Ein Antagonist des Ghrelin-Rezeptors (GHS-R1A) verringert die lohnenden Eigenschaften von Morphin und erhöht die Opioidpeptid-Spiegel in Belohnungsbereichen von Mäusen (2015)

Die akute und chronische Exposition von Suchtmitteln beeinflusst das mesolimbische Dopaminsystem, einen wichtigen Schaltkreis der Gehirnbelohnungssysteme (Nestler, 2005), erheblich. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Effekte zumindest teilweise der Entwicklung der Drogensucht zugrunde liegen (Wise, 2004). Drogensucht verursacht eine Vielzahl von schädlichen Auswirkungen auf den Einzelnen und die Gesellschaft, und neue pharmakologische Maßnahmen zur Behandlung dieses großen Problems der öffentlichen Gesundheit sind gerechtfertigt (Koob und Le Moal, 2001). Durch Aufklärung der Signalsysteme, die die Fähigkeit von Suchtmitteln zur Aktivierung des mesolimbischen Dopaminsystems vermitteln, können einzigartige Behandlungsstrategien für Störungen des Substanzgebrauchs identifiziert werden.

Untersuchungen haben gezeigt, dass gemeinsame neurobiologische Mechanismen die Aufnahme und Belohnung von Nahrungsmitteln und Suchtmitteln regulieren (Morganstern et al., 2011), was nahe legt, dass die Rolle der lebensmittelregulierenden Darm-Gehirn-Peptide wie Ghrelin die Belohnungsvermittlung umfasst. Zunächst konnte gezeigt werden, dass Ghrelin die Freisetzung von Wachstumshormon bewirkt (Kojima et al., 1999) und bei Ratten Adipositas induziert (Tschop et al., 2000). Bis heute ist bekannt, dass Ghrelin die Nahrungsaufnahme, den Hunger und den Appetit anregt hypothalamische Schaltkreise (zur Übersicht siehe Egecioglu et al. (2011)). Zusätzlich zum Hypothalamus werden Ghrelinrezeptoren (GHS-R1A) in belohnungsbezogenen Bereichen wie Amygdala, Striatum, präfrontaler Kortex, ventraler Tegmentbereich (VTA) und Hippocampus exprimiert (zur Übersicht siehe Engel und Jerlhag (2014)) Die physiologische Rolle von Ghrelin geht über die Regulierung der Energiehomöostase hinaus. In der Tat wurde gezeigt, dass das orexigene Peptid Ghrelin ein Aktivator des mesolimbischen Dopaminsystems sowie ein Regulator der Belohnung, Motivation und Aufnahme von Alkohol, Nikotin, Amphetamin und Kokain bei Mäusen ist (zur Übersicht siehe Engel und Jerlhag (2014)).

Opioide aktivieren wie andere Suchtmittel das mesolimbische Dopaminsystem und verursachen eine akkumbale Dopaminfreisetzung Aktivierung von μ- und / oder δ-Opioidrezeptoren im Nucleus accumbens (NAc) (Hirose et al., 2005, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999) und im VTA, vermutlich durch Verminderung der GABA -Inhibition von Dopamin-Neuronen (Johnson und North, 1992). Darüber hinaus regulieren akkumbale κ-Opioidrezeptoren die Aktivität des mesolimbischen Dopaminsystems (Chefer et al., 2005, Spanagel et al., 1992). Wiederholte Exposition gegenüber Opioiden führt zu adaptiven Veränderungen mehrerer Neurotransmitter, einschließlich Opioidpeptiden, in Belohnungsbereichen, die zur Entwicklung von Sucht beitragen (De Vries und Shippenberg, 2002). Bei Ratten vermindert die pharmakologische Suppression von GHS-R1A die Morphin-induzierte akumbale Dopaminfreisetzung sowie das stereotype Verhalten (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Ziel des ersten Teils der vorliegenden Versuchsreihe war es, den akuten Effekt eines GHS-R1A-Antagonisten, JMV2959, auf die Fähigkeit von Morphin zu untersuchen, eine lokomotorische Stimulation, eine akumbale Dopaminfreisetzung und eine konditionierte Platzpräferenz bei Mäusen zu bewirken. Das Ziel des zweiten Teils dieser Studie war es, die Wirkung einer wiederholten Behandlung mit JMV2959 oder Ghrelin auf die Opioidpeptidspiegel (Met-Enkephalin-Arg⁶Phe⁷ (MEAP), Dynorphin B (DynB) und Leu-Enkephalin-Arg⁶ (LeuArg)) in belohnungsbezogenen Bereichen wie Amygdala, Striatum, präfrontaler Cortex, VTA und Hippocampus.

Es wurden adulte männliche NMRI-Mäuse (8 – 12 Wochen alt und 25 – 40 g Körpergewicht; Charles River, Sulzfeld, Deutschland) verwendet, die dem Alter nach dem Pubertieren entsprachen. Kurz gesagt, alle Mäuse wurden in Gruppen gehalten und in einem 12 / 12 h-Hell / Dunkel-Zyklus gehalten (Licht an um sieben Uhr morgens). Leitungswasser und Futter (Normalfutter; Harlan Teklad, Norfolk, England) wurden geliefert nach Belieben, außer während des Versuchsaufbaus. Für jeden einzelnen Verhaltenstest sowie für die Opioidpeptidanalyse wurden neue Mäuse verwendet. Die Experimente wurden von der schwedischen Ethikkommission für Tierforschung in Göteborg genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der verwendeten Tiere zu verringern. Alle Tiere durften sich mindestens eine Woche vor Beginn der Versuche akklimatisieren.

Morphinhydrochlorid (Apoteksbolaget Sahlgrenska Hospital; Göteborg, Schweden) wurde in Vehikel (0.9% Natriumchloridlösung) gelöst und vor Beginn des Experiments ip mit einer Dosis von 20 mg / kg 10 min verabreicht. Diese Dosis wurde ausgewählt, da eine niedrigere Dosis (10 mg / kg, ip) bei unseren Mäusen keine lokomotorische Stimulation verursachte (Daten nicht gezeigt). Die ausgewählte Dosis (6 mg / kg, ip) von JMV2959 (synthetisiert am Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR5247, CNRS, Montpellier, 1 und 2, Frankreich), einem GHS-R1A-Antagonisten, wurde zuvor bestimmt und hat Keine Auswirkung auf die Bewegungsaktivität, die akumbale Dopaminfreisetzung und die Präferenz für konditionierte Orte bei Mäusen (Jerlhag et al., 2009). JMV2959 wurde in Vehikel (0.9% Natriumchloridlösung) gelöst und wurde immer zwanzig Minuten vor der Morphinexposition oder Enthauptung zur Analyse der Opioidpeptidspiegel verabreicht. Die ausgewählte Dosis von JMV2959 hatte in keinem Experiment einen Einfluss auf das Bruttoverhalten der Mäuse. Für die Verhaltenstests wurde JMV2959 akut verabreicht, da unsere durchgängigen Studien zeigen, dass eine einzelne Injektion von JMV2959 die medikamenteninduzierte Belohnung abschwächt (Übersicht siehe Engel und Jerlhag (2014)). JMV2959 wurde für die Opioid-Peptid-Analyse für fünf aufeinanderfolgende Tage subchronisch verabreicht, um die Möglichkeit zu erhöhen, einen robusten Effekt festzustellen. Darüber hinaus vermeiden Sie mit wiederholten Injektionen den möglichen störenden Effekt von akutem Injektionsstress auf Peptide. Acyliertes Rattenghrelin (Bionuclear; Bromma, Schweden) wurde in 0.9% Natriumchlorid verdünnt, und es wurde zuvor gezeigt, dass die ausgewählte Ghrelin-Dosis (0.33 mg / kg, ip) bei Mäusen (Jerlhag, 2008) Belohnungen hervorruft. Ein ausgewogenes Design wurde für alle Arzneimittelherausforderungen verwendet.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Morphin bei Nagetieren eine lokomotorische Stimulation bewirkt (Wise und Bozarth, 1987). Die Bewegungsaktivität wurde in acht schallgedämpften, belüfteten und schwach beleuchteten Bewegungskästen (420 × 420 × 200 mm, Kungsbacka mätoch reglerteknik AB; Fjärås, Schweden) registriert. Fünf mal fünf Reihen von Lichtschrankenstrahlen auf dem Boden des Kastens, die eine Lichtschrankenerkennung ermöglichten, ermöglichten es einem computergestützten System, die Aktivität der Mäuse zu registrieren. Die lokomotorische Aktivität wurde definiert als die akkumulierte Anzahl neuer Fotozellenstrahlen, die während einer 60-min-Periode unterbrochen wurden. In allen Experimenten durften sich die Mäuse eine Stunde vor der Arzneimittelbelastung an die Box für die lokomotorische Aktivität gewöhnen. Es gab keine Unterschiede zwischen der Gewöhnung in einer der Behandlungsgruppen (Daten nicht gezeigt).

In der ersten Versuchsreihe wurden die Auswirkungen von JMV2959 (6 mg / kg, ip) auf die morphininduzierte (20 mg / kg, ip) lokomotorische Stimulation untersucht. JMV2959 wurde 20 min vor der Morphingabe verabreicht und die Aktivitätsregistrierung begann zehn Minuten nach der letzten Injektion. Jede Maus erhielt eine Behandlungskombination (Vehikel / Vehikel, JMV2959 / Vehikel, Morphium / Vehikel oder JMV2959 / Morphium; n= 8 pro Behandlungskombination) und wurde nur einem experimentellen Versuch unterzogen.

Um die Wirkungen von JMV2959 auf die vorteilhaften Wirkungen von Morphin bei neuen Mäusen zu bewerten, wurden Präferenztests für konditionierte Orte bei Mäusen wie zuvor beschrieben durchgeführt (Jerlhag, 2008). Kurz gesagt wurde ein Zweikammer-CPP-Apparat mit 45 lx-Beleuchtung und unterschiedlichen visuellen und taktilen Hinweisen verwendet. Ein Abteil bestand aus schwarz-weiß gestreiften Wänden und einem dunklen Laminatboden, während das andere einen weiß gestrichenen Holzboden und Wände aus Holzstruktur aufwies. Das Verfahren bestand aus Vorkonditionierung (Tag 1), Konditionierung (Tage 2 – 5) und Nachkonditionierung (Tag 6). Bei der Vorkonditionierung wurde den Mäusen das Vehikel ip injiziert und sie wurden während 20 min in die Kammer mit freiem Zugang zu beiden Fächern gebracht, um die anfängliche Präferenz für den Ort (oder die Seite) zu bestimmen. Die Konditionierung (20 min pro Sitzung) wurde unter Verwendung eines voreingenommenen Verfahrens durchgeführt, bei dem Morphium (20 mg / kg) mit dem am wenigsten bevorzugten Abteil und Fahrzeug mit dem bevorzugten Abteil gepaart wurde. Alle Mäuse erhielten jeden Tag eine Injektion von Morphium sowie Vehikel, und die Injektionen wurden zwischen Morgen und Nachmittag in einem Waagendesign geändert. Bei der Nachkonditionierung der Mäuse (n= 16) wurden JMV2959 (6 mg / kg, ip) oder ein gleiches Volumen der Trägerlösung injiziert, und 20 min wurde später auf der Mittellinie zwischen den beiden Kompartimenten mit freiem Zugang zu beiden Kompartimenten für 20 min angeordnet (wodurch die folgenden Behandlungsgruppen erzeugt wurden; Morph-Veh und Morph-JMV2959).

Die Präferenz für den Ort des Zustands wurde als Differenz in% der Gesamtzeit berechnet, die in dem Arzneimittelpaar verbracht wurde (dh. am wenigsten bevorzugt) Fach während der Nachkonditionierung und der Vorkonditionierungssitzung.

Angesichts der Tatsache, dass JMV2959 die durch Morphin induzierte lokomotorische Stimulation und die Vorliebe für konditionierte Orte bei Mäusen abschwächt, wurde die Wirkung von JMV2959 (6 mg / kg, ip) auf die durch Morphin induzierte (20 mg / kg, ip) akumbale Dopaminfreisetzung unter Verwendung von untersucht in vivo Mikrodialyse bei sich frei bewegenden Mäusen. Zur Messung der extrazellulären Dopaminspiegel wurden Mäuse einseitig mit einer im Nucleus accumbens positionierten Mikrodialysesonde implantiert. Daher wurden die Mäuse mit Isofluran (Isofluran Baxter; Univentor 400 Anesthesia Unit, Univentor Ldt., Zejtun, Malta) anästhesiert, in einen stereotaktischen Rahmen (David Kopf Instruments; Tujunga, CA, USA) gelegt und auf einem Heizkissen gehalten, um dies zu verhindern Unterkühlung. Xylocain-Adrenalin (5 & mgr; g / ml; Pfizer Inic; New York, USA) wurde als Lokalanästhetikum verwendet, und Carprofen (Rimadyl, 5 mg / kg ip) (Astra Zeneca; Göteborg, Schweden) wurde verwendet, um mögliche Schmerzen zu lindern. Der Schädelknochen wurde freigelegt und ein Loch für die Sonde und ein Loch für die Verankerungsschraube wurden gebohrt. Die Sonde wurde zufällig entweder zur linken oder rechten Seite des Gehirns gewechselt. Für den Nucleus accumbens (Franklin und Paxinos, 1.5) wurden die Koordinaten 0.7 mm vor dem Bregma ± 4.7 lateral zur Mittellinie und 1997 mm unter der Oberfläche der Gehirnoberfläche verwendet. Die freiliegende Spitze der Dialysemembran (20,000 kDa, abgeschnitten mit einem OD / ID von 310 / 220 μm, HOSPAL, Gambro, Lund, Schweden) der Sonde betrug 1 mm. Alle Sonden wurden zwei Tage vor dem Experiment chirurgisch implantiert. Nach der Operation wurden die Mäuse bis zum Testtag (Macrolon III) in Einzelkäfigen gehalten.

Am Testtag wurde die Sonde an eine Mikroperfusionspumpe (U-864 Syringe Pump; AgnThós AB) angeschlossen und mit Ringer-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 1.5 μl / min perfundiert. Nach einer Stunde Gewöhnung an den Mikrodialyse-Aufbau wurden alle 20 min Perfusionsproben entnommen. Der Grundlinien-Dopaminspiegel wurde als Durchschnitt von drei aufeinanderfolgenden Proben vor der ersten Arzneimittel- / Vehikel-Exposition definiert, und der Anstieg von akkumbalem Dopamin wurde als prozentualer Anstieg gegenüber der Grundlinie berechnet. Nach den Grundlinienproben (-40 min bis 0 min) wurde Mäusen JMV2959 oder Vehikel (bei 0 min) injiziert, gefolgt von einer Morphin- oder Vehikelinjektion (bei 20 min). Nach diesen Arzneimittelverabreichungen wurden weitere acht 20-Min-Proben entnommen. Zusammen die folgenden Behandlungsgruppen (n= 8 in jeder Gruppe) wurden erstellt: Fahrzeug-Fahrzeug (Veh-Veh), Fahrzeug-Morphin (Veh-Morph), JMV2959-Fahrzeug (JMV2959-Veh) und JMV2959-Morphin (JMV2959-Morph).

Die Dopamingehalte in den Dialysaten wurden durch HPLC mit elektrochemischem Nachweis bestimmt. Eine Pumpe (Gyncotec P580A; Kovalent AB; V. Frölunda, Schweden), eine Ionenaustauschersäule (2.0 × 100 mm, Prodigy 3 μm SA; Skandinaviska GeneTec AB; Kungsbacka, Schweden) und ein Detektor (Antec Decade; Antec Leyden; Zoeterwoude) , Niederlande), die mit einer VT-03-Durchflusszelle (Antec Leyden) ausgestattet waren, verwendet. Die mobile Phase (pH 5.6), bestehend aus Sulfonsäure 10 mM, Zitronensäure 200 mM, Natriumcitrat 200 mM, 10% EDTA, 30% MeOH, wurde unter Verwendung eines 0.2 & mgr; m Membranfilters (GH Polypro; PALL Gelman Laboratory; Lund, Schweden). Die mobile Phase wurde mit einer Flussrate von 0.2 ml / min durch einen Entgaser (Kovalent AB) abgegeben und der Analyt wurde bei + 0.4 V oxidiert.

Nachdem die Mikrodialyseexperimente abgeschlossen waren, wurden die Mäuse enthauptet und die Sonden mit Pontamin Sky Blue 6BX perfundiert, um die Sondenlokalisierung zu erleichtern. Die Gehirne wurden auf eine Vibroslice-Vorrichtung (752 M Vibroslice; Campden Instruments Ltd., Loughborough, UK) montiert und in 50 & mgr; m-Schnitte geschnitten. Die Position der Sonde wurde durch grobe Beobachtung unter Verwendung von Lichtmikroskopie bestimmt. Die genaue Position der Sonde wurde verifiziert (Franklin und Paxinos, 1997) und nur Mäuse mit korrekten Platzierungen wurden in der statistischen Analyse verwendet.

Die Auswirkungen der JMV2959-Behandlung auf die Werte von MEAP, DynB und LeuArg in belohnungsbezogenen Bereichen wurden untersucht. Mäusen wurde entweder JMV2959 (6 mg / kg, ip, n= 8) oder ein gleiches Fahrzeugvolumen (ip, n= 8) für fünf aufeinanderfolgende Tage. 20 min nach der letzten Injektion wurden die Mäuse getötet und die Gehirne von diesen Mäusen wurden gesammelt. Separaten Mäusen wurde entweder Ghrelin (0.33 mg / kg, ip, n= 8) oder ein gleiches Fahrzeugvolumen (ip, n= 8) für fünf aufeinanderfolgende Tage. Fünf Minuten nach der letzten Injektion wurden die Mäuse getötet und die Gehirne dieser Mäuse gesammelt. Amygdala, Striatum, präfrontaler Cortex, VTA und Hippocampus wurden schnell präpariert und sofort auf Trockeneis gelegt und dann bis zur weiteren Verarbeitung bei –80 ° C gelagert.

Die Homogenisierungs- und Peptidextraktionsverfahren folgten einem zuvor detailliert beschriebenen Standardverfahren (Nylander et al., 1997). Kurz gesagt wurde heiße (95ºC) Essigsäure (1 M) zu den gefrorenen Proben gegeben. Die Proben wurden in einem Wasserbad (95 ° C) für 5 min erhitzt, auf Eis gekühlt und dann mit einem Branson Sonifier (Danbury, CT, USA) homogenisiert. Das Homogenisat wurde erneut bei 95 ° C für 5 min erhitzt und auf Eis gekühlt, bevor es für 15 min bei 4 ° C und 12,074 × zentrifugiert wurdeg in einer Beckman GS-15R-Zentrifuge (Fullerton, CA, USA). Die Extrakte wurden nach einem zuvor beschriebenen Verfahren (Nylander et al., 1997) weiter gereinigt. Es wurden zwei Fraktionen gesammelt: Fraktion III (Leu-Arg und MEAP) und Fraktion V (DynB). Die Proben wurden in einer Vakuumzentrifuge (Savant SpeedVac Plus SC210A; Thermo Scientific Inc., Waltham, MA USA) getrocknet und bis zur Peptidanalyse im Gefrierschrank (-20 ° C) aufbewahrt.

Die immunreaktiven (ir) Spiegel von DynB, LeuArg und MEAP wurden mit gut etablierten Radioimmunoassays analysiert und die Protokolle wurden an anderer Stelle ausführlich beschrieben (Nylander et al., 1997). Im DynB-Assay wurde Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (GARGG; Bachem, Bubendorf, Schweiz) verwendet, um freies und Antikörper-gebundenes Peptid zu trennen. Das Dyn-Antiserum (113 +) wurde in einer Endverdünnung von 1: 600000 verwendet. Die Kreuzreaktivität mit Big Dyn betrug 100% und mit DynB (1 – 29) 1%. Es wurde keine Kreuzreaktivität mit anderen Opioidpeptiden beobachtet. In den LeuArg- und MEAP-Assays wurde eine Kohlesuspension verwendet, um freies und an Antikörper gebundenes Peptid zu trennen. Für das LeuArg-Antiserum (91: 6D +, Endverdünnung 1: 60000) betrug die Kreuzreaktivität für Leu-Enkephalin und MEAP weniger als 0.01%, für DynB 0.02% und für alpha-Neoendorphin 0.04%. Das MEAP-Antiserum 0.08: 90D (II) wurde in einer Endverdünnung von 3: 1 160 verwendet. Kreuzreaktivität mit Met-Enkephalin, Met-Enkephalin-Arg⁶Met-Enkephalin-Arg⁶Gly⁷Leu⁸, Leu-Enkephalin und Leu-Enkephalin-Arg⁶ war <0.1%

Nach systemischer Verabreichung von Morphin (20 mg / kg) und JMV2959 (6 mg / kg) (F (3,27) = 7.409 wurde bei Mäusen eine allgemeine Hauptwirkung der Behandlung auf die Bewegungsaktivität festgestellt. P= 0.0009; n= 8 für Veh – Veh, JMV2959-Veh, JMV2959-Morph und n= 7 für Veh-Morph). Wie gezeigt in Figure 1Eine posthoc-Analyse ergab, dass die Vorbehandlung mit einer einzigen Injektion von JMV2959 (P<0.001) schwächte die Morphin-induzierte lokomotorische Stimulation signifikant ab (P<0.01 Fahrzeug - Fahrzeug vs Veh-Morph). Die ausgewählte Dosis von JMV2959 hatte keinen Einfluss auf die Bewegungsaktivität im Vergleich zur Behandlung mit dem Vehikel (P> 0.05). Es gab keinen Unterschied in der Reaktion der Bewegungsaktivität bei mit Vehikel behandelten Mäusen und mit JMV2959-Morhpin behandelten Mäusen (P> 0.05).

  

Figure 1

Der GHS-R1A-Antagonist JMV2959 schwächt die durch Morphin induzierte lokomotorische Stimulation, die akumbale Dopaminfreisetzung und die Präferenz für konditionierte Orte bei Mäusen ab. (A) Morphin-induzierte (20 mg / kg ip) lokomotorische Stimulation wurde durch eine einzelne Injektion von JMV2959 (6 mg / kg ip) abgeschwächt (n= 7 – 8 in jeder Gruppe; **P<0.01, ***P<0.001 Einweg-ANOVA, gefolgt von einem Bonferroni-Post-Hoc-Test). (B) Die Morphin-induzierte (20 mg / kg ip) Zustandspräferenz (CPP) wurde durch eine akute Einzelinjektion von JMV2959 (6 mg / kg ip) in Mäuse abgeschwächt (n= 8 in jeder Gruppe, *P<0.05, ungepaarter t-Test). (C) Zuerst zeigten wir eine signifikante Wirkung von Morphin (20 mg / kg ip) auf die Erhöhung der Dopaminfreisetzung im Vergleich zur Vehikelbehandlung (Zeitintervall 40–180 min (P<0.001), Veh - Veh vs Veh-Morph). Wie in (C) gezeigt, verringerte die Vorbehandlung mit JMV2959 (6 mg / kg ip) den durch Morphin verursachten Anstieg der Dopaminfreisetzung im Vergleich zur Vorbehandlung mit dem Vehikel im Zeitintervall 40 – 100 und 140 – 180 min (^##P<0.01, ^###P <0.001, JMV2959-Morph im Vergleich zur Veh-Morph-Behandlung). Die ausgewählte Dosis von JMV2959 hatte in keinem Zeitintervall einen signifikanten Einfluss auf die akkumbale Dopaminfreisetzung im Vergleich zur Vehikelbehandlung (P> 0.05, Veh - Veh vs JMV2959-Veh). JMV2959 reduzierte, blockierte jedoch nicht vollständig die Morphin-induzierte akumbale Dopaminfreisetzung im Zeitintervall 60-140 (*P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001, JMV2959-Morph im Vergleich zur Veh-Morph-Behandlung). Pfeile repräsentieren Zeitpunkte der Injektion von JMV2959, Vehikel und Morphin. Daten wurden mit einer Zweiwege-ANOVA analysiert, gefolgt von einem Bonferroni-Post-Hoc-Test (n= 8 in jeder Gruppe). Veh-veh (Quadrat), Veh-Morph (Raute), JMV2959-Veh (Dreieck), JMV2959-Morph (Kreis). Alle Werte sind Mittelwerte ± SEM.

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Die durch Morphium induzierte (20 mg / kg) (Morph-Veh) konditionierte Präferenz wurde durch eine akute einmalige Injektion von JMV2959 (6 mg / kg) (Morph-JMV2959) am Tag nach der Konditionierung signifikant abgeschwächt (P= 0.025, n= 8 in jeder Gruppe; Figure 1B).

Messungen der akkumbalen Mikrodialyse von Dopamin bei Mäusen ergaben insgesamt einen Haupteffekt der Behandlung (F(3,33) = 24.15, P<0.0001), Zeit F(11,308) = 7.05, P<0.0001) und Wechselwirkung Behandlung × Zeit (F(11,308) = 8.63, P<0.0001) (Figure 1C; n= 8 in jeder Gruppe). Morphin erhöhte die akumbale Dopaminfreisetzung im Vergleich zur Vehikelbehandlung im Zeitintervall 40 – 180 min (P<0.001). Wie gezeigt in Figure 1C Dieser Effekt wurde durch Vorbehandlung mit JMV2959 im Zeitintervall 40 – 80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) und 160–180 min (P<0.001). JMV2959 reduzierte die durch Morphin induzierte akumbale Dopaminfreisetzung, blockierte sie jedoch nicht vollständig, da es im Zeitintervall 2959–60 einen Unterschied zwischen der Vehikelbehandlung und der JMV80-Morphinbehandlung gab (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) und 160 min (P<0.05). Die ausgewählte Dosis von JMV2959 hatte in keinem Zeitintervall einen signifikanten Einfluss auf die akkumbale Dopaminfreisetzung im Vergleich zur Vehikelbehandlung (P> 0.05).

Die vorliegende Studie stützt ferner die Hypothese, dass die physiologische Rolle des orexigenen Peptids die Regulierung der Belohnung einschließt. In der Tat haben wir gezeigt, dass die periphere Verabreichung eines GHS-R1A-Antagonisten die Fähigkeit von Morphin vermindert, eine lokomotorische Stimulation zu verursachen, die Dopaminspiegel in NAc zu erhöhen und bei Mäusen eine konditionierte Platzpräferenz zu induzieren. Wir fanden auch heraus, dass eine subchronische Behandlung mit JMV2959, jedoch nicht mit Ghrelin, die ir-Gewebespiegel von MEAP im VTA, DynB im Hippocampus und LeuArg im Striatum erhöhte, was den ersten Beweis dafür liefert, dass die Fähigkeit des Ghrelinsignals, die Verstärkung zu regulieren, Opioidpeptide beinhalten kann .

Die hier dargestellten Daten zeigen, dass die GHS-R1A Antagonismus die Fähigkeit von Morphin wirkt sich auf die mesolimbischen Dopaminsystem bei Mäusen zu aktivieren. In Übereinstimmung damit zeigen die Ergebnisse, dass JMV2959 die Fähigkeit von Morphin blockiert, die extrazellulären Spiegel von akumbalem Dopamin zu erhöhen und bei Ratten ein stereotypes Verhalten zu verursachen (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Unterstützend erhöht die zentrale Ghrelin-Verabreichung den Haltepunkt, jedoch nicht die Anzahl der aktiven Hebelpressen im Zeitplan für die Verstärkung des progressiven Verhältnisses bei Ratten, die Heroin selbst verabreichen (Maric et al., 2012). Die Behauptung, dass das Ghrelin-Signal der Drogenabhängigkeit zugrunde liegt, wird weiter durch die Ergebnisse gestützt, die zeigen, dass JMV2959 die Aufnahme sowie die Motivation zum Alkoholkonsum bei Ratten verringert und dass die durch Amphetamin, Kokain und Nikotin induzierte Belohnung durch den GHS-R1A-Antagonismus bei Nagetieren blockiert wird ( zur Übersicht siehe Engel und Jerlhag (2014)) und dass Polymorphismen in Ghrelin-verwandten Genen mit dem Konsum von Alkohol, Rauchen und Amphetamin verbunden sind (zur Übersicht siehe Engel und Jerlhag (2014)).

Die vorliegenden Ergebnisse mit erhöhten Spiegeln an Opioidpeptiden im Striatum, VTA und Hippocampus nach subchronischer JMV2959-Behandlung legen erstmals Wechselwirkungen zwischen Opioidpeptiden und Ghrelinsignalisierung nahe. Die endogenen Opioide sind an belohnenden Effekten beteiligt, die nicht nur durch Opioide, sondern auch durch andere Missbrauchsdrogen und natürliche Belohnungen hervorgerufen werden, sowie an Anpassungsprozessen, die nach wiederholter Arzneimittelexposition auftreten (Trigo et al., 2010, Van Ree et al., 2000). In der Tat wird die Aktivität des mesolimbischen Dopaminsystems durch endogene Opioide sowohl auf der Ebene des VTA als auch des NAc (Hirose et al., 2005, Spanagel et al., 1992) reguliert, und es wurde gezeigt, dass die Wirkungen entweder direkt oder indirekt sind durch Modulation anderer Sender (Charbogne et al., 2014).

Wir fanden hier heraus, dass eine subchronische JMV2959-Behandlung die MEAP-Spiegel im VTA erhöhte. MEAP stammt ausschließlich aus Proenkephalin und wurde als Marker für Proenkephalin-Peptide verwendet, die hauptsächlich δ-Opioid-Rezeptoren aktivieren. Wir nehmen an, dass die erhöhten Werte von endogenem MEAP im VTA nach der Behandlung mit JMV2959 die Fähigkeit von Morphin, die GABA-Hemmung von mesoakkumbalen Dopamin-Neuronen (Johnson und North, 1992) zu verringern, verhindern, was zu den verringerten Morphin-induzierten Effekten beitragen kann, die nachher beobachtet werden JMV2959. Unterstützend ist, dass GHS-R1A auf GABAergen Interneuronen im VTA lokalisiert ist (Abizaid et al., 2006). Darüber hinaus haben frühere Studien gezeigt, dass die Intra-VTA-Infusion von JMV2959, Unbekannte Mechanismen, die eine durch Ghrelin induzierte Belohnung (Jerlhag et al., 2011) sowie eine durch Ghrelin vermittelte Saccharoseaufnahme bei Nagetieren (Skibicka et al., 2011) dämpfen, legen nahe, dass ventrales tegmentales GHS-R1A für die Belohnungsregulation wichtig ist. Für eine solche Behauptung sprechen die Ergebnisse, die zeigen, dass andere Peptide, die den Hunger regulieren, wie Galanin und Orexin, die lohnenden Eigenschaften von Morphin vermitteln lokale Mechanismen innerhalb des VTA (Narita et al., 2006, Richardson und Aston-Jones, 2012).

Im Striatum stellten wir fest, dass subchronisches JMV2959 die ir-Spiegel von LeuArg erhöht, was darauf hindeutet, dass die Fähigkeit von JMV2959, die durch Morphin induzierte Präferenz für konditionierte Orte, die Dopaminfreisetzung und die lokomotorische Stimulation zumindest teilweise von einer verstärkten akumbalen δ- Opioidrezeptoraktivität. Erhöhte LeuArg-Spiegel können auf eine erhöhte enzymatische Umwandlung von Dynorphinpeptiden in Enkephaline oder auf eine erhöhte Dyn-Freisetzung in der NAc als Reaktion auf erhöhtes Dopamin und einen anschließenden Abbau in LeuArg zurückzuführen sein. Frühere Studien haben jedoch gezeigt, dass die Aktivität des mesolimbischen Dopaminsystems reguliert ist κ-Opioidrezeptoren im NAc (Spanagel et al., 1992) und endogene κ-Opioidrezeptoren bewirken eine tonische Hemmung der mesoaccumbalen Dopamin-Neurotransmission und vermindern die kokaininduzierte Freisetzung von Dopamin in NAc (Chefer et al., 2005) Zeigen Sie, dass JMV2959 die ir-DynB-Werte im Striatum ändert. Daher sind weitere Studien zu Prodynorphinpeptiden erforderlich, um die Wechselwirkungen zwischen GHS-R1A-Antagonismus und Dynorphinen aufzuklären.

In der vorliegenden Studie haben wir auch gezeigt, dass die Behandlung mit JMV2959 die Spiegel von Hippocampus-DynB signifikant erhöht. Ghrelin erhöht die Gedächtniskonsolidierung sowie die Bildung der dendritischen Wirbelsäule, bewirkt eine langfristige Potenzierung und fördert die Gedächtnisförderung Hippocampus GHS-R1A bei Nagetieren (Carlini et al., 2010, Diano et al., 2006). Darüber hinaus zeigen GHS-R1A-Knockout-Mäuse im Morris-Wasserlabyrinth-Test ein verbessertes räumliches Gedächtnis und ein gestörtes kontextuelles Gedächtnis im angstkonditionierenden Paradigma im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (Albarran-Zeckler et al., 2012). Dynorphinpeptide, einschließlich DynB, sind im Hippocampus reichlich vorhanden und schwächen die Langzeitpotenzierung (Chavkin et al., 1985, Wagner et al., 1993) sowie das räumliche Lernen bei Ratten (Sandin et al., 1998). Wir nehmen daher die Hypothese an, dass der GHR-R1A-Antagonist das Belohnungsgedächtnis abschwächen kann, indem er die langfristige Potenzierung des Hippocampus hemmt Aktivierung von DynB. Zusammen bieten diese Daten einen neuen potenziellen Mechanismus für JMV2959 Opioidpeptide können die Verstärkung verändern. Opioidrezeptoren sind jedoch im Gehirn weit verbreitet, was darauf hindeutet, dass andere Bereiche, die in der vorliegenden Studie nicht berücksichtigt wurden, an der durch GHS-R1A regulierten, durch Morphin induzierten Belohnung beteiligt sind. Zum Beispiel wird die Ghrelin-induzierte Nahrungsaufnahme sowie das Hebelpressen für Saccharose durch zentrale oder intra-hypothalamische Verabreichung eines κ-Opioidrezeptor-Antagonisten (Romero-Pico et al., 2013) verringert. Die Rolle von Opioidpeptiden in anderen Bereichen muss jedoch in kommenden Studien geklärt werden.

Die endogenen & mgr; -Rezeptorliganden, Endomorphine und & bgr; -Endorphin, wurden hier nicht analysiert, so dass eine mögliche Wirkung von JMV2959 auf diese Peptide nicht ausgeschlossen werden kann. Tatsächlich umfassen die vorteilhaften Eigenschaften von Morphin μ-Opioidrezeptoren im VTA sowie in NAc (Hirose et al., 2005, Johnson und North, 1992, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999). Ein μ-Rezeptor-Antagonist schwächt jedoch weder die durch Ghrelin induzierte Nahrungsaufnahme (Naleid et al., 2005) noch die durch Ghrelin induzierte lokomotorische Stimulation und akumbale Dopaminfreisetzung (Jerlhag et al., 2011) ab, was darauf hindeutet, dass die Fähigkeit des GHSR- Der 1A-Antagonist zur Regulierung der Verstärkung enthält keine μ-Rezeptoren. Auf der anderen Seite wirkte sich JMV2959 auf Opioidpeptide aus, die von Proenkephalin und Prodynorphin abstammen, was zeigt, dass sie möglicherweise an den durch GHSR-1A-Antagonisten ausgelösten Effekten beteiligt sind.

Während frühere Studien gezeigt haben, dass die systemische Ghrelinverabreichung die Belohnung (Jerlhag, 2008) sowie die Belohnungseigenschaften von Suchtmitteln verbessert (siehe Engel und Jerlhag (2014)), zeigen wir hier, dass sich die subchronische Ghrelinbehandlung nicht verändert hat der ir-Gewebespiegel von Opioidpeptiden in einem der untersuchten belohnungsbezogenen Bereiche. Die systemische Ghrelinverabreichung aktiviert die c-fos-Expression in hypothalamischen Bereichen, jedoch nicht in mesolimbischen und hippocampalen Bereichen (Pirnik et al., 2011), und die Bindung von fluoreszenzmarkiertem Ghrelin ist auf lebensmittelregulierende Neuronen des Hypothalamus beschränkt (Schaeffer et al., 2013) ). Zusammen mit den Ergebnissen, die zeigen, dass Ghrelin, abgesehen von Spurenmengen im Hypothalamus, nach peripherer Ghrelinverabreichung nicht in tieferen Hirnregionen nachgewiesen werden kann (Furness et al., 2011, Grouselle et al., 2008, Sakata et al., 2009 ), erhöht die Möglichkeit, dass systemisches Ghrelin das Belohnungssystem aktiviert indirekte Mechanismen unabhängig von endogenen Opioiden. Unterstützend erfordert die Ghrelin-induzierte akumbale Dopamin-Freisetzung eine vorgeschaltete orexigene hypothalamische Signalübertragung (Cone et al., 2014), die periphere Ghrelin-Verabreichung verändert nicht die Alkoholaufnahme bei Mäusen (Lyons et al., 2008) und die Neutralisierung von peripherem Ghrelin schwächt Alkohol nicht ab -induzierte Belohnung bei Mäusen oder Alkoholkonsum bei Ratten (Jerlhag et al., im Druck). Die Möglichkeit, dass die subchronische Gabe von Ghrelin den ir-Gewebespiegel von Opioidpeptiden erhöht, sollte in Betracht gezogen werden. Dies muss jedoch in kommenden Studien eingehend untersucht werden.

Die Fähigkeit von Suchtmitteln, Stimulation und Dopaminfreisetzung zu bewirken und eine konditionierte Ortspräferenz zu induzieren, hängt eng mit den verstärkenden Eigenschaften von Suchtmitteln zusammen, und diese Parameter werden als Teil des Suchtprozesses angesehen (Wise, 2004). Da wir hier festgestellt haben, dass JMV2959 diese Belohnungsparameter bei Mäusen abschwächt, nehmen wir an, dass GHS-R1A eine wichtige Rolle bei Suchtprozessen spielt und dass endogene Opioide an diesen Prozessen beteiligt sind. Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass GHS-R1A-Antagonisten zur Behandlung der Drogenabhängigkeit aufgeklärt werden sollten.

JE und EJ werden durch Stipendien des schwedischen Forschungsrats (Stipendien Nr. 2011-4646, 2009-2782 und 2011-4819), der schwedischen Gehirnstiftung LUA / ALF (Stipendien Nr. 148251) des Sahlgrenska University Hospital, Alcohol, unterstützt Forschungsrat des schwedischen Alkoholhandelsmonopols und der Stiftungen Adlerbertska, Fredrik und Ingrid Thuring, Tore Nilsson, Längmanska, Torsten und Ragnar Söderberg, Wilhelm und Martina Lundgren, NovoNordisk, Knut und Alice Wallenberg, Magnus Bergvall, Anérs, Jeansons, Åke Wiberg , der Schwedischen Gesellschaft für Medizin, der Schwedischen Gesellschaft für medizinische Forschung und der Gothenburg Psychiatry Research Foundation. Alkoholforschungsrat des schwedischen Alkoholeinzelhandelsmonopols und des schwedischen Forschungsrats (K2012-61X-22090-01-3) unterstützt IN. Die Finanzierungsquellen spielten beim Studiendesign, bei der Erhebung, Analyse und Interpretation der Daten, beim Verfassen des Berichts und bei der Entscheidung zur Veröffentlichung der Daten keine Rolle