Eine Rolle für Hypocretin (Orexin) beim männlichen Sexualverhalten (2007)

J Neurosci. 2007 Mar 14;27(11):2837-45.

Muschamp JW1, Dominguez JM, Sato SM, Shen RY, Rumpf EM.

Abstrakt

Die Rolle von Hypocretin-Neuronen (Orexin; hcrt / orx) bei der Regulierung der Erregung ist gut bekannt.

Kürzlich wurde hcrt / orx mit der Belohnung von Nahrungsmitteln und dem Verhalten von Drogen in Verbindung gebracht. Wir berichten hier, dass bei männlichen Ratten die Fos-Immunreaktivität (ir) in hcrt / orx-Neuronen während der Kopulation deutlich zunimmt, wohingegen die Kastration in einem Zeitverlauf, der mit Postcastrations-Beeinträchtigungen des Kopulationsverhaltens im Einklang steht, eine Abnahme der Zellzahl und der Proteinspiegel von hcrt / orx-Neuronen bewirkt.

Dieser Effekt wurde durch Östradiolersatz umgekehrt. Die Immunmarkierung für Androgen (AR) - und Östrogen (ER alpha) -Rezeptoren ergab keine Kolokalisation von hcrt / orx mit AR und wenigen hcrt / orx-Neuronen, die ER alpha exprimieren, was darauf hindeutet, dass die hormonelle Regulation der hcrt / orx-Expression über Afferenzen von Neuronen erfolgt, die diese Rezeptoren enthalten. Wir zeigen auch, dass die systemische Verabreichung des Orexin-1-Rezeptorantagonisten SB 334867 [N- (2-Methyl-6-benzoxazolyl) -N ”-1,5-naphthyridin-4-ylharnstoff] das Kopulationsverhalten beeinträchtigt. Ein Ort für die prosexuellen Wirkungen von hcrt / orx kann der ventrale tegmentale Bereich (VTA) sein. Wir zeigen hier, dass hcrt-1 / orx-A in vivo dosisabhängige Erhöhungen der Feuerrate und der Populationsaktivität von VTA-Dopamin (DA) -Neuronen bewirkt. Die Aktivierung von hcrt / orx während der Kopulation und damit die Anregung von VTA-DA-Neuronen durch hcrt / orx kann zu dem robusten Anstieg des Nucleus accumbens DA beitragen, der zuvor während des männlichen Sexualverhaltens beobachtet wurde. Die anschließende dreifache Immunmarkierung in anteriorem VTA zeigte, dass Fos-ir in Tyrosinhydroxylase-positiven Neuronen, die an hcrt / orx-Fasern gebunden sind, während der Kopulation zunimmt.

Zusammengenommen stützen diese Daten die Ansicht, dass hcrt / orx-Peptide auf Steroide reagieren können, um die Aktivierung natürlicher Belohnungen wie Sex durch Aktivierung des mesolimbischen DA-Systems zu fördern.

Einleitung

Seit seiner Entdeckung in den 1990s (de Lecea et al., 1998; Sakurai et al., 1998) wurde das Hypocretinsystem (Orexin; hcrt / orx) hauptsächlich im Zusammenhang mit Erregung und Aufnahmeverhalten (Sutcliffe und de Lecea, 2002; Siegel, 2004). Mutante Mäuse mit gestörter Signalisierung von Hcrt / Orx zeigen ungleichmäßige Erregungsmuster, die durch häufige Übergänge zwischen Schlaf und Wachheit gekennzeichnet sind (Mochizuki et al. 2004). Es wird angenommen, dass die hcrt / orx-Peptide eine ununterbrochene Erregung durch robuste Projektionen auf aktivierende aminergische Zellgruppen im Hirnstamm (z. B. Locus ceruleus, raphe) (Peyronet al., 1998; Nambuet al., 1999; Saperet al., 2005). Zusätzlich zu ihren Projektionen auf Orte, an denen Wachsamkeit und Erregung reguliert werden, projizieren die hcrt / orx-Neuronen auch den Ursprung des mesolimbischen Dopamin (DA) -Wegs im ventralen Tegmentalbereich (VTA) (Fadel und Deutch, 2002). Dieses Muster der Konnektivität hat eine Reihe von Forschungsgruppen dazu veranlasst, die Rolle von hcrt / orx bei der belohnungsbezogenen Verstärkung zu bewerten (DiLeone et al., 2003; Harris et al., 2005; Harris und Aston-Jones, 2006).

Studien bei Tieren, die sich bewegen ad libitum zeigen, dass hcrt / orx-Neuronen ihre Zündrate während Perioden energiegeladenen, explorativen Verhaltens erhöhen (Mileykovskiy et al., 2005) und dass die gesteigerte lokomotorische Leistung nach intracerebroventrikulärer hcrt / orx-Infusion durch DA-Rezeptorblockade gedämpft wird (Nakamura et al., 2000). Andere Studien haben eine erhöhte Aktivität der DA-Zellen gezeigt in vitro von hcrt / orx (Korotkova et al., 2003) sowie die Freisetzung von Augmented Nucleus Accumbens (NAc) DA in vivo nach Anwendung von hcrt / orx auf den VTA (Naritaet al., 2006). In jüngster Zeit haben Verhaltensstudien gezeigt, dass die Aktivierung des hcrt / orx-Systems für die Motivation von Drogenmissbrauch von wesentlicher Bedeutung sein kann (Boutrel et al., 2005; Harris et al., 2005; Borglandet al., 2006) sowie natürliche Nahrungsmittelbelohnungen, deren Verstärkungsstärke homöostatisch durch hypothalamische Strukturen bestimmt wird (Hoebel, 1969; Rolls et al., 1980; Fulton et al., 2000; Thorpe et al., 2005).

Genauso wie exogenes hcrt / orx die Fütterung und Nahrungssuche verbessern kann (Kotz, 2006), Intrahypothalamus-Infusion von hcrt / orx erleichtert das männliche sexuelle Verhalten von Ratten (Gulia et al., 2003). In Anbetracht klassischer Studien, in denen das Fütterungs- oder Kopulationsverhalten bei Männern durch elektrische Stimulation von Stellen im lateralen Hypothalamusbereich (LHA) ausgelöst wurde, von denen bekannt ist, dass sie hcrt / orx-Neuronen enthalten (Vaughan und Fisher, 1962; Caggiula und Hoebel, 1966; Swanson et al., 2005) suchten wir nach Beweisen für die Aktivierung von hcrt / orx-Neuronen während der Kopulation und nach Beeinträchtigung des Verhaltens durch den Orexin-1-Rezeptor (OX1) Blockade. Wir untersuchten auch die neuroendokrine Regulation des hcrt / orx-Systems durch Messung der Auswirkungen von Kastration und Hormonersatz auf den zentralen hcrt / orx-Gehalt und durch doppelte Immunmarkierung für hcrt / orx- und Steroidhormonrezeptoren. Schließlich haben wir untersucht, inwieweit das mesolimbische DA-System durch hcrt / orx aktiviert werden konnte in vivo und ob DA-Neuronen in der VTA, die hcrt / orx-Eingaben erhalten, eine erhöhte Fos-Immunreaktivität (ir) während der Kopulation zeigen.

Materialen und Methoden

Fos Immunhistochemie, Verhalten und Zellzahlen.

Erwachsene (∼325 g), sexuell erfahrene männliche Long-Evans-Ratten (Harlan, Indianapolis, IN) wurden gemäß den National Institutes of Health aufbewahrt und verwendet Richtlinien für die Pflege und Verwendung von LabortierenAlle Verfahren wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees der Universitäten genehmigt. In der Woche vor dem Test durften alle Tiere vier Stunden lang täglich 1 Stunde lang sexuelle Erfahrungen mit einer ovarektomierten Frau machen, die 10 Stunden später durch Östradiolbenzoat (48 μg, sc) und Progesteron (400 μg, sc; 4 Stunden zuvor zum Östrus gebracht wurde) Testen; Sigma, St. Louis, MO). Verhaltenstests in allen Experimenten wurden 2 Stunden nach der üblichen nächtlichen Periode der Tiere in ihrem Heimkäfig unter Licht einer einzelnen roten 40-W-Glühlampe durchgeführt. Für Kopulationsexperimente wurde eine Gruppe (n = 6) von Männern durfte sich in ihrem Heimkäfig mit einem eströsen Weibchen zu einer einzigen Ejakulation paaren, wonach das Weibchen entfernt wurde. Alle Tiere bestiegen fast sofort und intromittierten in <4 min. Die mittlere Ejakulationslatenz für diese Gruppe betrug 632.6 ± 169.64 s (Mittelwert ± SEM; n = 6). Eine Kontrollgruppe (n = 6) wurde verwendet, um das Aktivitätsniveau zu kontrollieren. Diese Tiere wurden visuell überwacht, um zu überprüfen, ob sie für einen Zeitraum von 15 Minuten wach und aktiv waren, was der Dauer des Kopulationstestzeitraums der Versuchsgruppe entsprach. Käfigdeckel wurden zu Beginn und am Ende dieses Zeitraums von 15 Minuten geöffnet und geschlossen, ansonsten wurden die Tiere ungestört gelassen. Kontrolltiere, die sich während dieses Zeitraums im Ruhezustand befanden, wurden nicht verwendet. Die Tiere wurden als ruhig beurteilt, wenn sie auf ihrer Flanke oder in einer Kopf-nach-unten-Haltung zu ruhen schienen (angepasst von Espana et al., 2003). Sechzig Minuten nach Beginn der Kopulationssitzungen oder Kontrollbeobachtungen wurden die Tiere mit Natriumpentobarbital (100 mg / kg) tief anästhesiert und mit 0.1 m PBS, pH 7.4 und 4% Paraformaldehyd in PBS perfundiert. Gehirne wurden in 20% Sucrose-PBS cryoprotiziert, und jeder zweite 40-µm-Kryostat-Abschnitt (30 pro Tier) aus der Umgebung der hypothalamischen hcrt / orx-Zellpopulation wurde für Präpro-hcrt / orx (1: 100; MilliporeBillerica, MA) und Fos (1: 10,000; EMD Biosciences, San Diego, CA) mit 3 ', 3'-Diaminobenzidin (DAB) bzw. nickelverstärktem DAB gemäß den zuvor beschriebenen immunhistochemischen Verfahren (Espana et al., 2003; Sato et al., 2005). Zellzählungen wurden unter starker Vergrößerung mit einem Olympus (Tokio, Japan) -Mikroskop und einer Kamera in einem einzigen Bereich auf einem konsistenten rostrocaudalen Niveau durchgeführt (siehe Abb.. 1B,C) (2.45 mm hinter Bregma) (Swanson, 2004). In jeder Hemisphäre wurden Zellen, die in zwei 470 × 630-µm-Zählfelder fielen, mit einer digitalen Bildanalysesoftware (Image-Pro Plus; Media Cybernetics, Silver Spring, MD) von einem Untersucher, der an experimentelle Bedingungen blind war, markiert. In beiden Hemisphären verwendeten laterale Zählfelder die Vorderkanten als mediale Grenze. Mediale Zählfelder verwendeten die Vorderkanten als seitliche Begrenzung. Die Zahlen von nur Fos, nur hcrt / orx und doppelt markierten Zellen mit sowohl hcrt / orx als auch Fos-ir wurden aufgezeichnet.

Abbildung 1. 

Erhöhte Fos-Immunreaktivität in hcrt / orx-Neuronen während der Kopulation. A, Hcrt / orx-Neuron (rechts) zeigt Fos-ir. Maßstabsbalken, 25 μm. B, Repräsentative mikroskopische Aufnahme des rechten Zählfeldes in der linken Hemisphäre des nicht-kopulierenden Kontrollmännchens. Maßstab (in A), 200 μm. C, Mikroskopische Aufnahme von kopulierenden Männchen. Maßstabsbalken, 200 μm. Pfeile zeigen hcrt / orx-Neuronen an, die Fos-ir zeigen; Sternchen zeigen Fos-ir-Kerne in Nicht-Hcrt / Orx-Zellen an; fx, fornix.

Kastrationsexperimente und Immunoblotting.

Erwachsene männliche (∼325 g zu Beginn der Versuche) Long-Evans-Ratten wurden anästhesiert (75 mg / kg Ketamin-HCl und 10 mg / kg Xylazin-HCl, ip) und kastriert. Den Tieren wurde eine Überlebenszeit von 7, 14 oder 28 d nach der Operation erlaubt, bevor sie betäubt und perfundiert wurden, und ihr Gehirn wurde wie oben beschrieben für Präpro-hcrt / orx immunmarkiert (alle Gruppen, n = 5). Diese Tiere wurden mit einer Scheinoperationsgruppe verglichen, die unter identischer Anästhesie einen Skrotalschnitt erhielt (n = 5). Bei 28 wurden auch Shams getötet. D. Zellzählungen wurden wie oben in der gleichen Koronalebene bei geringerer Vergrößerung durchgeführt.

In einem separaten Experiment kastet 28 d (n = 5) und scheinbehandelte Kontrollen (n = 5) wurden mit Natriumpentobarbital (100 mg / kg) tief anästhesiert, und ihre Gehirne wurden entfernt und schnell in 2-Methylbutan eingefroren, das durch Trockeneis gekühlt wurde. Gefrorene Hypothalami wurden dann durch zwei koronale Schnitte blockiert, einer durch den medialen preoptischen Bereich (mPOA) nur rostral zur Dekussation der vorderen Kommissur und der andere durch den hinteren hypothalamischen Kern nur kaudal zur Teilung des dritten Ventrikels in seinen hypothalamischen und Brustaussparungen. Die Blöcke wurden dann mit zwei sagittalen Schnitten am medialen Ende eines der beiden Hirnstiele und durch einen horizontalen Schnitt am dorsalen Ende der hypothalamischen Aussparung des dritten Ventrikels zugeschnitten. Gewebeblöcke wurden dann durch Ultraschallbehandlung homogenisiert, Protein wurde mit Proteaseinhibitoren (Roche Complete Mini-Proteasemischung; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) in modifizierten Radioimmunpräzipitationspuffer, pH 8.0, extrahiert und Extrakte wurden nach Zentrifugation aliquotiert. Nach Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration für Extrakte von jedem Subjekt wurden 40 & mgr; g Protein von jedem Tier in separate Vertiefungen eines 15% SDS-PAGE-Gels geladen. Die elektrophoretische Trennung, der Transfer auf Polyvinylidendifluoridmembranen (Bio-Rad, Hercules, CA) und die Immunmarkierung wurden nach der Methode von Laemmli (Cleveland et al., 1977), unter Verwendung von 1: 1000 des zuvor genannten Anti-Prepro-hcrt / orx-Antikörpers und später 1: 2000-Anti-β-Actin (Sigma) und 1: 5000: Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ) in 5% Milchpulver in Tris-gepufferter Salzlösung. Proteinbanden wurden durch Enhanced Chemiluminescence Kit (ECL; GE Healthcare, Piscataway, NJ) und Kodak (Rochester, NY) BioMax-Filme sichtbar gemacht. Filme wurden für 40s belichtet und digital gescannt, und die optische Dichte wurde mit öffentlich verfügbarer ImageJ-Software gemessen. Für jedes Tier wurden die optischen Dichtewerte für hcrt / orx als Prozentsatz der β-Actin-Ladekontrolle bestimmt und einer statistischen Analyse unterzogen.

In einem dritten Experiment erhielten männliche Ratten wie oben beschrieben Scheinoperationen (n = 3) oder kastriert und jeden zweiten Tag für 28 d Dihydrotestosteron (500 μg, sc; n = 4), Estradiolbenzoat (20 & mgr; g, sc; n = 3) oder Ölträger (0.1 μl; n = 3). Beide Hormone wurden von Sigma gekauft. Hormondosen wurden aufgrund ihrer Fähigkeit in früheren Studien ausgewählt, die Kopulation in Kastraten aufrechtzuerhalten (Putnam et al., 2005). Am 28-ten Tag nach Operationen wurden die Tiere getötet und ihre Hypothalamis wurden zur Messung des Präpro-hcrt / orx-Gehalts durch Western-Immunoblot wie oben beschrieben blockiert.

Steroidhormonrezeptor und hcrt / orx-Doppellabel-Immunhistochemie.

Gehirnschnitte aus der LHA von intakten, sexuell naiven erwachsenen Männern (∼350 g) Long-Evans-Ratten wurden mit einem Androgenrezeptor (AR) (1: 750; n = 6; Santa Cruz Biotechnology) oder Östrogenrezeptor (ERα) (1: 2500; n = 9; Santa Cruz Biotechnology) mit nickelverstärktem DAB. Anschließend wurden AR-markierte Abschnitte für Präpro-hcrt / orx doppelt markiert (wie oben) und ERα-markierte Abschnitte wurden für Präpro-hcrt / orx doppelt gefärbt (n = 5). Nach der Montage wurden Abschnitte gefunden, die einer der vier koronalen Schichten der LHA im Atlas von Swanson (2004) wurden unter Verwendung eines Kamera-Lucida-Aufsatzes unter dem Mikroskop gezeichnet, und doppelt und einfach markierte Zellen in jedem Abschnitt wurden markiert. Mit Adobe (San Jose, CA) Illustrator wurden Zeichnungen auf Atlasebenen digital gescannt und übereinander gelegt, und jede Zellpopulation wurde auf Atlasillustrationen abgebildet (Swanson, 2004). Im Fall von ERα-plus-hcrt / orx-markierten Abschnitten wurde die Anzahl der doppelt und einfach markierten hcrt / orx-Neuronen gezählt.

Pharmakologie und Kopulationsverhalten.

Erwachsene männliche (∼350 g zu Beginn der Versuche) Long-Evans-Ratten (n = 9) erhielten in der Woche vor den Verhaltenstests vier 1-stündige Sitzungen mit einer sexuell empfänglichen Frau. Tiere, die während der ersten 30 Minuten des Endtests nicht mindestens einmal ejakulieren konnten, wurden vom Experiment ausgeschlossen. Erfahrungssitzungen und Verhaltenstests wurden unter 40 W rotem Glühlicht 2 Stunden nach der nächtlichen Periode des Tieres durchgeführt. Tests des Kopulationsverhaltens wurden im Heimkäfig des Mannes durchgeführt und dauerten 30 Minuten. Bestimmte Merkmale des männlichen Kopulationsverhaltens (dh Reittiere, Intromissionen und Ejakulationen) wurden von einem Beobachter bewertet, der für experimentelle Behandlungen blind war, wobei eine benutzerdefinierte Computersoftware verwendet wurde, die Frequenz- und Latenzdaten für jedes Verhaltensereignis aufzeichnete. XNUMX Minuten vor dem Verhaltenstest wurde den Tieren entweder das OX injiziert1 Antagonist N- (2-Methyl-6-Benzoxazolyl) -N ″-1,5-Naphthyridin-4-yl-Harnstoff (SB 334867) (20 mg / kg, ip) oder DMSO-Vehikel (0.5 ml / kg). Das Experiment folgte einem einfachen ausgeglichenen Design innerhalb der Probanden, so dass fünf Tiere am ersten Testtag Arzneimittelinjektionen erhielten und die restlichen vier Vehikel erhielten. Nach einer 48-stündigen Arzneimittelauswaschperiode erhielten die am ersten Tag mit Arzneimittel behandelten Tiere Vehikel und umgekehrt.

Elektrophysiologie.

Erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (∼350 g) wurden mit Chloralhydrat (400 mg / kg, ip zur Induktion; Anästhesie von 100 mg · kg) anästhesiert-1 · H-1 danach für die Wartung) und auf einem stereotaktischen Instrument montiert. Der Schädel und die Dura über der Hirnstammregion, die den VTA enthielt, wurden entfernt. Jedes Tier erhielt zuerst eine Infusion von künstlichem CSF (aCSF) [0.5 μl / 5 min; von Lambda, anteroposterior, + 2.6 oder + 3.4 mm; mediolateral, ± 0.8 mm; dorsoventral, -7.0 mm; flacher Schädel nach einem stereotaktischen Atlas (Paxinos und Watson, 1998)] mit einer 32 ga Hamilton-Spritze (0.5 μl / 5 min) auf einer Seite des VTA. Dann, 10, wurde das Zellen-pro-Spur-Abtastverfahren auf der ipsilateralen Seite des VTA durchgeführt. Als nächstes erhielten die Tiere eine Infusion von hcrt-1 / orx-A (0.014 nmol, n = 4; 1.4 nmol, n = 5; oder 140 nmol, n = 6 gelöst in aCSF; American Peptide, Sunnyvale, CA) in den kontralateralen VTA, bevor das Cell-per-Track-Verfahren auf dieser Seite wiederholt wurde. Die Injektionen wurden durch die Hemisphäre und die vordere oder hintere Injektionsstelle ausgeglichen. Extrazelluläre Einzelaufzeichnungen wurden mit Glasmikropipetten mit einem Lauf (1.5 mm Außendurchmesser vor dem Ziehen; World Precision Instruments, Sarasota, FL) durchgeführt, die mit 2 m NaCl gefüllt und hinterspritzt wurden. Die Elektrodenimpedanz reichte von 2 bis 4 MΩ bei 135 Hz. DA-Neuronen wurden anhand ihrer positiv-negativen extrazellulären Aktionspotenziale identifiziert, die häufig einen markanten anfänglichen Segment / somatodendritischen (IS / SD) -Abbruch, eine breite Aktionspotentialdauer, eine langsame Zündrate und ein unregelmäßiges Einzelspitzen- oder Burst-Zündmuster (Grace und Bunney, 1983). Um das Zelle-pro-Spur-Experiment durchzuführen, wurde die Aufzeichnungselektrode systematisch durch einen stereotaktisch definierten Block im VTA (2.8-3.4 mm anterior vor Lambda; 0.6-1.0 mm lateral bis zur Mittellinie; 6.5-8.5 mm unterhalb der Gehirnoberfläche) durchlaufen sechsmal. Jedes identifizierte DA-Neuron wurde online für 2 – 5 min mit dem Chart-Datenerfassungssystem (AD-Instrumente, Mountain View, CA). Die durchschnittliche Anzahl spontan aktiver DA-Neuronen pro Elektrodenspur von jedem Tier (Zellen pro Spur) war der Index für die VTA-DA-Neuronenpopulationsaktivität. Die mittlere Feuerrate von DA-Neuronen wurde aus allen DA-Neuronen bestimmt, die von allen Tieren in jeder Gruppe entnommen wurden.

Um die Depolarisationsinaktivierung in der Gruppe 140 nmol hcrt / orx zu testen, wurde Apomorphin-HCl (20 & mgr; g / kg, ip; n = 4; Sigma) wurde unmittelbar nach Abschluss der Probenahme nach der Hcrt-1 / orx-A-Verabreichung verabreicht. Zehn Minuten nach der Apomorphininjektion wurden sechs zusätzliche Elektrodenspuren in der VTA-Seite abgetastet, die zuvor hcrt-1 / orx-A erhalten hatte.

Verhalten, Triple-Label-Immunhistochemie und Zellzahlen.

Erwachsene (∼300 g) männliche Long-Evans-Ratten erhielten vier sexuelle 1 h-Sitzungen mit einer aufnahmefähigen Frau wie oben. Vor (1 h) Anästhesie, Perfusion und Vorbereitung von Gewebe für die Immunmarkierung, Tiere (n = 6) wurde zu einer einzelnen Ejakulation kopiert. Wie oben waren die Tiere fast sofort bestiegen und intromittiert, und die mittlere Ejakulationslatenz dieser Gruppe betrug 588.50 ± 85.03 s (Mittelwert ± SEM). Die experimentelle Gruppe wurde mit sexuell erfahrenen Kontrollen verglichen, denen für die Kopulation kein Zugang zu weiblichen Frauen gegeben wurde (n = 6). Wie oben wurde der Test 2 Stunden nach der üblichen nächtlichen Periode des Tieres unter rotem Glühlicht durchgeführt. Nachdem die Tiere getötet, fixiert und ein kaltes Mikrotom geschnitten worden war (wie oben), wurden vier Schnitte von jedem Tier, die vier rostro-kaudale VTA-Spiegel repräsentierten, für die Immunhistochemie ausgewählt. Für die Anzahl der Fächer (n) wird für die Zellzahl auf jeder Ebene verwendet, siehe Tabelle 4. Die Abschnitte wurden für Fos (1: 7500; Santa Cruz Biotechnology) mit DAB wie oben gekennzeichnet. Die Schnitte wurden dann für Präpro-hcrt / orx (1: 500) und Tyrosinhydroxylase (TH; 1: 2000; Millipore) mit Cyanin-konjugierten fluoreszierenden sekundären Antikörpern (1: 200; Cy3 bzw. Cy2; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Zellzählungen wurden unter hoher (40 ×) Vergrößerung an a durchgeführt Leica (Nussloch, Deutschland) DM 4000B-Mikroskop unter Verwendung von Stereo Investigator Software (MBF Bioscience, Williston, VT) von einem an Behandlungsbedingungen blinden Experimentator. Stereo Investigator Software wurde verwendet, um ein Zählfeld zu definieren, das alle DA-Zellen innerhalb jeder VTA-Ebene enthielt. Bei einer einzigen Brennweite in jeder der vier rostrocaudalen VTA-Ebenen wurden fünf Zelltypen markiert: TH-positive Neuronen, TH-positive Neuronen, die Fos-ir zeigen, TH-positive Neuronen, die direkte (auf somatisches Plasmalemma) Appositionen zeigen orx-Fasern, TH-positive Neuronen, die sowohl Fos-ir- als auch hcrt / orx-Appositionen zeigen, und schließlich Solo-Fos-positive Kerne, die sich nicht in TH-Neuronen befinden.

Datenanalyse.

Gruppenmittel für Zellzahlen im Fos-Experiment und Messungen der optischen Dichte von Western-Blots aus dem ersten solchen Experiment wurden durch unabhängige Proben verglichen t Prüfung. Matched-Samples t Die Tests wurden mit Mitteln des OX durchgeführt1 antagonistisches Verhaltensexperiment. Zellzahlen in der Kastration, Dreifachmarkierungsexperimente und mittlere Zündrate sowie Zell-pro-Spur-Messungen wurden ANOVA unterzogen.

Die Ergebnisse

Die Kopulation erhöht die Fos-Immunreaktivität in hcrt / orx-Neuronen

Der prozentuale Anteil von hcrt / orx-ir-Zellen, die Fos-ir zeigten, unterschied sich signifikant zwischen den Gruppen, wobei Tiere, die sich in der Kopplung befanden, einen erhöhten Fos-ir-Wert in hcrt / orx-Zellen zeigten (t(10) = 7.71; p <0.01) (Tabelle 1, Abb.. 1). Die mittleren Zahlen von doppelt markiertem hcrt / orx unterschieden sich auch signifikant zwischen den Gruppen (t(10) = 6.03; p <0.001). Bemerkenswerterweise wurde bei kopulierenden Tieren kein Unterschied in der Anzahl von Fos-positiven hcrt / orx-Neuronen zwischen dem medialen und dem lateralen Zählfeld festgestellt (Daten nicht gezeigt) (Harris und Aston-Jones, 2006). Die durchschnittliche Gesamtzahl der Fos-ir-Kerne (nur Fos-Neuronen und doppelt markierte hcrt / orx-Neuronen) war bei kopulierenden Tieren signifikant höher als bei nicht-kopulierenden Kontrollen (t(10) = 16.97; p <0.001) (Tabelle 1).

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Tabelle 1. 

Erhöhte Fos-ir während der Kopulation in hcrt / orx-Neuronen männlicher Ratten

Die Kastration verringert die Immunreaktivität von hcrt / orx und das Protein im Hypothalamus

Im Vergleich zu schein-behandelten Kontrollen zeigten die Zählungen der hcrt / orx-ir-Neuronen eine signifikante Abnahme der Zellzahl 28 d nach der Kastration (Abb.. 2A) (F(3,16) = 7.60; p <0.005). Dies entspricht einer Abnahme der Anzahl der Zellen in der beobachteten Population um 31.8%. Post hoc (Tukey) -Tests zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zahlen von scheinbehandelten Ratten oder 7- oder 14-D-Kastraten. Die anschließende Western-Immunoblot-Analyse von Hypothalamus-Präpro-hcrt / orx ergab eine signifikante Abnahme der mittleren optischen Dichte von hcrt / orx-Banden aus 28-D-Kastraten im Vergleich zu scheinbehandelten Kontrollen (Abb.. 2B) (t(8) = 2.99; p <0.05.).

Abbildung 2. 

Die Kastration verringert den hcrt / orx-ir-Wert bei männlichen Rattenhypothalamus. ARepräsentative mikroskopische Aufnahmen von hcrt / orx-markierten Neuronen in einer Hemisphäre zeigen eine signifikante Abnahme der Zellzahl durch 28 d nach der Kastration. Inset-Werte sind mittlere Zellzahlen für beide Hemisphären ± SEM; **p <0.005. Maßstabsbalken 200 μm; fx, fornix. BZeigen westliche Immunoblots signifikante Abnahmen im hypothalamischen Präpro-Hcrt / orx von 28-D-Kastraten. Jede Bande repräsentiert das Signal von einem Tier in jeder Gruppe. Die Werte sind mittlere ± optische SEM-Dichteeinheiten (od) für hcrt / orx relativ zu β-Actin; *p <0.05. C, Immunoblots für Präpro-hcrt / orx in 28-D-Kastraten zeigen E2 den hypothalamischen hcrt / orx-Gehalt im Vergleich zu den mit Öl behandelten Kontrollen auf dem Niveau des Shams zu halten. Gruppen mit demselben Kleinbuchstaben unterscheiden sich nicht wesentlich (p <0.05).

Östradiol stellt den Hypothalamus-Hcrt / Orx-Proteinspiegel wieder her

Bei 28 d nach Kastration oder Scheinoperationen waren die Präprovorhektat / Orx-Spiegel bei mit Öl behandelten Tieren signifikant niedriger als die für Sham und Estradiol (E2) behandelte Gruppen (F(3,9) = 8.47; p <0.005) (Abb.. 2C). Einweg-ANOVA mit Post-hoc- (Tukey) -Tests haben gezeigt, dass die Präpro-hcrt / orx-Werte in Sham- und E gemessen werden2-behandelte Tiere unterschieden sich nicht voneinander und das E2 Die Gruppe unterschied sich nicht von mit DHT behandelten Tieren.

ERα ist koextensiv mit hcrt / orx und wird in einer anatomisch unterschiedlichen Population von hcrt / orx-Neuronen coexprimiert

Die nukleare AR wurde ventral aus der Hauptpopulation der hcrt / orx-Neuronen entfernt und breitete sich mediolateral vom bogenförmigen Kern zum Optiktrakt aus. In keinem Fall wurden nukleare ARs und hcrt / orx im selben Neuron gefunden (Daten nicht gezeigt). Obwohl ER & agr; ein ähnliches Verteilungsmuster in der ventralen Ausdehnung des Hypothalamus zeigte, war die ER & agr; -Markierung im ventromedialen Kern umfangreicher. Weiter dorsal wurde die ERα-Markierung in sich verjüngenden Zellbändern gefunden, die sich medial von der inneren Kapsel unterhalb der Zona incerta bis zum dorsomedialen Hypothalamus (DMH) erstreckten. Eine Markierung für ER & agr; wurde selten in hcrt / orx-Neuronen gefunden (<1% der befragten Bevölkerung). Wenn beobachtet wurde, dass ER & agr; mit hcrt / orx kolokalisiert, war es typischerweise in Neuronen innerhalb oder nur rostral zum DMH (Abb.. 3). Obwohl sehr wenige hcrt / orx-Neuronen im Hypothalamus ERα exprimieren, ist ein hoher Anteil (∼65%) derjenigen in oder in der Nähe der DMH (Abb.. 3).

Abbildung 3. 

ERα ist koextensiv mit hcrt / orx. ERα-Kerne werden durch geschlossene Kreise dargestellt, hcrt / orx-Neuronen werden durch offene Kreise dargestellt und doppelt markierte ERα plus hcrt / orx-Zellen werden durch Sterne dargestellt. Zahlen sind in Millimetern caudal bis bregma. AHN, vorderer hypothalamischer Kern; fx, fornix; optischer Trakt; PVN, paraventrikulärer Kern; VMH, ventromedialer Hypothalamus; 3v, dritter Ventrikel.

Die Blockierung des Hcrt / orx-Rezeptors beeinträchtigt die Kopulation

Im Vergleich zum Fahrzeug Vorbehandlung mit dem OX1 Der Antagonist SB 334867 erhöhte die mittleren Latenzzeiten und verringerte die mittlere Ejakulationshäufigkeit (Tabelle 2). Gepaarte Stichproben t Tests zeigten einen signifikanten Effekt von SB 334867 auf die Latenzzeit von Intromissionen (t(8) = 3.31; p <0.05) und Ejakulationsfrequenz (t(8) = 2.40; p <0.05). Die medikamentöse Behandlung schien auch zu einer nicht signifikanten Zunahme der mittleren Latenzzeiten für die Zunahme und Ejakulation und zu einer Abnahme der mittleren Anzahl von Intromissionen zu führen (Tabelle 2).

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Tabelle 2. 

OX1 Der Antagonist SB 334867 beeinträchtigt das männliche Kopulationsverhalten

Hcrt-1 / orx-A erhöht die Aktivierungsrate der VTA-DA-Neuronen und die Populationsaktivität und induziert die Inaktivierung der Depolarisation

Die niedrigste Dosis von hcrt-1 / orx-A (0.014 nmol) erhöhte die mittlere VTA-DA-Neuronenzündungsrate im Vergleich zu mit Vehikel behandelten Kontrollen (Abb.. 4B,C) (paarweiser Vergleich; F(1,18) = 13.83, p <0.01; nach einer gemischten 2 × 3 ANOVA, F(1,10) = 13.67, p <0.005), aber keine andere Dosis von hcrt-1 / orx-A hatte diesen Effekt. Diese Dosis scheint für einen signifikanten Haupteffekt von hcrt / orx auf die in der 2 × 3-ANOVA festgestellte Feuerrate verantwortlich zu sein. EIN Post-hoc- (Tukey) -Test zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Rate zwischen aCSF-behandelten Kontrollgruppen über die Dosis. Die 1.4-nmol-Dosis von hcrt-1 / orx-A erhöhte die Populationsaktivität der VTA-DA-Neuronen signifikant (Anzahl der spontan aktiven Neuronen, die in jeder Elektrodenspur nachgewiesen wurden (Abb.. 4D) (paarweiser Vergleich, F(1,24) = 6.42, p <0.05; nach einer signifikanten Wechselwirkung in einer 2 × 3 gemischten ANOVA, F(2,10) = 16.71, p <001). Die höchste getestete Dosis von hcrt-1 / orx-A (140 nmol) verringerte die Populationsaktivität von DA-Neuronen (Zellen pro Spur) signifikant (Abb.. 4D) (wiederholte Einwegmessung der ANOVA mit 140 nmol-Dosis, F(2,6) = 12.20; p <0.01). Diese Abnahme wurde durch systemische Apomorphininjektion (Tukey's) umgekehrt Post-hoc- Prüfung).

Abbildung 4. 

Hcrt / orx reguliert die neuronale Aktivität von VTA DA in vivo. AWellenform eines typischen VTA DA-Neurons mit charakteristischem weitem Aktionspotential und IS / SD-Bruch. B, Top, Schussrate und Muster desselben mit einem Vehikel behandelten Neurons, die typische Berstaktivität zeigen; unten, ein schnell feuerndes Neuron, das nach lokaler Infusion von 0.014 nmol von hcrt 1 / orx A (n = 4). C, D, Dosisverhältnis von lokal infundiertem hcrt-1 / orx-A zur Zündrate und Populationsaktivität von VTA-DA-Neuronen. Hcrt-1 / orx-A (1.4 nmol; n = 5) erhöht die Populationsaktivität. Die verminderte Populationsaktivität nach 140 nmol von hcrt 1 / orx A (n = 4) wurde durch systemisches Apomorphin (20 μg / kg) rückgängig gemacht. Die Zahl in jedem Balken zeigt die Anzahl der aufgezeichneten Neuronen. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM. *p <0.05; ** **.p <0.01.

TH-positive VTA-Neuronen mit hcrt / orx-Appositionen zeigen nach Kopulation einen Anstieg in Fos-ir

Die bidirektionale ANOVA der mittleren Anzahl von Fos-ir-Kernen in nicht TH-positiven Neuronen zeigte signifikante Wirkungen der Behandlung (F(1,38) = 38.88; p <0.001) und anatomische Ebene (F(7,38) = 12.59; p <0.001) sowie eine signifikante Wechselwirkung zwischen diesen beiden Faktoren (F(7,38) = 7.45; p <0.001), was darauf hindeutet, dass während der Kopulation induziertes Fos bevorzugt in den vorderen Zählniveaus auftritt. Dies wurde durch nachfolgende Einweg-ANOVA und bestätigt Post-hoc- (Tukey) -Tests, bei denen die beiden vorderen Ebenen ("rostral" und "mittleres 1") eine signifikant höhere Anzahl von Fos-positiven Kernen (F(3,24) = 9.48; p <0.001). Gleiches galt nicht für nicht kopulierende Kontrollen, bei denen sich das basale Fos-ir nicht nach Level unterschied (Tabelle 3). Der prozentuale Anteil von TH-markierten Neuronen mit hcrt / orx-Appositionen unterschied sich nicht durch experimentelle Behandlung; Diese Maßnahme zeigte jedoch einen ausgeprägten rostrocaudalen Gradienten, wobei in beiden Gruppen der höchste rostrale Spiegel einen signifikant höheren Prozentsatz dieser Neuronen aufwies (Tabelle 4) (F(3,38) = 133.57; p <0.001). Dieser Befund steht im Einklang mit der höheren Dichte an hcrt / orx-Fasern, die wir im vorderen VTA beobachtet haben. Der Prozentsatz der TH-markierten Neuronen, die Fos-ir zeigten (aber keine hcrt / orx-Appositionen hatten), unterschied sich weder durch die Behandlung noch durch das rostro-kaudale Niveau. Der Prozentsatz der TH-Neuronen, die sowohl Fos- als auch hcrt / orx-Appositionen zeigten, zeigte einen signifikanten Effekt der Behandlung (F(1,38) = 8.62; p <0.01), Niveau (F(3,38) = 4.53; p <0.01) und ihre Wechselwirkung (F(3,38) = 4.53; p <0.01). Einweg-ANOVA-Mittel aus der Versuchsgruppe legen nahe, dass kopulationsinduziertes Fos-ir in TH-Neuronen mit hcrt / orx-Appositionen am stärksten in Zellen auftritt, die sich im rostralen VTA befinden (F(3,24) = 4.85; p <0.05).

Schau dir diese Tabelle an: 

Tabelle 3. 

Anzahl der Fos-ir-Kerne in nicht-TH-positiven VTA-Zellen auf vier rostrocaudalen Ebenen

Schau dir diese Tabelle an: 

Tabelle 4. 

Prozentsatz der TH-Neuronen, die hcrt / orx-Appositionen, Fos oder beides zeigen

Diskussion

Der erhöhte Fos-ir-Wert in hcrt / orx-Neuronen in der LHA nach der Kopulation legt nahe, dass die Aktivierung dieser Zellen das männliche Fortpflanzungsverhalten begleitet (Morgan und Curran, 1991). Diese Daten stimmen mit früheren 2-Desoxyglucose-Studien überein, die eine erhöhte metabolische Aktivität in LHA nach Exposition gegenüber weiblichen Estrogengerüchen berichteten (Orsini et al., 1985). Dieser Effekt kann eine verstärkte Übertragung von hcrt / orx in hcrt / orx-neuronalen Endbereichen wie dem mPOA widerspiegeln, in denen gezeigt wurde, dass hcrt / orx männliches Kopulationsverhalten fördert (Gulia et al., 2003). Die geschlechtsspezifische Fos-Induktion in hcrt / orx-Neuronen steht im Einklang mit der Annahme, dass die hcrt / orx-Neuronen gegenüber natürlichen Verstärkern empfindlich sind. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass Fos-ir in hcrt / orx-Neuronen von Ratten anstieg, die konditioniert wurden, um eine Futterbelohnung zu erwarten, und dass diese Zunahme von Fos-ir mit dem Präferenzwert der Tiere im Paradigma der Präferenz für konditionierte Orte korrelierte (Harris et al., 2005). Die Aktivierung von hcrt / orx-Neuronen kann ein belohnungsbezogenes Phänomen sein, da die obige Studie einen robusten Anstieg der Fos-ir-hcrt / orx-Zellen in Tieren zeigte, die einem neuen Objektstimulus ausgesetzt waren. Diese Autoren berichten auch über Prozentsätze von hcrt / orx-Neuronen, die basale (15%), durch Neuheit induzierte (18%) und lebensmittelbedingte (50%) Fos-ir exprimieren, die mit den hier beschriebenen (12% basal vs. 40) kompatibel sind % kopulationsinduziert). Diese Beobachtungen legen nahe, dass hcrt / orx-Neuronen durch natürliche Belohnungen wie Essen und Sex aktiviert werden.

Die hier beschriebene östrogene Regulierung von hcrt / orx liefert zusätzliche Hinweise auf eine mögliche hypokrinerge Kontrolle des männlichen Sexualverhaltens. Es ist bemerkenswert, dass der Zeitverlauf des hcrt / orx-Verlusts, der hier berichtet wird, mit den klassischen Verhaltensdaten kompatibel ist, die zeigen, dass das sexuelle Verhalten von Männern nach der Kastration mehrere Wochen dauert, und außerdem ist es E2 anstelle von DHT, das zur Wiederherstellung des Verhaltens erforderlich ist (Hull et al., 2006). Ohne weiteres Experiment können wir nur über die Mechanismen spekulieren, die der fortgesetzten Anwesenheit von hcrt / orx in Abwesenheit von E zugrunde liegen2. Die einfachste Erklärung kann darin bestehen, dass die Verzögerungszeit bei herabgesetzten hcrt / orx-Pegeln die Latenzzeit auf eine leicht quantifizierbare Abnahme in vesikulären Speichern des Senders spiegelt. Wie nachstehend diskutiert, deutet das Fehlen von ERs in hcrt / orx-Neuronen auf eine Regulierung der hcrt / orx-Expression durch Eingänge von Neuronen hin, die diese Rezeptoren enthalten. Weil die Neuropeptidsynthese (Enyeart et al., 1987) Motilität (Shakiryanova et al., 2005) und Freisetzung sind aktivitätsabhängige Phänomene (Fulop et al., 2005), nimmt jede postcastration in der neuronalen Erregbarkeit hcrt / orx ab (Smith et al., 2002) kann diese Prozesse negativ beeinflussen, was die Kinetik der Peptidfreisetzung verlangsamt, so dass reduzierte Synthesewerte für einige Zeit nicht sichtbar sind. Unabhängig von dem Mechanismus scheint es wahrscheinlich, dass die Wirkung des Steroids das erste Element einer komplexen Kaskade ist, die für die Aufrechterhaltung der Basalwerte des Peptids verantwortlich ist.

Genauso wie hcrt / orx-Neuronen die Nahrungsaufnahme als Reaktion auf humorale Faktoren zu regulieren scheinen, die mit dem Energiegleichgewicht zusammenhängen (Olszewski et al., 2003; Burdakov et al., 2006), scheinen hcrt / orx-Neuronen auch für das hormonelle Milieu empfindlich zu sein und können auf ähnliche Weise das reproduktive Verhalten erleichtern. Die hier präsentierten Daten legen nahe, dass die basale hcrt / orx-Expression von E beibehalten wird2. Bei gonadal intakten Tieren, die das vollständige Komplement von hcrt / orx ausdrücken, würde dieser Transmitter vermutlich die Verarbeitung in Strukturen erleichtern, die für das männliche Sexualverhalten und die Belohnung wichtig sind. Die hcrt / orx-Neuronen sind in wesentlichen wechselseitigen Beziehungen mit Bereichen wie mPOA, Bettkern der Stria terminalis (BNST) und VTA (Peyronet al., 1998; Sakurai et al., 2005), von denen bekannt ist, dass sie das männliche sexuelle Verhalten zum Ausdruck bringen (zur Übersicht siehe Hull et al., 2006). Es wird erwartet, dass eine Abnahme des hcrt / orx nach der Kastration eine wichtige Quelle für exzitatorischen Input in diese Strukturen verringert, wodurch das Verhalten beeinträchtigt wird.

Die Art und Weise, in der die ER-Aktivierung die basale Expression von hcrt / orx aufrechterhält, wartet auf weitere Untersuchungen. Es wird jedoch wahrscheinlich von Afferenten aus ERα-exprimierenden Gehirnregionen angetrieben, die auf LHA projizieren (Simerly et al., 1990; Yoshida et al., 2006), insbesondere bei solchen Strukturen, bei denen einige erregende Projektionen festgestellt wurden (z. B. BNST und mPOA (Georges und Aston-Jones, 2002; Henny und Jones, 2006)]. Wir berichten über keine Kolokalisation von AR mit hcrt / orx, und obwohl einige hcrt / orx-Neuronen ERα-immunopositiv waren, sind diese Zellen nicht zahlreich genug, um die ausgeprägten Wirkungen der Kastration zu erklären, noch sind sie im Einklang mit denen, bei denen es zu einer Abnahme kommt hcrt / orx-Inhalt nach der Kastration (Feigen. 2A, 3). Wir berichten auch, dass ERα-ir-Kerne und hcrt / orx-Neuronen häufig nebeneinander liegen, was die Möglichkeit einer lokalen Regulation von hcrt / orx-Neuronal- und Genexpressionsaktivität durch benachbarte ERα-enthaltende Zellen erhöht. Die Bedeutung der erregenden lokalen Schaltkreisaktivität dieses Typs wurde im System hcrt / orx beschrieben (Li et al., 2002). Bis die erforderlichen anatomischen Experimente exzitatorische Synapsen zeigen, die von ERα-enthaltenden Zellen an hcrt / orx-Neuronen gebildet werden, kann jedoch keine hormonabhängige, afferentgesteuerte Expression von hcrt / orx angenommen werden. Hcrt Ausdruck schwankt täglich (Taheri et al., 2000), während der Schwangerschaft (Kanenishi et al., 2004) und als Reaktion auf verschiedene diätetische Manipulationen (Cai et al., 1999; Griffond et al., 1999). Die molekularen Mechanismen, die die Dynamik von regeln hcrt Die Expression wurde nicht charakterisiert, so dass ein Weg vom Zellkern zur Membran verfolgt werden kann, und es ist derzeit schwierig, Kandidatensignalmoleküle zu benennen, die die hcrt / orx-Expression beeinflussen können.

Die Annahme, dass die Signalisierung von hcrt / orx an der Verstärkung von Verhaltensweisen wie Sex beteiligt ist, wird auch durch Daten gestützt, die nach einer OX-Behandlung Beeinträchtigungen des Sexualverhaltens zeigen1 Antagonist SB 334867 (Tabelle 2). Bei einer Dosis, die der Dosis ähnelt, die zur Blockierung der stressinduzierten Wiedereinstellung der Kokain-Selbstverabreichung verwendet wird (Boutrel et al., 2005), SB 334867 erhöhte die Intromissionslatenz signifikant und verringerte die Anzahl der Ejakulationen, was darauf hindeutet, dass eine Blockade der Übertragung von hcrt / orx die Anreizeigenschaften von weiblichen Frauen beeinflussen kann.

DA ist ein wichtiger Neurotransmitter für Belohnung, Motivation und adaptives Verhalten (Berridge und Robinson, 1998; Ikemoto und Panksepp, 1999; Weise, 2004). Wir beobachteten einen starken dosisabhängigen exzitatorischen Effekt von hcrt / orx auf die Aktivität von VTA DA-Neuronen. Dieser Befund unterstützt die Rolle von hcrt / orx bei der Verstärkung und legt nahe, dass das mesolimbische DA-System ein Locus außerhalb des mPOA ist, in dem hcrt / orx-Projektionen das männliche Sexualverhalten verbessern können. Bei der niedrigsten getesteten Dosis (0.014 nmol) erhöhte hcrt / orx die Schussrate, ohne die Populationsaktivität (Zellen / Spur) zu beeinflussen (Abb.. 4C). Bei der mittleren Dosis (1.4 nmol) war die Populationsaktivität von DA-Neuronen erhöht, was darauf hinweist, dass zuvor ruhende, hyperpolarisierte Neuronen aktiviert waren (Abb.. 4D). Bei der höchsten Dosis (140 nmol) war die Populationsaktivität von VTA-DA-Neuronen verringert. Interessanterweise wurde die durch hcrt / orx induzierte Reduktion der VTA-Aktivität der DA-Neuronen durch akute Verabreichung des DA-Agonisten Apomorphin (Abb.. 4D). Bei normalen Tieren hyperpolarisiert Apomorphin DA-Neuronen durch Aktivierung von Autorezeptoren und verringert deren Feuerrate und Populationsaktivität. Nach einer chronischen antipsychotischen Behandlung oder einer wiederholten Behandlung mit Missbrauchsmedikamenten kann Apomorphin jedoch die durch Drogen verursachte Abnahme der Populationsaktivität aufheben (Grace et al., 1997; Shen und Choong, 2006). Es wird angenommen, dass Apomorphin die Depolarisationsinaktivierung aufhebt, indem es die übererregten Zellen genug repolarisiert, um das Abfeuern wieder aufzunehmen. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass hcrt / orx eine dosisabhängige exzitatorische Wirkung auf VTA-DA-Neuronen ausübt, die mit den vorherigen übereinstimmt in vitro Arbeit (Korotkova et al., 2003).

Die Bedeutung absteigender Pfade vom LHA zum VTA wurde in einer Reihe von Experimenten untersucht (Bielajew und Shizgal, 1986; Shizgal, 1989; Sie et al., 2001). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Zunahme von NAc DA während hypothalamisch vermittelten motivierten Verhaltensweisen wie der Kopulation (Pfaus et al., 1990; Wenkstern et al., 1993) oder füttern (Hernandez und Hoebel, 1988; Rada et al., 2005) kann sich auf diese absteigenden Projektionen verlassen. Dass solche Projektionen hcrt / orx enthalten, wird durch Experimente gestützt, bei denen der NAc-DA-Efflux nach Intra-VTA-Injektion von hcrt / orx zunimmt (Naritaet al., 2006). Im Hypothalamus kann Serotonin [5-Hydroxytryptamin (5-HT)] hcrt / orx-Neuronen in der LHA hyperpolarisieren (Li et al., 2002). Selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer oder 5-HT selbst, die in der LHA in der Nähe der Hauptpopulation von hcrt / orx-exprimierenden Zellen revers dialysiert werden, reduzieren die NAc-DA-Freisetzung von Basalzellen und Frauen und beeinträchtigen die Kopulation (Lorrainet al., 1997, 1999). In Anbetracht der oben dargestellten Daten, die die Aktivierung von hcrt / orx-Neuronen während der Kopulation und von VTA-DA-Neuronen durch hcrt / orx zeigen, argumentieren wir, dass absteigende hcrt / orx-Projektionen in den VTA eine geschlechtsspezifische NAc-DA-Freisetzung vermitteln könnten. Darüber hinaus kann die Hemmung dieser Projektionen durch intra-LHA 5-HT die Hemmwirkung von 5-HT auf die Freisetzung von NAc DA und das Sexualverhalten erklären.

Ein anatomisches Substrat für hcrt / orx-DA-Wechselwirkungen zeigt sich in unserem Befund, dass TH-positive VTA-Neuronen durch das hcrt / orx-System innerviert werden und einen erhöhten Fos-ir-Wert zeigen, wenn sie belohnenden Stimuli wie Kopulation ausgesetzt sind (Abb.. 5, Tabelle 4). Dieser Effekt zeigte sowohl Verhaltensrelevanz als auch räumliche Spezifität, da die Fos-Induktion in hcrt / orx-apposierten TH-Neuronen nur im anterioren VTA von kopulierenden Tieren nachgewiesen wurde. Es ist vielleicht unauffällig, dass dieses Aktivierungsmuster in diesem Teil der VTA auftritt, da DA-Zellen nur kaudal zur Hauptpopulation von hcrt / orx-Neuronen liegen, deren absteigende Fasern diesen Bereich durchqueren, bevor sie sich zu distaleren Zielen im Hirnstamm ausbreiten (Peyronet al., 1998).

Abbildung 5. 

Die Kopulation induziert Fos-ir in hcrt / orx-applizierten VTA DA-Neuronen. A, Mikrofotografien, die TH, hcrt / orx und Fos-Kennzeichnung in VTA zeigen. Pfeile bezeichnen Fos-positive TH-Neuronen mit hcrt / orx-Appositionen; Sternchen kennzeichnen doppelt markierte Neuronen ohne Appositionen. Maßstabsbalken, 45 μm. B, Detail von Fos-positiven TH-Neuronen mit Pfeilen, die auf Standorte von hcrt / orx-Boutons in Apposition hinweisen. C, Koronale Schnitte zeigen rostrocaudale VTA-Werte, die beim Zählen verwendet werden (dunkel schattiert). Die Zahlen oben links in jedem Abschnitt sind in Millimetern von Bregma. Die Zahlen oben rechts sind mittlere ± SEM-Schätzungen der Zelldichte auf diesem Niveau. Das Kästchen zeigt die Fläche der Aufnahmen in an A.

Diese Daten legen einen neuen Weg nahe, durch den Gonadensteroide einen hypothalamischen Input für DA-Systeme beeinflussen können, die an motiviertem Verhalten beteiligt sind (Abb.. 6). Sie fügen der wachsenden Liste von Verhaltensweisen, die durch hcrt / orx reguliert werden, auch sexuelles Verhalten hinzu, einschließlich Erregung, Aufnahmeverhalten und Drogensucht.

Abbildung 6. 

Modell zur Regulierung von hcrt / orx durch Gonadensteroide und VTA DA durch hcrt / orx. Östradiol, das durch Aromatase aus Gonadatestosteron synthetisiert wird, wirkt auf ERα-enthaltende Neuronen in BNST, mPOA und LHA. Diese Strukturen projizieren auf hypothalamische hcrt / orx-Neuronen. Excitatorische Projektionen aus diesen Strukturen können die neuronale und Genexpressionsaktivität von hcrt / orx auf steroidempfindliche Weise beeinflussen. Hcrt / orx-Projektionen auf VTA verbessern die neuronale DA-Aktivität des mittleren Gehirns während des männlichen Sexualverhaltens. Dieser Effekt kann durch Intra-LHA-Infusionen von 5-HT, die die Aktivität von Hcrt / orx hemmen, das sexuelle Verhalten und die NAc-DA-Freisetzung beeinträchtigen, blockiert werden.

Fußnoten

  • Empfangen April 21, 2006.
  • Überarbeitung erhalten Januar 23, 2007.
  • Akzeptiert Februar 8, 2007.

  • Diese Arbeit wurde von den staatlichen Gesundheitsdienstleistern MH073314 (JWM), MH40826 und MH01714 (EMH) sowie AA12435 (R.-YS) der Vereinigten Staaten unterstützt. Wir danken Dr. Samir Haj-Dahmane für seinen hilfreichen Rat und Dr. Zuoxin Wang für die Einrichtung von Mikroskopie-Geräten.

  • Die Korrespondenz sollte an John Muschamp, Abteilung für Psychologie, Florida State University, Tallahassee, FL 32306-1270 gerichtet werden. [E-Mail geschützt]

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  • Orexin A / Hypocretin-1 fördert selektiv die Motivation für positive Verstärker Zeitschrift für Neurowissenschaften, 9 September 2009, 29 (36): 11215-11225
  • Orexin-stimulierte MAP-Kinase-Kaskaden werden durch mehrere G-Protein-Signalwege in humanen H295R-Nebennierenzellen aktiviert: verschiedene Rollen für die Orexine A und B Journal of Endocrinology, 1 August 2009, 202 (2): 249-261