Saccharose-Aufnahme induziert schnellen AMPA-Rezeptor-Handel (2013)

Die Mechanismen, durch die natürliche Belohnungen wie Zucker synaptische Übertragung und Verhalten beeinflussen, sind weitgehend unerforscht. Hier untersuchen wir die Regulation von Nucleus Accumbens Synapsen durch Saccharose-Aufnahme. Frühere Studien haben gezeigt, dass der AMPA-Rezeptor-Transport ein Hauptmechanismus zur Regulierung der synaptischen Stärke ist in vitroDer Transport von AMPA-Rezeptoren, die die GluA1-Untereinheit enthalten, erfolgt durch einen zweistufigen Mechanismus, der einen extrasynaptischen und dann einen synaptischen Rezeptortransport beinhaltet. Wir berichten, dass bei Ratten die wiederholte tägliche Einnahme einer 25% Saccharoselösung vorübergehend erhöhte spontane Lokomotion und potenzierte accumbens Kern Synapsen durch Einbau von Ca²⁺-permeable AMPA-Rezeptoren (CPARs), die GluA1-haltige, GluA2-fehlende AMPA-Rezeptoren sind. Elektrophysiologische, biochemische und quantitative elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass das Saccharosetraining (7 Tage) eine stabile (> 24 Stunden) intraspinöse GluA1-Population induzierte und dass bei diesen Ratten ein einzelner Saccharosestimulus schnell (5 Minuten), aber vorübergehend (<24 Stunden) anstieg GluA1 an extrasynaptischen Stellen. CPARs und Dopamin-D1-Rezeptoren waren erforderlich in vivo für erhöhte Fortbewegung nach Saccharose-Einnahme. Signifikanterweise induzierte ein 7-Tag-Protokoll der täglichen Einnahme einer 3% -Lösung von Saccharin, einem kalorienfreien Süßstoff, synaptisches GluA1 ähnlich wie 25% Saccharose-Aufnahme. TDiese Ergebnisse identifizieren das zuvor beschriebene mehrstufige GluA1-Trafficking in vitro, als ein Mechanismus für die akute Regulierung der synaptischen Übertragung in vivo durch eine natürliche orosensorische Belohnung. Der Handel wird durch einen chemosensorischen Stoffwechselweg stimuliert, der nicht vom Kaloriengehalt von Saccharose abhängig ist.

Themen und chirurgische Verfahren

Die Probanden waren männliche Sprague-Dawley-Ratten (Taconic; Verhaltensexperimente) mit 150-300-Gramm bei Ankunft und weibliche E18-schwangere Sprague-Dawley-Ratten (Taconic; Zellkulturexperimente). Die Ratten wurden 2 pro Käfig für Verhaltensexperimente an einem 12h / 12h-Hell-Dunkel-Zyklus (leuchtet bei 18: 00) untergebracht und hatten Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum jederzeit. Alle experimentellen Verfahren wurden von der New York University School of Medicine für die Tierpflege und -verwendung genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit den "Prinzipien der Labortierpflege" (NIH-Veröffentlichungsnummer 85-23) durchgeführt.

Saccharosetraining und Fortbewegungsmessungen

Die Ratten wurden für 3 h / Tag in ihren Heimkäfigen in den Testraum 2 aufeinanderfolgende Tage transportiert. Am vierten Tag wurden Flaschen, die Wasser oder 25% Saccharose enthielten, durch den Käfigdeckel für 5 min eingeführt. Die Flaschen wurden dann gewogen. Für alle Experimente mussten die Ratten mindestens 1 g Saccharose während des 5 min-Zugangs innerhalb von 3-Tagen nach Beginn des Trainings trinken, um in die Studie aufgenommen zu werden; Tatsächlich erfüllten alle Ratten dieses Kriterium. Nach dem Entfernen der Flasche verblieben die Ratten vor dem Transport in die Tiereinrichtung im Untersuchungsraum für 30 min. Am Tag des Opfers wurden Ratten durch CO bewusstlos gemacht₂durch Guillotine enthauptet, und Gewebeproben wurden auf Eis gesammelt. Für lokomotorische Experimente wurden Ratten in Bewegungsmesskammern (Accuscan, Columbus, OH) für insgesamt 35-min platziert. Nach 15-min in der Kammer wurde eine Flasche mit einem Wulststopfen durch den oberen Teil der Kammer eingeführt und stabilisiert. Die Flasche wurde nach 5-min von der Oberseite der Kammer entfernt und die Ratten blieben nach der Entfernung der Flasche für weitere 15-min in der Kammer. Diese Prozedur wurde für 7 aufeinanderfolgende Tage identisch wiederholt. Die zurückgelegte Entfernung wurde unter Verwendung des VersaMax-Systems (Accuscan, Columbus, OH) gemessen, das die Tieraktivität über ein Gitter von 16 × 16-Infrarotlichtstrahlen beobachtete, die den Tierkäfig (42 × 42 × 30 cm) von vorne nach hinten und von links nach rechts durchqueren . Informationen über den Strahlstatus, die mit einer Rate von 100-Zeiten pro Sekunde abgetastet wurden, wurden auf der Platte gespeichert. Die Aktivität wurde ausgedrückt als ambulante Distanz, gemessen in cm während 12 verschiedener 3-min-Fächer in einer 35 min-Sitzung (das letzte Fach war 2-min).

Saccharin-Training

Um den Saccharose-induzierten Transport von GluA1 mit den Wirkungen der Saccharin-Aufnahme zu vergleichen, wurden erwachsene 12-männliche Ratten (250 g) in der Tiereinrichtung in einem 12-Stunden-Hell / Dunkel-Zyklus untergebracht. Alle Ratten wurden dann an den Testraum gewöhnt, indem sie in den Testraum gebracht, 2-Stunden lang gelassen und zurück zur Tiereinrichtung transportiert wurden. An einem 4-Tag (nach 3-Tagen der Habituation) erhielten die Ratten Zugangsflaschen, die Wasser, Saccharose oder Saccharin enthielten. 4-Ratten erhielten Zugang zu einer Flasche mit Wasser, die auf dem oberen Teil des Käfigs ruhte, wobei der Ausguss durch den Deckel in den Käfig ragte. Die Zugangszeit betrug 5 Minuten, dann wurde die Flasche entfernt und nach 15 min zusätzliche Minuten wurden die Ratten zurück in die Tiereinrichtung transportiert. 4-Ratten wurde Zugang zu 25% Saccharoselösung gegeben und 4 Ratten wurde Zugang zu 3% Saccharinlösung (Sweet'n Low) gegeben. Das Volumen der verbrauchten Flüssigkeit wurde gemessen. Dieser Vorgang wurde für 7-Tage wiederholt. An dem 7-Tag des Trinkens, unmittelbar nach der Flaschenentfernung, wurden die Ratten getötet und der Accumbens-Kern wurde geerntet und die GluA1-Spiegel wurden durch Western-Blot untersucht.

Elektrophysiologie

Die Ratten wurden wie oben beschrieben in klaren Kunststoffkäfigen mit Saccharose behandelt und nach der Flaschenentfernung am Tag 7 mit Ketamin (100 mg / kg ip) und Xylazin (10 mg / kg ip) anästhesiert und mit kalter Kochsalzlösung transkardial perfundiert (mEPSC-Experimente). oder sofort enthauptet (Rektifikationsexperimente). Die Gehirne wurden schnell in künstliche cerebrospinale Flüssigkeit (ACSF) entfernt, die aus folgendem bestand (in mM): für mEPSC-Experimente: NaCl (118), KCl (2.5), CaCl₂ (3), MgCl₂ (1), NaHCO₃ (26), NaH₂PO₄ (1), D-Glucose (10), Osmolarität, eingestellt auf 325 mOsm und belüftet durch 95% O₂/ 5% CO₂ (pH 7.4); für Rektifikationsexperimente: 75-Saccharose, 87-NaCl, 2.5-KCl, 1.25-NaH₂PO₄, 0.5 CaCl₂, 7 MgCl2 6 H₂O, 25 NaHCO₃, 10-Dextrose, gesprudelt mit 95% O₂ / 5% CO₂ (pH 7.4). Koronale Scheiben (300 & mgr; m dick), die den Nucleus accumbens enthielten, wurden in eiskaltem ACSF unter Verwendung eines Vibrotoms (Leica, VT1200S) geschnitten und in ACSF (ACSF, in mM: 124 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH) eingetaucht gehalten₂PO₄, 2.5 CaCl₂, 1.5 MgSO₄ 7H2O, 26 NaHCO₃und 10 Dextrose) für <30 min; dann in einem Scheibenvorinkubator mindestens 1 Stunde lang bei Raumtemperatur aufbewahrt, um eine Erholung zu ermöglichen. Für mEPSC-Experimente: Eine einzelne Scheibe wurde dann in eine Aufzeichnungskammer überführt, in der sie von einem Nylonnetz bei 32 ° C mit einem TC324B-Inline-Lösungsheizer und -controller (Warner Instruments, CT) untergetaucht gehalten wurde. Die Kammer wurde kontinuierlich durch ACSF mit einer konstanten Geschwindigkeit von 2 ml / min perfundiert. Mittlere stachelige Neuronen aus der Kernregion des Nucleus accumbens wurden unter visueller Anleitung unter Verwendung von Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast-Videomikroskopie (Hamamatsu C5405) mit einem aufrechten Olympus BX50WI-Mikroskop identifiziert, das mit einem 40-fach Wasserimmersionsobjektiv mit Arbeitsabstand ausgestattet war. Patchelektroden (4–6 MΩ), gefüllt mit einer intrazellulären Pipettenlösung bestehend aus (in mM): CsCl (145), HEPES (10), EGTA (0.5) und MgATP (5). Die Osmolarität wurde mit Saccharose auf 290 mOsm eingestellt, und der pH wurde mit CsOH auf 7.4 eingestellt. Miniatur-exzitatorische postsynaptische Ströme (mEPSCs) wurden in Gegenwart von Bicucullin (10 uM) und Tetrodotoxin (1 uM) unter Verwendung eines Axopatch 200B-Verstärkers (Molecular Devices, CA) aufgezeichnet und durch Digidata 1322A (Molecular Devices, CA) digitalisiert. Für Rektifikationsexperimente: Die Scheiben wurden in die Aufzeichnungskammer überführt und perfundiert (2.0–2.5 ml min^-1) mit oxygeniertem ACSF bei 33-35 ° C, das 50 & mgr; m Picrotoxin enthält, um EPSCs zu isolieren. Somatische Ganzzell-Aufzeichnungen wurden von Mittelstachel-Nervenzellen in Spannungsklemme mit einem Multiclamp-700B-Verstärker (Molecular Devices) unter Verwendung von IR-DIC-Videomikroskopie hergestellt. Patch-Pipetten (4-6 MΩ) wurden mit intrazellulärer Lösung gefüllt (in mM: 125 Cs-Gluconat, 2 CsCl, 5 TEA-Cl, 4 Mg-ATP, 0.3 GTP, 10 Phosphokreatin, 10 HEPES, 0.5 EGTA und 3.5 QX -314). Die Daten wurden bei 2 kHz gefiltert, bei 10 kHz digitalisiert und mit Clampfit 10 (Molecular Devices) analysiert. Extrazelluläre Stimulation (0.01-1 ms, 5-150 & mgr; A, 0.2 Hz) wurde mit einer kleinen bipolaren Glaselektrode 0.05-0.5 mm von der Aufzeichnungselektrode aufgebracht. Nach ~ 10 min der Grundlinienaufzeichnung wurde eine Lösung, die Naspm (200 & mgr; M) enthielt, für 10 min in das Bad perfundiert. Änderungen der EPSC-Amplitude wurden vor und nach der Medikamentenapplikation bei Haltepotentialen von -70, -50, -30, 0, + 20, + 40 und + 60 mV gemessen. Der Rektifikationsindex (i_r) wurde berechnet, indem mögliche Verschiebungen des Umkehrpotentials korrigiert und aus der folgenden Gleichung berechnet wurden: i_r = (I_-70 / 70) / (I₊₄₀ / 40), wo I_-70 und I₊₄₀ sind die EPSC-Amplituden bei -70 mV bzw. + 40 mV aufgezeichnet.

Subzelluläre Fraktionierung und Western Blotting

Accumbens wurde wie oben beschrieben auf Eis gesammelt. Wenn Kern und Schale getrennt seziert wurden, wurde die Trennung bestätigt, indem Synaptosomen-Fraktionen auf Dopamin-β-Hydroxylase untersucht wurden, ein Enzym, das in den Enden von Axonen an der Schale, aber nicht am Kern gefunden wurde (Sesack und Gnade, 2010). Ganze Zell-, Synaptosomen- und PSD-Fraktionen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Jordan et al., 2004). Synaptosomale Pellets wurden in 200 & mgr; l 25 mM Tris mit 1% Triton X-100 resuspendiert, bei 4 ° C für 30-min geschüttelt und mit 13,800 × g für 15-min in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um PSDs zu pelletieren. Das Pellet, das rohe PSDs enthielt, wurde in 25 mM Tris mit 2% SDS resuspendiert. Die Fraktionen wurden durch Western-Blot auf SDS-PAGE-Gelen wie zuvor beschrieben analysiert (Jordan et al., 2004). Die folgenden Antikörper wurden verwendet: Dopamin-β-Hydroxylase (1: 1,000, Abcam), GluA1 (1: 1,000, Millipore), Phosphor-Ser 845 GluA1 (1: 1,000, Millipore), GluA2 (1: 1,000, Millipore) und Tubulin (1: 10,000, Sigma).

Elektronenmikroskopie

Am Tag der Gewebeentnahme (Tag 7 des Saccharosetrainings) wurden Ratten aus 3-Testgruppen (Wasser, Saccharose / Wasser, Saccharose; 3-Ratten / Testgruppe) in Bewegungs-Messkammern für 15-min; Bei 15-min wurde eine Flasche durch die Kammeroberseite eingeführt. Ratten in der Wassergruppe erhielten Wasser, Ratten in der Ucrose-Gruppe erhielten 25% Saccharose, Ratten in der Saccharose / Wasser-Gruppe, die 25% Saccharose für 6 Tage verbraucht hatten, erhielten Wasser. Die Ratten wurden mit Nembutal (50 mg / kg ip) tief anästhesiert und mit 0.1 M Phosphatpuffer (pH 7.4), der 4% Paraformaldehyd und 0.1% Glutaraldehyd enthielt, mit einer Rate von 50 ml / min während des ersten 3-min und dann bei 1600 transcardial perfundiert eine Rate von 20 ml / min für die nachfolgende 7-min. Das Gewebe wurde für die post-markierte Immunogold (PEG) -Markierung vorbereitet und die Bilder wurden wie zuvor beschrieben (Nedelescu et al., 2010). Immunolabels wurden gemäß ihrer Position relativ zu der PSD an asymmetrischen synaptischen Verbindungen als "Spalt", "nahe PSD" (innerhalb der 1-PSD-Breite von der PSD), "bei PSD", "intraspinös" oder "extrasynaptische Membran" kategorisiert Jedes Tier, 93 Synapsen waren Proben aus dem Kern der Accumbens. Die Zufallsstichproben wurden durch die Analyse aller ersten 93-Zufallssynapsen sichergestellt, während wir systematisch über das Gitter fegten und dann die gleiche Anzahl von Synapsen von jedem der drei Tiere, die identische Ante-Mortem-Behandlungen erhielten, zusammenfassten. Zwei Arten der Quantifizierung wurden durchgeführt. Eine bestand darin, das GluR1-Immunoreaktivitätsniveau zu bewerten, indem die Anzahl der PEG-Partikel, die an diskreten funktionellen Domänen der Wirbelsäule auftraten, berechnet wurde. Die andere bestand darin, den Anteil der Synapsen, die an der PSD durch eine beliebige Anzahl von PEG-Partikeln markiert wurden, zu bestimmen. Selbst Synapsen, die nur mit 1-PEG-Partikeln markiert waren, wurden als markiert betrachtet, basierend auf früheren Arbeiten, die die Spezifität des GluR1-PEG-Verfahrens demonstrierten (Nedelescu et al., 2010). Behandlungseffekte auf den Anteil und das Niveau der GluR1-Immunmarkierung wurden durch Einweg-ANOVA mit geplanten Post-hoc-Vergleichen (Fisher's LSD) analysiert. Um die experimentelle Verzerrung zu eliminieren, wurden die Daten dreifach geblindet: Ein Experimentator führte Saccharose-Training durch und führte Aufzeichnungen der Tiere in den drei Testgruppen, ein zweiter Experimentator erstellte die Elektronenmikroskopaufnahmen und ordnete jedem Mikrographen einen neuen alphanumerischen Code zu und versiegelte den Code und drei weitere Experimentatoren scannten die Mikrophotographien und quantifizierten PEG-Partikel. Nachdem die PEG-Quantifizierung abgeschlossen war, kamen die Experimentatoren zusammen, um die Identitäten jeder mikroskopischen Aufnahme aufzudecken.

Kanülenimplantation und intrakranielle Injektionen

Intrakranielle Injektion wurde verwendet, um Naspm und APV an den Accumbens-Kern zu liefern. Zur Kanülenimplantation, wie zuvor beschrieben (Carr et al., 2010) wurden Ratten mit Ketamin (100 mg / kg ip) und Xylazin (10 mg / kg ip) tief anästhesiert und postoperativ mit dem analgetischen Benamin (1 mg / kg subkutan) injiziert. Die Ratten wurden stereotaktisch mit zwei 26-Meßkanülen (PlasticsOne, Roanoke, VA) bilateral in den Accumbens-Kern mit den Koordinaten 1.6 mm vor dem Bregma implantiert; 2.9 mm lateral der Sagittalnaht, Spitzen 8 ° zur Mittellinie, 5.6 mm ventral zur Schädeloberfläche. Kanülen wurden durch dentales Acryl an Ort und Stelle gehalten, und die Durchgängigkeit wurde mit einem Okklusions-Stilett beibehalten. Für intrakraniale Injektionen wurden Naspm- und APV-Lösungen in zwei 30-cm-Längen von PE-50-Schläuchen gegeben, die an einem Ende an 25-ul-Hamilton-Spritzen, die mit destilliertem Wasser gefüllt waren, und an dem anderen Ende an 31-Injektorkanülen, die 2.0 mm verlängerten, angebracht waren jenseits der implantierten Führungen. Die Spritzen wurden auf den Zwillingshaltern einer Harvard 2272-Mikroliter-Spritzenpumpe befestigt, die die 0.5 & mgr; l-Injektionsvolumina über einen Zeitraum von 100 sek. Eine Minute nach Beendigung der Injektionen wurden die Injektorkanülen aus den Führungen entfernt, die Stilette wurden ersetzt und die Tiere wurden in die Bewegungs-Testkammern für das Saccharose-Training gegeben. Nach Tieropfern wurden kryogene Hirnschnitte auf Kanülokalisation untersucht; 2 von 15-Tieren wurde aufgrund einer ungeeigneten Kanülenplazierung von der Studie ausgeschlossen.

statistische Analyse

Einweg-ANOVA gefolgt von Fisher-Post-hoc-Tests wurde für Elektronenmikroskopie, Immunzytochemie und Biotinylierungsexperimente verwendet. Zweiseitige Student-t-Tests wurden für die Elektrophysiologie verwendet. Für Sucrose-Hyperaktivitätsexperimente wurde eine Zweiwege-ANOVA verwendet, gefolgt von Fisher-Post-hoc-Tests.

Charakterisierung eines Sucrose Ingestion Paradigmas

Wir verwendeten ein Sucrose-Ingestion-Paradigma, um die Auswirkungen einer natürlichen, orosensorischen Belohnung auf die synaptische Übertragung zu untersuchen (Abbildung 1A). Erwachsene männliche Ratten wurden an drei aufeinanderfolgenden Tagen in einen Testraum transportiert. Am vierten Tag (erster Trainingstag) wurden die Ratten in eine Bewegungs-Messkammer gelegt. Nach der 15-Minuten-Messung der Bewegungsaktivität in der Kammer wurden Flaschen, die entweder Wasser (für Wassertiere) oder 25% Saccharoselösung (für Saccharose-Tiere) enthielten, durch Löcher im Deckel der Kammer in die Messkammern eingeführt. Die Flaschen wurden nach 5 Minuten entfernt und die lokomotorische Aktivität wurde für weitere 15 Minuten gemessen, bevor die Tiere in die Heimkäfige zurückgebracht wurden. Wir haben dieses Verfahren für 7-Folgetage wiederholt. In einigen Experimenten wurde das Saccharosetraining auf ein 8 erweitert^th Tag. Dieser kurze, nicht-kontingente Zugang zu einer sehr wohlschmeckenden Lösung erlaubte es uns, sowohl akute als auch kumulative Effekte der Saccharose-Aufnahme zu untersuchen, da Tiere innerhalb von drei Tagen nach dem Training zuverlässig Saccharose während des Zugangsfensters zuverlässig absorbierten (Abbildung 1B). Diese experimentellen Bedingungen ermöglichten den Vergleich von Testgruppen unmittelbar nach Beendigung der Einnahme. Unser Kriterium für die Aufnahme in die Studie war, dass Ratten während der Zugangszeit innerhalb von drei Tagen nach Beginn des Trainings mindestens ein Gramm Saccharose zu konsumieren beginnen; Auf der Grundlage dieses Kriteriums wurden keine Tiere von der Studie ausgeschlossen.

  

Figure 1

Wiederholte Saccharoseaufnahme verursacht vorübergehende Erhöhungen der spontanen Fortbewegung.

Wir haben beobachtet, dass Saccharose-Tiere innerhalb von drei Tagen nach dem Training signifikant mehr Saccharose-Lösung konsumierten als Wasser-Tiere, die Wasser konsumierten (Abbildung 1B). Während an den Trainingstagen 1-6 (Daten nicht gezeigt) keine signifikanten Unterschiede in der spontanen Fortbewegung beobachtet wurden, beobachteten wir zusätzlich eine signifikante Erhöhung der gesamten zurückgelegten Distanz in Saccharose-Tieren im Vergleich zu Wassertieren in den drei Minuten nach Flaschenentfernung am Tag 7 (Abbildung 1D), und dieser Unterschied war auch am Tag 8 (Abbildung 1E). Zwischen den Saccharose- und den Wassertieren wurden in den drei Minuten vor der Flascheneinführung an keinem der Testtage Unterschiede in der Gesamtdistanz beobachtet (Abbildung 1C), was darauf hindeutet, dass eine erhöhte Fortbewegung eine akute Reaktion auf die Saccharose-Aufnahme war, die für die mit Saccharose trainierte Ratte spezifisch ist, und nicht auf eine konditionierte Reaktion auf die Bewegungskammer. Im Einklang mit dieser Möglichkeit bestand eine signifikante positive Korrelation zwischen der Menge an verbrauchtem Saccharose und der gesamten zurückgelegten Strecke (Abbildung 1F). Es gab keinen Unterschied in den Tiergewichten zwischen den Saccharose- und Wassergruppen vor oder nach den 7-Trainingstagen (Daten nicht gezeigt).

Saccharose-Aufnahme induziert CPAR-Einbau

Sucrose-Training führte am letzten Trainingstag zu einer vorübergehenden Erhöhung der Fortbewegung. Um zu bestimmen, ob diese Konsequenz der Saccharoseaufnahme durch elektrophysiologische Veränderungen im Nucleus accumbens, einer Region, die Belohnungsverhalten reguliert, begleitet wurde, haben wir Nucleus accumbens Scheiben unmittelbar nach Flaschenentfernung am Tag 7 präpariert und von Neuronen des accumbens Kerns aufgenommen (Abbildung 2A). Die Kernsubregion wurde mit lokomotorischen Reaktionen auf Belohnungsreize in Zusammenhang gebracht (Sesack und Gnade, 2010). Wir fanden, dass sowohl die Amplitude als auch die Frequenz der spontanen exzitatorischen postsynaptischen Miniaturströme (mEPSCs) im accumbens-Kern von Saccharose-Tieren im Vergleich zu Wassertieren signifikant höher waren (Abbildung 2B). Dies zeigte, dass ein wiederholter Saccharoseverbrauch die synaptische Übertragung im Nucleus accumbens Kern positiv regulieren könnte. Um zu bestimmen, ob die CPAR-Inkorporation eine Rolle bei der Potenzierung nach Saccharose spielte, bestimmten wir Rektifikationsindizes für Accumenskernneuronen durch Messung von EPSCs bei unterschiedlichen Membranpotentialen (Abbildungen 2C, 2D und 2E). CPARs rekrutieren innerlich an depolarisierten Potentialen wegen endogener Polyaminblockade. Wir beobachteten eine signifikante Rektifikation in Aufzeichnungen von Neuronen von Saccharose-Tieren, was durch Nichtlinearität in der I / V-Beziehung im Vergleich zu Wassertieren (Abbildung 2E), zusätzlich zu einer signifikanten Erhöhung des Rektifikationsindex (Abbildung 2F).

  

Figure 2

Accumbens Kern Synapsen werden nach wiederholter Einnahme von Saccharose potenziert.

Um die Erhöhung der CPAR-Spiegel durch eine andere Methode zu bestätigen, haben wir aus Akcumbens-Kernneuronen nach Einschluss des spezifischen CPAR-Blockers 1-Naphthylacetylspermin (Naspm) im Bad aufgezeichnet. Wir fanden, dass Naspm die EPSC-Amplitude in Aufzeichnungen von Neuronen aus Saccharose, aber nicht von Wassertieren (Abbildungen 3A-C). Zusätzlich wurde nach Naspm-Behandlung die I / V-Beziehung in Neuronen von Saccharose-Tieren linear, was die Hemmung von CPARs in Saccharose-Tiersynapsen widerspiegelt, während nach Naspm-Behandlung in Neuronen von Wassertieren keine signifikante Auswirkung auf die I / V-Beziehung beobachtet wurde (Abbildungen 3D). Diese Ergebnisse zeigen, dass wiederholte Saccharose-Aufnahme den Einbau von CPARs in Synapsen des Accumbens-Kerns induziert.

  

Figure 3

Saccharoseaufnahme verursacht den Einbau von Ca2 + -permeablen AMPA-Rezeptoren.

Saccharose-Aufnahme induziert GluA1-Trafficking

CPARs sind AMPA-Rezeptoren, denen die GluA2-AMPA-Rezeptor-Untereinheit fehlt. Daher beinhaltet der synaptische Einbau von CPARs am häufigsten den synaptischen aktivitätsabhängigen Transport der GluA1-Untereinheit (Er und andere, 2009; Isaacet al., 2007; Liu und Zukin, 2007; Plant et al., 2006). Um den synaptischen Einbau von CPAR nach dem Saccharose-Training zu bestätigen, untersuchten wir, ob die Aufnahme von Saccharose die synaptische Expression von GluA1 erhöhte. Die Ratten erhielten Zugang zu Saccharose, wie oben für 7 aufeinanderfolgende Tage beschrieben. An den Tagen 1, 3, 5 und 7 isolierten wir die gesamte Zell-, Synaptosomen- und postsynaptische Dichte (PSD) von drei Hirnregionen: accumbens core (Kern), accumbens shell (Schale) und somatosensorischer Kortex (Cortex). Wir analysierten die gesamten Zell- und PSD-Fraktionen durch Western Blot für die Expression von GluA1 und GluA2.

Wir fanden keine Veränderungen in GluA1 oder GluA2 in den gesamten Zellfraktionen von Accumbens-Lysaten an den untersuchten Testtagen, was darauf hindeutet, dass wiederholter Saccharoseverbrauch nicht die Gesamthöhe dieser Proteine ​​reguliert (Abbildungen 4A-C). In den accumbens PSD-Fraktionen stieg jedoch GluA1 am Tag 7 im Kern signifikant an, aber nicht in der Schale, während sich GluA2 in beiden Fraktionen nicht signifikant veränderte (Abbildungen 4D-4F und Daten nicht gezeigt). Wir beobachteten keinen signifikanten Anstieg von GluA1 in den Accumbens-Kern-PSD-Fraktionen an den vorhergehenden Testtagen (Abbildungen 4D-F) und GluA1 oder GluA2 änderten sich an keinem der Testtage in den Kortex-PSD-Fraktionen (Daten nicht gezeigt). Erhöhte GluA1, insbesondere relativ zu GluA2, in akkumulierten Kern-PSDs nach wiederholter Saccharose-Aufnahme entspricht der in Accumbens-Kernneuronen beobachteten erhöhten Rektifikation, wie oben beschrieben.

  

Figure 4

Postsynaptische Dichte GluA1, aber nicht GluA2, ist im Nucleus Accumbens-Kern nach Sucrose-Aufnahme erhöht.

Es wurde gezeigt, dass das aktivitätsabhängige GluA1-Trafficking zur synaptischen Plastizität beiträgt in vitro und in vivo (Lu und Roche, 2011). Ein schneller, mehrstufiger Mechanismus für das GluA1-Trafficking wurde demonstriert in vitro (Serulleet al., 2007; Sun et al., 2008; Sun et al., 2005). Bislang jedoch der Beitrag dieses mehrstufigen Mechanismus zur gluA1 synaptischen Akkumulation in vivo wurde nicht getestet. Um zu bestimmen, ob das Saccharosetraining den GluA1-Transport akut durch den mehrstufigen Mechanismus induziert, lokalisierten wir GluA1 an Nucleus accumbens-Synapsen von Saccharose- und Wasser-trainierten Tieren durch quantitative Elektronenmikroskopie. Das Kerngewebe von Accumbens wurde am siebten Tag des Saccharose-Trainings aus 3-Testgruppen von Ratten geerntet. Dies waren Ratten, die (1) Wasser für 7-Tage (Wasser) verbrauchten, 2) Saccharose für 7-Tage (Saccharose) verbraucht und 3) Saccharose für 6-Tage verbraucht und Wasser am Tag 7 (Saccharose / Wasser). Ratten wurden auf dem 7 getötet^th Tag, 5 Minuten nach Verbrauch von Saccharose oder Wasser. Somit zeigte der Vergleich von zwei der Testgruppen, Saccharose / Wasser und Saccharose-Tiere, miteinander und mit Wassertieren die Zeitskala von postsynaptischen Veränderungen, die durch Saccharoseverbrauch in Saccharose-trainierten Ratten induziert wurden. Wir haben postembed immunogold (PEG) -markiertes GluA1 in 5 verschiedenen postsynaptischen Kompartimenten gemessen: dendritisches Wirbelsäulencytosol (intraspinös), extrasynaptische Plasmamembran (Membran), PSD, nahe PSD und synaptischer Spalt, wobei die letzten drei Kompartimente als "PSD" zusammengefasst sind "(Abb. 5A). Um die Voreingenommenheit des Experimentators zu eliminieren, wurden Elektronenmikroskop-Testgruppenidentitäten von dreifach geblendet.

  

Figure 5

Die Elektronenmikroskopie zeigt die Induktion von mehrstufigem GluA1-Transport durch Saccharose-Aufnahme.

Sowohl Saccharose- als auch Saccharose / Wasser-Tiere zeigten signifikant erhöhte intraspinöse GluA1-Werte im Vergleich zu Wassertieren (Abb. 5B und 5C). Dies deutet darauf hin, dass der chronische Saccharoseverbrauch einen intrazellulären Pool von GluA1-haltigen AMPA-Rezeptoren angrenzend an synaptische Stellen, Rezeptoren, die leicht für synaptisches Trafficking verfügbar sind, erhöht und dass dieses intrazelluläre Reservoir für 24 Stunden nach dem letztendlichen Konsum von Saccharose persistieren kann . Wir untersuchten dann die wichtige Frage, ob ein akuter Saccharosestimulus einen schnellen GluA1-Transport induzieren kann. Wir beobachteten, dass die extrasynaptische Plasmamembran GluA1 bei Saccharose-Tieren im Vergleich zu Saccharose / Wasser und Wasser Tieren signifikant erhöht war (Abbildungen 5B und 5D). Diese Beobachtung zeigt, dass eine natürliche, orosensorische Belohnung, die durch einen einzelnen Saccharosestimulus bereitgestellt wird, die extrasynaptische Population von GluA5-haltigen AMPA-Rezeptoren schnell (<24 min), aber vorübergehend (Abklingzeit <1 h) erhöhen kann, wodurch ein labiler Pool entsteht, aus dem die Rezeptoren stammen kann Verkehr zur Synapse.

Bedeutend, in vitro Studien haben gezeigt, dass der synaptische Einbau von AMPA-Rezeptoren in 2-Schritten stattfindet. In der ersten Phase erhöht die Glutamat- oder Dopamin-abhängige Ser-845-Phosphorylierung die Rezeptoren an extrasynaptischen Stellen in der Plasmamembran (Esteban et al., 2003; Serulleet al., 2007; Sun et al., 2008; Sun et al., 2005), während in der zweiten Ser 818 Phosphorylierung die synaptische Inkorporation fördert (Boehm et al., 2006). Unser elektronenmikroskopischer Vergleich von Saccharose-Tieren mit Saccharose / Wasser und Wasser-Tieren zeigt, dass der erste Schritt des GluA1-Traffickings beobachtet wurde in vitro (Makino und Malinow, 2009), findet auch ein schneller Transport zur extrasynaptischen Membran statt in vivo nach der Bereitstellung einer orosensorischen Belohnung.

In Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Elektrophysiologie- und biochemischen Ergebnissen zeigte PEG EM, dass die Sucrose-Aufnahme auch den zweiten Schritt des GluA1-Trafficking des GluA1-Rezeptoreintritts in die Synapse induzierte, da das Niveau der GluA1-Immunreaktivität an der PSD im Vergleich zu Wasserratten signifikant höher für Saccharose war. und es gab einen Trend zu erhöhtem GluA1 in Saccharose / Wasser verglichen mit Wasserratten (Abbildungen 5B und 5E). Die Zunahme an Saccharose / Wasser-Tieren ist konsistent mit entweder schneller Inkorporation von GluA1, das mit einer synaptischen Halbwertszeit von ~ 24 hr zerfällt, oder schneller Inkorporation von GluA1 und Ersatz durch synaptisches GluA1 / 2 über einen ähnlichen Zeitraum. Der Prozentsatz an Synapsen, die GluA1 in der PSD exprimieren, war auch bei Saccharose-Ratten im Vergleich zu Wasserratten signifikant höher (Abbildung 5F), was darauf hindeutet, dass GluA1 zu Synapsen gehandelt wurde, denen zuvor GluA1 fehlte. Dies legt auch nahe, dass der bei Saccharoseratten beobachtete Anstieg der mEPSC-Amplitude auf einen Anstieg des synaptischen GluA1 zurückzuführen ist und dass der Anstieg der mEPSC-Frequenz auf die Rekrutierung von GluA1 zu zuvor stillen Accumbens-Synapsen zurückzuführen sein kann, obwohl die Potenzierung der Glutamatfreisetzung nicht ausgeschlossen werden kann. Wir haben auch die Anzahl der Synapsen in jeder der drei Testgruppen gemessen, um zu bestimmen, ob die Aufnahme von Saccharose die Synaptogenese induziert; Es gab keine Unterschiede zwischen den drei Testgruppen (Daten nicht gezeigt). Wir schließen daraus, dass die wiederholte Einnahme von Saccharose einen stabilen (> 24 Stunden) intraspinösen Pool von GluA1 erhöht und ein einziger Saccharosestimulus für eine mit Saccharose trainierte (6 Tage) Ratte ausreicht, um GluA5 in der extrasynaptischen Plasmamembran möglicherweise schnell (1 Minuten) zu erhöhen Rezeptoren aus dem intraspinösen Pool ziehen. Wir schlagen vor, dass ein Teil dieser extrasynaptischen Rezeptoren stabil in die PSD eingebaut wird, was zu den beobachteten Rektifikationsindex- und PSD-GluA1-Änderungen führt, bevor der extrasynaptische Pool 24 Stunden nach der Stimulation zur Grundlinie zurückkehrt. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine natürliche Belohnung einen schnellen GluA1-Handel bei einem trainierten Tier akut induzieren kann.

CPAR-Aktivität ist für erhöhte Fortbewegung nach Saccharose-Einnahme erforderlich

Mittlere stachelige Neuronen erhalten sowohl dopaminerge als auch glutamaterge Inputs (Calabresi, et al., 1992). Um die Beteiligung des Glutamat-Signalwegs bei der erhöhten spontanen Fortbewegung, die wir nach Saccharose-Aufnahme bei Saccharose-trainierten Ratten beobachteten, zu untersuchen, implantierten wir Kanülen in den Accumbens-Kern von Ratten und trainierten Tiere in Bewegungs-Messkammern, wie oben beschrieben. Am Tag 8 des Saccharose-Trainings injizierten wir Naspm vor der Platzierung in der Bewegungs-Testkammer in den Kern. Die Injektion verringerte die Gesamtdistanz der Saccharose-Tiere und beseitigte den Unterschied zwischen Saccharose- und Wassertieren, die unmittelbar nach der Flaschenentfernung gesehen wurden (Abbildung 6A). Um zu bestätigen, dass Stress, der durch den Umgang mit den Tieren verursacht wurde, die Saccharose-Reaktion nicht beeinflusst hatte, injizierten wir am folgenden Tag Kochsalzlösung in den Kern (Tag 9 des Saccharose-Trainings); Bei den Saccharose-Tieren wurde unmittelbar nach der Flaschenentfernung erneut eine signifikante Hyperaktivität beobachtet (Abbildung 6B). Dies zeigt, dass Naspm Saccharose-induzierte Erhöhung der Fortbewegung spezifisch gehemmt hatte. Die Injektion des NMDAR-Antagonisten APV in den Kern an den folgenden Tagen eliminierte auch den Unterschied zwischen Saccharose- und Wassertieren (Abbildung 6C), was zeigt, dass NMDARs auch für die Erhöhung der spontanen Fortbewegung nach der Einnahme von Saccharose erforderlich sind. Um zu bestimmen, ob eine konditionierte Antwort auf die Testkammer eine Rolle bei der Hyperaktivitätsinduktion spielte, wurden Tiere in die Kammer für 35 min ohne Flascheneinführung gegeben; Zwischen Saccharose und Wassertieren wurden keine Unterschiede in der zurückgelegten Entfernung beobachtet (Abbildung 6D). Naspm und APV beeinflussten den Saccharoseverbrauch nicht (Abbildung 6E), die zeigen, dass Kern-CPARs und NMDARs für eine kräftige Einnahme von Saccharose nicht erforderlich sind. Tiere, bei denen keine Kanülen in den Accumbens-Kern (2 aus 15-Tieren) eingesetzt wurden, wie nach der Tötung bewertet (Abbildung 6F) wurden nicht in die Studie einbezogen. Zusammenfassend zeigen diese Daten zusammen, dass der Konsum von Saccharose durch eine mit Saccharose trainierte Ratte in 1-Minuten zu einem synaptischen Verkehr von GluA5 führt, und dass die Blockade von Signalmechanismen, die diesen Verkehr steuern, die Erhöhung der spontanen Bewegungsaktivität nach Saccharose verhindert.

  

Figure 6

Eine erhöhte spontane Fortbewegung nach Einnahme von Saccharose erfordert CPARs und NMDARs.

Es können zwei Wege für die Saccharosesignalisierung in Betracht gezogen werden. Ein rein chemosensorischer oder orosensorischer Weg wird durch die Bindung von Sucrose an den Rezeptor mit süßem Geschmack initiiert, der dem heteromerischen G-Protein-gekoppelten Rezeptorkomplex T1R2 / T2R3 (Kitagawa et al., 2001; Max et al., 2001; Nelson et al., 2001; Sainz et al., 2001). Kalorienreiche Nährstoffe können die Funktion des Gehirns auch unabhängig vom Geschmack durch Stoffwechselwege regulieren, obwohl die Mechanismen nicht gut verstanden werden (de Araujo et al., 2008). Um zwischen diesen beiden Alternativen für den durch Sucrose induzierten Weg des GluA1-Transports zu unterscheiden, wiederholten wir das Trainingsprotokoll mit drei Gruppen von Ratten (4-Ratten / Gruppe), die für 5-Minuten Zugang zu Flaschen erhielten, die Wasser, 25% Sucrose-Lösung enthielten oder 3% Saccharin (süß und niedrig). Die Flaschen wurden entfernt und die Ratten blieben 15 Minuten länger im Übungskäfig. Das Training wurde für 7-Tage wiederholt. Die von den Saccharose- und Saccharin-Testgruppen verbrauchten Flüssigkeitsmengen unterschieden sich nicht signifikant voneinander und beide waren größer als der Verbrauch in der Wassergruppe, was mit der Belohnung der beiden süßen Substanzen übereinstimmt (Abbildung 7A). Am 7-ten Tag des Trinkens wurden die Ratten unmittelbar nach der Flaschenentfernung getötet, das Accumbens-Kerngewebe für jede Testgruppe geerntet und gepoolt, die PSD-Fraktion isoliert und die mit Western Blot untersuchten GluA1-Spiegel (Abbildung 7B). Wie zuvor zeigten Tiere, die Saccharose konsumierten, erhöhte GluA1-Werte in der PSD-Fraktion im Vergleich zur Wassergruppe (Abbildung 7C). Bezeichnenderweise war GluA1 auch in der PSD-Fraktion von Tieren, die Saccharin konsumierten, erhöht. Es gab keinen signifikanten Unterschied in den GluA1-Spiegeln in den gesamten Zellfraktionen des Accumbens-Kerns von Wasser-, Saccharose- und Saccharin-Tieren, was darauf hindeutet, dass der GluA1-Anstieg spezifisch für die synaptische Fraktion war (Abbildung 7D). Da Saccharin den gleichen heteromerischen G-Protein-gekoppelten Geschmacksrezeptorkomplex stimuliert wie Saccharose (Masuda et al., 2012; Nelson et al., 2001), dem jedoch der Kalorienwert fehlt, schließen wir, dass die Stimulation des Rezeptors für süßen Geschmack ausreicht, um Signale zu initiieren, die den GluA1-Spiegel an den Kernsynapsen des Nukleus accumbens erhöhen.

  

Figure 7

Saccharin-Training führt zu einem Anstieg des synaptischen GluA1, ähnlich dem Saccharosetraining.

Wir danken den Mitgliedern des Ziff-Labors in Vergangenheit und Gegenwart für technische Unterstützung und hilfreiche Diskussionen, darunter H. Girma, L. Lee und Dr. B. Fernholz, B. Jordan, W. Lu, G. Rameau, S. Restituito & Y. Serulle. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Mental Health Predoctoral Fellowship F31MH76617-01 und dem NIH Training Grant 5T32DC000063 für das Ausbildungsprogramm der New York University in den Neurowissenschaften (DST), R01NS061920 des National Institute of Neurological Disorders and Stroke (EBZ), 1R21MH091445- unterstützt 01 vom Nationalen Institut für psychische Gesundheit und dem Büro für Frauengesundheitsforschung, der Klarman Family Foundation gewährt Programm für Essstörungenforschung, dem NYU Research Challenge Fund und P30EY13079 (CA), dem Nationalen Institut für Drogenmissbrauch, Zuschuss DA003956 und einem Independent Investigator Award von NARSAD (KDC), Nationales Institut für Taubheit und andere Kommunikationsstörungen, gewährt RCF DC009635 und durch ein Startkapital im Center of Excellence on Addiction des Langone Medical Center der New York University.

Interessenkonflikt: Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

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