Diabétologie. 2017; 60 (8): 1502-1511.
Publié en ligne 2017 May 20. est ce que je: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
Chisayo Kozuka,1 Tadashi Kaname,2 Chigusa Shimizu-Okabe,3 Chitoshi Takayama,3 Masato Tsutsui,4 Masayuki Matsushita,5 Keiko Abe,6,7 ainsi que Hiroaki Masuzaki
1
Abstract
But / hypothèse
Trop manger des graisses alimentaires provoque l'obésité chez l'homme et les rongeurs. Des études récentes chez l'homme et les rongeurs ont démontré que la dépendance aux graisses avait un mécanisme commun à la dépendance à l'alcool, à la nicotine et aux narcotiques en termes de dysfonctionnement des systèmes de récompense du cerveau. Il a été souligné qu'un régime riche en graisses atténuait la signalisation du récepteur D2 de la dopamine (D2R) dans le striatum, un régulateur essentiel du système de récompense du cerveau, entraînant une suralimentation hédonique. Nous avions précédemment signalé que le constituant bioactif spécifique du riz brun, le γ-oryzanol, atténuait la préférence pour un HFD via un contrôle hypothalamique. Nous avons donc exploré la possibilité que le γ-oryzanol modulerait le fonctionnement du système de récompense du cerveau chez la souris.
Méthodologie
Des souris mâles C57BL / 6J nourries avec un HFD ont été traitées par voie orale avec du γ-oryzanol et les niveaux de striatalité des molécules impliquées dans la signalisation D2R ont été évalués. L'impact du γ-oryzanol sur la méthylation de l'ADN du promoteur D2R et les modifications ultérieures des préférences pour les graisses alimentaires ont été examinés. En outre, les effets de la 5-aza-2′-désoxycytidine, un puissant inhibiteur de l’ADN méthyltransférase (DNMT), sur les préférences alimentaires, la signalisation D2R et les niveaux de DNMT dans le striatum ont été étudiés. Les effets inhibiteurs du γ-oryzanol sur l'activité des DNMT ont été évalués enzymatiquement in vitro.
Résultats
Chez des souris nourries avec un HFD, la production de D2R a été réduite via une augmentation de la méthylation de l'ADN de la région promotrice du D2R. L'administration orale de γ-oryzanol a diminué l'expression et l'activité des DNMT, rétablissant ainsi le niveau de D2R dans le striatum. L'inhibition pharmacologique des DNMT par la 5-aza-2'-désoxycytidine a également amélioré la préférence pour les graisses alimentaires. Conformément à ces résultats, des essais enzymatiques in vitro ont démontré que le γ-oryzanol inhibait l'activité des DNMT.
Conclusions / interprétation
Nous avons démontré que le γ-oryzanol améliore l'hyperméthylation de l'ADN induit par HFD de la région promotrice de D2R dans le striatum de souris. Notre paradigme expérimental met en évidence le γ-oryzanol en tant que substance anti-obésité prometteuse avec la propriété distincte d’être un nouveau modulateur épigénétique.
Matériel supplémentaire électronique
La version en ligne de cet article (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) contient du matériel supplémentaire, évalué par les pairs mais non-édité, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés.
Introduction
La suralimentation chez les personnes obèses partage, au moins en partie, les mécanismes communs de dépendance à l'alcool, à la nicotine et aux stupéfiants [1]. Outre la régulation hypothalamique et hormonale de l'appétit, le système de récompense du cerveau, en particulier la signalisation des récepteurs de la dopamine, est étroitement lié au comportement alimentaire entraînant une dépendance ou un effet hédonique [2]. Une étude antérieure chez le rat a montré que l'inhibition du récepteur D2 de la dopamine striatale (D2R) par un ARN interférent en épingle à cheveux court induit par le lentivirus induisait rapidement des déficits de récompense analogues à une dépendance et une recherche alimentaire semblable à une contrainte [2].3]. En raison de la densité réduite de D2R, le striatum dorsal réagit moins bien à la récompense alimentaire que les groupes de contrôle maigres chez les humains obèses et les rongeurs [3-5]. Conformément à cette notion, le TaqIA allèle du ANKK1 le locus du gène (codant DRD2 / répète ankyrine et domaine de la kinase contenant 1), qui diminue la production de D2R striatale, est associé à un phénotype obèse chez l’homme [6], alors que les effets de la perte de poids après une chirurgie bariatrique sont associés à une densité D2R striatale élevée [7]. Ces données suggèrent fortement l’importance de D2R striatal en tant que nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de l’obésité. Cependant, certains médicaments mis au point qui agissaient sur le système de récompense du cerveau entraînaient des effets indésirables considérables, y compris des problèmes psychiatriques graves, entraînant leur retrait éventuel des dispensaires [8].
Les modifications épigénétiques sont essentielles non seulement pour le développement et la différenciation, mais aussi parce qu’elles résultent de changements environnementaux, y compris en matière de régime alimentaire et de mode de vie [9]. La méthylation de l'ADN est un événement épigénétique important pour la stabilité de l'expression des gènes [9]. Chez le rat, l'exposition maternelle à un régime alimentaire riche en graisses altère de manière intergénérationnelle la méthylation de l'ADN au sein du système de récompense central de la progéniture, ce qui entraîne une surconsommation de HFD par les chiots [10]. L’ADN méthyltransférase (DNMT) joue un rôle essentiel dans la régulation du comportement alimentaire et de l’activité physique [10, 11], suggérant que les DNMT pourraient être des cibles thérapeutiques prometteuses pour le traitement du syndrome de l’obésité – diabète. Il est important de noter que certaines substances naturelles d'origine alimentaire, notamment l'acide caféique et l'épigallocatéchine, agissent en tant qu'inhibiteurs de la DNMT [12, 13].
Nous avons récemment montré que le γ-oryzanol, un composé bioactif spécifique du riz brun, constitué d'un mélange d'ester d'acide férulique et de plusieurs phytostérols, atténuait la préférence pour les graisses alimentaires par une diminution du stress du réticulum endoplasmique hypothalamique [ER) [14]. Chez la souris et le lapin, le γ-oryzanol administré par voie orale était rapidement absorbé par l'intestin et distribué principalement au cerveau [15, 16]. En combinant ces résultats, les produits naturels dérivés des aliments agissant sur le système nerveux central pourraient constituer une alternative pour améliorer en toute sécurité le comportement alimentaire altéré en cas d'obésité. Dans ce contexte, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le γ-oryzanol modifierait le statut de méthylation de l'ADN dans le système de récompense du cerveau, ce qui aurait pour effet d'atténuer la préférence d'un HFD chez la souris.
Méthodologie
Animaux
Des souris mâles C57BL / 6J âgées de sept semaines obtenues auprès de Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japon) ont été hébergées (3 à 4 par cage) dans des conditions sans pathogène spécifique à 24 ° C sous une lumière de 12 h / 12 h / cycle sombre. Après une semaine d'acclimatation, des souris âgées de 8 semaines ont été appariées en poids et divisées en deux ou trois groupes pour subir chaque expérience. Les souris ont pu accéder librement à la nourriture et à l'eau. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité d'éthique des expériences animales de l'Université du Ryukyus (nos 5352, 5718 et 5943).
Administration de γ-oryzanol et de 5-aza-2′-désoxycytidine
Pour évaluer la préférence pour le HFD, le gamma-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japon) a été administré à des souris de la semaine 8 par gavage lors du test de choix du produit alimentaire décrit précédemment [14, 17]. Pour les autres expériences, un HFD (D12079B; Research Diets, Nouveau-Brunswick, NJ, USA) contenant 0.4% γ-oryzanol a été fabriqué sous forme de pellets. Les composants du régime alimentaire sont indiqués dans le tableau du matériel complémentaire électronique (MSE). 1. Après 12 semaines d'alimentation, des tissus ont été prélevés sur le striatum et l'hypothalamus. L'apport quotidien de γ-oryzanol, estimé à partir de l'apport alimentaire moyen des souris, était d'environ 320 μg / g de poids corporel. Les doses de γ-oryzanol ont été déterminées comme décrit précédemment [14]. La 5-aza-2′-désoxycytidine (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) a été injectée par voie intrapéritonéale (0.25 μg / g de poids corporel) trois fois par semaine pendant 12 semaines [18].
Estimation de la préférence pour les graisses alimentaires
Pour évaluer les préférences pour les graisses alimentaires, les tests sur les aliments ont permis de choisir entre le chow et le HFD (D12450B et D12451; régimes de recherche) comme décrit précédemment [14]. Les composants du régime alimentaire sont présentés dans le tableau ESM 1. En bref, les souris ont été autorisées à accéder librement à la nourriture et au HFD. Les apports de nourriture et de HFD ont été mesurés chaque semaine et analysés pour les changements de préférence pour les graisses alimentaires. La préférence HFD a été calculée selon la formule: Préférence HFD = [(apport HFD / apport alimentaire total) × 100].
Séquençage du bisulfite pour la méthylation de l'ADN
L'ADN a été purifié en utilisant un kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN, Tokyo, Japon). La solution d'ADN a été mélangée avec 3 mol / 37 de NaOH fraîchement préparé, incubée à 15 ° C pendant 5.3 minutes et ajoutée à 1.7 mol / 4.9 d'urée, 15 mol / 95 de bisulfite de sodium et 30 mmol / 50 d'hydroquinone. La solution a été soumise à 15 cycles de dénaturation à XNUMX ° C pendant XNUMX s et incubation à XNUMX ° C pendant XNUMX min [19]. L'ADN traité au bisulfite a été purifié à l'aide du kit MinElute PCR Purification (QIAGEN) et amplifié par PCR à l'aide d'un kit KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) et des amorces autour du site CpG de la région promotrice de D2 . Les séquences d'amorces étaient les suivantes: amorce directe, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; amorce inverse, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 '. Ensuite, les séquences d’adaptateur ont été ajoutées et nettoyées avec Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, Californie, États-Unis). Les échantillons ont ensuite été regroupés et chargés sur un GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Japon) pour un séquençage conforme au protocole du fabricant. Le niveau de méthylation a été exprimé en pourcentage de cytosines méthylées dans tous les résidus de cytosines.
Test d'activité DNMT
Le dosage de l'activité enzymatique de la DNMT a été réalisé à l'aide d'un kit de dosage d'activité / inhibition d'ADN EpiQuik DNA (Epigentek Group, Brooklyn, NY, États-Unis) et du kit de dosage de méthyltransférase EPIgeneous (Cisbio Japan, Chiba, Japon) selon les protocoles du fabricant.
Pour évaluer l’activité inhibitrice de chaque composé sur la méthylation de l’ADN, la formation de S-adénosyl-l-homocystéine (SAH) a été mesurée en présence de chaque composé (20 μmol / l pour les tests de dépistage), S-adénosyl méthionine (SAM; 10 μmol / l) et substrat DNMT (4 ng / μl) à 37 ° C pendant 90 min. Pour évaluer la cinétique de Michaelis-Menten, DNMT1 (20 μmol / l) a été incubé avec du γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) et la concentration indiquée de poly dI-dC à 37 ° C pendant 90 min. DNMT3a (100 μmol / l) et DNMT3b (100 μmol / l) ont été incubés avec du γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) et la concentration indiquée de poly dG · dC à 37 ° C pendant 120 min. Les dosages ont été réalisés en quatre exemplaires. La protéine extraite (0.75 mg / ml) a été incubée avec SAM (5 μmol / l), poly dI-dC (5 μg / ml) et poly dG · dC (5 μg / ml) à 40 ° C pendant 120 min, et La formation de SAH a été mesurée.
Dosage de l'activité des récepteurs γ liés aux œstrogènes
L'activité antagoniste potentielle du γ-oryzanol sur le récepteur γ lié aux œstrogènes (ERRγ) a été évaluée à l'aide du système de test du récepteur gamma reporter associé aux œstrogènes humains (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) selon le protocole du fabricant. En bref, des cellules rapporteuses de mammifères non humaines exprimant de manière constitutive ERRy active ont été exposées aux concentrations indiquées de chaque composé pendant 24 h en triple.
Western blot
Ceci a été effectué comme décrit précédemment [20] avec des anticorps contre D2R (1: 500, lapin), transporteur de dopamine (DAT; 1: 500, lapin), tyrosine hydroxylase (TH; 1: 1000, lapin) (AB5084P, AB1591P et AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), transducteur de signal et activateur de transcription 3α (STAT3α; 1: 1000, lapin), DNMT1 (1: 1000, lapin), DNMT3a (1: 1000, lapin) (nos 8768, 5032 et 3598; Cell Signaling Technology, Tokyo, Japon), DNMT3b (1 μg / ml, lapin), ERRγ (1: 1000, lapin) et β-actine (1: 10,000 16049, souris) (ab128930, ab6276 et abXNUMX; Abcam, Cambridge, MA, USA).
PCR quantitative en temps réel
L’expression génique a été examinée comme décrit précédemment [14]. Les niveaux d'ARNm ont été normalisés à Rn18s (ARNr 18S). Les jeux d’amorces utilisés pour les analyses PCR en temps réel quantitatives sont résumés dans le tableau ESM. 2.
analyses statistiques
Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. Une ANOVA à un facteur et une ANOVA à mesures répétées suivies de tests de comparaison multiples (méthode Bonferroni – Dunn) ont été utilisées le cas échéant. Étudiants t Le test a été utilisé pour analyser les différences entre deux groupes. Les différences ont été jugées significatives à p <0.05.
Résultats
L'inhibition pharmacologique des DNMT par 5-aza-dC a atténué la préférence pour les graisses alimentaires chez la souris
Chez les souris nourries avec le HFD, la méthylation de l’ADN dans la région promotrice de D2R dans le striatum a été significativement augmentée par rapport aux souris nourries au régime Chow (Fig. (Fig.1a) .1une). Par contre, la méthylation de l’ADN hypothalamique dans la région promotrice de D2R était apparemment plus élevée que dans le striatum sous régime chow (p <0.01) (Fig. (Fig.1a, 1a, f) et n’a pas été altéré par le HFD (Fig. (Fig.1f) .1F). Chez des souris nourries avec le HFD, la méthylation de l'ADN augmenté dans la région promotrice de D2R dans le striatum a été normalisée par traitement avec 5-aza-dC, un puissant inhibiteur de la DNMT (Fig. (Fig.1a) .1une). En revanche, la méthylation de l'ADN dans la région promotrice de D2R dans l'hypothalamus n'a pas été modifiée de manière significative par le traitement par 5-aza-dC (Fig. (Fig.1f) .1F). Dans le striatum de souris mâles âgées de 20 semaines nourries avec le HFD pendant 12 semaines, les taux d'ARNm et de protéines de D2R ont été significativement diminués (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). En revanche, les niveaux de récepteurs D1 de la dopamine (D1R, codés par Drd1), qui agissent de manière opposée aux D2R sur la signalisation intracellulaire médiée par l'adénylyl cyclase et l'AMPc, étaient inchangés (Fig. (Fig.1c) .1c) De plus, il n’ya pas eu de changement dans les niveaux d’autres molécules liées à la signalisation D2R, tels que TH et DAT au niveau de l’ARNm et / ou des protéines (Fig. (Fig.1d, 1d, e, k, m). Par contre, aucun changement apparent n’a été observé dans l’hypothalamus, y compris pour D2R (Fig. (Fig.1g – m) .1g – m). Notamment, les taux protéiques de D2R et de TH dans l'hypothalamus étaient beaucoup plus bas que ceux du striatum (Fig. (Fig.1l, 1l, m), reflétant éventuellement l’importance relative de la signalisation des récepteurs de la dopamine dans le système de récompense du cerveau par rapport à l’hypothalamus.
Pour examiner si la méthylation de l'ADN dans la région promotrice de D2R modifierait la préférence pour les graisses alimentaires, le comportement alimentaire des souris traitées avec 5-aza-dC a été analysé. Comme prévu, 5-aza-dC a significativement augmenté les niveaux d'ARNm et de protéines de D2R dans le striatum de souris nourries avec HFD (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). D'autre part, il n'y avait aucun effet sur les niveaux de Drd1, Th ainsi que Slc6a3 (codage DAT) dans le striatum ou à des niveaux de Drd2, Drd1, Th ainsi que Slc6a3 dans l’hypothalamus (Fig. (Fig.1c – e, 1c – e, g – m). Alors que les souris traitées avec le véhicule préféraient le HFD, la préférence pour le HFD était significativement réduite chez les souris traitées avec 5-aza-dC (88% des valeurs pour les souris traitées avec un véhicule) (Fig. (Fig.1n) .1n). En conséquence, le traitement par 5-aza-dC a réduit le gain de poids corporel (Fig. (Fig.11o).
Le γ-oryzanol diminue les taux de DNMT dans le striatum de souris nourries avec HFD
Comme nous l'avions précédemment signalé [14], l'administration orale de γ-oryzanol à des souris mâles par gavage a considérablement atténué la préférence pour un HFD (93% des valeurs pour les souris traitées avec le véhicule) (Fig. (Fig.2a), 2a), entraînant une atténuation apparente du gain de poids corporel (Fig. (Fig.2b) .2b) Nous avons donc exploré l’impact potentiel du γ-oryzanol sur la modulation épigénétique des D2R dans le striatum.
Chez les mammifères, il existe trois principaux DNMT: DNMT1, 3a et 3b. DNMT1 fonctionne pour maintenir la méthylation de l’ADN, tandis que DNMT3a et 3b jouent un rôle dans la facilitation de la méthylation de novo de l’ADN [21]. Pour explorer l'impact potentiel du γ-oryzanol sur les DNMT in vivo, nous avons évalué les niveaux de DNMT dans le cerveau des souris nourries avec HFD. Bien que le HFD en soi n’ait eu aucun effet sur les niveaux d’ARNm et de protéines des DNMT dans le striatum ou dans l’hypothalamus, la supplémentation en y-oryzanol a significativement diminué les niveaux de DNMT dans le striatum mais pas dans l’hypothalamus (Fig. (Fig.2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Ces données laissent penser que le γ-oryzanol pourrait réguler les niveaux de DNMT de manière spécifique au striatum. De manière similaire, 5-aza-dC a significativement diminué les niveaux d’ARNm de DNMT3a et 3b de manière préférentielle dans le striatum (ESM Fig. 1un d).
Sur la base d'une étude antérieure montrant que le niveau d'ARNm de DNMT1 était régulé positivement, au moins en partie, par le récepteur nucléaire ERRγ [22], nous avons examiné l'effet potentiel du γ-oryzanol sur l'activité de ERRγ. Dans les cellules de mammifère non humaines exprimant de manière constitutive l'ERRγ actif, 4-hydroxy tamoxifène, un puissant agoniste inverse de ERRγ, a nettement réduit l'activité de ERRγ. Il est à noter que le γ-oryzanol a partiellement diminué l’activité de l’ERRγ (une réduction approximative de 40 de la valeur innée) (Fig. (Fig.3a) .3une). Fait important, ERRγ était fortement exprimé dans le striatum mais pas dans l'hypothalamus (Fig. (Fig.3b – d) .3b – d). Contrairement à la situation pour le striatum, le γ-oryzanol a significativement augmenté les taux de DNMT1 dans l’hypothalamus (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Ces résultats pourraient être expliqués, au moins en partie, par notre constatation que STAT3α, un régulateur positif du niveau de DNMT1 [23], était abondamment exprimé dans l'hypothalamus mais pas dans le striatum (Fig. (Fig.33par exemple).
Pour évaluer plus en détail l'impact du γ-oryzanol sur l'activité des DNMT in vivo, la formation de SAH, un sous-produit de la méthylation de l'ADN et également un puissant inhibiteur des DNMT, a été évaluée chez des souris traitées au γ-oryzanol et nourries avec le HFD. Il n’ya pas eu de changements significatifs dans la formation de SAH dans le striatum ou dans l’hypothalamus entre les souris nourries avec HFD et celles nourries avec de la nourriture chow (Fig. (Fig.2f, 2f, j). De manière remarquable, le γ-oryzanol a significativement diminué la formation de SAH dans le striatum (Fig. (Fig.2f) 2f) mais pas dans l'hypothalamus (Fig. (Fig.2j), 2j), suggérant que le γ-oryzanol peut supprimer l'activité des DNMT de manière spécifique au striatum chez les souris nourries avec HFD.
Analyses enzymatiques sur les propriétés inhibitrices du γ-oryzanol pour les DNMT in vitro
Nous avons ensuite évalué l'impact du γ-oryzanol sur l'activité des DNMT in vitro. Les puissances inhibitrices du γ-oryzanol, de l'acide férulique, de 5-aza-dC, de l'halopéridol (un antagoniste représentatif de D2R), du quinpirole (un agoniste représentatif de D2R) et du SAH contre les DNMT ont été évalués. En tant que contrôle positif, SAH a fortement atténué les activités des DNMT de manière dose-dépendante (Fig. (Fig.4a – f) .4un F). Comme prévu, l'halopéridol et le quinpirole n'ont montré aucun effet sur les activités des DNMT (ESM Fig. 2). Le y-oryzanol inhibe de manière significative les activités de DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) et 3b (inhibition maximale 57%) (Fig. (Fig.4d – f) .4d – f). En revanche, l’activité inhibitrice de l’acide férulique, un métabolite du γ-oryzanol, était nettement inférieure à celle du γ-oryzanol (Fig. (Fig.44d – f).
Nous avons également étudié les propriétés inhibitrices du γ-oryzanol sur les DNMT. La formation de SAH a été mesurée pour évaluer l'activité inhibitrice du γ-oryzanol sur les DNMT in vitro. Les données sur la formation de SAH au cours de la méthylation de l’ADN induite par la DNMT indiquent un schéma saturable de la cinétique de Michaelis – Menten pour la présence et l’absence de γ-oryzanol (Fig. (Fig.4g – i) .4g – i). Dans la méthylation de l’ADN induite par DNMT1, l’analyse Eadie – Hofstee a montré que le γ-oryzanol ne présentait aucun effet sur la V max de formation de SAH (véhicule, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), tandis que le γ-oryzanol a apparemment augmenté le K m (véhicule, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Fig. (Fig.4j) .4j). Ces résultats suggèrent que le γ-oryzanol inhibe DNMT1 au moins en partie de manière compétitive. En revanche, pour la méthylation de l’ADN médiée par DNMT3a et 3b, le γ-oryzanol a diminué la V max de formation de SAH (DNMT3a: véhicule, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: véhicule, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) et, de même, le K m pour cette réaction (DNMT3a: véhicule, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: véhicule, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Fig. (Fig.4k, 4k, l). Ces résultats suggèrent que le γ-oryzanol inhibe DNMT3a et 3b au moins en partie de manière non compétitive.
Le γ-oryzanol augmente les niveaux de D2R dans le striatum de souris nourries avec HFD
Nous avons ensuite testé la possibilité que le γ-oryzanol augmente le contenu en D2R striatal par une inhibition des DNMT. Chez les souris nourries avec HFD, l'administration orale de γ-oryzanol a significativement diminué la méthylation de l'ADN striatal dans la région promotrice des D2R (Fig. (Fig.5a), 5a), alors qu’il n’a pas fait cela dans l’hypothalamus (Fig. (Fig.5f) .5F). Conformément à ces découvertes, les niveaux d'ARNm et de protéines de D2R ont été augmentés de manière réciproque (Fig. (Fig.5b, 5b, g, k, l). Similaire aux données sur le traitement par 5-aza-dC (Fig. (Fig.1), 1), aucun effet apparent sur les taux d'ARN et de protéines de Drd1, Th ainsi que Slc6a3 (DAT) dans le striatum et aucun effet sur les niveaux de Drd1, Th ainsi que Slc6a3 dans l’hypothalamus (Fig. (Fig.5c – e, 5c – e, h – k, m).
Des études antérieures ont montré que les niveaux de D2R et de DNMT1 sont régulés par le stress et l'inflammation des urgences, au moins en partie par le biais de NF-κB [17, 24, 25]. Nous avons donc examiné les niveaux de gènes liés au stress et à l'inflammation dans les urgences. Comme démontré précédemment [26], le HFD augmentait l'expression des gènes codant pour TNF-α (Tnfa), protéine chimioattractive monocyte – 1 (MCP-1) (Ccl2), Protéine homologue C / EBP (Hacher), DnaJ 4 (ERdj4) localisé dans l'ER (Dnajb9) et la forme épissée de la protéine 1 (XNUMX)Xbp1s) dans l'hypothalamus mais pas dans le striatum (Fig. (Fig.6) .6). Notamment, la supplémentation du HFD avec du γ-oryzanol a considérablement diminué l’expression augmentée de Ccl2, Hacher, Dnajb9 ainsi que Xbp1s exclusivement dans l'hypothalamus mais pas dans le striatum (Fig. (Fig.66).
a lieu
La principale conclusion de la présente étude est que le γ-oryzanol agit comme un puissant inhibiteur de la DNMT dans le striatum des souris, atténuant ainsi, du moins en partie, la préférence pour un HFD via la modulation épigénétique du D2R striatal. Dans le striatum de souris nourries avec HFD, les niveaux de D2R ont été significativement réduits, alors que ceux de D1R, TH et DAT n'ont pas été modifiés (Fig. (Fig.1b – e, 1b – e, k – m). Ces données concordent avec la notion selon laquelle la dysrégulation du D2R striatal joue un rôle essentiel dans la perception de la récompense alimentaire lorsqu’un HFD entraîne une surconsommation hédonique de HFD chez les animaux obèses [3]. Dans la présente étude, le traitement des souris nourries avec HFD avec 5-aza-dC a significativement augmenté les taux de D2R striatal (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l) éventuellement par une réduction du niveau de méthylation de l'ADN dans la région promotrice de D2R (Fig. (Fig.1a), 1a) et par conséquent atténué la préférence pour les graisses alimentaires (Fig. (Fig.1n) .1n). Cette constatation confirme également le rôle crucial des D2R striataux dans la perception de la récompense alimentaire lorsqu’il s’agit d’une DPS.
Notre essai in vitro a montré que l'activité inhibitrice du γ-oryzanol contre les DNMT était apparemment plus forte que celle de son métabolite, l'acide férulique (Fig. (Fig.4d – f), 4d – f), suggérant l'importance de la structure complète du γ-oryzanol pour son action inhibitrice sur les DNMT. Nos études suggèrent qu'après administration orale, le γ-oryzanol atteint le cerveau sous forme de structure complète et diminue les niveaux et les activités des DNMT de manière préférentielle dans le striatum, ce qui entraîne une diminution de la méthylation de l'ADN dans la région du promoteur. D2R dans le striatum. De plus, nos études in vitro ont démontré que le γ-oryzanol agit comme un antagoniste partiel de l’ERRγ, qui sert principalement de régulateur positif pour la production de DNMT1 [22], et par conséquent diminué l'activité de DNMT1 (Fig. (Fig.3a) .3une). Il est à noter que ERRγ était fortement exprimé dans le striatum mais pas dans l'hypothalamus chez la souris (Fig. (Fig.3b) .3b) Ces données suggèrent que le γ-oryzanol a le potentiel de diminuer le niveau d'ARNm de DNMT1, au moins en partie, par inhibition de ERRγ. Contrairement au striatum, le γ-oryzanol n'a montré aucun effet sur le taux de D2R dans l'hypothalamus de souris nourries avec HFD (Fig. (Fig.5g, 5g, k, l).
D'autre part, nous avons démontré que le γ-oryzanol augmentait significativement les taux de DNMT1 dans l'hypothalamus mais pas dans le striatum (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Il a été démontré que STAT3 augmente la teneur en DNMT1 dans les cellules de lymphome T malin [23]. Notamment, nous avons précédemment démontré que le γ-oryzanol augmentait de manière significative la phosphorylation de STAT3 induite par la leptine dans l'hypothalamus de souris nourries avec HFD [14]. Il convient également de noter que STAT3a était essentiellement exprimé dans l'hypothalamus mais pas dans le striatum chez la souris (Fig. (Fig.3e – g) .3par exemple). Ces données nous incitent à penser que la différence apparente d'effet du γ-oryzanol sur les concentrations de DNMT1 entre l'hypothalamus et le striatum peut être attribuée, au moins en partie, au contenu spécifique à la région de STAT3α et ERRγ dans le cerveau de souris ( Figue. (Fig.3b – g) .3b – g). Collectivement, il semble exister un schéma d’expression réciproque de ERRγ et de STAT3α entre le striatum et l’hypothalamus chez la souris. Sur la base de nos résultats, il est donc raisonnable de supposer que dans le striatum, où la production d’ERRγ est abondante, le γ-oryzanol peut diminuer de manière préférentielle le niveau d’ARNm et l’activité enzymatique de DNMT1 en tant que régulateur négatif de l’ERRγ. En revanche, dans l'hypothalamus, où la production de STAT3α est dominante, le γ-oryzanol peut augmenter de manière préférentielle les taux de DNMT1.
Une étude récente a démontré qu'une atténuation de la signalisation striatale de D2R induite par une HFD dérégule le comportement alimentaire [3], suggérant l'importance potentielle de l'inhibition des DNMT striataux pour le traitement de l'obésité. Par ailleurs, une étude antérieure avait démontré la possibilité que le statut de méthylation de l'ADN du gène 4 du récepteur de la mélanocortine exprimé dans des noyaux hypothalamiques spécifiques puisse moduler les formes d'obésité transgénérationnelles chez des souris jaunes viables agouti [27]. Bien que des études supplémentaires soient nécessaires pour élucider les mécanismes sous-jacents, elles suggèrent l’importance de la méthylation de l’ADN spécifique des tissus, des gènes et des séquences dans la physiopathologie de l’obésité induite par HFD.
Nous avons récemment signalé que HFD augmentait le niveau de D2R dans les îlots pancréatiques de souris [17, 24]. Il est probable que cette augmentation est provoquée, du moins en partie, par le stress et l'inflammation du RE via NF-KB, car il existe plusieurs éléments sensibles au NF-KB dans la région promotrice de D2R [17, 24]. En outre, une étude récente a montré que TNF-α et IL-1β augmentaient le niveau et l'activité de DNMT1 dans le tissu adipeux de souris nourries avec HFD [25]. Fait important, la présente étude a démontré que la HFD induisait le stress et l’inflammation des urgences de préférence dans l’hypothalamus mais pas dans le striatum (Fig. (Fig.6) .6). Les mécanismes en profondeur de la méthylation et de la déméthylation de l'ADN spécifiques de tissus, régions et sites dans notre paradigme expérimental doivent encore être examinés.
Ensemble avec notre précédent rapport montrant que le γ-oryzanol atténue la préférence pour un HFD via la régulation hypothalamique du stress ER chez la souris [14], le γ-oryzanol représente également une propriété unique d’améliorer la dysrégulation hédonique et métabolique du comportement alimentaire. Parce que certains médicaments anti-obésité qui ont été développés sont connus pour causer des effets indésirables critiques [8], une approche naturelle du système de récompense cérébrale fondée sur les aliments devrait permettre de traiter le syndrome d'obésité – diabète de manière sûre [16]. Dans ce paradigme, le γ-oryzanol est un candidat anti-obésité prometteur avec une propriété distincte d’être un modulateur épigénétique.
Remerciements
Nous remercions S. Okamoto (Université des Ryukyus, Japon) d’avoir révisé le manuscrit. Nous remercions M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato et C. Noguchi (Université des Ryukyus, Japon) pour l'assistance de secrétariat.
Abréviations
| 5-aza-dC | 5-aza-2′-désoxycytidine |
| D1R | Récepteur de la dopamine D1 |
| D2R | Récepteur de la dopamine D2 |
| DAT | Transporteur de dopamine |
| DNMT | ADN méthyltransférase |
| ER | Réticulum endoplasmique |
| ERR | Récepteur lié aux œstrogènes |
| HFD | Régime riche en graisses |
| SAH | S-Adénosyl-l-homocystéine |
| SAM | S-Adénosyl méthionine |
| STAT3α | Transducteur de signal et activateur de transcription 3α |
| TH | La tyrosine hydroxylase |
Notes
Disponibilité des données
Les ensembles de données générés et / ou analysés au cours de l’étude en cours sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur des demandes raisonnables.
Financement
Ce travail a été financé en partie par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 et 24591338), le Conseil pour la science, la technologie et l'innovation (CSTI), programme de promotion de l'innovation stratégique interministériel (SIP) «Technologies pour la création d’une agriculture, de forêts et de pêcheries de nouvelle génération», Fondation Lotte, Fondation japonaise pour l’Enzymologie appliquée, l’Organisation de développement des technologies nouvelles et industrielles (NEDO), le projet de formation d’un réseau des sciences de la vie (domaine pharmaceutique). ) (Préfecture d’Okinawa, Japon) et le projet de promotion du regroupement médical de la préfecture d’Okinawa, au Japon, ainsi qu’une subvention de la préfecture d’Okinawa pour la promotion de la médecine de pointe (préfecture d’Okinawa, Japon).
Dualité d'intérêt
Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de dualité d'intérêt associée à ce manuscrit.
Relevé de contribution
CK et HM ont conçu la recherche. CK et TK ont effectué les expériences et analysé les données. TK, CS-O, CT, MT, MM et KA ont contribué à l'interprétation des données. CK et HM ont écrit le manuscrit. Tous les auteurs ont contribué à l'interprétation des données. Tous les auteurs se sont joints à la révision du manuscrit et ont approuvé sa version finale. HM est le garant de ce travail, dispose d'un accès complet à toutes les données et assume l'entière responsabilité de l'intégrité des données et de l'exactitude de l'analyse des données.
Notes
Matériel supplémentaire électronique
La version en ligne de cet article (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) contient du matériel supplémentaire, évalué par les pairs mais non-édité, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés.
Bibliographie
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