Plus eins. 2010; 5(10): e15401.
Abstrakt
Die Musterkomplettierung, die Fähigkeit, vollständige Speicher auszulesen, die durch partielle Hinweise ausgelöst werden, ist ein kritisches Merkmal des Speicherprozesses. Über die molekularen und zellulären Mechanismen, die diesem Prozess zugrunde liegen, ist jedoch wenig bekannt. Um die Rolle von Dopamin beim Gedächtnisabruf zu untersuchen, haben wir dopamintransportierende heterozygote Knockout - Mäuse (DAT+/-) und fanden heraus, dass diese Mäuse unter normalen Cue-Bedingungen zwar normales Lernen, Konsolidierung und Gedächtnisrückruf besitzen, unter partiellen Cue-Bedingungen jedoch spezifische Defizite bei der Mustervervollständigung aufweisen. Diese Form des Gedächtnisrückrufdefizits bei heterozygoten Dopamintransporter-Knockout-Mäusen kann durch eine niedrige Dosis des Dopaminantagonisten Haloperidol rückgängig gemacht werden, was weiter bestätigt, dass die Unfähigkeit, Gedächtnismuster wiederzugewinnen, ein Ergebnis eines Dopamin-Ungleichgewichts ist. Daher zeigen unsere Ergebnisse, dass eine sorgfältige Kontrolle des Dopaminspiegels im Gehirn für die Vervollständigung des Musters während des assoziativen Gedächtnisrückrufs entscheidend ist.
Einleitung
Erinnerungserinnerung beinhaltet eine Rekapitulation von zuvor erworbenen Informationen [1], [2]. Abhängig vom Zustand der Rückrufbedingungen kann das Abrufen des Gedächtnisses mit den meisten oder allen zuvor aufgetretenen Hinweisen im Zusammenhang mit dem Lernen erfolgen (z. B. eine Person gleichzeitig sehen und ihre Stimme hören oder die Heimatstadt erneut besuchen, die sich nicht wesentlich geändert hat usw.). Andererseits finden in vielen Fällen Speicherabrufe normalerweise statt, wenn nur Teilmengen der ersten Hinweise vorhanden sind (z. B. Rekonstruktion der alten Straßenkarten der eigenen Heimatstadt, wenn nur wenige alte Wahrzeichen unverändert blieben). Dies ist als Mustervervollständigung bekannt, bei der das Gehirn ganze Speichermuster aus partiellen externen Hinweisen oder selbstinitiierten internen Prozessen rekonstruiert und abruft. Derzeit ist wenig über die tatsächlichen molekularen und zellulären Mechanismen bekannt, die der Mustervervollständigung des Gedächtnisrückrufs zugrunde liegen. Neue Studien deuten jedoch darauf hin, dass die Monoaminsignalisierung eine Rolle beim Abrufen des Gedächtnisses spielen kann [3].
In dieser Studie untersuchten wir, wie der modulatorische Neurotransmitter Dopamin eine Rolle bei der Regulation der Speichermusterkomplettierung während des partiellen Cue-Recalls spielt. Dopamin ist ein wichtiger Neurotransmitter, der Kognition, Emotion und Bewegung beeinflussen kann. Eine abnormale dopaminerge Übertragung wurde mit einer Reihe von psychiatrischen und neurologischen Störungen in Verbindung gebracht, darunter Aufmerksamkeitsdefizit- und Hyperaktivitätsstörung (ADHS), Schizophrenie und Parkinson [4]-[8]. Obwohl dopaminerge Neuronen nur aus dem ventralen Tegmentum und der Substantia nigra compacta stammen, ragen ihre Ausgänge fast überall im Gehirn hervor, einschließlich des präfrontalen Cortex, des medialen Temporallappens und des Hippocampus, Regionen, die während der Gedächtnisretrievation aktiviert werdenl [3], [9]-[14].
Es sollte auch angemerkt werden, dass Dopamin funktionell als entscheidend für die Aufmerksamkeit und das Arbeitsgedächtnis angesehen wurde, das durch die oben genannten Gehirnregionen vermittelt wird [15]-[18]Beide wurden im Prozess des Speicherabrufs unter partiellen Cue-Bedingungen impliziert [19]. Als primärer zellulärer Mechanismus zur Beendigung der Dopamin-Signalübertragung nimmt der Dopamin-Transporter (DAT), der sich an den neuronalen präsynaptischen Enden befindet, Dopamin aus dem synaptischen Spalt wieder in die dopaminergen Neuronen zurück. Als solches ist DAT ein kritisches Molekül bei der Regulierung der synaptischen Spiegel von Dopamin und folglich bei der Bestimmung der zeitlichen Dauer von Dopaminwirkungen auf die lokalen neuronalen Schaltkreise. In der Tat führt der genetische Knockout des Dopamintransportergens zu schwerwiegenden Beeinträchtigungen. Die homozygoten DAT-KO-Mäuse leiden unter offenkundigen Anomalien einschließlich Wachstumsverzögerung, robuster lokomotorischer Hyperaktivität und vielen anderen Beeinträchtigungen einschließlich Defiziten in Gewöhnung und sozialer Interaktion sowie gestörter Darmbeweglichkeit, Atmungskontrolle usw. [6], [20], [21]. Die Gesamtdefekte in den homozygoten DAT-KO-Mäusen haben es weniger geeignet gemacht, die Rolle von Dopamin bei der Regulierung von Gedächtnisprozessen zu untersuchen.
Interessanterweise wurden die heterozygoten Knockout - Mäuse (DAT+/- Mäuse), die immer noch ein Allel des funktionellen DAT-Gens besitzen, scheinen in ihrem gesamten Bruttoverhalten ziemlich normal zu sein [6], [20], [21]. Also, das DAT+/- Mäuse können ein wertvolles Modell für die Untersuchung einiger der empfindlichen, aber wichtigen Phänotypen liefern, wie assoziative Gedächtnisprozesse und verwandte Mechanismen, die durch dopaminerge Schaltkreise reguliert werden. Hier verwendeten wir eine Reihe von Verhaltensparadigmen, um die funktionellen Konsequenzen des Dopamin-Ungleichgewichts auf die Mustervervollständigung während des assoziativen Gedächtnisabrufs zu untersuchen.
Die Ergebnisse
Um die Rolle von Dopamin bei der Gedächtniswiederherstellung zu untersuchen, verwendeten wir die heterozygoten Dopamintransporter - Knockout - Mäuse (DAT+/-). Wir haben eine Reihe grundlegender Verhaltensmessungen durchgeführt, um ihre Bewegungsaktivität im offenen Feld zu beurteilen (Abbildung 1A), Rotarod-Aufführungen (Abbildung 1B und 1C) und fanden heraus, dass diese heterozygoten Knockout-Mäuse völlig normal sind. Wir haben auch bestätigt, dass der DAT+/- Mäuse zeigen nicht unterscheidbare Leistungen im Angstniveau, gemessen durch das erhöhte Plus-Labyrinth (Abbildung 1D).
Darüber hinaus bewerteten wir die grundlegenden Lern- und Gedächtnisfunktionen im DAT+/- Mäuse. Zunächst haben wir den neuartigen Objekterkennungstest verwendet und beobachtet, dass diese Mäuse in den 1-Retentionstests im Vergleich zu ihrer Wildtyp-Wurfgeschwisterkontrolle völlig normale Verhaltensleistungen aufwiesen (Abbildung 1E). Darüber hinaus zeigen diese Mäuse auch eine normale 1-Tage-Furcht-konditionierte Retention, die von ihren Wildtyp-Kontrollmäusen nicht unterscheidbar ist (Abbildung 1F). Daher legen diese Ergebnisse nahe, dass das DAT+/- Mäuse haben normale Lern- und Gedächtnisfunktionen in diesen zwei Formen von primären Gedächtnistests.
Der räumliche Referenzspeichertest wurde zuvor verwendet, um die Mustervollendung des Speicherabrufs zu bewerten. Wir unterwarfen das DAT+/- Mäuse und Wildtyp-Steuerelemente für diese Aufgabe. Verwenden des räumlichen Referenzspeicherprotokolls, das zuvor beschrieben wurde [22], trainierten wir diese Mäuse in dem versteckten Plattform-Wasserlabyrinth. Das Training bestand aus vier Versuchen pro Tag mit einem Abstand von einer Stunde zwischen den Versuchen. Wir fanden, dass sowohl der DAT+/- Mäuse und die Wildtyp-Mäuse zeigten eine vergleichbare Lern- und Gedächtniskonsolidierung im Verlauf von 10-Tagessitzungen und mit ähnlichen Schwimmgeschwindigkeiten (Abbildung 2A und 2B).
Als nächstes untersuchten wir ihre Erinnerungen an den Ort der versteckten Plattform mit Hilfe des Sondentests (P1) am Tag 11 einen Tag nach dem Abschluss der letzten Trainingseinheit. Wie durch Quadrantenbelegung gemessen, sind beide DAT+/- Mäuse und ihre Kontrollkameraden konnten ihre Suche im Zielquadranten in Anwesenheit von vollständigen Hinweisen konzentrieren (Abbildung 3A). Außerdem, DAT+/- Mäuse zeigten auch eine starke Präferenz im Bereich der Phantomplattform, und es gab keinen Unterschied im Vergleich zur Plattformbelegung der Kontrollen (Abbildung 3B). Darüber hinaus, wie erwartet, beide DAT+/- Mäuse und die Wildtyp Wurfgeschwister zeigten eine signifikante Zunahme der Anzahl der Kreuzungen (Abbildung 3C). Alle diese Messungen legen nahe, dass DAT+/- Mäuse können diese Aufgabe normal lernen und diesen assoziativen Speicher normalerweise unter Voll-Cue-Bedingungen abrufen.
Um zu bestimmen, ob das empfindliche Gleichgewicht von Dopamin für die Mustervervollständigung unter partiellen Cue-Bedingungen wesentlich ist, führten wir den zweiten Sondentest (P2) am nächsten Tag durch Entfernen von drei der vier distalen Hinweise (Tag 12) durch. Um ein mögliches Aussterben von der vorherigen Rückrufsitzung zu vermeiden, wurde ein weiterer Block (4-Versuche) des Trainings 1 Stunde nach dem P1-Sondentest abgegeben. Während dieser partiellen Stichprobenuntersuchung konzentrierten die Kontrollmäuse ihre Suchzeit eher auf den Zielquadranten als auf die anderen Quadranten, den DAT+/- Mäuse zeigten nur eine zufällige Leistung, gemessen anhand der Zielquadrantenbelegung (Abbildung 3D). Darüber hinaus bestätigte die Messung der Belegung der Phantom-Plattform-Bereiche, dass diese DAT+/- Mäuse waren in der Erinnerung an die Plattform Lage beeinträchtigt (Abbildung 3E). Dieses Abrufdefizit wurde auch durch das Fehlen eines Anstiegs der Plattformübergänge (Abbildung 3F), während die Wildtyp-Wurfgeschwister vollständig in der Lage waren, einen teilweisen Cue-Speicherabruf durchzuführen. Daher legen diese Daten nahe, dass die DAT+/- Mäusen fehlt es unter partiellen Bedingungen an räumlichen Referenzspeichern.
Schließlich haben wir gefragt, ob wir die Mustervervollständigung in diesen DAT wiederherstellen können+/- Mäuse mit pharmakologischen Methoden. Es wurde berichtet, dass eine geringe Dosis des Dopamin-Antagonisten Haloperidol zur Linderung bestimmter Dopamin-Störungen nützlich sein könnte [20]. Die Begründung ist, dass die niedrige Dosis von Haloperidol in der Lage sein kann, die Wirkung des erhöhten Dopamins in den heterozygoten Mäusen, die aufgrund des Verlusts eines Allels des normalen Dopamintransportergens eine unzureichende Dopaminwiederaufnahme haben, etwas zu dämpfen. Wir haben den gleichen Satz von Mäusen auf das Rettungsexperiment angewendet. An Tag 13 und Tag 14 unterwarfen wir die oben genannten Mäuse der dritten Sonden-Studie (P3) unter Voll-Cue-Bedingungen und der vierten Sonden-Studie (P4) unter partiellen Cue-Bedingungen. Um einer möglichen Extinktion, die während des Sondentests aufgetreten sein könnte, entgegenzuwirken, führten wir erneut einen Block (4-Versuche) der Trainings-1-Stunde nach Beendigung des P2- oder P3-Sondentests durch. Unsere Messungen der Zielquadrantenbelegung beim P3-Sondentest zeigen, dass sowohl der DAT+/- Mäuse und die Kontrollgenossen konzentrierten ihre Suche im Zielquadranten in Anwesenheit von vollständigen Hinweisen (Abbildung 4A). Darüber hinaus wurde ihr normaler Speicherabruf erneut durch die Messung der Plattformbelegung (Abbildung 4B) sowie die Anzahl der Bahnsteigüberquerungen (Abbildung 4C). Somit waren diese mutierten Mäuse vollständig in der Lage, das räumliche Gedächtnis unter Bedingungen eines vollständigen Hinweises wiederzugewinnen.
Am Tag 14 entfernten wir drei der vier distalen Hinweise und führten die vierten Sondenversuche (P4) unter dem partiellen Cue-Zustand durch. Wir haben den DAT injiziert+/- Mäuse intraperitoneal mit einer geringen Dosis von Haloperidol (0.002 mg / kg Körpergewicht) 30 Minuten vor den Retentionstests. Die Wildtyp-Wurfgeschwister erhielten eine Salzlösung als Kontrolle. Wir fanden das DAT+/- Mäuse konzentrierten ihre Suchzeit im Zielquadranten und zeigten statistisch ähnliche Leistungen im Vergleich zu den Wildtyp-Pendants (Abbildung 4E). Auch die Messung der Belegung der Phantom-Plattform-Bereiche begründete weiter, dass diese DAT+/- Mäuse können den Standort der Plattform abrufen (Abbildung 4F). Ihr normaler Erinnerungsabruf wurde erneut durch einen Anstieg der Anzahl von Plattformkreuzungen bestätigt, der auf dem gleichen Niveau wie der der Wildtypmäuse war (Abbildung 4G). Diese Experimente legen daher nahe, dass Defekte bei der Mustervervollständigung ursprünglich im DAT beobachtet wurden+/- Mäuse können durch das Dopamin-Ungleichgewicht verursacht werden.
Um auszuschließen, dass die Ergebnisse für den mit Haloperidol in der P4-Sondenstudie injizierten Phänotyp auf Übertraining während der wiederholten Sondentests zurückzuführen waren, verwendeten wir einen anderen Satz von DAT+/- und Kontrolle Geschwister und wiederholte das gesamte Experiment. Wie erwartet, beide DAT+/- Mäuse und ihre Wildtyp-Mäuse zeigten im Verlauf der 10-Tagessitzungen gute Lernraten (Abbildung 5A). Am Tag 11 unterzogen wir diese Mäuse dann Full-Cue-Recall-Tests, es gibt keinen signifikanten Unterschied bei den Testergebnissen des Memory-Retention-Tests zwischen den DAT+/- Mäuse und die Kontroll-Wurfgeschwister, gemessen anhand der Quadrantenbelegung (Abbildung 5B), Zielquadrantenbelegung (Abbildung 5C) und die Anzahl der Bahnsteigüberquerungen (Abbildung 5D). Eine Stunde nach dem Abschluss des Voll-Cue-Sondentests trainierten wir diese Mäuse mit einem weiteren Trainingsblock, um jeglichen Extinktionseffekt zu verhindern. Am Tag 12 wurden diese Mäuse den Partial-Cue-Recall-Tests unterzogen. Eine geringe Dosis von Haloperidol (oder Kochsalzlösung) für die Kontrollen wurde den Mäusen intraperitoneal 30 Minuten vor dem partiellen Cue-Versuch injiziert. Wir fanden heraus, dass diese Behandlung tatsächlich zu den normalen Leistungen in den mutierten Mäusen führte. Die Mutanten- und Kontrollmäuse zeigten vergleichbare Leistungen in der Quadrantenbelegung (Abbildung 5E), Zielquadrantenbelegung (Abbildung 5F) und die Anzahl der Bahnsteigüberquerungen (Abbildung 5G). Die Messung ihrer Schwimmgeschwindigkeiten ergab ebenfalls keine Unterschiede (Abbildung 5H). Daher zeigten diese Daten eindeutig, dass das gerettete partielle Cue-Retrieval-Defizit in der DAT+/- Mäuse durch Haloperidol waren nicht auf wiederholtes Übertraining während mehrerer Sondenversuche zurückzuführen.
Diskussion
Das Dopaminsystem ist bekanntlich für die Regulation vieler kognitiver Prozesse entscheidend [8], [16]-[18], [23]-[25]In unserer vorliegenden Studie wurde erstmals nachgewiesen, dass das Dopamin - Ungleichgewicht, das durch den Verlust eines Allels des normalen Dopamintransportergens entsteht, zu einem spezifischen Defizit in der Musterkomplettierung während des assoziativen räumlichen Gedächtnisabrufs führte. Dieses Erinnerungs-Erinnerungsdefizit ist nur unter den Teil-Räumlichkeits-Cue-Bedingungen evident, aber nicht unter den Voll-Cue-Bedingungen. Darüber hinaus scheint dieses Erinnerungsdefizit eine höchst spezifische Form des Gedächtnisdefizits widerzuspiegeln, da breite Aspekte des Grundverhaltens (Offenfeldbewegung, Rotarod und Angst) und anderer Gedächtnisformen wie kontextabhängige Angstkonditionierung und neuartige Objekterkennung normal bleiben.
Es gibt mehrere potentielle Moleküle und zelluläre Szenarien, die kollektiv zu dem beobachteten räumlichen Partial-Cue-ausgelösten Recall-Defizit beitragen können, von denen Dopamin als ein Hauptkandidatenmolekül betrachtet wird, das diesem Gedächtnisprozeß zu Grunde liegt, weil Aufmerksamkeit und Arbeitsgedächtnis hauptsächlich durch gesteuert werden Dopamin-Signale, werden berichtet, um für die Wiedergewinnung von räumlichen Erinnerungen kritisch zu sein [15]-[18], [26]. Es ist allgemein bekannt, dass dopaminerge Neuronen, die nur aus dem ventralen Tegmentum und der Substantia nigra compacta stammen, fast überall im Gehirn, einschließlich des präfrontalen Cortex, des medialen Temporallappens und des Hippocampus, projiziert werden [5], [19], [27]-[28]Regionen, von denen bekannt ist, dass sie während des Speicherabrufs sowie bei Aufmerksamkeitsprozessen aktiviert werden [3], [9]-[14], [29], [30]. Angesichts der breiten Beweise, dass Dopamin für Aufmerksamkeit und Arbeitsgedächtnis unerlässlich ist [15]-[18] und dass angenommen wird, dass der genetische Polymorphismus im DAT-Gen an ADHS beteiligt ist [31]-[33]Es ist möglich, dass sowohl die Aufmerksamkeit als auch das Arbeitsgedächtnis eine Rolle bei der Vervollständigung des Gedächtnisses beim Abrufen des Gedächtnisses unter den Bedingungen des partiellen Hinweises durch DAT-vermittelte Dopaminregulation spielen. Somit können Gedächtnismuster-Vervollständigungsdefizite, die bei heterozygoten DAT-Mutantenmäusen beobachtet werden, auf die Unfähigkeit der Maus zurückzuführen sein, die erhöhten Aufmerksamkeitsanforderungen während eines partiellen Cue-basierten Gedächtnisrückrufs infolge einer synaptischen Dopaminstörung zu erfüllen.
Unsere Feststellung, dass ein Dopamin-Ungleichgewicht zu einem Defizit bei der Gedächtniswiederherstellung führte, ist auch angesichts der bei Parkinson-Patienten beobachteten klinischen Demenz interessant. Diese Patienten scheinen normalerweise die Fähigkeit zu behalten, neues Gedächtnis zu lernen, zu konsolidieren und zu speichern, sind jedoch beim Abrufen von Erinnerungen stark beeinträchtigt, insbesondere unter teilweisen externen Hinweisen oder selbstinitiiertem Rückruf [34], [35]. Dieses Defizit ist besonders ausgeprägt, wenn keine expliziten Hinweise vorhanden sind [8], [23], [34]-[36], was weiter darauf hinweist, dass Dopamin am Gedächtnisrückrufprozess beteiligt sein könnte. Diese Arten von Defiziten beim Gedächtnisrückruf bei Parkinson-Patienten stehen in starkem Kontrast zu den Gedächtnisdefiziten bei anderen Neurotransmittersystemen [37] oder die frühe Demenz bei Alzheimer-Patienten, die typischerweise beim Lernen und Festigen neuer Erinnerungen beeinträchtigt sind, während die Fähigkeit erhalten bleibt, alte Erinnerungen abzurufen [34], [35]. Dies zeigt die Notwendigkeit, unterschiedliche therapeutische Strategien zu entwickeln, aufgrund der unterschiedlichen Verwundbarkeiten zu unterschiedlichen molekularen und temporalen Prozessen in Speicherschaltungen.
Unsere Demonstration, dass die Mustervervollständigung durch die Injektion von Haloperiodol zum Zeitpunkt des Rückrufs vollständig gerettet werden kann, verstärkt die Vorstellung über die Rolle von ausgeglichenen Dopaminspiegeln bei der Gedächtniswiederherstellung. Dieses pharmakologische Rettungsexperiment liefert zusätzliche Beweise für die zeitliche Spezifität, die das partielle cue-basierte Recall-Defizit verursacht. Es sollte beachtet werden, dass Dopamin Dysfunktionen in DAT+/- Mäuse und Parkinson-Patienten unterscheiden sich stark voneinander, doch beide führen zu Defiziten bei der Musterwiederherstellung. Diese Gemeinsamkeit stützt kollektiv die Annahme, dass das empfindliche Gleichgewicht des Dopaminsystems für das Abrufen des Gedächtnisses entscheidend ist und ein Ungleichgewicht in beide Richtungen (nach oben oder unten) zu Defiziten bei der Vervollständigung des Gedächtnismusters während des Abrufs führen würde. Wichtig ist, dass unsere vorliegende Analyse nicht als Beweis für die Verwendung der DAT-Mutantenmäuse als Parkinson-Modell interpretiert werden sollte. Andererseits, in vivo Die Messung von Dopamin in DAT-homozygoten Knockout-Mäusen zeigt eine signifikante Reduktion der Dopaminfreisetzung, die durch Burst-Stimulation ausgelöst wird [38]-[40]. Dies weist darauf hin, dass die Fähigkeit, die neuronale Aktivität in Dopaminsignale in den verschiedenen Hirnregionen von Knockout-Mäusen umzuwandeln, möglicherweise unzureichend ist. Es ist denkbar, dass verringerte Änderungen des Dopaminverhältnisses zu veränderten physiologischen Änderungen der Zündmuster innerhalb der an der Speicherverarbeitung beteiligten neuronalen Schaltkreise führen können. Derzeit ist nicht bekannt, ob die ähnliche Veränderung auch bei heterozygoten DAT-Knockout-Mäusen oder bei Parkinson-Patienten auftritt.
Obwohl wenig über die neuronalen Schaltkreise bekannt ist, die während des räumlichen Gedächtnisses aktiviert werden, rekrutiert es wahrscheinlich mehrere Regionen einschließlich des präfrontalen Kortex, des medialen temporalen Kortex und des Hippocampus. Dies passt gut zu den anatomischen Befunden, dass die dopaminergen Ausgangswerte aus dem ventralen Tegmentum stark in den ventralen CA1-Bereich und den entorhinalen Kortex projiziert sind[13], [28]. Diese präfrontale Hippocampus-VTA-Schleife könnte eine entscheidende Rolle bei der Generierung von kontextueller Vertrautheit spielen, was wiederum die Mustervervollständigung während des partiellen Cue-basierten räumlichen Gedächtnisabrufs durch die Erleichterung der Dopamin-regulierten Aufmerksamkeit fördert [3], [14], [26], [28]. In zukünftigen Studien wird es wichtig sein, die anatomischen Loci, aus denen die beobachteten Defizite bei der Mustervervollständigung stammen, weiter zu definieren. Es wäre besonders interessant, Kandidatenstellen wie den anterioren cingulären Kortex, den temporalen Kortex und den Hippocampus unter Verwendung pharmakologischer, genetischer und großtechnischer In-vivo-Aufzeichnungstechniken zu untersuchen [11], [41]-[44]. Es ist auch wichtig zu beurteilen, ob eine genetische Kompensation oder langsame Veränderungen im mutierten Gehirn zu den beobachteten Erinnerungsdefiziten beitragen. Es gibt auch Hinweise darauf, dass andere Neurotransmittersysteme auch bei der Regulation des Gedächtnisabrufs eine entscheidende Rolle spielen könnten [3], [37], [45], [46]und es wäre sehr interessant, ihre dynamischen Interaktionen zwischen der partiellen Cue-getriggerten Musterkomplettierung und dem vollständigen Cue-basierten Speicherabruf zu untersuchen und zu vergleichen. Zusammenfassend lässt unsere Studie darauf schließen, dass ein empfindliches Gleichgewicht der Dopaminspiegel entscheidend für die Vervollständigung des Musters während des assoziativen Gedächtnisses ist.
Materialen und Methoden
Ethische Aussagen
Alle in der Studie beschriebenen Tierversuche wurden gemäß den NIH-Richtlinien durchgeführt und vom Institutional IACUC-Komitee am Medical College of Georgia genehmigt (Genehmigung AUP-Nummer: BR07-11-001).
Produktion und Genotypisierung von Mutantenmäusen
Die DAT-Mäuse waren ein großzügiges Geschenk aus dem Labor von Dr. XiaoXi Zhuang von der Universität von Chicago. Zucht und Genotypisierung von heterozygoten DAT-Knockout-Mäusen sind die gleichen wie beschrieben [6]. Für unsere Experimente wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse gleichermaßen in einem Verhältnis von 1 verwendet![[Verhältnis]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
1. PCR für DAT+/- Den Mäusen wurde das Protokoll wie beschrieben folgen gelassen [6]. Alle Mäuse wurden unter Standardbedingungen (23.1 ° C, 50.5% Feuchtigkeit) in der Tiereinrichtung des Medical College of Georgia gehalten. Alle Experimente wurden in einem schalldichten und spezialisierten Behavioraum durchgeführt. Alle Experimentatoren waren blind für den Genotyp des einzelnen Tieres.
Novel-Objekterkennungsaufgabe
Das experimentelle Protokoll war das gleiche wie zuvor beschrieben [37], [47]. Kurz gesagt wurden die Mäuse für 20-Tage einzeln an eine Freifeldbox (20 × 10 × 3 hohe Zoll) gewöhnt. Während der Trainingseinheiten wurden zwei neue Objekte auf dem offenen Feld platziert und das Tier durfte 15 min erkunden. Der Zeitaufwand für die Erkundung der einzelnen Objekte wurde aufgezeichnet. Während der einstündigen Rücknahmetests wurde das Tier in die gleiche Box zurückgestellt, in der eines der vertrauten Objekte während des Trainings durch ein neues Objekt ersetzt wurde, und durfte frei für 15 min erforschen. Ein Präferenzindex, ein Verhältnis der Zeit, die zum Erkunden eines der beiden Objekte (Trainingssitzung) oder des Neuen (Aufbewahrungssitzung) verbracht wurde, über die Gesamtzeit, in der beide Objekte untersucht wurden, wurde zum Messen des Erkennungsspeichers verwendet.
Open Field- und Rota-Rod-Tests
Die Protokolle waren die gleichen wie beschrieben [48]. Zur Messung der Aktivität im offenen Feld wurden die Mäuse in ein offenes Feld gelegt, das aus einer 14 × 14 Zoll Blackbox bestand. Die Box wurde durch 2 × 2 Zoll kleine quadratische Gitter markiert (7 Quadrate durch 7 Quadrate mit 49 Quadraten insgesamt). Die Freilandaktivität von Tieren wurde anhand der Anzahl von Kreuzen gemessen, die die Mäuse innerhalb der 3-Minuten-Periode bestanden haben. Zur Messung des Rota-Rod-Tests wurden die Mäuse einem sich beschleunigenden rotierenden Holzstab ausgesetzt. Die Stange ist 12 lang und 1 Zoll im Durchmesser. Die Anfangsdrehzahl betrug 4 U / min und wurde dann stetig auf 40 U / min beschleunigt. Die Leistung wurde anhand der Zeitspanne (in Sekunden) gemessen, die die Mäuse während des fünfminütigen oder des einstündigen Rückruftests auf dem rotierenden Stab zu halten vermochten.
Erhöhte Plus-Labyrinth-Tests
Die Protokolle waren die gleichen wie beschrieben [49]. Das erhöhte Plus-Labyrinth besteht aus Edelstahl, der mattschwarz lackiert ist und aus vier Armen (zwei ohne Wände und zwei mit 15.25 cm hohen Wänden) 30 cm lang und 5 cm breit besteht. Jeder Arm des Labyrinths ist an stabilen Metallbeinen befestigt, so dass er 40 cm über dem Tisch steht, auf dem er ruht. Die Aktivität wurde mit einer Digitalkamera (Logitech Camera, Modell Nr. N231) aufgezeichnet, die 130 cm über dem Labyrinth angeordnet war. Die Prüfung erfolgte bei schwachem Licht (eine 40-W und eine 60-W weiche weiße Glühbirne, beide angewinkelt, um eine indirekte Beleuchtung im Labyrinth zu erzeugen) während der Lichtphase des zirkadianen Zyklus (zwischen 0900 h und 1400 h). Das Labyrinth wurde zwischen den Tests mit 5% Essigsäure gereinigt. Weißes Rauschen (30 dB) maskierte externes Hintergrundrauschen. Am Testtag wurden die Tiere in ihren Heimatkäfigen in den Testraum gebracht, und jedes Paar Tiere wurde dann aus seinem Heimkäfig entfernt und für 5min in einen separaten Haltekäfig gegeben, bevor es auf das Labyrinth gelegt wurde. Die Tiere wurden einzeln in die Mitte des Labyrinths gesetzt, wobei die Kopfposition zwischen den Mäusen ausgeglichen wurde, und das Verhalten wurde für 5 min aufgezeichnet. Die Zeit, die auf dem offenen Arm und dem geschlossenen Arm verbracht wurde (wenn alle vier Pfoten des Nagetiers auf dem offenen oder geschlossenen Arm waren) wurde aufgezeichnet und analysiert.
Kontextual Fear Conditioning
Die Angstkonditionierung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [45]. Das Experiment wurde in einem Fear-Conditioning-System durchgeführt, einer Kammer in einer schallgedämpften Box mit einer Hausbeleuchtung an der Decke und einem Edelstahlgitterboden (Coulbourn Instruments, Whitehall, PA). Der Gitterboden war mit einem Stoßgenerator verbunden und ein akustisches Signal stammte von einem Lautsprecher, der an der Wand der Kammer angebracht war. Alle Stimuli wurden automatisch unter Verwendung eines Personal Computers mit einem Graphic State Programm gesteuert. Eine Videokamera wurde vor dem Käfig platziert, um das Verhalten aufzuzeichnen. Mäuse wurden für 3-Tage behandelt und dann an die Trainingskammer für 5 min gewöhnt. Der verwendete konditionierte Stimulus (CS) war ein 85 dB-Sound bei 2.8 kHz, während der unkonditionierte Stimulus (US) bei 0.8 mA für 2 s ein kontinuierlicher, verschlüsselter Fußschock war. Nach einer einzelnen CS / US-Paarung mit gemeinsamer Terminierung blieb das Tier in der Kammer für eine weitere 30 s für die Messung des sofortigen Gefrierens. Während des Retentionstests wurde jede Maus in die gleiche Kammer zurückgebracht, und die Gefrierreaktionen wurden für 5 min aufgezeichnet (kontextabhängige Gefrierreaktion). Alle Tests wurden unter Rotlicht gefilmt. Die gesamte Gefrierzeit wurde als ein Index des Angstgedächtnisses gemessen. Das Gefrierverhalten wurde als völliger Bewegungsmangel ohne Atmung definiert. Das Einfrierverhalten wurde durch Software (Coulbourn Instruments) bewertet und in eine Einfrierantwort [Einfrieren der Reaktion] umgewandelt 
= (gesamte Gefrierzeit / gesamte Testzeit) × 100%].
Spatial Reference Memory Tests
Der räumliche Referenzgedächtnistest war das verborgene Plattform-Wasserlabyrinth. Wir folgten dem Protokoll, wie es zuvor von Nakazawa et al. [22]. Das Training bestand aus vier Versuchen pro Tag mit einer Stunde zwischen den Versuchen. Die Bewegung von Mäusen wurde mittels Videokamera verfolgt und durch Software (Noldul Information Technology, Niederlande) gemessen. Die Ausstiegslatenz auf die Plattform sowie die Quadrantenbelegung und die Plattformüberquerung wurden alle aufgezeichnet und analysiert. Der Pool hat einen Durchmesser von 118 cm und die Plattform ist 9.5 cm im Durchmesser. Vier Sondentests wurden durchgeführt. Der erste Sondentest (P1) wurde am Tag nach der letzten Trainingseinheit unter Voll-Cue-Bedingungen (Tag 11) durchgeführt. Der zweite Sondentest (P2) wurde am Tag 12 unter partiellen Bedingungen durchgeführt (durch Entfernen von drei der vier visuellen Hinweise, die an der schwarzen Vorhangwand hingen). Für den DAT+/- Mäuse, führten wir die dritte Probe-Studie (P3) am Tag 13 unter Voll-Cue-Bedingungen und vierte Probe-Studie (P4) am Tag 14 unter Partial-Cue-Bedingungen. Ein weiterer Block (4-Versuche) des Trainings wurde 1-Stunden nach P1-, P2- und P3-Sondentests abgegeben, um eventuellen Auslöschungen während des Sondentests entgegenzuwirken. Um den compoundierenden Effekt eines wahrscheinlichen Übertrainings vor P4 (Sondentest mit partieller Cue- und Haloperidol-Injektion) auszuschließen, unterzogen wir eine weitere Gruppe von DAT+/- Mäuse sowie ihre Kontroll-Wildtyp-Wurfgeschwister zu zwei zusätzlichen Sondentests (P3'- und P4'-Versuche). Der P3'-Sondentest wurde einen Tag nach der letzten Trainingseinheit unter Full-Cue-Bedingungen (Tag 10) durchgeführt. Der P4'-Sondentest wurde am Tag 11 unter Teil-Cue-Bedingungen durchgeführt. Während aller unserer Sondentests wurde die Plattform entfernt und die Mäuse konnten für die gleiche Zeit wie während des Trainings (60 Sekunden) im Pool schwimmen. Die in jedem Quadranten verbrachte Zeit wurde aufgezeichnet. Wiederherstellung des Dopaminspiegels [6], [20], [21], Mäuse von DAT+/- und Kontrollgruppen wurden alle 0.002 Minuten vor den P30- und P4'-Sondenversuchen entweder Haloperidol (4 mg / kg Körpergewicht) oder Kochsalzlösung intraperitoneal injiziert.
Datenanalyse
Um die Intra-Tier-Korrelationen zwischen wiederholten Messungen zu berücksichtigen, wurden lineare gemischte Modelle verwendet, um die Verhaltensleistung im Morris-Wasserlabyrinth, neuartige Objekterkennung, kontextabhängige Angstkonditionierung und Rota-Rod-Tests zu schätzen. Die Tukey-Kramer-Methode wurde verwendet, um die Bedeutung dieser Verhaltensmessungen zwischen DAT zu bestimmen+/- Mäuse und die Kontroll-Wurfgeschwister. Im Freiland- und erhöhten Plus-Labyrinth-Test wurden Einweg-ANOVA- und Post-hoc-Dunnett-Test verwendet, um Genotypeffekte zu bestimmen. Kontinuierliche Variablen werden als Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Daten wurden unter Verwendung von SPSS Version 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) analysiert. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn P <0.05 war.
Anerkennungen
Wir danken Dr. Xiaoxi Zhuang von der University of Chicago für die Bereitstellung von DAT+/- KO-Mäuse und Brianna Klein für technische Hilfe bei Experimenten.
Fußnoten
Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Finanzierung: Diese Forschung wurde durch Mittel von NIMH (MH060236), NIA (AG024022, AG034663 & AG025918), USAMRA00002, der Georgia Research Alliance und der Wissenschafts- und Technologiekommission der Stadt Shanghai (10140900500) (alle an JZT) unterstützt. National Science Foundation of China (81000592), Wissenschafts- und Technologiekommission der Stadt Shanghai (10DZ2272200, 09DZ2200900, 10PJ1407500 und 10JC1411200), Shanghai Municipal Education Commission (11ZZ103) an FL und XMS. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Datenerfassung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.
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