Vorne Psychiatrie. 2018; 9: 81.
Veröffentlicht online 2018 Mar 12. doi: 10.3389 / fpyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Yae Eun Park,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* und Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Abstrakt
Hintergrund
Die süchtig machende Nutzung des Internets und von Online-Spielen ist eine potentielle psychiatrische Störung, die als "Internet Gaming Disorder" (IGD) bezeichnet wird. Veränderte microRNA (miRNA) Expressionsprofile wurden in Blut und Hirngewebe von Patienten mit bestimmten psychiatrischen Störungen berichtet und als Biomarker vorgeschlagen. Es gibt jedoch keine Berichte über Blut-miRNA-Profile in IGD.
Methoden
Um IGD-assoziierte miRNAs zu entdecken, analysierten wir die miRNA Expressionsprofile von 51 Proben (25 IGD und 26 Kontrollen) mit dem TaqMan Low Density miRNA Array. Zur Validierung führten wir eine quantitative reverse Transkriptions-PCR mit 36-unabhängigen Proben (20 IGD- und 16-Kontrollen) durch.
Die Ergebnisse
Durch Entdeckung und unabhängige Validierung identifizierten wir drei miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p), die in der IGD-Gruppe signifikant herunterreguliert waren. Individuen mit allen drei miRNA-Veränderungen hatten ein viel höheres IGD-Risiko als solche ohne Veränderung (Odds Ratio (OR) 22, 95% CI 2.29-211.11), und die ORs stiegen dosisabhängig mit der Anzahl der veränderten miRNAs. Die vorhergesagten Zielgene der drei miRNAs waren mit Nervenbahnen assoziiert. Wir untersuchten die Proteinexpression der drei stromabwärts gelegenen Zielgene mittels Western Blot und bestätigten, dass die Expression von GABRB2 und DPYSL2 in der IGD-Gruppe signifikant höher war.
Zusammenfassung
Wir beobachteten, dass die Expression von hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p und hsa-miR-652-3p bei den IGD-Patienten herunterreguliert war. Unsere Ergebnisse werden hilfreich sein, um die Pathophysiologie von IGD zu verstehen.
Einleitung
Die suchterzeugende Nutzung von internet- und internetbasierten Spielen ist nicht nur ein soziales Phänomen in Ländern mit einer umfangreichen Infrastruktur für den Internetzugang, sondern auch eine potenzielle psychiatrische Störung, die als "Internet Gaming Disorder" (IGD) bezeichnet wird (1-3). Epidemiologischen Berichten zufolge variieren die IGD-Prävalenzraten bei Jugendlichen von Land zu Land und reichen von 0.8 bis 26.7% (4). Insbesondere zeigen Studien bei Jugendlichen in vielen asiatischen Ländern wie Südkorea, China, Taiwan, Hongkong und Singapur Prävalenzraten über 10% (4). IGD ist mit einer Beeinträchtigung der kognitiven, psychosozialen Beziehungen und des täglichen Lebens verbunden; zum Beispiel rückläufige akademische oder berufliche Leistungen (4-7). Die IGD wird jetzt in Abschnitt III (Bedingungen für weitere Studien) der fünften Revision des Diagnostischen und Statistischen Handbuchs Psychischer Störungen (DSM-V) (8). Trotz seiner klinisch-sozialen Bedeutung ist wenig über den molekularen genetischen Mechanismus hinter IGD bekannt.
Jüngste groß angelegte Zwillingsstudien haben einen genetischen Hintergrund für IGD vorgeschlagen (9, 10). Vinket al. untersuchten individuelle Unterschiede in der zwanghaften Internetnutzung mit 5,247 eineiigen und zweieiigen adoleszenten Zwillingen in den Niederlanden Twin Register und berichteten, dass 48% der Unterschiede durch genetische Faktoren erklärt wurden (9). Li et al. beobachteten 825-Paare von chinesischen jugendlichen Zwillingen und berichteten, dass genetische Faktoren 58-66% der Unterschiede erklärten (10). Dementsprechend sind Polymorphismen der Gene, die an der Neurotransmission, Kognition und Aufmerksamkeit beteiligt sind, wie das D2-Gen des Dopaminrezeptors (DRD2), Catecholamin-O-Methyltransferase-Gen (COMT), Serotonintransportergen (5HTTLPR), und cholinergischer Rezeptor nikotinischen alpha 4 Gen (CHRNA4) wurde berichtet, dass sie signifikant mit der Internetsucht verbunden sind (11-13). Kürzlich haben Kim et al. Screening von Varianten von mehr als 100 Kandidatengenen in Bezug auf Produktion, Wirkung und Metabolismus von Neurotransmittern durch Next Generation Sequencing Analyse und berichteten, dass rs2229910 von NTRK3 Gen ist mit IGD assoziiert (14).
Zusätzlich zu den genetischen Faktoren ist es auch bekannt, dass neurobehaviorale Phänotypen durch nicht-kodierende RNAs einschließlich microRNAs (miRNAs) epigenetisch kontrolliert werden (15, 16). miRNAs sind kleine nicht-kodierende einzelsträngige RNA-Moleküle (ungefähr 20-23-Nukleotide lang), die die Expression von Protein-kodierenden Genen durch Abbau von mRNAs negativ regulieren und eine kritische Rolle im pathophysiologischen Prozess verschiedener Krankheiten spielen (17). Beweislinien haben gezeigt, dass miRNAs im menschlichen Zentralnervensystem (ZNS) reichlich vorhanden sind und eine Feinabstimmung der Expressionslevel ihrer Zielgene bewirken, die an der Entwicklung und Reifung des ZNS-Systems beteiligt sind (15). In der Tat haben kürzlich durchgeführte Studien gezeigt, dass miRNA-Expressionsprofile im Gehirngewebe von Patienten mit psychiatrischen Störungen verändert sind, was darauf hindeutet, dass ihre Expressionsprofile Biomarker für psychiatrische Störungen sein könnten (15, 16, 18). Zum Beispiel, durch Postmortem-Analyse, Lopez et al. berichteten, dass die Expression von miR-1202, das die Expression des metabotropen Glutamat-Rezeptor-4-Gens reguliert und die Reaktion auf Antidepressiva vorhersagt, in präfrontalen Kortexgeweben von Patienten mit schwerer Depression herunterreguliert war (19). In Bezug auf das Biomarkerscreening hat dieser Ansatz eine klare Einschränkung, da eine Biopsie von ZNS-Gewebe für das Screening unmöglich ist. Da miRNAs im Blut (Plasma oder Serum) nachgewiesen werden können, haben zirkulierende miRNAs einen eindeutigen Vorteil als nicht-invasive Biomarker bei neuropsychiatrischen Erkrankungen. Bislang gab es jedoch keine Studien über zirkulierende miRNA-Profile in IGD. Ein besseres Verständnis zirkulierender miRNA-Expressionsprofile könnte helfen, den Mechanismus der IGD-Entwicklung zu klären und die klinische Translation zu erleichtern.
In dieser Studie wollten wir IGD-assoziierte miRNA-Marker identifizieren, indem wir differentiell exprimierte Plasma-miRNAs zwischen den IGD- und Kontrollgruppen beobachten und ihre biologischen Implikationen untersuchen.
Materialen und Methoden
Studienfächer
Wir haben 3,166 Teenager (im Alter von 12-18 Jahren) mit DSM-V IGD Scoring befragt. Unter ihnen wurden 251 (168-Männchen und 83-Weibchen) als IGD nach den DSM-V-Kriterien diagnostiziert (8). Insgesamt gaben 91-Personen (49-IGDs und 42-Kontrollen) die Einwilligung nach Aufklärung für diese Studie ab. Unter ihnen wurden vier Personen gemäß den Ausschlusskriterien ausgeschlossen. Schließlich wurden 87-Individuen (45-IGD-Probanden und 42-Gesunde-Kontroll-Individuen) für diese Studie aufgenommen. Unter ihnen wurden 51-Teilnehmer (25 IGD-Patienten und 26-Kontrollen) als Erkennungsgruppe von 2014 zu 2016 rekrutiert. Die anderen 36-Teilnehmer (20 IGD-Patienten und 16-Kontrollen) wurden als unabhängige Validierungsgruppe von 2016 rekrutiert. Alle Teilnehmer waren koreanische Einzelpersonen, die aus dem Seoul St. Mary's Krankenhaus (Seoul, Südkorea) und dem Seoul National University Boramae Krankenhaus (Seoul, Südkorea) eingeschrieben waren. Alle Teilnehmer wurden einem strukturierten Interview mit einem Psychiater nach dem koreanischen Kiddie Zeitplan für affektive Störungen und Schizophrenie (K-SADS-PL) unterzogen (20). Alle Teilnehmer absolvierten die Subtests Block Design und Vocabulary der Koreanisch-Wechsler Intelligenzskala für Kinder, 4th edition (K-WISC-IV) (21). Die Impulsivität wurde mit der Barratt Impulsiveness Scale (BIS) (22). Behavioral Inhibition System (BInS) und Behavioural Activation System (BAS) Skalen wurden gemessen, um die Persönlichkeitsdimension zu beurteilen (23). Ausschlusskriterien umfassen frühere oder aktuelle schwere medizinische Störungen (z. B. Diabetes mellitus), neurologische Störungen (z. B. Krampfanfälle, Kopfverletzungen), psychiatrische Störungen (z. B. schwere depressive Störung, Angststörungen), geistige Behinderung oder Drogenmissbrauch (z , Tabak, Cannabis, Alkohol). Die allgemeinen Merkmale der Studienfächer sind in Tabelle zusammengefasst Tabelle1.1. Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Medizinischen Kollegs der Katholischen Universität von Korea (MC16SISI0120) genehmigt. Alle Teilnehmer und ihre Eltern gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung ab.
Tabelle 1
Allgemeine Merkmale der Studienfächer.
| Angewandte F&E | Validierung | Kombiniert | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Control | IGD | P-Wert | Control | IGD | P-Wert | Control | IGD | P-Wert | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Alter Jahre) | |||||||||
| Median (Min-Max) | 13 (12-17) | 13 (12-15) | 0.759 | 15 (13-18) | 14.5 (12-18) | 0.628 | 14 (12-18) | 14 (12-18) | 0.509 |
| Wöchentliche Internet-Spielzeit (h) | |||||||||
| Median (Min-Max) | 5.25 (2-17) | 18 (6-46) | 1.27E-6a | 5.5 (2-23) | 8 (1-112) | 0.374 | 5.5 (2-23) | 14 (1-112) | 1.63E-5a |
| Monatliches Haushaltseinkommen (Mio. KRW) | |||||||||
| Median (Min-Max) | 5 (1-9) | 3 (1-9) | 0.588 | 4 (4-4) | 2 (2-2) | 1.000 | 5 (1-9) | 3 (1-9) | 0.460 |
| Ausbildung (Jahre) | |||||||||
| Median (Min-Max) | 8 (7-9) | 8 (7-9) | 0.584 | 12 (12-12) | 6 (6-13) | 0.305 | 8 (7-12) | 8 (6-13) | 0.269 |
| K-WISC: Blockdesign | |||||||||
| Median (Min-Max) | 10.5 (4-17) | 10 (4-16) | 0.544 | 10 (3-16) | 12.5 (4-15) | 0.125 | 10 (3-17) | 11 (4-16) | 0.598 |
| K-WISC: Vokabular | |||||||||
| Median (Min-Max) | 9 (5-17) | 7 (5-13) | 0.174 | 9.5 (8-15) | 11.5 (5-15) | 0.595 | 9 (5-17) | 9 (5-15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Median (Min-Max) | 24 (17-36) | 37 (22-51) | 3.81E-6a | 29 (17-34) | 59 (22-108) | 1.2E-5a | 25 (17-36) | 40 (22-108) | 2.05E-10a |
| BIS | |||||||||
| Median (Min-Max) | 63 (35-75) | 67.5 (45-81) | 0.080 | 61 (45-79) | 63 (32-82) | 0.835 | 62 (35-79) | 65 (32-82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Median (Min-Max) | 31 (15-40) | 31 (13-51) | 0.558 | 36.5 (22-48) | 34 (27-52) | 1.000 | 32 (15-48) | 34 (13-52) | 0.637 |
| BINS | |||||||||
| Median (Min-Max) | 18 (10-26) | 17.5 (13-27) | 0.642 | 18.5 (12-25) | 20 (13-21) | 0.138 | 18 (10-26) | 19 (13-27) | 0.302 |
IGD, Internet-Spielstörung Patienten; KS, koreanische Internet-Neigungs-Neigungs-Skala; BIS, Barratt-Impulsivitätsskala; BAS, Verhaltensaktivierungssystem; BINS, Verhaltensinhibierungssystem; KRW, koreanischer Won.
aP <0.05 (Mann-Whitney-Wilcoxon-Test).
TaqMan Low Density miRNA Array (TLDA) Experimente
Peripheres Blut wurde von jedem Teilnehmer gesammelt und innerhalb von 4 h zum Labor gebracht, um die Lyse der Blutzellen zu minimieren. Die Probe wurde bei 3,000 rpm für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Dann wurde der Überstand (Plasmaschicht) gesammelt, ohne die Blutzellen zu kontaminieren. Zirkulierende miRNAs wurden unter Verwendung des TaqMan miRNA-ABC-Reinigungskits (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Kurz gesagt, wurden 50 & mgr; l Plasmaprobe und 100 & mgr; L ABC-Puffer gemischt. Nach der Hybridisierung mit zielspezifischen Anti-miRNA-Magnetkügelchen wurden begrenzte zirkulierende miRNAs von den Kügelchen mit 100 & mgr; l Elutionspuffer eluiert. In der Entdeckungsphase wurden 381-miRNAs aus 51-Plasmaproben (25-IGDs und 26-Kontrollen) unter Verwendung des TaqMan miRNA-ABC-Reinigungskits (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers untersucht. Megaplex-Reverse-Transkriptions- und Präamplifikationsreaktionen wurden durchgeführt, um die Menge an cDNA für die miRNA-Expressionsanalyse unter Verwendung von MegaplexPreAmp Primers Human Pool A und TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific) zu erhöhen. Das TLDA-Panel A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) wurde auf dem Echtzeit-PCR-System ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) getestet, um die Expression der miRNAs zu bewerten. Rohdaten wurden mit der ExpressionSuite Software v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) verarbeitet, um Ct-Werte für jede miRNA zu bestimmen.
Datenanalyse für TLDA
Wir haben zuerst die Schwellenzyklen (Ct-Wert) jeder miRNA gemessen. miRNAs mit einem Ct-Wert> 35 wurden als nicht nachweisbar angesehen und von der nachfolgenden Analyse ausgeschlossen. Alle Ct-Werte wurden auf den Ct-Wert von miR-374b (ΔCt-Wert) normalisiert, einer der am stabilsten exprimierten miRNAs, die im menschlichen Plasma zirkulieren (24). Ein log2-Faltenänderungsverhältnis (ΔΔCt-Wert) der Expression wurde unter Verwendung von Mittelwerten von Kontrollproben als ein Kalibrator in dem HTqPCR-Paket in einem Bioconductor (25). Die relative Quantifizierung (RQ) jedes miRNA-Ziels wurde als 2 definiert-ΔΔCt. Für die hypothetische Untersuchung des Unterschieds in der Expression zwischen zwei Gruppen haben wir die Surrogate Variable Analysis (SVA) angewendet, um Heterogenitäten wie Batch - Effekte in den Experimenten mit der jeder Paket in Bioconductor (26). miRNAs mit a P-Werte <0.05 wurden als signifikant unterschiedlich zwischen zwei Gruppen angesehen.
Gen-Anreicherungsanalyse
Für die Analyse der Genmengenanreicherung wurde ToppFun in der ToppGene Suite verwendet (27), um signifikant angereicherte Gene Ontology (GO)28) Begriffe, Pathway und Krankheitsbegriffe. Als Input für diesen Ansatz verwendeten wir 1,230-vorhergesagte Zielgene der miRNA-Kandidaten. Pathway-Analyse wurde verwendet, um signifikante Wege der vorhergesagten Zielgene nach KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP und MSigDBin den ToppGene-Wegen zu finden. Die Bedeutung funktioneller Anreicherungsterme wurde anhand der Bonferroni-adjusted bestimmt P-Wert.
Quantitative Reverse-Transkript-PCR (qRT-PCR) Validierung und Replikation
Um die 10 miRNAs zu validieren, die in der Entdeckungsstufe differentiell exprimiert wurden, wurde qRT-PCR unter Verwendung des TaqMan MicroRNA Assays (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, # 000407; miR-29b-3p, # 000413, miR-125b-5p, # 000449, miR-200c-3p, # 002300, miR-337-5p, # 002156, miR-411-5p, # 001610, miR-423-5p, # 002340, miR-483 -5p, #002338; und miR-652-3p, #002352) und das ViiA7-System (Life Technologies) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Zehn Nanogramm Gesamt-RNA wurden mit miRNA-spezifischen Primern unter Verwendung des TaqMan MicroRNA Reverse Transkription Kits (#4366596, Life Technologies) in Erststrang-cDNA umgewandelt, gefolgt von Echtzeit-PCR mit TaqMan-Sonden. Der RQ jeder miRNA wurde als 2 definiert-ΔCt, wobei ΔCt die Differenz der Schwellenzyklen für die fragliche Probe ist, normalisiert gegen die endogene miRNA (miR-374b-5p, #001319). Alle PCR-Reaktionen wurden dreifach durchgeführt und ihre Ct-Werte wurden gemittelt. Wir berechneten ein log2-Faltungsveränderungsverhältnis (ΔΔCt) jeder miRNA auf die gleiche Weise wie bei der Array-basierten Analyse. Ein nicht-parametrischer Mann-Whitney-Wilcoxon-Test wurde durchgeführt, um die Unterschiede in den Expressionsmengen von miRNAs in zwei Gruppen mit einem Schwellenwert zu testen P-Wert von 0.05.
Western-Blot-Analyse
Jede Serumprobe wurde zuerst an den oberen 14-Proteinen mit hoher Abundanz (Albumin, Immunglobulin G, Immunglobulin A, Serotransferrin, Haptoglobin, alpha-1-Antitrypsin, Fibrinogen, alpha-2-Makroglobulin, alpha-1-saures Glykoprotein, Immunglobulin M, Apolipoprotein AI) depletiert , Apolipoprotein A-II, Komplement C3 und Transthyretin) unter Verwendung der MARS-14-Säule (4.6 × 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) vor der Western-Blot-Analyse. Die ungebundene Fraktion, die von der MARS-14-Säule erhalten wurde, wurde unter Verwendung eines Amicon Ultracel-3-Zentrifugalfilters (3 kDa-Cutoff) konzentriert, und dann wurde die Proteinkonzentration unter Verwendung der Bicinchoninsäure-Methode bestimmt. Die gleichen Mengen (von 10 bis 30 & mgr; g) Kontroll- und IGD-Serumproben wurden auf einem 4-20% Mini-PROTEAN TGX Fertiggel (Bio-Rad, CA, USA) aufgetrennt und auf eine Polyvinylidendifluoridmembran übertragen. Als nächstes wurde die Membran in TBS-T (190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 und 0.05% Tween 20) mit 5% fettfreier Trockenmilch bei Raumtemperatur für 30 min blockiert. Die Membranen wurden dann mit primären Antikörpern gegen DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) und CNR1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology , Inc., Santa Cruz, CA, USA), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) und PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) in TBS-T mit 5 % fettfreie Trockenmilch bei 4 ° C über Nacht und dann mit geeigneten sekundären Antikörpern, entweder Rinder-Anti-Maus (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) oder Ziegen-Anti-Kaninchen (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA) ) konjugiert mit Meerrettichperoxidase bei Raumtemperatur für 1 h. Die Signaldetektion wurde unter Verwendung von Chemilumineszenz mit ECL-Reagens (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) durchgeführt. Wir quantifizierten die Western-Blot-Ergebnisse mit der TotalLab 1D-Analysesoftware (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK). Dann wurde der Densitometrie-Verhältniswert berechnet, indem der Densitometriewert jeder Probe, wie an anderer Stelle beschrieben, geteilt wurde (29). Als Kontrolle für die Normalisierung wurde eine Serumprobe, die aus 46 IGD und Kontrollproben gesammelt wurde, für jedes Experiment verwendet. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung eines nichtparametrischen Mann-Whitney-Wilcoxon-Tests mit einem Schwellenwert bestimmt P-Wert von 0.05.
Die Ergebnisse
Merkmale der Studienfächer
Die demographischen und klinischen Merkmale der Studienteilnehmer sind in der Tabelle dargestellt Tabelle1.1. Als wir die IGD- und Kontrollgruppen nach der koreanischen Internet-Suchtpräferenzskala verglichen haben (K-Scale) wie an anderer Stelle beschrieben (20, 30), zeigte die IGD-Gruppe einen signifikant höheren K-Wert als die Kontrollgruppe (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Tabelle (Table1) .1). Die durchschnittliche wöchentliche Internet-Zeit in der IGD-Gruppe war signifikant länger als die der Kontrollen (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen zwei Gruppen in Bezug auf Alter, monatliches Haushaltseinkommen, Bildungsdauer, Blockgestaltung und Wortschatz-Untertest-Ergebnisse der K-WISC, BIS, BInS und BAS.
Differentiell exprimierte miRNAs zwischen IGD und Kontrollen
Um IGD-assoziierte miRNAs zu entdecken, haben wir einen zweistufigen Ansatz (Discovery und unabhängige Validierung) entwickelt. Das Studiendesign und die Gesamtstrategie sind in Abbildung S1 in Supplementary Material dargestellt. In der Entdeckungsphase analysierten wir miRNA-Expressionsprofile von 51-Proben (25-IGDs und 26-Kontrollen) unter Verwendung des miRNA-Arrays, das 384-miRNAs enthielt. Die Expressionsniveaus von 10 miRNAs unterschieden sich signifikant zwischen den IGD - und Kontrollgruppen (Tabelle 1) (Table2) .2). Relative Expressionsniveaus dieser 10 miRNAs sind in Abbildung 2 dargestellt Abbildung1.1. Unter diesen waren zwei (hsa-miR-423-5p und hsa-miR-483-5p) hochreguliert und acht (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411-5p und hsa-miR-652-3p) wurden in der IGD-Gruppe herunterreguliert.
Tabelle 2
Differentiell exprimierte microRNAs (miRNAs) und falten Veränderungen.
| miRNA | Angewandte F&E | Validierung | Kombiniert | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-Wert | Falten wechseln | P-Wert | Falten wechseln | P-Wert | Falten wechseln | |
| hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNAs veränderten sich sowohl in den Erkennungs- als auch in den Validierungsmengen in konsistenter Weise signifikant.
qRT-PCR-Validierung der Kandidaten-miRNAs
Um die 10-Kandidaten-miRNAs zu validieren, führten wir qRT-PCR mit einem unabhängigen Validierungssatz (20-IGDs und 16-Kontrollen) durch (Tabelle S1 in Supplementary Material). Drei dieser miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p und hsa-miR-652-3p) wurden in der IGD-Gruppe des Validierungssatzes signifikant herunterreguliert (Tabelle 1) (Table2) .2). Drei weitere miRNAs (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b und hsa-miR-423-5p) wurden in der IGD-Gruppe ebenfalls herunterreguliert, jedoch nicht signifikant. Die verbleibenden vier miRNAs (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p und hsa-miR-423-5p) wurden entgegengesetzt in dem Validierungssatz exprimiert. Bei der Kombination der Erkennungs - und Validierungssets (insgesamt 45 IGD - Probanden und 42 - Kontrollen) waren die drei validierten miRNAs durchweg signifikant (Tabelle 1) (Table2) .2). Detaillierte Informationen, chromosomale Positionen, reife Sequenzen und Expressionslevels im ZNS dieser drei miRNAs sind in Tabelle S2 in Supplementary Material verfügbar.
Synergistische Wirkung der gleichzeitigen Veränderung der drei miRNAs auf IGD-Risiko
Um den kombinierten Effekt der drei miRNAs zu bewerten, beobachteten wir die Odds Ratios (ORs) der vier Untergruppen (mit 0-, 1-, 2- oder 3-miRNA-Veränderungen). Die Veränderung der miRNA wurde durch den RQ-Wert definiert, wie in Abschnitt "Materialen und Methoden. "Da alle drei miRNA-Marker in der IGD-Gruppe herunterreguliert waren, wurde eine miRNA, deren RQ-Wert unter eins lag, als verändert angesehen. Detaillierte Informationen zum RQ-Wert der einzelnen Studienobjekte für die drei miRNAs finden Sie in Tabelle S3 in Supplementary Material. Für jede Untergruppe wurden die Quoten als das Verhältnis der Anzahl der Kontrollen zu denen der IGDs berechnet, dann wurde jeder OR berechnet, indem die Quoten jeder Untergruppe durch die Quoten der Untergruppe ohne irgendwelche miRNA-Veränderungen dividiert wurden. Individuen mit drei miRNA-Veränderungen zeigten ein Risiko, das 22-mal höher war als diejenigen ohne jegliche miRNA-Veränderung (OR 22, 95% CI 2.29-211.11). ORs zeigten einen zunehmenden Trend mit der Anzahl der veränderten miRNAs von 0 zu 3 (r2 = 0.996) (Abbildung (Abbildung22).
GO- und Pathway-Analyse von Zielgenen der Kandidaten-miRNAs
Um Einblick in die Funktionen der drei miRNA-Marker zu erhalten, die in der IGD-Gruppe signifikant herunterreguliert sind, wurden ihre Zielgene mithilfe der miRWalk 2.0-Datenbank vorhergesagt (31). Insgesamt wurden 1,230-Gene als Downstream-Ziele durch vier Algorithmen (miRWalk, miRanda, RNA22 und Targetscan) unter Verwendung der miRWalk-Datenbank (32-34) (Tabelle S4 im Ergänzungsmaterial). Die Genset-Anreicherungsanalyse mit ToppFun in der ToppGene Suite zeigte, dass die Zielgene dieser miRNAs signifikant mit neuronalen Entwicklungspfaden wie "Axon guidance" und GO-Begriffen wie "neurogenesis" assoziiert sind (Tabelle S5 in Supplementary Material).
Ausdruck der vorhergesagten Zielgene
Unter den stromabwärts gelegenen Zielgenen der drei miRNAs wurde 140 gleichzeitig für zwei oder mehr miRNAs vorhergesagt (Tabelle S4 in Supplementary Material). Um zu untersuchen, ob ihre Proteinexpressionsniveaus der stromabwärts gelegenen Zielgene zwischen den IGD- und Kontrollgruppen unterschiedlich sind, wählten wir 2-Gene (DUSP4 und PI15), die als Downstream-Ziele aller 3 miRNAs und zusätzlicher 3-Gene vorhergesagt werden (GABRB2, DPYSL2 und CNR1) von denen, die für 2 miRNAs vorhergesagt wurden, und führten eine Western - Blot - Analyse mit den für das Experiment verfügbaren Plasmaproben von 28 IGDs und 28 - Kontrollen durch. Wir verglichen die Ausdrücke der fünf Ziele zwischen den IGD- und Kontrollgruppen durch Messen der Bandenintensität und -fläche, wie an anderer Stelle beschrieben (29). Unter ihnen sind die Expressionslevel von DPYSL2 (28 IGDs und 28 Controls, P = 0.0037) und GABBR2 (27 IGDs und 28 Kontrollen, P = 0.0052) waren in der IGD-Gruppe signifikant höher (Abbildung (Abbildung3) .3). Wir konnten jedoch differentielle Ausdrücke von CNR1 nicht beobachten (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) und PI15 (P = 0.6346).
Diskussion
Es wurde berichtet, dass miRNAs an der neuronalen Entwicklung beteiligt sind (35, 36), und differentielle Expression von Gehirn miRNAs werden bei psychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie beobachtet (37). Daher ist es plausibel, dass zirkulierende miRNA-Profile nützliche Biomarker für IGD sein könnten. Zirkulierende miRNAs wurden als Biomarker für verschiedene neuropsychiatrische Erkrankungen vorgeschlagen (38-40); Die molekularen Mechanismen hinter der IGD-Entwicklung sind jedoch trotz ihrer klinischen und sozialen Bedeutung noch weitgehend unbekannt. Insbesondere gab es keine Studien zu IGD-assoziierten miRNAs. Das Ziel dieser Studie war zweifach. Zuerst versuchten wir, miRNAs im Plasma zu entdecken, die mit IGD assoziiert sind. Zweitens haben wir die biologische Implikation der miRNA-Kandidaten untersucht, indem wir die Proteinexpression und das GO der stromabwärts gelegenen Zielgene untersucht haben. Durch das genomweite Screening von miRNA-Expressionsprofilen und die nachgeschaltete Validierung der Kandidaten fanden wir die Expression von drei miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p und hsa-miR-652-3p) bei IGD-Patienten signifikant niedriger als bei Kontrollen. Obwohl die Expressionsmuster anderer sieben miRNA-Kandidaten in der Validierung nicht repliziert wurden, kann es in dieser Studie aufgrund der geringen Stichprobengröße falsch negativ sein. Nach unserem Wissen ist dies der erste Bericht über die Möglichkeit, dass Blut-miRNA-Expressionsprofile nützliche Biomarker für IGD sein könnten. Die Kombination der drei miRNA-Marker könnte als minimal-invasives Instrument zur Früherkennung von IGD-gefährdeten Personen dienen.
Es wurde berichtet, dass die in dieser Studie identifizierten miRNAs an verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen beteiligt sind. Es wurde berichtet, dass die Expression von hsa-miR-200c im Blut bei verschiedenen psychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie herunterreguliert ist (41) und depressive Episoden (42). Es wurde berichtet, dass miR-200c in synaptischen Fraktionen stärker exprimiert wird als im gesamten Vorderhirn (43) und auch mit dem neuronalen Zelltod (44). Basierend auf diesen früheren Berichten ist miR-200c an der Neuroentwicklung beteiligt und kann mit neuropsychiatrischen Störungen in Verbindung gebracht werden, wenn seine Expression gestört ist. Mehrere Studien haben eine Assoziation zwischen miR-652 und dem Risiko neuropsychiatrischer Störungen nahegelegt. Ähnlich unserem Ansatz, Blut-Biomarker für Schizophrenie zu identifizieren, haben Lai et al. führten TLDA-Analysen mit Schizophreniepatienten und normalen Kontrollen durch und fanden, dass sieben miRNAs einschließlich hsa-miR-652 bei Schizophrenie-Patienten differentiell exprimiert wurden (45). In der anschließenden Studie entwickelten sie ein Vorhersagemodell, das die miRNA-Expressionsdaten verwendet und Schizophrenie erfolgreich von der normalen Kontrolle unterscheidet (46). Eine veränderte Expression von hsa-miR-652 wurde auch bei Alkoholikern beobachtet (47). Hsa-miR-26b wurde während der Differenzierung neuronaler Zellen aktiviert (48). Perkinset al. berichteten, dass hsa-miR-26b im präfrontalen Kortex von Schizophreniepatienten herunterreguliert wurde (49).
Obwohl es keinen direkten Beweis für die Beziehung zwischen der gestörten Expression dieser miRNAs und der Pathophysiologie von IGD gibt, können wir daraus schließen, dass Dysregulation dieser miRNAs mit der Pathophysiologie von IGD auf der Grundlage verschiedener früherer Berichte über die stromabwärts gelegenen Gene assoziiert sein könnte . Einige der nachgeschalteten Gene der drei miRNAs wie GABRB2, CNR1, NRXN1 und DPYSL2 werden Berichten zufolge mit neuropsychiatrischen Störungen in Verbindung gebracht. Gamma-Aminobuttersäure (GABA) ist ein wichtiger inhibitorischer Neurotransmitter im ZNS. Dysregulation des GABA-Rezeptors ist an neuropsychiatrischen Störungen einschließlich Sucht, Angst und Depression beteiligt (50), die auch die Hauptmerkmale von IGD sind (8). Es wird berichtet, dass genetische Polymorphismen in GABA-Rezeptorgenen mit Alkoholsucht und Schizophrenie assoziiert sind (51, 52). Dihydropyrimidinase-ähnliches 2 (DPYSL2) ist ein Mitglied der Collapsin-Antwort-Mediator-Proteinfamilie, die eine Rolle bei der Mikrotubulus-Assemblierung, der synaptischen Signalgebung und der Regulation des axonalen Wachstums spielt. Folglich wurde dieses Molekül als Biomarker für psychiatrische Erkrankungen vorgeschlagen (53, 54). Polymorphismus in der DPYSL2 Gen wurde auch mit Alkoholkonsumstörung in Verbindung gebracht (55). Frühere Berichte und unsere Daten legen nahe, dass die Überexpression von GABRB2 und DPYSL2, Downstream-Targets der herunterregulierten miRNAs, Auswirkungen auf die Pathogenese neuropsychiatrischer Erkrankungen einschließlich IGD hat. Der Cannabinoidrezeptor Typ 1 (CNR1) ist ein präsynaptischer Heterorezeptor, der die Freisetzung von Neurotransmittern moduliert und Störungen der Cannabinoid-Signalübertragung mit verschiedenen neuropsychiatrischen Störungen (56). Genetischer Polymorphismus von CNR1 Gen ist bekanntermaßen mit Substanzabhängigkeit in Kaukasiern assoziiert (57). In einem Rattenmodell stört die Aktivierung des ventralen Hippocampus CNR1 das normale Sozialverhalten und die kognitive Wahrnehmung (58). Es ist bekannt, dass genetische Veränderungen in der NRXN-Familie an verschiedenen neuropsychiatrischen Störungen einschließlich Sucht beteiligt sind (59).
Um die biologische Bedeutung der drei miRNA-Kandidaten auf direktere Weise zu untersuchen, untersuchten wir die Proteinexpression ihrer stromabwärts gelegenen Zielgene. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Plasmaproben, der 140-Standardkandidaten (vorhergesagt als 2 oder mehr miRNAs) untersuchten wir 5-Targets (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 und PI15) mittels Western Blot und bestätigten diese Expression von GABRB2 und DPYSL2 war signifikant höher in der IGD-Gruppe. Frühere Berichte und unsere Daten legen nahe, dass die Überexpression von GABRB2 und DPYSL2, Downstream-Targets der herunterregulierten miRNAs, Auswirkungen auf die Pathogenese neuropsychiatrischer Erkrankungen einschließlich IGD haben könnte. Die Ergebnisse der GO- und Pathway-Analyse neuraler Entwicklungswege unterstützen ebenfalls die neurobiologische Implikation der miRNA-Marker. Ein weiterer interessanter Befund war der synergistische Effekt der simultanen Veränderung der miRNAs. Individuen mit einer Herunterregulierung aller 3 miRNAs zeigten ein 22-mal höheres Risiko als solche ohne Herunterregulierung und die ORs stiegen dosisabhängig an. Obwohl das CI für diese drei Änderungen wegen der begrenzten Stichprobengröße sehr groß war, ist die eindeutige positive Korrelation (r2 = 0.996) unterstützt den synergistischen Effekt der drei miRNAs.
Obwohl wir die IGD-assoziierten miRNA-Marker entdeckt haben und Individuen mit allen drei miRNA-Veränderungen ein Risiko von 22-mal höher als jene ohne miRNA-Veränderungen hatten, gibt es in dieser Studie mehrere Einschränkungen. Erstens erhöhte die geringe Stichprobengröße die Wahrscheinlichkeit, dass andere signifikante miRNA-Marker fehlten. Zweitens, da unsere Daten nicht ausreichen, um zu klären, ob die miRNA-Profile im Plasma Ursache oder Wirkung sind, können wir die biologische Rolle dieser nicht-invasiven Marker in einer klinischen Umgebung nicht bestätigen. Weiteres miRNA-Profiling und ihre nachgeschaltete Genanalyse mit menschlichem Hirngewebe aus Hirngewebebanken können eine direktere Antwort geben. Eine Gehirngewebeanalyse mit einem Tiermodell mit einer Spielstörung wäre ebenfalls hilfreich. Drittens haben wir aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Plasmaproben nur fünf nachgeschaltete Kandidatenmoleküle untersucht. Die Untersuchung weiterer stromabwärts liegender Ziele mit einer größeren Stichprobenmenge wird hilfreich sein, um den molekularen Mechanismus von IGD weiter zu verstehen.
Zusammenfassend konnten wir durch das genomweite Screening von miRNA-Expressionsprofilen und unabhängige Validierung drei IGD-assoziierte miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p und hsa-miR-652-3p) entdecken. Viele ihrer nachgeschalteten Gene sind Berichten zufolge an verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen beteiligt, und die experimentelle Validierung der veränderten Expression dieser nachgeschalteten Gene unterstützt die Implikation der miRNAs, die in dieser Studie identifiziert wurden. Wir fanden heraus, dass Individuen mit einer Herunterregulierung aller drei miRNA ein hohes IGD-Risiko haben. Zusammen mit den bekannten klinischen oder umweltbedingten Risikofaktoren und diagnostischen Kriterien können unsere Ergebnisse eine frühzeitige Intervention erleichtern, um Menschen mit einem höheren IGD-Risiko zu helfen.
Ethik-Erklärung
Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Medizinischen Kollegs der Katholischen Universität von Korea (MC16SISI0120) genehmigt. Alle Teilnehmer und ihre Eltern gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung ab.
Autorenbeiträge
ML und HC haben gleichermaßen zu diesem Papier beigetragen. ML, D-JK und Y-JC entwarfen die Studie. SJ, S-MC, YP, DC und JL führten Experimente und Datengenerierung durch. J-WC, S-HP, J-SC und D-JK sammelten Blutproben und klinische Informationen. ML, HC, S-HY und Y-JC analysierten Daten. ML, HC, S-HY und Y-JC beschrieben das Manuskript. Y-JC beaufsichtigte das Projekt.
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass die Untersuchung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als möglicher Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Fußnoten
Finanzierung. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Brain Research Program der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft und IKT und Zukunftsplanung (NRF-2015M3C7A1064778) finanziert wurde.
Ergänzungsmaterial
Das Ergänzungsmaterial zu diesem Artikel finden Sie online unter http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Bibliographie
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