurch die mögliche Verwechslung durch beobachtete Veränderungen ausgeschlossen wird in der neuronalen Aktivität nach der Antagonisteninfusion sind sekundär zu Verhaltensänderungen.

Wir zeichneten 322 NAc-Neuronen in 31 Aufzeichnungs-/Injektionssitzungen bei 12 Ratten auf. Ungefähr 45 % der aufgezeichneten Neuronen wurden durch die DS-Präsentation signifikant angeregt. Diese Anregungen zeigten ähnliche Eigenschaften wie die zuvor berichteten (Yun et al., 2004; Nicola et al., 2004a; Ambroggi et al., 2011; McGinty et al., 2013; Morrison und Nicola, 2014): Sie waren größer als die von NSs hervorgerufenen (Abb.. 2A); Sie begannen mit einer kurzen Latenzzeit nach dem Einsetzen des Signals (ca. 120 ms) und traten vor dem Beginn der hebelgesteuerten Bewegung auf (Abb.. 2B); und ihre Größe korrelierte mit der Wahrscheinlichkeit einer Verhaltensreaktion, der Latenz der Bewegungsinitiierung und der Nähe zum Hebel (McGinty et al., 2013; Abb.. 2C – E).

Die bilaterale Infusion des D1- oder D2/D3-Antagonisten führte zu einer starken Verringerung der Stärke der durch DS hervorgerufenen Erregung. Wie in zwei Beispielneuronen gezeigt (Abb.. 3A,C), war dieser Effekt in den Minuten unmittelbar nach der Infusion am stärksten ausgeprägt, was der maximalen Verringerung des durch die Injektionen hervorgerufenen Annäherungsverhaltens entspricht (Abb.. 3A,C, blaue Raster und Histogramme). Als sich der Verhaltenseffekt erholte, erholte sich auch die Schussreaktion (Abb.. 3A,C, schwarze Raster und Histogramme). Dieses Ergebnismuster war bei allen durch Reize angeregten Neuronen konsistent (Feigen. 5A, , 66A, Bilaterale Histogramme und Whisker-Plots). Die Hypothese, dass diese Erregungen die Stärke der Annäherungsbewegung des Hebels bestimmen, wird dadurch gestützt, dass die Größe der durch den Reiz hervorgerufenen Erregung während der Zeit vor der Injektion die Latenzzeit des Tieres bis zum Erreichen des Hebels vorhersagte (Abb.. 4A,C, links). Nach bilateraler D1- oder D2-Antagonisten-Injektion waren diese Latenzen deutlich zu höheren Werten verschoben, oft so hoch, dass es innerhalb der 10-s-Cue-Präsentation überhaupt keine Reaktion gab (Abb.. 4A,C, linke und rechte Latenzverteilung). Bemerkenswerterweise konnte die Stärke der Verhaltensreaktion während der Postinjektions- und Erholungsperioden, obwohl das durch den Reiz hervorgerufene Feuern durch die Antagonisten reduziert wurde, weiterhin vorhergesagt werden (Abb.. 4A,C, rechte Rasterdiagramme). Diese Beobachtung weist darauf hin, dass die verhaltensbezogenen und neuronalen Wirkungen des Arzneimittels von Versuch zu Versuch miteinander korrelierten: Je stärker die durch einen Dopaminantagonisten verursachte Verringerung der Ausschüttung, desto größer die Latenzzeit bis zum Erreichen des Hebels und desto geringer die Wahrscheinlichkeit, dass der Dopaminantagonist die Wirkung des Arzneimittels auf das Gehirn auslöst Tier überhaupt den Hebel erreicht hat.

Um die Konsistenz dieser Korrelation von Versuch zu Versuch zu beurteilen, haben wir für jedes durch einen Reiz angeregte Neuron die Spearman-Rangkorrelation zwischen der Stärke der Erregung und der Latenzzeit bis zum Drücken des Hebels berechnet. Wir haben Versuchen, bei denen es keine Reaktion gab, eine Latenz von 10 s zugewiesen; Die Latenz lag bei diesen Versuchen daher auf dem höchsten Rang. (Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Versuche ohne eine DS-gesteuerte Hebelreaktion aus der Analyse weggelassen wurden; Daten nicht gezeigt.) Als wir die Korrelationskoeffizienten in der Zeit vor der Injektion mit denen in der kombinierten Zeit nach der Injektion/Erholung verglichen, stellten wir fest, dass fast alle der Koeffizienten waren in beiden Zeiträumen negativ. Darüber hinaus hatten die Antagonisten entweder keinen signifikanten Einfluss auf den Mediankoeffizienten oder verschoben die Verteilung in Richtung noch negativerer Werte (Abb.. 4B,D). Daher kann nicht nur die Population von durch Reize erregten Neuronen zuverlässig die Verhaltensreaktionslatenz vorhersagen, sondern auch die durch einen Antagonisten bei einem bestimmten Versuch verursachte Erhöhung der Reaktionslatenz wird zuverlässig durch die Auswirkungen des Antagonisten auf die durch Reize hervorgerufene Erregung bei diesem Versuch vorhergesagt. Diese Ergebnisse liefern starke Beweise für eine kausale Rolle von endogenem Dopamin bei der Festlegung der Stärke der belohnungssuchenden Reaktion auf den Hinweis: Dopamin erhöht die durch den Hinweis hervorgerufene Erregung von NAc-Neuronen, was wiederum zu einer Annäherung an den Hebel mit kurzer Latenz führt.

Eine alternative Interpretation dieser Ergebnisse besteht darin, dass eine verringerte, durch Signale hervorgerufene Erregung eine Folge einer verringerten Verhaltensreaktion ist – möglicherweise, weil die Erregung lediglich die Verhaltensreaktion verfolgt (oder antizipiert), aber nicht ursächlich für sie ist. Wenn dies der Fall wäre, sollte die Anwendung der Antagonisten in einer Weise, dass sie das Verhalten nicht beeinflussen, nicht zu einer Verringerung der durch Reize hervorgerufenen Erregung führen. Wie jedoch in zwei Beispielneuronen gezeigt wird (Abb.. 3B,D) reduzierte eine einseitige Injektion eines D1- oder D2/D3-Antagonisten deutlich das Ausmaß der durch Signale hervorgerufenen Erregung, obwohl einseitige Injektionen die Verhaltensleistung nicht veränderten. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Mittelung über durch Reize hervorgerufene Erregungen erzielt, die im injizierten NAc aufgezeichnet wurden (Feigen. 5A, , 66A, Ipsilaterale Histogramme); Darüber hinaus zeigen die Durchschnittsdaten, dass durch Reize hervorgerufene Erregungen in Neuronen, die im NAc kontralateral zur Injektion aufgezeichnet wurden, unbeeinflusst blieben (Feigen. 5A, , 66A, kontralaterale Histogramme). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Verringerung der durch Signale hervorgerufenen Erregung ipsilateral zu den Injektionen auf kleine Unterschiede in der Verhaltensreaktionswahrscheinlichkeit zurückzuführen war, wiederholten wir die Analyse, nachdem wir alle Versuche ausgeschlossen hatten, in denen das Tier keine Hebeldruckreaktion ausführte; ähnliche Ergebnisse wurden erhalten (Daten nicht gezeigt; p < 0.05 für D1- und D2-Antagonisten, Wilcoxon). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch den Antagonisten induzierte Verringerung der durch Reize hervorgerufenen Erregung wahrscheinlich keine Folge einer beeinträchtigten Verhaltensleistung ist.

Obwohl die zeitlichen Eigenschaften der durch ein Signal hervorgerufenen Erregung in allen Neuronen recht ähnlich waren, waren die Hemmungen nach dem Einsetzen des Signals vielfältiger und zeigten typischerweise einen späteren Beginn und weniger stereotype Zeitverläufe als Erregungen (Feigen. 5B, , 66B). Analysen von Hemmungen (und in gewissem Maße auch Erregungen), die sich auf ein einzelnes Zeitfenster konzentrieren, können daher einen erheblichen Teil des Signals übersehen. Darüber hinaus können standardmäßige statistische Erkennungsmethoden Rückgänge aufgrund sehr niedriger Basalfeuerraten, einschließlich der vieler NAc-Neuronen, nicht konsistent identifizieren. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir einen umfassenderen Ansatz gewählt, bei dem wir für 50-ms-Postcue-Zeit-Bins in jedem aufgezeichneten Neuron die ROC-AUC quantifiziert haben, die den Unterschied zwischen dem Abfeuern im Bin und der Precue-Basislinie darstellt. Heatmaps der AUC-Werte in Zeitabschnitten, die auf den DS-Beginn ausgerichtet sind (Feigen. 5B, , 66B) zeigen, dass die Verringerung der durch DS hervorgerufenen Erregung nach bilateralen und ipsilateralen (aber nicht kontralateralen) Injektionen von D1- und D2-Antagonisten in fast jedem durch Reize erregten Neuron ausgeprägt war und über den gesamten zeitlichen Verlauf der Erregung auftrat. Im Gegensatz dazu wurden die Hemmungen nach Beginn des DS nicht verringert. Um diese Effekte zu quantifizieren, haben wir ermittelt, ob jeder AUC-Wert einen signifikanten Unterschied zum Ausgangswert anzeigt, indem wir einen Bootstrap-p-Wert berechnet haben, der die Wahrscheinlichkeit darstellt, dass die AUC aus der Verteilung von AUCs ermittelt wurde, die aus zufällig gemischten Ausgangs- und Postcue-Bin-Auslöseraten generiert wurden (siehe Materialien und). Methoden). Wie aus Diagrammen des Anteils von Neuronen hervorgeht, die signifikante (p < 0.05) Erregung oder Hemmung in jedem Bin ausgerichtet auf DS-Beginn (Feigen. 5C, , 66C, linke Diagramme in jeder Spalte), wurde der Anteil der Erregungen, aber nicht der Hemmungen, durch bilaterale und ipsilaterale Injektionen der Antagonisten reduziert. Diese Interpretation wurde statistisch bestätigt, indem die Anteile signifikant angeregter und inhibierter Bins über das gesamte 1-s-Post-DS-Fenster verglichen wurden (Feigen. 5C, , 66C, Punktdiagramme). Somit wurden die Erregungen nach DS-Beginn durch die Injektion von D1- und D2-Antagonisten reduziert, die Hemmungen jedoch nicht.

Tatsächlich war die Anzahl der Neuronen, die eine signifikante Hemmung zeigten, nach einigen Arten der Injektion erhöht (Feigen. 5B,C, , 66B,C). Es ist unwahrscheinlich, dass diese auftretenden Hemmungen zu den Verhaltenseffekten bilateraler Antagonisteninfusionen beigetragen haben, da sie nicht konsistent waren (z. B. traten sie nach bilateraler und kontralateraler, aber nicht ipsilateraler D1-Antagonisteninjektion und nach ipsilateraler, aber nicht bilateraler D2-Antagonisteninjektion auf) und daher Sie erklären nicht die Verhaltenseffekte der Antagonisten. Darüber hinaus waren diese späten Hemmungen etwa 600 ms nach DS-Beginn am stärksten ausgeprägt, ein Zeitpunkt, zu dem in der Kontrollbedingung bereits etwa 50 % des zielgerichteten Annäherungsverhaltens eingeleitet worden waren (Abb.. 2B). Folglich ist es unwahrscheinlich, dass auftretende Hemmungen zu der durch den Antagonisten verursachten Erhöhung der Latenzzeit bei der Annäherungsinitiierung oder der Verringerung der Reaktionswahrscheinlichkeit beigetragen haben. Interessanterweise trat die große Mehrheit der auftretenden Hemmungen in DS-erregten Neuronen auf, normalerweise gegen Ende der Erregung (bilateraler D1-Antagonist: 14/17 Neuronen, 82 %; ipsilateraler D2-Antagonist: 11/16 Neuronen, 69 %; Feigen. 5B,C, , 66B,C), was mit der Möglichkeit übereinstimmt, dass sie durch die Antagonisten-induzierte Verringerung der erregenden Reaktion entlarvt wurden, und die Hypothese stützt, dass das Feuern von DS-erregten Neuronen ursächlich für die Einleitung des Annäherungsverhaltens ist.

NS-Präsentationen, die selten Reaktionen auf Hebeldrücke hervorriefen (Abb.. 1B), löste eine kleine, aber konsistente Erregung in denselben Neuronen aus, die durch den DS erregt wurden (Abb.. 2A). Überraschenderweise wurden NS-induzierte Erregungen durch den D1-Antagonisten nicht reduziert, weder in der Stärke nochAbb.. 7A) oder in der Anzahl der erregten Neuronen (Abb.. 7B,C). Im Gegensatz dazu reduzierte die Injektion des D2-Antagonisten sowohl das Ausmaß als auch die Anzahl der durch NS hervorgerufenen Erregungen (Abb.. 8). NS-bedingte Hemmungen wurden durch keinen der beiden Antagonisten verringert (Feigen. 7B,C, , 88B,C). Unter diesen Bedingungen ist daher die Aktivierung des D1-Rezeptors erforderlich, damit NAc-Neuronen als Reaktion auf hervorstechende belohnungsvorhersagende Reize große Erregungen erzeugen können, wohingegen die Aktivierung des D2-Rezeptors für Reaktionen sowohl auf belohnungsvorhersagende als auch auf neutrale Reize erforderlich ist.

Wir haben die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass ein vermindertes belohnungssuchendes Verhalten nach bilateralen Infusionen auf die Unterbrechung eines neuronalen Prozesses zurückzuführen sein könnte, der mit der Verstärkung oder der hedonischen Verarbeitung von Belohnungen zusammenhängt. Solche Prozesse können die Subpopulationen von NAc-Neuronen betreffen, die während des Konsums von Saccharose gehemmt oder angeregt werden (Nicola et al., 2004b; Roitman et al., 2005; Taha und Felder, 2005). Da die Tiere nach einseitiger Antagonisteninfusion weiterhin eine Belohnung erhielten, konnten wir feststellen, ob die mit dem Belohnungskonsum verbundene neuronale Aktivität von der Aktivierung des Dopaminrezeptors abhängt. Wir untersuchten das Abfeuern während der 5 Sekunden nach Eintritt des Tieres in den Belohnungsbehälter, dem Zeitraum, in dem es typischerweise zum Verzehr der Belohnung kommt (Nicola, 2010). Mithilfe der ROC-Analyse haben wir das Abfeuern in 200-ms-Bins innerhalb dieses Fensters mit der 10-s-Precue-Basislinie verglichen. Wärmekarten der resultierenden AUC-Werte zeigen eine geringe Wirkung der Antagonisteninjektion, weder ipsilateral noch kontralateral zur Injektion (Abb.. 9A,C). Die Anteile erregter und gehemmter Neuronen wurden durch die Antagonisten nicht beeinflusst (Abb.. 9B,D), was stark darauf hindeutet, dass konsumbedingte Erregungen und Hemmungen nicht von Dopamin abhängen. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, als wir dieselbe Analyse mit 50-ms-Bins durchführten (Daten nicht gezeigt).

Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die beobachteten Ergebnisse auf einen anderen Faktor als den Antagonisten zurückzuführen waren (z. B. eine durch die Injektion oder einen Bestandteil des Arzneimittelträgers verursachte körperliche Störung), injizierten wir in einigen Experimenten Kochsalzlösung. Wie ein Beispielneuron zeigt (Abb.. 10A) und durch die durchschnittliche Erregung über durch Reize erregte Neuronen (Abb.. 10B), DS-induzierte Erregungen wurden durch die Injektion von Kochsalzlösung nicht verändert; NS-induzierte Erregungen waren ebenfalls nicht betroffen (Abb.. 10C). Darüber hinaus hatte die Injektion von Kochsalzlösung keinen Einfluss auf den Anteil der Neuronen, die nach Beginn des DS oder NS eine signifikante Erregung und Hemmung zeigten (Abb.. 10D – G).

Schließlich fragten wir, ob die Aktivierung des Dopaminrezeptors das Cue-Annäherungsverhalten zulassen könnte, indem sie zu den Grundfeuerraten von NAc-Neuronen beiträgt. Im Widerspruch zu dieser Hypothese gab es keinen signifikanten Effekt des D1- oder des D2-Antagonisten auf die Basisfeuerraten von DS-erregten oder anderen NAc-Neuronen (Abb.. 10H,I).

Diskussion

Diese Ergebnisse legen einen Mechanismus nahe, durch den NAc-Dopamin belohnungssuchendes Verhalten fördert, das durch Umweltreize hervorgerufen wird: Die Aktivierung des Dopaminrezeptors erleichtert durch Reize hervorgerufene Erregungen, die wiederum die Einleitung der Annäherung an belohnungsassoziierte Objekte mit kurzer Latenzzeit fördern. Diese Schlussfolgerung wird stark durch die Beobachtung gestützt, dass die bilaterale Injektion eines Dopaminantagonisten beide die Latenzzeit bis zum Einleiten einer Bewegung erhöhte (Abb.. 1D) und reduzierte die Stärke der durch Reize hervorgerufenen Erregungen (Feigen. 33​-6). Eine verringerte durch Reize hervorgerufene Erregung kann nicht die Folge einer Verhaltensstörung sein, da einseitige Injektionen das DS-bedingte Verhalten nicht veränderten (Abb.. 1C-F), jedoch stark reduzierte DS-induzierte Erregung im injizierten Gewebe (Feigen. 3B,D, , 5,5, ​,6).6). Diese Erregungen waren eine vorherrschende neuronale Reaktion im NAc (die in 45 % der aufgezeichneten Neuronen auftrat) und gingen beide dem Beginn der Bewegung voraus (Abb.. 2B) und vorhergesagte Bewegungsinitiierungslatenz mit stärkerem Feuern bei Versuchen mit kürzerer Latenz (Abb.. 2D) (McGinty et al., 2013; Morrison und Nicola, 2014). Daher ist die durch ein Reizsignal hervorgerufene Erregung sowohl dopaminabhängig als auch für das intensive Streben nach Belohnung notwendig.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die durch Signale hervorgerufene Erregung und keine andere Form neuronaler Aktivität im NAc wahrscheinlich ein kritisches Signal im neuronalen Schaltkreis ist, das die Latenz zielgerichteter Bewegungen bestimmt. Diese Schlussfolgerung ergibt sich aus der Beobachtung, dass die Antagonisten die durch Reize hervorgerufene Erregung verringerten, ohne die durch Reize hervorgerufenen Hemmungen, das mit dem Belohnungskonsum verbundene Feuern oder die Grundfeuerraten zu verringern. Darüber hinaus waren die Studien, in denen bilaterale Injektionen der Antagonisten die Erregung am wirksamsten reduzierten, diejenigen, in denen sie die größte Verhaltensbeeinträchtigung verursachten (Abb.. 4), was stark gegen die Möglichkeit spricht, dass eine andere unentdeckte Veränderung der neuronalen Kodierung für die Verhaltenseffekte verantwortlich war. Daher besteht in unseren Daten ein fester Zusammenhang zwischen der Aktivierung des Dopaminrezeptors im NAc, dem Ausmaß der durch Signale hervorgerufenen Erregung und der Latenzzeit des Tieres, die Suche nach einer Belohnung einzuleiten.

Frühere Arbeiten zeigten, dass die VTA-Inaktivierung, die die durch NAc-Signale hervorgerufenen Erregungen und Hemmungen reduzierte, auch Tiere daran hinderte, ein Signal-Annäherungsverhalten zu zeigen (Yun et al., 2004). Diese Studie schloss jedoch nicht die Möglichkeit aus, dass es sich bei diesen Änderungen um einen indirekten Schaltkreiseffekt handelte. Hier zeigen wir, dass Dopaminrezeptoren, die sich lokal an den aufgezeichneten Neuronen befinden, für die durch Signale hervorgerufene Erregung notwendig sind, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wird, dass die antagonistischen Wirkungen auf eine Wirkung von Dopamin vor dem NAc zurückzuführen sind. Im Gegensatz dazu wurden durch VTA-Inaktivierung hervorgerufene Hemmungen reduziert (Yun et al., 2004), wurden sie durch die lokale Injektion eines Dopaminantagonisten nicht reduziert, und daher ist es unwahrscheinlich, dass diese Hemmungen das Ergebnis einer direkten Wirkung von Dopamin innerhalb des NAc sind.

Die Auswirkungen der D1- und D2-Antagonisten sowohl auf das durch DS hervorgerufene Annäherungsverhalten als auch auf das durch DS hervorgerufene Feuern waren bemerkenswert ähnlich. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit einer langen Reihe von NAc-Mikroinjektionsexperimenten, bei denen D1- und D2-Antagonisten bei ähnlichen Dosen wie unseren nahezu nicht unterscheidbare Verhaltenseffekte hervorriefen (Hiroi und Weiß, 1991; Ozer et al., 1997; Koch et al., 2000; Eiler et al., 2006; Pezze et al., 2007; Lex und Hauber, 2008; Liao, 2008; Nicola, 2010; Shinet al., 2010; Haghparast et al., 2012). Diese Ergebnisse stellen zusammen mit dem Kontrast zwischen der Antagonistenkonzentration im Injektat, die zur Beobachtung von Wirkungen erforderlich ist (mm), und der Affinität der Arzneimittel für ihre Ziele (nm) die Frage, ob die Arzneimittelwirkungen spezifisch sind. Obwohl die wirksame Konzentration am Rezeptor aufgrund der Diffusion, des Metabolismus und der Oxidation der Arzneimittel wahrscheinlich erheblich niedriger ist als die injizierte Konzentration, ist die kombinierte Wirksamkeit und der zeitliche Verlauf dieser Prozesse unbekannt. Daher besteht eine formale Möglichkeit darin, dass sowohl die Verhaltens- als auch die elektrophysiologischen Wirkungen von SCH23390 und Racloprid darauf zurückzuführen sind, dass beide Arzneimittel einen oder mehrere Rezeptoren binden, die überhaupt nicht an Dopamin gebunden sind. Mehrere Faktoren sprechen gegen diese Möglichkeit. Das durch Reize hervorgerufene Annäherungsverhalten wird nicht nur durch SCH23390 und Racloprid blockiert, sondern auch durch die Injektion des Breitband-Dopaminrezeptor-Antagonisten Flupenthixol in das NAc (Di Ciano et al., 2001; Saunders und Robinson, 2012), durch Inaktivierung des VTA (Yun et al., 2004) und durch Schädigung des NAc mit 6-Hydroxydopamin (Parkinson et al., 2002), das selektiv katecholaminerge Fasern abtötet. Darüber hinaus erhöht die NAc-Injektion eines Dopamin-Wiederaufnahmeblockers, eines D1- oder D2-Rezeptoragonisten oder des Dopaminfreisetzers Amphetamin die Wahrscheinlichkeit einer gezielten Annäherung (Wyvell und Berridge, 2000; Nicola et al., 2005; du Hoffmann und Nicola, 2013). Schließlich wird die optogenetische Selbststimulation von VTA-Dopamin-Neuronen (ein Verhalten, das zweifellos durch die Aktivierung von Dopamin-Neuronen aufrechterhalten wird) durch die Injektion von SCH23390 oder Racloprid in die NAc in ähnlichen Dosen wie den hier verwendeten abgeschwächt (Steinberg et al., 2014). Es ist schwierig, sich einen einfachen Mechanismus vorzustellen, der jedes dieser Ergebnisse erklären könnte, ohne anzunehmen, dass SCH23390 und Racloprid den Cue-Ansatz blockieren, indem sie die Wirkung von endogenem Dopamin blockieren.

Eine alternative Möglichkeit besteht darin, dass die Antagonisten nicht nur ihre Zielrezeptoren, sondern auch Dopaminrezeptoren außerhalb des Ziels binden. Bei Konzentrationen von 10 μm oder weniger bindet Racloprid keine D1-ähnlichen Rezeptoren (Hall et al., 1986); Höhere Konzentrationen wurden nicht getestet. Daher könnte Racloprid selbst bei den von uns und anderen verwendeten mm-Injektatkonzentrationen spezifisch für D2/D3-Rezeptoren sein, insbesondere unter Berücksichtigung von Diffusion, Metabolismus und Oxidation. Schätzungen der SCH23390-Bindungskonstante an D2-ähnliche Rezeptoren liegen zwischen 1 und 5 μm (Bourne, 2001; Mottola et al., 2002); Obwohl diese Werte darauf hindeuten, dass SCH23390 D2/D3-Rezeptoren in den injizierten Konzentrationen bindet, ist die funktionelle Wirksamkeit von SCH23390 bei der Blockierung der Aktivierung von D2-ähnlichen Rezeptoren durch Dopamin unbekannt. Unsere Beobachtung, dass Racloprid die durch NS hervorgerufene Erregung reduziert, während SCH23390, stützt nicht die Idee, dass die Medikamente an unterschiedlichen Rezeptoren wirken, beweist aber nicht definitiv ihre Spezifität. Selbst wenn jedoch eines oder beide Medikamente beide Rezeptortypen blockieren würden, um die durch DS hervorgerufene Erregung zu reduzieren, stünde dies völlig im Einklang mit unserer Schlussfolgerung, dass die Aktivierung mindestens einer Form des Dopaminrezeptors für die durch DS hervorgerufene Erregung erforderlich ist. Obwohl die Frage der Arzneimittelspezifität unbeantwortet bleibt, schwächt diese Frage unsere Hauptschlussfolgerung, dass Dopamin den reizgesteuerten Ansatz erleichtert, indem es die durch den Reiz hervorgerufene Erregung erhöht, nur geringfügig ab.

Wenn die Medikamente tatsächlich spezifisch wirken, deuten unsere Erkenntnisse, dass D1- und D2/D3-Antagonisten jeweils das durch Signale hervorgerufene Feuern in der Mehrzahl der durch Signale erregten Neuronen reduzierten, darauf hin, dass die Aktivierung dieser Rezeptoren synergistisch zu einer Erregung in denselben Neuronen führt. Während D1- und D2-Rezeptoren in weitgehend getrennten Neuronenpopulationen im NAc zu finden sind (Albinet al., 1989; Gerfen et al., 1990), enthalten erhebliche Anteile der NAc-Kern- und Schalenneuronen, die D1-Rezeptoren exprimieren, auch mRNA für D3-Rezeptoren (Le Moine und Bloch, 1996), die durch D2-Antagonisten, einschließlich Racloprid, blockiert werden. Die Koexpression von D1- und D3-Rezeptoren stellt einen möglichen Mechanismus dar, durch den Dopamin die Erregung in NAc-Neuronen durch einen synergistischen Effekt fördern könnte, der entweder durch D1- oder D2/3-Antagonisten blockiert würde (Schwartz et al., 1998). Alternativ (oder zusätzlich) kann die Interaktion zwischen D1- und D2- (und/oder D3-)Rezeptoren auf der Ebene des lokalen Schaltkreises stattfinden (Goto und Gnade, 2005; Gerfen und Surmeier, 2011). Beispielsweise wirkt Dopamin an D1-Rezeptoren, um die GABA-Freisetzung auf NAc-Neuronen zu reduzieren (Nicola und Malenka, 1997; Hjelmstad, 2004), ein Effekt, der die Erregung zusammen mit der Aktivierung von D2/D3-Rezeptoren auf stacheligen Neuronen fördern könnte (Hopf et al., 2003). Diese Mechanismen gehen insbesondere davon aus, dass Dopamin NAc-Neuronen nicht direkt erregt, sondern vielmehr deren Erregbarkeit als Reaktion auf glutamatergen Input erhöht; So konnten sie erklären, warum durch Reize hervorgerufene Erregungen nicht nur durch Dopaminantagonisten, sondern auch durch die Inaktivierung der basolateralen Amygdala und des präfrontalen Kortex blockiert werden (Ambroggi et al., 2008; Ishikawa et al., 2008), die beide glutamaterge Projektionen an das NAc senden (Brog et al., 1993).

Die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den Wirkungen von SCH23390 und Racloprid könnten das Ergebnis zweier gegensätzlicher neuronaler Mechanismen sein, an denen phasisches und tonisches Dopamin beteiligt ist. Da sowohl D1- als auch D2/D3-Antagonisten die durch DS hervorgerufene Erregung reduzierten, wurde die kleinere, durch NS hervorgerufene Erregung, die in denselben Neuronen auftrat, jedoch nur durch den D2/D3-Antagonisten reduziert (Feigen. 8, ​,9),9), scheint es, dass Dopamin die Kodierung des Reizwerts über die Aktivierung von D1-Rezeptoren fördert, aber über D2/D3-Rezeptoren die Auslösung von Reaktionen auf alle Signale (unabhängig davon, ob sie mit einem wertvollen Ergebnis verbunden sind oder nicht) erleichtert. Dies könnte auf die größeren phasischen Dopamin-Transienten zurückzuführen sein, die im NAc durch belohnungsprädiktive als durch neutrale Signale hervorgerufen werden (Phillips et al., 2003; Roitman et al., 2004). Da D2/3-Rezeptoren eine höhere Affinität zu Dopamin haben als D1-Rezeptoren, können kleine NS-induzierte Dopamintransienten ausreichen, um nur D2/3-Rezeptoren zu aktivieren, während belohnungsvorhersagende DSs die Dopaminkonzentration auf Werte erhöhen können, die hoch genug sind, um D1-Rezeptoren zu aktivieren (Gnade, 1991).

Alternativ könnte das Ausmaß der durch ein Signal hervorgerufenen Erregung durch tonisches und nicht durch phasisches Dopamin reguliert werden. Der tonische Dopaminspiegel kann die Opportunitätskosten der Untätigkeit widerspiegeln (Niv et al., 2007), wodurch die Stärke der operanten Leistung bestimmt wird. Wenn also ausreichend hohe tonische Dopaminspiegel erreicht werden, könnten genügend Dopaminrezeptoren aktiviert werden, um die durch Signale hervorgerufene Erregung zu erleichtern und die Latenzzeit des belohnungssuchenden Ansatzes zu verringern. Ein ähnlicher Mechanismus könnte auch dem bekannten Beitrag von NAc-Dopamin zur Ausführung ungesteuerter operanter Aufgaben zugrunde liegen, die ein hohes Maß an Anstrengung erfordern (Salamone und Correa, 2012), bei dem eine Dopaminstörung die Latenzzeiten bis zur Annäherung an das Operandum erhöht (Nicola, 2010). Implizite externe Signale (z. B. der Anblick des Hebels) oder interne Signale (z. B. durch Timing oder Hunger) könnten eine Annäherung auslösen, indem sie NAc-Neuronen in größerem Maße erregen, wenn Opportunitätskosten und Dopaminspiegel hoch sind.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, unabhängig von dem spezifischen pharmakologischen Mechanismus, dass NAc-Dopamin das belohnungssüchtige Verhalten fördert, indem es die Erregung von NAc-Neuronen auf herausragende Umweltreize erhöht. Die Größe dieser Erregung setzt die Latenz des Subjekts, um eine Annäherungsantwort zu initiieren. Über diesen Mechanismus reguliert Dopamin sowohl die Vitalität als auch die Wahrscheinlichkeit des angestrebten Belohnungssuchens.

Fußnoten

Bibliographie