Chemie und Biologie der Orexinsignalisierung (2010)

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Abstrakt

Die Orexine (auch Hypocretine genannt) sind Neuropeptide, die zuerst in 1998 von zwei unabhängigen Arbeitsgruppen entdeckt wurden^{1, 2}. Die Orexine A (33-Aminosäuren) und B (28-Aminosäuren) stammen von einem einzelnen Prä-Pro-Orexin-Polypeptid³. Sie vermitteln ihre Aktionen durch Interaktionen mit zwei eng verwandten GPCRs, den Orexin-Rezeptor 1 und 2 (OxR1 und OxR2). OxR1 bindet Orexin A mit etwa 100-fach höherer Affinität als Orexin B, während OxR2 beide Peptide mit annähernd gleicher Affinität bindet. Die Orexine werden von spezialisierten Neuronen im Hypothalamus produziert, die auf viele verschiedene Regionen des Gehirns projizieren^{4, 5}.

Wie im Folgenden kurz beschrieben wird, haben physiologische Studien in den letzten zehn Jahren dazu geführt, dass die Signalübertragung durch Oexexin eine zentrale Rolle in einer Vielzahl wichtiger biologischer Prozesse spielt, darunter Fütterung, Energiehomöostase, Schlaf- / Wach-Zyklen, Sucht und Belohnungssuche⁶. Es gibt eindeutige Beweise dafür, dass Defekte bei der Orexinsignalisierung an diätetischer Fettleibigkeit und an Diabetes beteiligt sind^{7, 8}, Narkolepsie^{9, 10}Panik Angststörung¹¹, Drogenabhängigkeit¹² und Alzheimer-Krankheit¹³. Daher besteht in der Arzneimittelindustrie ein erhebliches Interesse an der Entwicklung wirksamer Verbindungen zur Manipulation der Orexinsignalisierung. Die jüngsten Fortschritte beim Verständnis und bei der Manipulation der Orexinsignalisierung werden hier beschrieben.

Orexin signalisiert die Koordination von Schlaf und Fütterung

Die am besten verstandene Rolle des Orexinsignals ist die Koordination von Fütterung und Schlaf. Das Niveau der Orexinproduktion im Hypothalamus ist umgekehrt proportional zum Blutzuckerspiegel ¹⁴. Die Signalisierung von Orexin induziert zumindest kurzfristig ein Hungergefühl und stimuliert das Ernährungsverhalten, wahrscheinlich durch Aktivierung von Neuronen im Gehirn, die Neuropeptid Y und funktionell verwandte Hormone produzieren. Darüber hinaus ist die Orexinsignalisierung eine Schlüsselkomponente, um bei Säugetieren einen Wachzustand zu induzieren^{9, 15}. Mit anderen Worten, das Orexin-Signal signalisiert, dass Tiere, wenn sie hungrig sind, auch wach sind, aber wenn sie gesättigt sind, können sie müde sein. Dies ist aus physiologischer Sicht sinnvoll, da Tiere nach Nahrung suchen und nicht schlafen wollen, wenn sie hungrig sind.

Die genetische Ablation des Orexin-Gens oder des Rezeptors bei Nagetieren führt zu einem Phänotyp, der der menschlichen Narkolepsie mit Kataplexie bemerkenswert ähnlich ist, wobei das Tier unangemessen in den normalen Weckzeitpunkt eingedrungen ist, einschließlich des Zusammenbruchs in unregelmäßigen Momenten⁹. Gleiches gilt für Hunde mit einer inaktivierenden Mutation im OxR2-exprimierenden Gen¹⁰. Die meisten, wenn auch nicht alle, menschliche Narkoleptika, obwohl sie keine Mutationen in den Genen tragen, die für Orexin und seine Rezeptoren kodieren, fehlt jedoch nachweisbares Orexin. Es wird angenommen, dass dies auf einen Autoimmunangriff auf die orexinproduzierenden Neuronen im Gehirn zurückzuführen ist^{16, 17}. Dieses Autoimmunmodell für die menschliche Narkolepsie muss jedoch noch nachgewiesen werden, und es ist nichts über die Art der mutmaßlichen Autoimmunreaktion bekannt.

Die bekannte Biologie der Orexin-Signalübertragung sagt daher voraus, dass die durch das Gehirn penetrierenden OxR2-Agonisten die Wachheit anregen sollten und für die Behandlung von Narkolepsie nützlich sein könnten. Yanagisawa und Kollegen haben Proof of Concept-Experimente veröffentlicht, die diese Idee unterstützen¹⁸. Sie zeigten, dass die direkte intrakranielle Injektion von Orexinpeptid in das Gehirn von Nagetieren mit Oexinmangel zu einem erhöhten Wachzustand führte. Umgekehrt könnten Orexinrezeptorantagonisten zur Behandlung von Schlafstörungen eingesetzt werden¹⁹Obwohl die mögliche Auslösung einer Kataplexie, die bei Tieren und Menschen mit chronischem Orexin-Mangel beobachtet wird, ein Anliegen ist (siehe unten).

Orexin-Signalisierung bei Suchtverhalten und anderen pathologischen Verhaltensweisen

Die Insula ist eine Gehirnregion, die bekanntermaßen an der Entwicklung von Verlangen und Sehnsüchten beteiligt ist, und ist im Allgemeinen am Belohnungsverhalten beteiligt²⁰. Die Schädigung dieser Gehirnregion führt zu einer bemerkenswerten Abnahme der Motivation der Raucher, ihre Gewohnheit fortzusetzen²¹. Im Gegensatz dazu ist es bekannt, dass Abstinenz bei Zigarettenrauchern die Insula aktiviert²². Die gleiche Region des Gehirns scheint an der Belohnungssuche beteiligt zu sein, die zusätzlich zu Morphium, Kokain und Alkohol involviert ist. Orexin-produzierende Neuronen innervieren diese Region des Gehirns dicht und Orexin-Signale spielen bei diesen Verhaltensweisen eine Schlüsselrolle^23-25. Zum Beispiel die Verabreichung des OxR1-Selektivantagonisten SB-334867 (siehe Figure 5) verringerte signifikant den Antrieb von Nagetieren, sich selbst mit Nikotin zu injizieren¹². Ähnliche Ergebnisse wurden für andere süchtigmachende Verbindungen erhalten. Interessanterweise unterdrückte die pharmakologische Blockade von OxR1 in der Nikotinstudie die Nahrungsaufnahme nicht wesentlich, was vermutlich zusammen mit Wachheit hauptsächlich durch OxR2 vermittelt wird. Die vorklinischen Daten bei Nagetieren deuten daher stark darauf hin, dass selektive OxR1-Antagonisten interessante Anti-Suchtmittel sein könnten.

 

Figure 5

Strukturen von Orexinrezeptorantagonisten, entwickelt von Glaxo Smith Kline (GSK) und Merck.

Kürzlich wurde auch gezeigt, dass Orexin-Signale an Panikattacken und Angstzuständen beteiligt sind¹¹. Unter Verwendung eines Rattenmodells, bei dem Panikattacken durch chronische Behandlung des Tieres mit einem GABA-Syntheseinhibitor gefolgt von einer akuten Behandlung mit Natriumlactat induziert wurden, wurde gezeigt, dass die SB-334867-vermittelte Blockade von OxR1 oder die siRNA-vermittelte Silencing-Produktion der Orexinproduktion stark ist unterdrückt Panikattacken in diesem Modell. Darüber hinaus haben Menschen, die Panikattacken ausgesetzt sind, erhöhte Oexinwerte in ihrer Zerebrospinalflüssigkeit (Liquor). ¹¹, im Einklang mit einer Rolle der Orexinsignalisierung bei menschlichen Angststörungen.

Vor kurzem erschien ein Bericht, der den Schlaf- / Wachzyklus mit der Alzheimer-Krankheit in Verbindung brachte¹³. Insbesondere wurde gezeigt, dass die Anhäufung von Amyloid Beta, ein Kennzeichen der Krankheit, mit Wachheit korreliert. Zum Beispiel erhöhte chronischer Schlafentzug die Amyloid-Beta-Spiegel im Liquor des Tieres. Interessanterweise verringerte die Verabreichung des Orexinrezeptorantagonisten SB-334867 die Spiegel dieses neurotoxischen Intermediats. Daher ist es möglich, dass ein geeignetes Behandlungsschema mit OxR-Antagonisten eine praktikable Behandlung sein kann, um die Entwicklung der Alzheimer-Krankheit zu verlangsamen, wenn dies früh genug diagnostiziert wird.

Orexinsignalisierung bei der Energiehomöostase, durch Ernährung verursachter Fettleibigkeit und bei Diabetes

Es gibt Indizien dafür, dass die Orexinsignalisierung für die Energiehomöostase wichtig ist. Beispielsweise zeigen narkoleptische Menschen, denen Orexin fehlt, einen höheren Body-Mass-Index als narkoleptische Personen mit normalen Orexinwerten²⁶. Die genetische Ablation von Orexin-Neuronen bei Mäusen führt zu adipösen Tieren²⁷ und diese Mäuse entwickeln auch altersbedingte Insulinresistenz⁷. Diese Ergebnisse scheinen insofern nicht intuitiv zu sein, als die pharmakologische Induktion der Orexin-Signalgebung das Fütterungsverhalten akut fördert¹. Dies legt nahe, dass die kurz- und langfristigen Auswirkungen der Orexinsignalisierung auf die Energiehomöostase unterschiedlich sind.

Vor kurzem wurde dieses Gebiet der Orexinbiologie durch eine wegweisende Studie geklärt, in der eindeutig nachgewiesen wurde, dass das Orexinsignal stark diätbedingter Fettleibigkeit und der anschließenden Entwicklung von Insulinresistenz bei Nagetieren stark entgegenwirkt⁸. Es wurde gezeigt, dass die chronische Überexpression des Orexingens oder die pharmakologische Induktion des Orexinrezeptors die Entwicklung von Fettleibigkeit und Insulinresistenz bei Mäusen, die eine fettreiche Ernährung erhielten, nahezu vollständig blockierte. Es wurde gezeigt, dass dies zu einem großen Teil auf den erhöhten Energieverbrauch zurückzuführen ist, obwohl sich der respiratorische Quotient, ein indirekter Indikator für Kohlenhydrate gegenüber der Lipidverwendung, nicht verändert hat. Die chronische Stimulation der Orexin-Signale reduzierte auch den Nahrungsverbrauch. Verschiedene genetische und pharmakologische Experimente zeigten, dass der Hauptteil dieser Wirkung durch Signalübertragung durch OxR2 und nicht durch OxR1 vermittelt wurde. Ein bemerkenswertes Ergebnis dieser Studie ist schließlich, dass die chronische Stimulation der Orexinsignalisierung keinen Einfluss auf Mäuse hatte, denen Leptin fehlt. Wenn diese Tiere mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden, wurden sie selbst bei Behandlung mit dem Orexin-Rezeptor-Agonisten obsese und Insulinresistenz. Daher scheint die schützende Wirkung von Orexin auf die Verbesserung der Leptinempfindlichkeit zurückzuführen zu sein. Diese Studie hat offensichtliche therapeutische Implikationen bei der Behandlung von diätetischer Adipositas und Diabetes.

Während diese Studie hauptsächlich die Signalisierung durch OxR2 als wichtig für den adipositasresistenten Phänotyp implizierte, wurden einige OxR1-vermittelte Effekte festgestellt⁸. Die Autoren fanden heraus, dass die genetische Ablation von OxR1 alleine vor einer fettreichen Diät-induzierten Hyperglykämie schützt, nicht jedoch vor Fettleibigkeit. Dies deutet darauf hin, dass die Orexin-Signalisierung durch OxR1 durch normale physiologische Oreexinspiegel eine maßgebliche Rolle bei der Entwicklung einer durch Insulinresistenz verursachten alters- oder fettreichen Ernährung spielt. In dem nicht-physiologischen Szenario einer anhaltenden Überexpression von Oexin über ein Transgen wurde jedoch sowohl OxR1- als auch OxR2-Schutz gegen die Entwicklung von Insulinresistenz bei einer fettreichen Diät vermittelt. Dieser komplizierte Satz von Ergebnissen in Bezug auf OxR1 legt nahe, dass entweder der Rezeptor unter den Bedingungen normaler und supraphysiologischer Oexin-Expression eine unterschiedliche Rolle spielt oder dass der Rezeptor verschiedene physiologische Wirkungen vermittelt, die die Entwicklung von Hyperinsulinämie verstärken oder dagegen wirken können Diese konkurrierenden Effekte unterscheiden sich je nach Oexin-Level oder Zeitpunkt und Dauer der Signalisierung.

Die Kopplung des Orexin-Effekts an die Leptinsignalisierung ist im Hinblick auf eine andere kürzlich veröffentlichte Studie interessant, in der festgestellt wurde, dass supraphysiologische Leptinspiegel das Gedeihen diabetischer Nagetiere ermöglichen, denen vollständig Insulin fehlt ²⁸. Zuvor war bekannt, dass Leptin den Blutzuckerspiegel senkt, indem es die Restmengen an endogenem Insulin in Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Ratten mit partiellem Insulinmangel potenziert ²⁹. Die Idee, dass Leptin allein Insulin-defiziente Tiere vor diabetischen Symptomen retten konnte, wurde jedoch nie getestet, und dieser Befund war eine große Überraschung. Die ähnlichen Phänotypen, die durch chronische Behandlung von Tieren mit supraphysiologischen Oexin - und Leptinkonzentrationen induziert werden, und die Feststellung, dass Orexin durch die Verbesserung der Leptinsensitivität zu funktionieren scheint, lassen die Frage aufkommen, ob es sich bei diesen beiden Studien um unterschiedliche Seiten der gleichen Münze und um die Stimulation handelt Die Orexin / Leptin-Signalwege können in der Tat eine vielversprechende Behandlung von Diabetes Typ I oder Typ II sein.

Hat Orexinsignalisierung Auswirkungen in der Peripherie?

Es wird angenommen, dass die meisten der oben beschriebenen Auswirkungen der Orexinsignalisierung im Hypothalamus auftreten. Die Rolle des Oexin-Signals außerhalb des Nervensystems ist umstritten. Die Expression der Orexine und ihrer Rezeptoren wurde in verschiedenen peripheren Geweben nachgewiesen, einschließlich Darm, Pankreas, Nieren, Nebennieren, Fettgewebe und Fortpflanzungsorgan ^30-33, aber der funktionelle Nachweis einer Rolle für die Orexinsignalisierung in der Peripherie ist selten.

Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass die Inzidenz von OxR1-exprimierenden Zellen in den Pankreasinseln mit Streptozotocin (STZ) -induzierter Hyperglykämie bei Ratten zunahm und gemeinsam mit Glucagon lokalisierte³⁴. Darüber hinaus wurde die gespaltene Caspase-3 mit OxR1 in den Inseln immunochemisch lokalisiert. Tiere ohne Orexin zeigten dagegen eine verminderte Hyperglykämie und eine bessere Glukosetoleranz als Wildtyptiere. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Signalübertragung von Oexin durch OxR1 im Pankreas zur Betazellapoptose und zur Entwicklung von Diabetes als Reaktion auf eine STZ-Behandlung beitragen kann. Während der Zusammenhang schwach ist, ist es möglich, dass dieser Effekt die Beobachtungen von Funato et al., Die oben erwähnt wurden, erklären könnte, dass die genetische Ablation von OxR1 vor fettreicher Diät-induzierter Hyperglykämie und Hyperinsulinämie schützt⁸.

Die Orexin-Signalkaskade

Während die Orexinsignalisierung auf physiologischer Ebene intensiv untersucht wurde, ist der Charakterisierung der intrazellulären Ereignisse, die durch die Bindung der Orexinhormone an ihre Rezeptoren ausgelöst werden, sehr viel weniger Mühe gewidmet. Es ist bekannt, dass die Bindung des Hormons an seinen Rezeptor einen Zufluss von Calcium auslöst, der an die Aktivierung von Erk gekoppelt ist ³⁵. Die Rezeptoren koppeln auch an einen Phospholipase C (PLC) -vermittelten Weg, der intrazelluläre Kalziumspeicher freisetzt.

Die gründlichste Analyse der durch Orexinsignalisierung ausgelösten Gentranskriptionsprogramme wurde in 2007 berichtet ³⁶. In dieser Studie wurden globale Genexpressionsprofile eingesetzt, um Gene zu identifizieren, die in HEK293-Zellen, die OxR1 stabil exprimieren, stark auf- oder abreguliert sind. Es wurde festgestellt, dass 260-Gene hochreguliert sind und 64 um das Doppelte oder mehr herunterreguliert wurde, wenn sowohl zwei als auch vier Stunden nach der Orexinstimulation Proben genommen wurden. Die Genannotationen zeigten, dass etwa die Hälfte der hochregulierten Gene am Zellwachstum (30%) oder am Stoffwechsel (27%) beteiligt war. Eine Analyse der Signalwege unter Verwendung des kommerziellen Ingenuity-Programms implizierte, dass mehrere Signalwege durch die Orexinsignalisierung (Figure 1). Die kanonischen TGF-β / Smad / BMP-, FGF-, NF-kB- und hypoxischen Signalwege waren am prominentesten. Diese Studie konzentrierte sich detailliert auf den hypoxischen Weg, der in dieser Studie ein seltsamer "Treffer" war, da die Zellen unter normoxischen Bedingungen kultiviert wurden. Nichtsdestotrotz waren der Hypoxie-induzierbare Faktor 1-α (HIF-1α) -Transkriptionsfaktor, von dem zuvor bekannt war, dass er als Reaktion auf Hypoxie ansteigt, und viele seiner Zielgene durch die Behandlung mit Orexin stark induziert. In hypoxischen Krebszellen, in denen die Wirkung von HIF-1α am besten untersucht wurde, kooperiert sie mit HIF-1β, um einen heterodimeren Transkriptionsfaktor (HIF-1) zu bilden, der eine Umprogrammierung des zellulären Metabolismus vorantreibt³⁷. Insbesondere werden Glukoseimport und Glykolyse massiv nachreguliert, wobei Bindungsstellen stromaufwärts von fast allen an diesen Ereignissen beteiligten Genen vorhanden sind. In hypoxischen Zellen dient HIF-1 dazu, das Produkt der Glykolyse, des Pyruvats, zur Produktion von Laktat anstatt zur Umwandlung in Acetyl-CoA und zum Eintritt in den TCA-Zyklus und zur oxidativen Phosphorylierung umzuleiten. Dies geschieht zumindest teilweise durch die HIF-1-abhängige Hochregulierung der Expression der Lactatdehydrogenase A (LDH-A), des Enzyms, das die Umwandlung von Pyruvat zu Lactat sowie von Pyruvatdehydrogenase-Kinas ( PDHK), das PDH, das Enzym, das die Umwandlung von Pyruvat in Acetyl Co-A vermittelt, inaktiviert (vgl Figure 2). Überraschenderweise schienen die mit Orexin behandelten Zellen jedoch den größten Teil ihres metabolischen Flusses durch den TCA-Zyklus und die oxidative Phosphorylierung zu drängen ³⁶, was zu einer stark erhöhten Produktion von ATP führt und vermutlich andere biosynthetische Zwischenprodukte, die mit der Aktivierung dieser Wege einhergehen. Es ist nicht bekannt, wie Orexinsignalisierung und Hypoxie beide die HIF-1α-Aktivität stimulieren können, jedoch wird in Orexin-behandelten Zellen nur eine Teilmenge von Genen aktiviert, die üblicherweise durch diesen Transkriptionsfaktor bei Hypoxie aktiviert werden.

 

Figure 1

Zusammenfassung der Ergebnisse einer Genexpressionsanalyse der Wirkung von Orexin auf Zellen, die den Orexinrezeptor 1 exprimieren. Oben: Kreisdiagramm fasst kommentierte Funktionen von Genen zusammen, die signifikant von der Orexinsignalisierung betroffen sind. Unten: Vorgeschlagene Signalwege ...

 

Abb.. 2

Schematische Zusammenfassung der Hauptwirkung von Orexin-Signalen auf den Glukosestoffwechsel. OxSig = Orexin-Signalisierung. Das orange Oval repräsentiert einen Glukosetransporter. Pfeile zeigen eine Stimulation des angezeigten Prozesses an und die senkrechten Linien repräsentieren eine ...

Parallele Studien von hypothalamischen Schnitten, die aus Wildtyp- oder OxR1-Knock-out-Mäusen erhalten wurden, stimmten im Allgemeinen mit diesen Schlussfolgerungen überein und bestätigten, dass die beobachteten Effekte das Ergebnis der Orexinsignalisierung waren ³⁶. In gewisser Weise ist dieses Ergebnis insofern interessant, als es ein Rätsel in unserem Verständnis der Orexinbiologie auf physiologischer Ebene erklärt. Wenn wir einen Zustand des Wachzustandes mit einer hohen neuronalen Stoffwechselaktivität gleichsetzen, was vernünftig erscheint, ist es merkwürdig, dass dies der Fall sein würde, wenn das Gehirn mit niedrigem Glukosespiegel getränkt wird. Daher macht es Sinn, dass Wachsamkeit eine Übersteuerung dieser Situation durch einen Mechanismus erfordert, der die Effizienz der Glukoseaufnahme und -verarbeitung erhöht. Eine durch Orexin vermittelte Hochregulierung des zellulären Metabolismus scheint auch mit der Beobachtung eines erhöhten Energieverbrauchs und einer Resistenz gegen fettreiche Diät-induzierte Fettleibigkeit zu vereinbaren ⁸. Es ist jedoch wichtig zu wissen, dass sich diese Studie auf OxR1-exprimierende Zellen und neuronale Schnitte konzentrierte, die aus Wildtyp- oder OxR1-Knock-out-Mäusen erhalten wurden. Wachsamkeit und Widerstand gegen ernährungsbedingte Fettleibigkeit, wie oben erwähnt, sind nunmehr eher ein Effekt der OxR2-vermittelten Signalgebung. Es kann sein, dass die beobachteten Pfade relevanter sind, um Verhalten und andere Prozesse zu belohnen, die durch OxR1-vermittelte Signalgebung dominiert zu sein scheinen. In verschiedenen Zelltypen und Geweben ist viel Arbeit erforderlich, um diese Probleme zu lösen. Aber die Idee, dass das Orexinsignal ein wichtiger Regulator des Energiestoffwechsels ist, ist ein interessantes Modell, das zukünftige Studien leiten wird.

Ist das Signal von Orexin bei Krebs wichtig?

Die Feststellung, dass die Orexinsignalisierung den Glukoseverbrauch mit Turboladung aufladen kann, deutet auf eine mögliche Verbindung zur Zellproliferation in sich teilenden Zellen und damit auf Krebs hin. Die oben diskutierten veröffentlichten Ergebnisse zeigen jedoch, dass Orexin den oxidativen Energiestoffwechsel anregen kann ³⁶während viele Krebszellen für den Großteil ihres Stoffwechsels anaerobe Glykolyse verwenden ³⁸. Eine Möglichkeit ist, dass Krebszellen, die einen oxidativen Metabolismus einsetzen, die Oxyin-Signalgebung auf autokrine oder parakrine Weise einsetzen könnten, um ihren Metabolismus und ihre Proliferation zu stimulieren, und wenn dies der Fall wäre, wären Orexin-Rezeptorantagonisten interessante therapeutische Optionen. Wenn auf der anderen Seite das Orexin-Signal den Stoffwechselfluß durch TCA und oxidative Phosphorylierungswege auf Kosten einer anaeroben Glykolyse erzwingt, könnte die Aktivierung dieses Weges toxisch für Tumorzellen sein, die an einen glykolytischen Lebensstil "süchtig" sind.

Es gibt einige Hinweise auf eine Rolle für die Orexinsignalisierung in Krebszellen, und wie man aus der obigen Analyse vorhersagen könnte, scheint die Wirkung der Orexinsignalisierung bei verschiedenen Arten von Krebszellen unterschiedlich zu sein. Zum Beispiel unterdrücken Orexine das Zellwachstum, indem sie Apoptose bei menschlichem Kolonkarzinom, Neuroblastomzellen und Pankreastumorzellen der Ratte induzieren ³⁹. Andererseits ist die Expression von OxR1 und OxR2 bei Adenomen höher als bei der normalen Nebennierenrinde. Orexin A und B können die Zellproliferation in diesen Zellen stimulieren, und die Wirkungen waren in kultivierten adenomatösen Zellen ausgeprägter als in normalen Nebennierenrindenzellen ⁴⁰. Während diese Berichte interessant sind, ist unser Verständnis der Bedeutung der Orexin-Signalgebung bei Krebs, wenn überhaupt, noch in den Kinderschuhen, und es wird weitaus mehr Arbeit erforderlich sein, um zu bestimmen, ob die Orexinrezeptoren oder nachgeschalteten Effektoren des Signalweges geeignete Ziele für die Krebschemotherapie darstellen .

Pharmakologische Kontrolle der Orexin-Signalgebung

Die oben besprochene Biologie legt nahe, dass Agonisten, Antagonisten und Potentiatoren der Orexin-Signalgebung klinisch von erheblichem Interesse sein könnten. Zum Beispiel sollte die Behandlung von Narkolepsie und Kataplexie, die durch mangelnde Orexinproduktion hervorgerufen wird, unter Verwendung eines Orexinrezeptoragonisten behandelbar sein. Auf der anderen Seite sollte das Suchtverhalten mit einem Orexin-Rezeptor-Antagonisten behandelt werden können. Diät-induzierte Fettleibigkeit und Diabetes können entweder mit einem Orexin-Rezeptor-Agonisten oder möglicherweise einem positiven allosterischen Potentiator bekämpft werden. Mehrere große Pharmaunternehmen haben die Entwicklung von Molekülen für die Orexinrezeptoren in Angriff genommen ⁴¹.

Orexin-Rezeptor-Antagonisten

Da die Orexinsignalisierung im Gehirn die Wachheit fördert, ist es naheliegend, dass eine pharmakologische Blockade dieses Signalwegs zu Schläfrigkeit führen sollte. Daher könnten Orexinrezeptorantagonisten nützliche Medikamente zur Behandlung von Schlaflosigkeit sein. Ein Hauptproblem wäre jedoch die Auslösung einer Kataplexie. In der Tat ist die zentrale Frage bei der Entwicklung von therapeutisch nützlichen Orexinrezeptor-Antagonisten die Frage, ob eine vorübergehende pharmakologische Hemmung des Orexinrezeptors den narkoleptischen und kataplektischen Phänotyp des chronischen Orexinmangels phänokopieren wird.

Die bisher verfügbaren präklinischen und klinischen Daten sprechen für "Nein". Die meisten Daten stammen aus Studien von Almorexant (Figure 3; auch bekannt als ACT-078573), das von Actelion Pharmaceuticals zur Behandlung von Schlaflosigkeit entwickelt wird. Almorexant ist ein oral verfügbares Tatrahydroisochinolin, das sowohl OxR1 als auch OxR2 wirksam antagonisiert. Actelion veröffentlichte eine erste Studie im frühen 2007, die über die erfolgreiche Behandlung von Ratten, Hunden und Menschen mit Almorexant oder einem klassischen GABA-Rezeptor-Agonisten, Zolpidem, berichtete ¹⁹. Almorexant erwies sich in dieser Studie als sicher und gut verträglich. Es induzierte subjektive und objektive physiologische Anzeichen von Schlaf. In den Rattenversuchen wurde gezeigt, dass Almorexant nicht-REM- und REM-Schlaf induzierte. Dies ist insofern von Bedeutung, als Zolpidem keinen REM-Schlaf induziert. Wichtig ist, dass bei keinem der Versuchstiere oder menschlichen Patienten Anzeichen einer Kataplexie beobachtet wurden.

 

Figure 3

Zusammenfassung der Entwicklung von Almorexant, einem klinischen Kandidaten für die Behandlung von Insomnie, und verwandten Verbindungen mit unterschiedlicher Selektivität für die beiden Orexinrezeptoren.

Am Ende von 2009 gab Actelion den Abschluss einer umfangreichen Phase-III-Studie für eine zweiwöchige Behandlung von erwachsenen und älteren Patienten mit primärer chronischer Insomnie bekannt. Das Unternehmen behauptet, der primäre Endpunkt der Studie, die überlegene Wirksamkeit von Almorexant gegenüber dem Placebo, sowie mehrere sekundäre Endpunkte (siehe http://www1.actelion.com/en/our-company/news-and-events/index.page?newsId=1365361). In einer kryptischen Zeile in der Pressemitteilung heißt es jedoch: „… wurden einige Sicherheitsbeobachtungen gemacht, die in längerfristigen Phase-III-Studien einer weiteren Bewertung und Bewertung bedürfen.“ Es wird interessant sein zu wissen, was dies bedeutet, wenn die Daten verfügbar werden.

Almorexant war das Ergebnis eines umfangreichen Entwicklungsprogramms, das mit dem Tatrahydroisochinolin begann 1 (Figure 3) ⁴². Diese Verbindung entstand als primärer Treffer aus einem Hochdurchsatz-Screening unter Verwendung eines FLIPR-basierten Calciumassays in Chinese Hamster Ovary (CHO) -Zellen, die hohe Mengen an menschlichem OxR1 oder OxR2 exprimieren. Beachten Sie diese Verbindung 1 ist ziemlich selektiv für OxR1. Tatsächlich produzierte dieses Arzneimittelprogramm viele verschiedene potente Verbindungen, von denen einige duale Rezeptorantagonisten waren, während andere vernünftigerweise selektive Inhibitoren von OxR1 oder OxR2 waren (vgl Figure 3). Es wurden ziemlich große Schwankungen des Selektivitätsgrades als Ergebnis mäßiger struktureller Veränderungen beobachtet. Zum Beispiel der Austausch einer der Methoxygruppen im "oberen linken" aromatischen Ring von 1 mit einem Isopropylether führte zu einem vollständig OxR1-spezifischen Antagonisten. Ein weiterer interessanter Kontrast ist zusammengesetzt 3, was für OxR2 eher selektiv ist, aber viele strukturelle Merkmale mit dem Doppelantagonisten Almorexant teilt. Leider gibt es keine strukturellen Daten zum Orexinrezeptor und somit ist die molekulare Basis dieser Selektivität nicht bekannt.

Die Tetrahydroisochinoline sind weit von den einzigen berichteten Orexinrezeptorantagonisten entfernt. Beispielsweise hat Actelion strukturell verschiedene Verbindungen wie Sulfonamide berichtet 4 und 5, die potente duale und OxR2-selektive Antagonisten sind (Figure 4) ⁴³. Bei der Untersuchung der Strukturen, zu denen ein stark modifizierter Glycinkern gehört, kann man zu der Schlussfolgerung gelangen, dass die Tetrahydroisochinoline und Sulfonamide überlappende Stellen am Rezeptor einnehmen können, dies wurde jedoch nach unserem besten Wissen nicht getestet.

 

Figure 4

Strukturen anderer Orexinrezeptorantagonisten, die von Actelion Pharmaceuticals entwickelt wurden.

GSK berichtete über einen der ersten Orexinrezeptorantagonisten, SB-334867 ^44-46 (Figure 5), eine Verbindung, die relativ selektiv für OxR1 ist und nach wie vor die am häufigsten verwendete „Werkzeugverbindung“ in Forschungslabors ist, in denen die Orexinbiologie untersucht wird. Sie berichteten auch über einen relativ entfernten Verwandten von SB-334867, 6, das eine Prolin-Einheit enthält, mit einer viel besseren Wirksamkeit gegen beide Rezeptoren, aber eine angemessene OxR1-Selektivität beibehält ⁴⁷. Das wurde spekuliert 6 könnte ein enger Verwandter einer Verbindung mit einer unbekannten Struktur sein, die GSK in klinische Studien zur Behandlung von Schlafstörungen namens SB-674042 aufgenommen hat ⁴¹. GSK kündigte die Progression dieses Wirkstoffs zu klinischen Phase-II-Studien mit 2007 an, aber nach unserem besten Wissen liegen keine weiteren klinischen Daten vor.

Ein Merck-Team hat Prolin-haltige Orexinrezeptor-Antagonisten entwickelt ⁴⁸. Verbindung 7 (Figure 5) ging aus einem Hochdurchsatz-Screening hervor und zeigte eine hervorragende in vitro-Wirksamkeit gegen OxR2 sowie eine bescheidene Aktivität gegen OxR1, zeigte jedoch in vivo eine schlechte Penetration der Blut-Hirn-Barriere. Es wurde festgestellt, dass dies ein Substrat für das P-Glycoprotein ist. Sie fanden heraus, dass dieses Problem durch Methylierung des Benzimidazolstickstoffs verbessert werden konnte ^{41, 48}. Verbindung 8, der auch einen Phenylring anstelle einer Pyrroleinheit im "oberen rechten" Quadranten des Moleküls enthält, ist ein wirksamer Doppelrezeptorantagonist mit ausgezeichneter Penetration der Blut-Hirn-Schranke. 8 hat sich bei Ratten als aktiv erwiesen.

Andere pharmazeutische Unternehmen haben über einige Verbindungen mit In-vitro-Aktivität gegen Orexinrezeptoren berichtet, die hier jedoch nicht besprochen werden.

Es ist verlockend zu spekulieren, dass dieselben Verbindungen, die als Schlafmittel entwickelt werden, auch für die Behandlung chronischer Abhängigkeiten nützlich sein könnten, obwohl eine offensichtliche Nebenwirkung dieses Behandlungsregimes darin besteht, dass die Patienten schläfrig werden, wenn sie zwei Rezeptorantagonisten sind. Die Entdeckung der Rolle der Orexin-Signalgebung bei Suchtverhalten ist jedoch relativ neu, und nach unserem besten Wissen wurden keine klinischen Studien mit den oben für diese Indikation diskutierten Verbindungen initiiert.

Orexin-Rezeptor-Agonisten und Potentiatoren

Wie oben diskutiert, haben Yanagisawa und Kollegen in Tiermodellen bewiesen, dass die Narkolepsie mit einem Orexin-Rezeptor-Agonisten behandelbar sein sollte ¹⁸. Sie verwendeten ein modifiziertes Orexinpeptid in diesen Studien. Seltsamerweise wurden jedoch nach unserem besten Wissen bisher keine Nicht-Peptid-Agonisten in der Literatur beschrieben. Es ist schwer vorstellbar, dass aufgrund dieser umfangreichen Arbeit an Rezeptorantagonisten keine Screenings auf solche Verbindungen durchgeführt wurden. Es ist daher wahrscheinlich, dass starke Agonisten schwer zu finden sind, obwohl nicht klar ist, warum dies so ist.

Vor kurzem wurde der erste positive allosterische Potentiator des Orexinrezeptors 9 (Figure 6), wurde identifiziert. Diese Verbindung wurde zufällig während einer bescheidenen Kampagne der medizinischen Chemie entdeckt, die auf die Steigerung der Wirksamkeit eines auf Peptoid basierenden Orexinrezeptorantagonisten gerichtet war ⁴⁹. Peptoid 10 wurde in einem Screen identifiziert, in dem Zellen, die OxR1 nicht exprimieren oder nicht exprimieren, aber ansonsten identisch sind, mit verschiedenfarbigen Farbstoffen (rot bzw. grün) markiert und mit einem Mikroarray hybridisiert wurden, der mehrere tausend auf einem Objektträger immobilisierte Peptoide zeigte. Verbindungen, die selektiv die OxR1-exprimierenden Zellen banden, wurden durch ein hohes Rot: Grün-Verhältnis der an dieser Stelle eingefangenen Fluoreszenzfarbstoffe identifiziert (siehe Lit. ⁵⁰ für die Entwicklung dieser Methodik). Ein Sarkosin-Scanning-Experiment ⁵¹ zeigten, dass nur zwei der neun im Molekül vorhandenen Seitenketten für die Bindung an die Rezeptor exprimierenden Zellen (in rot hervorgehoben) wichtig sind Abb.. 6). Nachfolgende Synthese und Analyse der Verbindung 11 bestätigte, dass es sich um den "minimalen Pharmakophor" für die Rezeptorbindung handelt. 11 ist ein sehr schwacher Antagonist beider Orexinrezeptoren mit einem IC₅₀ von nur ungefähr 300 μM in vitro.

 

Figure 6

Entwicklung eines positiven Potentiators für den Orexinrezeptor. Die Struktur des Peptoids, das aus einem Bindungsbildschirm als primärer Treffer entstand, ist oben dargestellt. Der für die Rezeptorbindung wichtige Teil des Moleküls ist rot hervorgehoben. Diese ...

Die Struktur 11 schien eine schwache Ähnlichkeit mit Almorexant zu suggerieren (Figure 6), dass die Verbindung einen Piperonylring enthielt, der an eine Glycineinheit gebunden war, während fast die gleichen Einheiten, jedoch mit einem Dimethoxybenzylring anstelle von Piperonyl, in Almorexant vorhanden waren. Anhand dieses Modells können mehrere Ableitungen von 11 wurden synthetisiert, in denen Kohlenwasserstoffeinheiten durch reduktive Aminierung zu dem Aminstickstoff gegeben wurden. Ein Benzylderivat, 12, bei dem auch ein zusätzliches Methylen zwischen dem aromatischen Ring und dem Stickstoff eingefügt worden war, erwies sich als wesentlich verbesserter Antagonist, wenn auch immer noch mit nur geringer Wirksamkeit (Abb.. 6), was darauf hindeutet, dass das Modell möglicherweise korrekt ist. Wettbewerbsstudien, um festzustellen, ob das Peptoid-Derivat 12 und Almorexant konkurrieren miteinander um die Bindung an den Rezeptor.

Bei weiteren Optimierungsbemühungen zusammensetzen 9 wurde synthetisiert, die sich davon unterschieden 12 nur dadurch, dass der Piperonylring bis zu zwei Methoxyeinheiten geöffnet wurde und der einzige Methylenlinker zwischen dem Glycinstickstoff und dem aromatischen Ring, der in der Verbindung vorhanden war 10 wurde restauriert. Bemerkenswert, 9 OxR1 in einem Zellkulturtest nicht antagonisiert, schien jedoch die Expression eines Orexin-abhängigen Reportergens leicht zu erhöhen. Die Assays wurden daher bei niedrigeren Orexinkonzentrationen (EC₂₀ des Hormons) und die Ergebnisse zeigten eindeutig, dass 9 ist ein positiver Potentiator der durch Orexin vermittelten Aktivierung des Rezeptors. Bei dieser Hormonkonzentration 9 eine EG ausgestellt₅₀ von etwa 120 nM. Wenn der Assay bei Sättigungsniveaus des Potentiators durchgeführt wurde 9 und der Gehalt an Orexin wurde titriert, es wurde festgestellt, dass die EC₅₀ von Orexin wurde ungefähr um das Vierfache verringert, und das maximale Niveau der Reportergenexpression war ungefähr dreimal höher als dasjenige, das durch Sättigungsniveaus von Orexin hervorgerufen wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden in Experimenten unter Verwendung von OxR2 exprimierenden Zellen erhalten, die dies zeigen 9 ist ein Potentiator mit zwei Rezeptoren.

Die Entdeckung des ersten Orexinrezeptor-Potentiators ist potenziell spannend im Hinblick auf mögliche Anwendungen als Behandlung gegen Fettleibigkeit / Diabetes ⁸obwohl bis heute keine in vivo Experimente wurden unter Verwendung dieser Verbindung berichtet. Wie oben erwähnt, hat Yanagisawa gezeigt, dass ein auf Peptid basierender Orexinrezeptor-Agonist diätbedingte Fettleibigkeit und die Entwicklung von Typ-II-Diabetes bei Nagetieren blockiert ⁸. Da diese Tiere und vermutlich überernährte Menschen noch normale Niveaus des Orexinhormons exprimieren, kann ein positiver Potentiator nützlich sein, um die günstige natürliche Wirkung des Hormons bei diesen Individuen zu stimulieren. Natürlich ist es unwahrscheinlich, dass ein Potentiator bei der Behandlung von Narkolepsie von Interesse ist, da betroffene Personen wenig oder kein Orexin produzieren.

Zusammenfassung

Es ist nun klar, dass das Neuropeptid Orexin und seine verwandten Rezeptoren eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Ernährung, des Schlafens, des Energieverbrauchs, der Suche nach Belohnungen und einer Vielzahl anderer Verhaltensweisen spielen. Über die intrazellulären Ereignisse, die durch die Orexinsignalisierung ausgelöst werden, ist wenig bekannt. Die pharmakologische Manipulation von Orexin-Signalen ist aus medizinischer Sicht eindeutig vielversprechend, und eine Reihe von Pharmaunternehmen und akademischen Laboratorien unterhält aktive Programme in diesem Bereich. Obwohl sich solche Verbindungen noch nicht in der Klinik befinden, hat der potente Dual-Orexin-Rezeptor-Antagonist Almorexant eine anscheinend erfolgreiche klinische Phase-III-Studie zur Behandlung von Schlaflosigkeit abgeschlossen. Bisher wurden keine Orexinrezeptor-Agonisten berichtet. Es ist wahrscheinlich, dass es in den nächsten Jahren in diesem Bereich viel Aktivität geben wird.

Anerkennungen

Bibliographie