Proc Natl Acad Sci US A. avril 29, 2014; 111 (17): 6455 – 6460.
Publié en ligne Apr 15, 2014. est ce que je: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neuroscience
Teruko Danjo,a Kenji Yoshimi,b Kazuo Funabiki,a Satoshi Yawata,a ainsi que Shigetada Nakanishia,1
Cet article a été cité par autres articles dans PMC.
Importance
Les neurones dopaminergiques (DA) de la région tegmentale ventrale (VTA) réagissent aux stimuli aversifs principalement par le biais de silences transitoires. Il n’est pas clair si cette réaction induit directement des réactions aversives chez les souris qui se comportent bien. Nous avons examiné cette question en contrôlant de manière optogénétique les neurones DA de la VTA et avons constaté que l'inactivation de ces neurones entraînait une réponse et un apprentissage aversifs. Le noyau accumbens (NAc), le principal noyau de sortie des neurones VTA DA, était considéré comme étant responsable de cette réponse. Nous avons donc examiné laquelle des voies fondamentales de la NAc était essentielle à ce comportement en utilisant l'inactivation des récepteurs D1 ou D2, et a constaté que la voie spécifique du récepteur D2 était cruciale pour ce comportement.
Abstract
La transmission de la dopamine (DA) à partir de la région tegmentale ventrale (VTA) est essentielle pour contrôler les comportements valorisants et aversifs. Le silence transitoire des neurones DA est l’une des réponses aux stimuli aversifs, mais ses conséquences et les mécanismes neuronaux concernant les réponses aversives et l’apprentissage sont restés en grande partie insaisissables.. Ici, nous rapportons que l'inactivation optogénétique des neurones VTA DA réduit rapidement les niveaux de DA et induit une régulation à la hausse de l'activité neuronale dans le noyau accumbens (NAc) évaluée par l'expression de Fos. Tsa suppression optogénétique de la mise à feu de neurones DA a immédiatement provoqué des réponses aversives à la chambre noire précédemment privilégiée et conduit à un apprentissage aversif envers le lieu conditionné par optogénèse. Il est important de noter que cette aversion pour le lieu a été supprimée par suppression des récepteurs D2 de la dopamine, mais pas par celle des récepteurs D1 de la NAc.. Réduire au silence les neurones DA dans la VTA était donc indispensable pour induire des réponses aversives et l'apprentissage via les récepteurs D2 de la dopamine dans le NAc.
Le système dopaminergique mésolimbique joue non seulement un rôle essentiel dans un large éventail de motivations et d’apprentissage (1-3), mais son dysfonctionnement a également été impliqué dans des troubles neuropsychiatriques graves, comme dans la maladie de Parkinson, la schizophrénie et la toxicomanie. Les neurones dopaminergiques (DA) situés dans la région tegmentale ventrale (VTA) réagissent aux stimuli gratifiants par un tir phasique, et la fonction principale de ce tir est théorisée de coder «l'erreur de prédiction de récompense», la différence de valeur entre la récompense prédite et le résultat obtenu. récompense réelle (4). Contrairement à la réponse aux stimuli valorisants, leurs réactions aux stimuli aversifs sont loin d'être homologues; c'est-à-dire que certains neurones DA sont activés en réponse à des stimuli aversifs, alors que la plupart des autres réagissent en supprimant temporairement leur déclenchement (5-9). En fait, des études récentes ont révélé que l'activation optogénétique des neurones GABAergiques et l'inactivation des neurones DA qui en résulte suppriment la consommation de récompense et induisent une réponse aversive (10, 11). Cependant, les mécanismes dans les circuits neuronaux sont essentiels pour l'acquisition d'un apprentissage aversif suite à l'inactivation des neurones DA de la VTA et la manière dont les réponses comportementales sont contrôlées pour supprimer la consommation de récompense et induire des comportements aversifs.
Les preuves accumulées ont révélé que l'apprentissage motivationnel et cognitif en réponse à des stimuli positifs et négatifs est en grande partie régulé par les circuits neuronaux, y compris les noyaux gris centraux (12), qui reçoivent une grande partie de la projection dopaminergique du cerveau moyen. Dans le striatum, deux circuits neuronaux fondamentaux sont constitués de neurones épineux (MSN) de taille moyenne spécifiés, chacun exprimant un type distinct de récepteur DA (13).
- Un circuit est la voie directe, consistant en une projection directe des MSN sur les noyaux de sortie des ganglions de la base, de la substance noire paralysée (SNr) et en exprimant principalement les récepteurs D1 de la dopamine (D1R).
- L'autre est la voie indirecte, consistant en les MSN qui se projettent indirectement à travers le globus pallidus vers le SNr et expriment principalement les récepteurs D2 de la dopamine (D2R).
Les signaux DA du cerveau moyen modulent dynamiquement ces deux voies parallèles de la manière opposée via D1R et D2R, cette modulation étant supposée faciliter l’apprentissage par la motivation (3, 14).
- En ce qui concerne les stimuli valorisants, les niveaux de DA régulés positivement induits par des signaux gratifiants sont considérés comme activant les D1R et facilitant ainsi principalement la voie directe dans le noyau accumbens (NAc).
- D'autre part, la suppression des déclenchements de neurones DA en réponse à des stimuli aversifs diminue les niveaux de DA dans le NAc; et cette réaction est supposée favoriser spécifiquement la transmission du signal dans la voie indirecte par le biais de D2R activés.
Bien que des études utilisant les stratégies pharmacologiques et la méthode de blocage de la neurotransmission réversible (RNB) aient confirmé ce mécanisme de régulation dans le NAc (15, 16), il est resté inconnu si la suppression du déclenchement de neurones DA est suffisante pour promouvoir l'activité de la voie indirecte et induire par la suite le comportement d'évitement. Dans la présente étude, nous avons traité cette question en inactivant sélectivement les neurones DA de la VTA en manipulant de manière optogénétique la protéine Arch membranaire hyperpolarisante (17) et a explicitement démontré que la suppression des neurones DA dans la VTA diminuait ensuite les niveaux de DA dans le NAc et induisait une réaction et un apprentissage aversifs. De plus, nous avons étudié les mécanismes de régulation de cette réaction et révélé que cette réaction aversive était spécifiquement contrôlée par les D2R dans le NAc.
Résultats
Inactivation Optogenetic Des Neurones DA Bloque La Préférence De La Chambre Noire.
Pour inactiver sélectivement les tirs de neurones DA, nous avons injecté une construction virale adéno-associée de Cre-inductible codant pour Arch-eGFP [DIO) -Arch].17) unilatéralement dans la VTA de souris adultes tyrosine hydroxylase (TH) -Cre (18) et de déchets de type sauvage (WT) et a placé une fibre optique au-dessus de la VTA (Fig. S1 A ainsi que C). Deux semaines après la chirurgie, Arch-eGFP a été détecté de manière restreinte dans la VTA (Fig. S1B). Nous avons testé l'effet hyperpolarisant de la protéine Arch par enregistrement électrophysiologique et mesuré l'effet de la stimulation optique de la VTA de souris TH-Cre injectées avec de l'AAV-DIO-Arch. Les enregistrements électrophysiologiques in vivo à partir de la VTA de souris TH-Cre anesthésiées ont révélé que la stimulation optique de neurones DA présumés inhibait leur déclenchementFig. S2), ce qui indique que la stimulation optique a suffisamment hyperpolarisé le potentiel membranaire des cellules DA exprimant Arch et a ainsi inhibé leur déclenchement spontané.
En utilisant ces souris, nous avons ensuite examiné si l'inactivation optique des neurones DA de la VTA pouvait servir de signal aversif pour l'apprentissage comportemental. Les souris ont une tendance innée à préférer un environnement sombre (19). Nous avons conçu un appareil comportemental dans lequel les souris pouvaient explorer librement la pièce sombre et ouvrir un espace lumineux (Fig. 1A). Après l’accoutumance, les souris WT sont restées préférentiellement dans la chambre noire avec ou sans stimulation optique dans la chambre noire (Fig. S1D), en veillant à ce que la stimulation optique elle-même n’ait aucune influence sur leur comportement préférant la chambre noire. Nous avons programmé l’expérience comportementale d’animaux pour tester l’effet de l’inactivation optique des neurones DA sur leur comportement (Fig. S1E). Après l'accoutumance et le test préliminaire, les souris ont été conditionnées en stimulant optiquement les neurones DA de la VTA lorsqu'elles sont restées dans la pièce sombre. Même au cours de la première minute de conditionnement 5, les souris TH-Cre sont restées en dehors de la pièce sombre précédemment préférée et ont successivement évité la pièce sombre pendant le conditionnement (Fig. 1B). Les souris TH-Cre n’ont pas inversé leur stratégie d’évitement dans la chambre noire bien qu’elles n’aient reçu aucune stimulation optique lors du post-test (Fig. 1C). Ces données indiquent que l’hyperpolarisation des neurones DA induit non seulement un comportement transitoire par aversion, mais également un signal d’apprentissage aversif contre la pièce sombre et démontre également que l’inactivation des neurones DA joue un rôle causal à la fois dans le comportement aversif transitoire et dans l’apprentissage aversif prolongé.
Régulation à la baisse optogénétique des niveaux de DA dans le NAc.
Nous avons ensuite examiné si l'inactivation des neurones DA dans la VTA modifiait réellement la concentration en DA dans sa région de ciblage principale, la NAc. Nous avons mesuré les niveaux de DA dans la NAc par voltamétrie cyclique à balayage rapide (FSCV) chez des souris TH-Cre anesthésiées à qui on avait injecté de l'AAV-DIO-Arch dans leur VTA. Les niveaux de DA dans la NAc ont été rapidement élevés par une stimulation électrique de la VTA et la libération de DA évoquée a été significativement réduite par une stimulation optique simultanée de la VTA (Fig. S3). Nous avons ensuite testé si la stimulation optique de la VTA pouvait réduire le niveau de DA tonique dans le NAc. Dans les mêmes contextes expérimentaux, nous avons observé que le niveau de DA dans le NAc était temporairement diminué par la stimulation optique de la VTA par 20 (Fig. 2), ce qui concorde avec la réaction du FSCV rapportée contre les stimuli aversifs (20). Ces données démontrent que la stimulation optique de la VTA était suffisamment efficace pour inactiver les neurones de la VTA DA et diminuer le niveau de DA dans le NAc pendant l'expérience comportementale.
Régulation à la hausse de l'expression du gène Fos par inactivation optique des neurones DA dans la VTA.
Le changement de comportement provoqué par l'inactivation conditionnée des neurones DA dans la VTA a suggéré que la stimulation optique altérait directement l'activité neuronale et entraînait un changement de performance comportementale. Nous avons donc ensuite étudié les régions dans lesquelles l'activité neurale était élevée par l'inactivation conditionnée des neurones DA en examinant l'expression de Fos, un gène précoce immédiat. Peu de temps après le conditionnement dans le test de la chambre noire, des souris ont été rapidement traitées pour déterminer la quantité d'expression de Fos par analyse d'hybridation quantitative in situ (Fig. 3 ainsi que Fig. S4). La NAc, la région qui reçoit une grande quantité de projections dopaminergiques de la VTA, a montré une quantité significativement plus élevée d'expression de Fos chez les souris TH-Cre (Fig. 3). Cette régulation à la hausse a également été détectée du côté controlatéral de la stimulation optique, qui aurait été causée par une faible quantité d'infection virale dans ce côté. Cependant, la régulation à la hausse était beaucoup plus élevée du côté ipsilatéral que du côté controlatéral de la stimulation optique, ce qui suggère que l'inactivation optique des neurones DA a directement augmenté l'activité neurale de la NAc. L 'expression accrue de Fos a également été observée dans d' autres régions du cerveau, notamment le septum, les régions périventriculaires du striatum, l 'amygdale basolatérale (BLA) et l' hypothalamus latéral, mais pas dans l 'habénule latérale ou le cortex préfrontal médial (mPFC; Fig. S4). Ces résultats indiquent que les régions activées par l'inactivation optique des neurones DA n'étaient pas limitées aux régions cibles directes des neurones VTA DA, mais incluaient plutôt les régions qui pourraient être activées indirectement de manière dépendante du circuit neural. Cette observation suggère que l'inactivation optique des neurones DA modifie l'activité neuronale à l'échelle du circuit et pourrait non seulement provoquer une réaction aversive, mais également déclencher plusieurs autres fonctions cérébrales telles que l'anxiété, la peur et les réponses au stress (21).
La signalisation DA via D2R est cruciale pour l'aversion de lieu conditionnée induite de manière optogénétique.
La majorité des signaux dopaminergiques provenant de la VTA sont transmis aux MSN de la NAc par le biais des récepteurs DA, D1R et D2R. D1R est presque exclusivement exprimé dans les substances exprimant les substances P (codé par le gène Tac1) et D2R est principalement exprimé dans les substances exprimant les enképhaline (codé par le gène Penk); chaque type de MSN constitue les voies directe et indirecte, respectivement, dans le NAc (3). Comme l'affinité pour DA est beaucoup plus élevée pour le D2R (ordre nM) que pour le D1R (ordre µM) (22, 23), une réduction des niveaux de DA entraînerait probablement l'inactivation de Gicouplé D2R, mais n’a aucun effet appréciable sur le D1R (3, 24), régulant ainsi l’activité neuronale spécifiquement dans la voie indirecte. De plus, l'activation de Fos a été observée plus clairement dans les cellules exprimant Penk ou Drd2 (D2R) que dans les cellules exprimant Tac1 ou Drd1a (D1R) (Fig. S5). Sur la base de ces observations, nous avons émis l’hypothèse que la signalisation DA par D2R pourrait jouer un rôle majeur dans le conditionnement aversif observé.
Pour tester cette hypothèse, nous avons effectué le test d’aversion au lieu conditionnée (CPA) à trois chambres (Fig. S6). Nous avons préparé un appareil comportemental contenant deux chambres avec des circonstances pratiquement identiques et un petit couloir. Cette condition environnementale non biaisée dans le test CPA nous a permis d’examiner plus avant si l’inactivation des neurones VTA DA était capable d’induire une réaction aversive et d’apprentissage, en plus de bloquer la préférence de la pièce sombre. Lorsque les animaux ont été autorisés à se déplacer librement dans l’ensemble de l’appareil, la plupart d’entre eux sont restés dans deux chambres sans aucune différence comportementale typique lors du test préliminaire. Le conditionnement optique a ensuite été réalisé en associant une stimulation optique à une chambre fixe. Même lorsqu'une des chambres était utilisée pour le conditionnement, les souris TH-Cre évitaient de manière persistante et significative de rester dans la chambre optiquement conditionnée pendant le conditionnement et après le test (Fig. S6 B-E). L’analyse statistique a validé une réduction significative du temps de séjour des souris TH-Cre dans la chambre conditionnée optiquement au post-test par rapport au temps de séjour des souris WT (Fig. S6F).
Nous avons ensuite tenté de spécifier les sous-types de récepteurs DA impliqués dans ce comportement aversif en supprimant spécifiquement chacun des récepteurs DA de la NAc (Fig. 4 ainsi que Fig. S7). Nous avons conçu et validé des vecteurs lentiviraux contenant un ARN en épingle à cheveux court (shRNA) spécifique de chaque récepteur DA avec expression constitutive de mCherry. Trois semaines après l’injection du lentivirus dans le NAc, une expression robuste de mCherry était localisée dans le NAc (Fig. 4B). L’inhibition effective de l’expression de l’ARNm de chaque récepteur a été confirmée par une analyse PCR quantitative en temps réel (Fig. S7A). La mesure des taux de protéines par Western blot a également révélé que l’injection de chacun des lentivirus réduisait sélectivement son produit protéique cible sans affecter l’expression de l’autre sous-type de récepteur DA (Fig. 4C ainsi que Fig. S7 B-G). Les lentivirus exprimant shD1R et shD2R ont diminué leur niveau de protéine cible à 46.2 ± 1.1% et 38.4 ± 4.9%, respectivement, par rapport au niveau du virus de contrôle (Fig. 4C). Ces résultats ont permis de vérifier que les vecteurs lentiviraux exprimant un shRNA spécifique de D1R et de D2R supprimaient sélectivement et suffisamment leurs ARN cibles et régulaient négativement la quantité des produits protéiques respectifs. Nous avons également confirmé que l'expression de mCherry médiée par le virus n'était pas détectée dans la VTA, excluant la possibilité que l'ARNsh médié par le lentivirus affecte directement la VTA.
À l'aide de ces lentivirus contenant des shARN, nous avons testé le type de récepteur de la DA responsable du comportement aversif induit par l'inactivation optogénétique des neurones de la DA. Nous avons injecté un lentivirus contenant un shRNA ou un lentivirus contrôle dans le NAc bilatéral avec AAV-DIO-Arch dans le VTA gauche des souris TH-Cre. La fibre optique a également été insérée au-dessus de la VTA (Fig. 4A). Lorsque le test CPA à trois chambres a été réalisé trois semaines après la chirurgie, les souris TH-Cre à qui on avait injecté du lenti: shD1R-mCherry montraient toujours une CPA explicite contre la chambre à paire de stimulation optique comparable à celle des souris TH-Cre à injection. contrôle lentivirus (lenti: mCherry). En revanche, les souris TH-Cre ayant reçu une injection de lenti: shD2R-mCherry n’ont pas montré de CPA évident lors du conditionnement (Fig. 4D). Le déficit d'apprentissage exclusif des souris TH-Cre ayant reçu une injection de lenti: shD2R-mCherry a été corroboré par l'analyse de l'apprentissage aversif lors du post-test (Fig. 4E). Ces résultats démontrent que le comportement aversif à l'endroit conditionné par l'inactivation des neurones DA a été spécifiquement évoqué par D2R, et non par D1R, dans le NAc.
a lieu
Dans le striatum, des études ont révélé que l'activation du GsD1R bi-couplé facilite son tir, alors que l'activation du GiD2R non couplé entraîne une efficacité de tir réduite (25). AcEn fonction de la spécificité de l’expression du récepteur DA, les déclenchements phasiques de neurones DA activent principalement la voie directe via D1R, tandis qu’une diminution transitoire du déclenchement des neurones DA favorise principalement la compétence de voie indirecte via D2R. (3, 26). Sur la base de ce mécanisme de régulation, il a été proposé que le silence des neurones DA en réponse à des stimuli aversifs soit principalement traité par la voie indirecte et entraîne un comportement aversif. (3). Des études récentes ont montré que le blocage de la transmission synaptique de la voie indirecte entrave l'acquisition d'un comportement aversif induit par un choc électrique (15) et que cette dégradation est due à l'inhibition de la transmission du signal médiée par D2R (16). jeDe plus, la régulation optogénétique des MSN exprimant D2R dans la voie indirecte évite le comportement (27). Cependant, étant donné que les neurones DA présentent des déclenchements renforcés et supprimés en réponse à des stimuli aversifs et que d'autres informations sensorielles liées au choc sont simultanément traitées dans le cerveau, il reste à déterminer si le silence de ces neurones pourrait directement déclencher une réaction et un apprentissage aversifs. et si cette réaction est régulée par le biais de MSN exprimant D2R dans la voie indirecte.
Dans cette étude, nous avons utilisé le contrôle optogénétique des déclenchements de neurones DA dans les deux tests comportementaux: le test de préférence de chambre noire et le test CPA à trois chambres. Notre manipulation optogénétique a montré une suppression efficace des déclenchements de neurones DA dans la VTA et une régulation à la baisse des niveaux de DA dans le NAc. Notre inactivation optogénétique précise des préparations de neurones DA uniquement pendant la période où les animaux sont restés dans la chambre conditionnée a explicitement provoqué une réaction aversive et un apprentissage, démontrant que le silence transitoire de DA provoquait directement un comportement d'évitement passif. De plus, cette enquête a permis de comprendre que le traitement du signal par D2R est un facteur déterminant pour l’induction de cette réaction aversive et cet apprentissage.
Bien que nos données démontrent que D1R n’a aucun effet sur les expériences comportementales évoquant le CPA, plusieurs études ont montré que le déclenchement en phase de neurones DA est nécessaire pour les réactions de peur et l’apprentissage aversif (28, 29). Cette différence est due au cadre expérimental; c'est-à-dire que notre approche optogénique excluait la possibilité de signalisation par le biais de neurones DA activés pour évoquer un comportement aversif, indiquant que l'inactivation de neurones DA était suffisante pour induire un comportement et un apprentissage aversifs. La fonction et le traitement du signal de la décharge de DA activée, évoqués par des stimuli aversifs, apporteraient une contribution différente aux comportements aversifs de ceux étudiés ici et doivent être clarifiés à l'avenir.
Les neurones DA se projettent également dans diverses autres régions, notamment le mPFC, l'amygdale et l'hippocampe. Une étude récente a indiqué que L'activation optogénétique des neurones d'habenula latéraux se projetant vers les neurones DA de la VTA est capable d'induire un comportement aversif. Ces neurones DA s'adressent principalement et spécifiquement au mPFC. (30), bien que leur conditionnement optogénétique soit différent de celui de notre étude actuelle, leur stimulation optogénétique s’étendant sur une période entière. Il a été rapporté que l’apport dopaminergique dans la mPFC était activé non seulement par des stimuli aversifs, mais également par un stress chronique (31, 32), il est possible que leur activation continue des neurones DA en projection de mPFC soit perçue comme un signal provenant d’un environnement extrêmement stressant; et, à la suite de l'accumulation de conditionnement stressant, les animaux montreraient un comportement aversif à la chambre conditionnée. En revanche, nous n'avons inhibé le déclenchement des neurones DA que lorsque les animaux séjournaient dans la chambre conditionnée. Les résultats de nos expériences comportementales utilisant un conditionnement adapté au timing indiquaient qu'une suppression soudaine du signal de DA serait perçue comme une entrée aversive soudaine, ce qui entraînait une réponse aversive rapide.
Les neurones DA se projettent également sur l'amygdale, la région qui contribue largement à la réponse à la peur. En effet, la signalisation DA vers l’amygdale a été impliquée dans la réponse à la peur et l’acquisition de la mémoire de la peur (33, 34). Dans notre étude, l’étiquetage des neurones DA dans la VTA a identifié un ensemble de neurones DA projetant vers la BLA, mais l’ampleur de ces projections était bien inférieure à celle projetant vers l’ANac. Bien que nous ne puissions pas exclure un effet subtil de la signalisation de l'AD projetée par l'amygdale sur notre comportement aversif observé, le principal effet de notre inactivation optogénétique des neurones de l'AD devrait être sur l'ANc, car nos expériences avec le renversement spécifique du D2R dans l'ANc ont considérablement diminué le comportement aversif. Des investigations futures portant sur la signalisation DA spécifique à la cible sont nécessaires pour élucider les effets de la modification des neurones DA à l'échelle du circuit sur les stimuli aversifs et le conditionnement de la peur.
Matériels et méthodes
Sujets.
Tyrosine hydroxylase :: Souris knock-in IRES-Cre (TH-Cre) (EM: 00254) (18) ont été obtenus auprès de l’European Mouse Mutant Archive. Tous les animaux de laboratoire avaient été rétrocroisés avec la souche C57BL / 6J pendant plus de générations 10. Les souris ont été accouplées avec les souris C57BL / 6J WT et logées avec un cycle d'obscurité standard 12-h light / 12-h et ont reçu de la nourriture et de l'eau à volonté. Cre+ et Cre- des souris des mêmes portées (3 – 6 mo age) ont été utilisées pour les expériences. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité sur les animaux de l'institut de bioscience d'Osaka conformément aux directives relatives aux expériences sur les animaux.
Tests comportementaux.
Au cours de tous les tests comportementaux, les souris ont été connectées à une fibre optique et autorisées à se déplacer dans l’appareil. Le mouvement des souris a été surveillé de manière à ce qu'elles puissent se déplacer sans aucun obstacle, même lorsqu'elles étaient connectées avec une fibre optique sur la tête. La position d'une souris a été détectée par une caméra vidéo suspendue sur l'appareil comportemental et analysée par un programme personnalisé utilisant le logiciel Labview.
Test de préférence de chambre noire.
L'appareil comportemental fabriqué sur mesure utilisé dans le test était composé d'une pièce sombre (15 × 9.5 cm) et d'un espace ouvert lumineux (15 × 11 cm). La pièce sombre avait des murs, un sol et un toit, tous colorés en noir et dotés d’une entrée (4.5 cm de long) dans l’espace lumineux et ouvert. L'espace ouvert et lumineux avait la forme d'une ellipse et disposait d'un sol en grille métallique et de murs clairs sans toit. Avant le test, toutes les souris étaient habituées à l’utilisation de 10 min dans l’appareil. Le test consistait en trois sessions: au début de la moitié de la journée, 1 (prétest: 5 min), les souris étaient autorisées à explorer tout l'appareil. De la fin de la moitié de la journée au traitement par 1 (conditionnement: minimum de 4 au total), les souris ont reçu une stimulation optique lorsqu'elles sont restées dans la pièce sombre. Le jour 35, la préférence pour la chambre noire a été testée sans stimulation optique (post-test: 5 min; Fig. S1E).
Test CPA à trois chambres.
L’appareil de préférences / CPA conditionnées et personnalisées à trois chambres, utilisé dans l’essai, était composé de deux chambres (10 × 17 cm) et d’un couloir de liaison. Le test consistait en trois sessions. Jour 1 (pré-test: 15 min): les souris ont été autorisées à explorer librement l’appareil entier. Les souris qui sont restées 1.5 plus longtemps dans une chambre que dans l'autre ont été exclues du test. Jours 2 et 3 (conditionnement: 15 min chacun): Les souris ont été soumises à une stimulation optique lorsqu'elles sont restées dans la chambre à paire de lumière. Le choix de la chambre à paire de lumière était contrebalancé. Jour 4 (post-test: 15 min): le test a été réalisé dans les mêmes conditions que lors du prétest (Fig. S6A).
Au cours de la séance de conditionnement, la stimulation optique a été arrêtée pour 30 lorsque les souris sont restées en permanence au-dessus de 30 dans la chambre noire ou dans la chambre couplée à la lumière pour éviter toute surchauffe. La puissance du laser était approximativement 5 mW au bout de la fibre optique dans tous les tests comportementaux.
Voltamétrie cyclique à balayage rapide in vivo.
Des expériences sur le FSCV ont été menées à l'aide de la méthode décrite dans des études antérieures (35-37). Les souris ont été anesthésiées avec un mélange de kétamine et de xylazine comme décrit dans Matériels et méthodes SI et placé dans un cadre stéréotaxique. Une fibre optique utilisée pour stimuler les neurones DA exprimant l'Arch était localisée à proximité de l'électrode de stimulation. L'optrode de stimulation a ensuite été placée dans la VTA (de bregma: antérieur-postérieur, -3.2 mm; latérale, 0.5 mm; et dorsale-ventrale, 3.5 mm) et abaissée à des intervalles de 0.25 mm. Une microélectrode en fibre de carbone (300 µm de longueur) destinée à l'enregistrement voltamétrique est abaissée dans le NAc (de bregma: antérieur-postérieur, 1.0 mm; latéral, 1.0 mm; et dorsal-ventral, 3.5 mm). Des mesures voltamétriques ont été effectuées toutes les 100 en appliquant une forme d'onde en triangle (-0.4 V à + 1.3 V à -0.4 V par rapport à Ag / AgCl, à 400 V / s) à la microélectrode en fibre de carbone. Un potentiostat sur mesure a été utilisé pour l'isolation de la forme d'onde et l'amplification du courant. La libération de DA a été provoquée par une stimulation électrique de neurones DA en utilisant une stimulation par impulsions 24 (100 µA, durée 5 ms, 30 Hz). Une stimulation optique de neurones DA (532 nm, puissance W5 mW à la pointe de la fibre) a été appliquée pour 10 à partir de 5 avant le début d’une stimulation électrique. Les microélectrodes en fibres de carbone ont été étalonnées dans une solution avec des concentrations connues de DA (0.2 µM, 0.5 µM et 1.0 µM). Toutes les données de voltamétrie ont été analysées par des programmes personnalisés utilisant les logiciels Labview et Matlab. La réduction des niveaux de DA par stimulation optique a été résolue avec une analyse en composantes principales, en utilisant les formes d'onde de matrice DA obtenues à partir de stimulations électriques d'ATV pour séparer les signaux de dopamine (35, 36).
Analyses statistiques.
L'analyse statistique a été réalisée en utilisant GraphPad PRISM 5.0 (logiciel GraphPad). Les données ont été analysées par des mesures répétées ANOVA (Les figs. 1B, , 4D,4Det Fig. S6 D ainsi que E) ou ANOVA à un facteur (Les figs. 1C, , 3D,3D, 4 C ainsi que Eet Figues. S4 K-M, S6Fet S7A), et des analyses post-hoc ont été effectuées en utilisant le test de Bonferroni. Toutes les marques / colonnes et barres représentaient la moyenne et ± SEM, respectivement.
D'autres procédures expérimentales comprenant la préparation et l'injection de virus, l'enregistrement électrophysiologique et l'analyse immunohistochimique et d'ARNm sont décrites en détail dans Matériels et méthodes SI.
Remerciements
Nous remercions E. Boyden pour la construction Arch, R. Matsui pour les conseils techniques concernant la production et la purification des lentivirus, et Y. Hayashi pour les conseils techniques concernant la programmation de l'analyse des données. Ce travail a été financé par les subventions de recherche 22220005 (à SN), 23120011 (à SY et SN), 24700339 (à TD) et 25871080 (à SY) du ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Culture. Technology of Japan et une subvention de Takeda Science Foundation (à SN).
Notes
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.
Cet article contient des informations complémentaires en ligne sur www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
Bibliographie
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