Un régime riche en graisses prolongé réduit le recaptage de la dopamine sans altérer l’expression génique DAT (2013)

  • Jackson J. Cone,
  • Elena H. Chartoff,
  • David N. Potter,
  • Stephanie R. Ebner,
  • Mitchell F. Roitman

Abstract

L'obésité d'origine alimentaire (DIO) peut fortement modifier de nombreux aspects de la signalisation de la dopamine, notamment l'expression du transporteur de la dopamine (DAT) et la recapture de la dopamine. Cependant, l'évolution dans le temps des modifications de l'expression et de la fonction du DAT induites par le régime alimentaire et le fait de savoir si ces modifications dépendent du développement de la DIO restent non résolues. Ici, nous avons nourri des rats avec un régime riche en graisses (HFD) ou faible (LFD) pendant les semaines 2 ou 6. Après l'exposition au régime, les rats ont été anesthésiés avec de l'uréthane et la fonction striatale de la DAT a été évaluée en stimulant électriquement les corps cellulaires de la dopamine dans la région du tegmental ventral (VTA) et en enregistrant les modifications résultantes de la concentration en dopamine dans le striatum ventral à l'aide d'une voltamétrie cyclique à balayage rapide. Nous avons également quantifié l'effet du HFD sur le DAT associé à la membrane dans des fractions de cellules striatales provenant d'un groupe séparé de rats à la suite d'une exposition au même protocole de régime. Notamment, aucun de nos groupes de traitement n'a différé par son poids corporel. Nous avons constaté un déficit du taux de recapture de la dopamine chez les rats HFD par rapport aux rats LFD après 6 mais pas pendant 2 semaines d'exposition au régime. En outre, l'augmentation de la dopamine évoquée à la suite d'une provocation pharmacologique de la cocaïne a été significativement atténuée dans le HFD par rapport aux rats LFD. L'analyse Western blot a révélé que le régime n'avait aucun effet sur la protéine DAT totale. Cependant, les semaines 6 d'exposition au HFD ont considérablement réduit l'isoforme 50 kDa DAT dans une fraction associée à la membrane synaptosomale, mais pas dans une fraction associée au recyclage des endosomes. Nos données fournissent une preuve supplémentaire des modifications induites par le régime alimentaire dans la recapture de la dopamine, indépendamment des modifications de la production de DAT, et démontrent que de telles modifications peuvent se manifester sans le développement de la DIO. 

Citation: Cone JJ, Chartoff EH, DN Potter, Ebner SR, Roitman MF (2013), un régime riche en graisses prolongé réduit le recaptage de la dopamine sans altérer l’expression génique DAT. PLoS ONE 8 (3): e58251. doi: 10.1371 / journal.pone.0058251

Rédacteur en chef: Sidney Arthur Simon, Centre médical de l'Université de Duke, États-Unis d'Amérique

reçu: Octobre 26, 2012; Accepté: Février 5, 2013; Publié le: 13 mars 2013

Droits d'auteur: © 2013 Cone et al. Ceci est un article en accès libre distribué selon les termes de la licence d'attribution Creative Commons, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur tout support, moyennant mention de l'auteur et de la source d'origine.

Financement: Le projet décrit a été financé par les subventions DA025634 (MFR) et T32-MH067631 du National Institutes of Health (NIH) du programme de formation en neuroscience biomédicale (JJC). Un soutien supplémentaire a été fourni par le NIH, le centre national pour les ressources de recherche et le centre national pour l'avancement des sciences translationnelles, par le biais de la subvention UL1RR029877 (JJC), ainsi que par le Chicago Biomedical Consortium, avec le soutien des fonds Searle du Chicago Community Trust (JJC). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles du NIH ou du Chicago Biomedical Consortium. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publication ou la préparation du manuscrit.

Intérêts concurrents: Les auteurs ont déclaré qu'ils n'existaient pas de conflit d'intérêts.

Introduction

Les personnes en surpoids et obèses représentent un pourcentage de plus en plus grand des États-Unis et de la population mondiale , . Bien qu'il existe de nombreuses voies menant à l'obésité, l'une des plus grandes menaces pour un poids santé est la prévalence et la consommation d'aliments très appétissants et très caloriques. . En effet, la densité énergétique (kcal / g) des aliments contribue fortement au surpoids et à l'obésité chez les adultes , . Les aliments palatable évoquent la libération de dopamine dans le striatum chez l'homme et chez l'animal non humain , , , et les évaluations subjectives de la grosseur dans les aliments sont positivement corrélées à la force des réponses neuronales dans le striatum ventral . Ainsi, la dopamine et le striatum semblent contribuer aux préférences pour les aliments riches en énergie. Récemment, il a été démontré que les différences de régime alimentaire peuvent entraîner des modifications simultanées des circuits striataux et du comportement alimentaire . Cependant, les preuves croissantes selon lesquelles les différences dans les aliments ingérés, en particulier en ce qui concerne les matières grasses, peuvent faire l’objet d’une rétroaction et d’une modification de la signalisation striatale de la dopamine sont peut-être moins bien comprises.

La signalisation striatale de la dopamine est régulée par plusieurs facteurs, notamment la production de dopamine par l'enzyme tyrosine hydroxylase, les récepteurs de la dopamine pré et post-synaptiques et les transporteurs présynaptiques de la dopamine (DAT), tous impliqués dans l'obésité. , . Des modifications du nombre ou de la fonction DAT peuvent modifier la sphère d’influence de la dopamine libérée et, par conséquent, la fonction striatale , . Il a été démontré que l'insuline, libérée en réponse à l'ingestion d'aliments, influait sur la fonction DAT , . Ainsi, le DAT est l’un des candidats probables aux effets du régime alimentaire.

Récemment, des corrélations entre l'obésité et la disponibilité de la DAT ainsi que des altérations de la fonction de la DAT induites par l'alimentation ont été explorées. L'indice de masse corporelle (IMC) est négativement corrélé à la disponibilité de DAT dans le striatum humain . La liaison au DAT, et donc la disponibilité, est réduite chez les souris nourries au régime riche en graisses (HFD) . L'obésité induite par la HFD (DIO) est associée à un taux réduit de recapture de la dopamine par la DAT chez le rat . Prises ensemble, ces études suggèrent que l'obésité établie par la consommation de HFD peut potentiellement influencer les régulateurs présynaptiques critiques de la signalisation de la dopamine - en particulier le DAT. Cependant, l'évolution dans le temps des modifications induites par le régime alimentaire de la signalisation de la dopamine et la question de savoir si le développement de la DIO est nécessaire pour que des modifications manifestes restent inconnues. Nous avons testé la fonction DAT en évoquant la libération de dopamine dans le striatum ventral et en quantifiant son taux de réabsorption chez le rat en utilisant une voltamétrie cyclique à balayage rapide. Pour déterminer si la baisse de la recapture de la dopamine était due à une expression réduite du gène DAT, nous avons mesuré l'ARNm de DAT dans la région tégmentale ventrale et la substance noire en utilisant la PCR en temps réel qRT-PCR. De plus, nous avons utilisé une procédure de fractionnement biochimique et une analyse par transfert Western pour tester les niveaux de DAT striataux dans les membranes synaptosomales et endosomales brutes. Les rats ont suivi un régime soit riche, soit faible en gras, soit 2, soit 6, mais toutes les mesures ont été effectuées en l'absence de DIO. Nos résultats suggèrent qu'une consommation prolongée de HFD, indépendante de la DIO, diminue le taux de réabsorption de la dopamine dans le striatum ventral sans diminuer l'expression de la DAT.

Matériels et méthodes

Déclaration d'éthique

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide sur le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité de protection des animaux de l'Université de l'Illinois à Chicago. Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie à l'uréthane et tous les efforts ont été déployés pour minimiser les souffrances.

Sujets

Des rats mâles standard Sprague-Dawley (n = 67), âgés d'environ 2 mois et pesant 225-275 à leur arrivée ont été utilisés. Les animaux ont été logés individuellement dans des cages en plastique (26.5 × 50 × 20 cm) dans un environnement à température contrôlée (22 ° C) et à humidité contrôlée (30%) dans un environnement 1212 h clair: à l'obscurité (s'allume à 0700 h) Les rats s’y sont acclimatés pendant une semaine avec ad libitum accès à de la nourriture de laboratoire standard et à de l'eau.

Mesures de la consommation alimentaire et du poids corporel

Après acclimatation, les rats ont été pesés et attribués de manière aléatoire à 1 ou à des groupes 4 contrebalancés par le poids corporel initial. Deux groupes ont été maintenus sur un régime pauvre en graisses (LFD; Research Diets, Nouveau-Brunswick, NJ; D12450B; 10% kilocalories provenant des lipides (3.85 kcal / g)). Les autres groupes 2 ont été maintenus sur HFD (régimes de recherche; D12492; 60% kilocalories de graisse (5.24 kcal / g)). Pour chaque régime, les rats ont été maintenus pendant les semaines 2 ou 6 (semaines). Ainsi, les groupes 4 étaient: LFD-2 wk (n = 18), HFD-2 wk (n = 16), LFD-6 wk (n = 16) et HFD-6 wk (n = 17). Tous les groupes avaient ad libitum accès à l'eau. Des mesures de l'ingestion d'aliments et du poids corporel ont été effectuées trois fois / semaine et les données sont rapportées séparément pour les rats soumis à des enregistrements voltamétriques ou à une analyse protéine / message DAT.

Procédures chirurgicales et mesures de dopamine

Après une exposition au régime alimentaire, un sous-ensemble de rats dont le poids corporel ne différait pas a été préparé pour les enregistrements voltampérométriques (LFD-2 semaines (n = 8), HFD-2 semaines (n = 6), LFD-6 semaines (n = 6)) et HFD-6 semaines (n = 7)) sous anesthésie à l'uréthane (1.5 g / kg) [comme dans 9,21]. Une canule guide (Bioanalytical Systems, West Lafayette, IL) a été positionnée au-dessus du striatum ventral (1.3 mm antérieur, 1.5 mm latéral de bregma), une électrode de référence en fil d'argent chloré (Ag / AgCl) a été implantée dans le cortex controlatéral et les deux ont été fixé au crâne avec des vis en acier inoxydable et du ciment dentaire. Un micromanipulateur contenant une électrode en fibre de carbone (CFE) a été inséré dans la canule de guidage et l'électrode a été abaissée dans le striatum ventral. Le CFE et l'électrode de référence ont été connectés à une tête de scène et le potentiel du CFE a été balayé de -0.4 à +1.3 V (par rapport à Ag / AgCl) et inversement (400 V / s; 10 Hz). Une électrode de stimulation bipolaire (Plastics One, Roanoke, VA) a ensuite été progressivement abaissée dans la zone tegmentale ventrale / substantia nigra pars compacta (VTA / SNpc; 5.2 mm postérieur, 1.0 mm latéral et initialement 7.0 mm ventral de bregma) par incréments de 0.2 mm . A chaque incrément, un train d'impulsions de courant (60 impulsions, 4 ms par impulsion, 60 Hz, 400 µA) a été délivré. Lorsque l'électrode de stimulation est positionnée dans le VTA / SNpc et que le CFE est dans le striatum, la stimulation évoque de manière fiable la libération de dopamine - extraite des données voltampérométriques en utilisant l'analyse des composants principaux , ; et converti en concentration après chaque CFE est étalonné dans un système d’injection après chaque expérience . La position de l'électrode de stimulation a été optimisée pour une libération maximale. On a ensuite laissé le CFE s'équilibrer pendant 10 min avant de commencer l'expérience. La libération de dopamine a été provoquée par une stimulation électrique de la VTA / SNpc (mêmes paramètres que ci-dessus), et les changements résultants de la concentration en dopamine ont été calculés de -5 à 10 par rapport à la stimulation. Immédiatement après la stimulation, on a injecté au rat une solution de chlorhydrate de cocaïne dissoute dans une solution saline à 0.9 (mg / kg de 10) et, une minute plus tard, la stimulation a été répétée. Les tensions appliquées, l'acquisition des données et l'analyse ont été effectuées à l'aide d'un logiciel écrit sous LabVIEW (National Instruments, Austin, Texas, USA). .

Reprise de la dopamine

La recapture de la dopamine a été modélisée à l'aide du logiciel d'analyse de voltamétrie démon (24; Wake Forest University, Winston-Salem, NC). Nous rapportons ici la constante de désintégration tau en tant que notre mesure du taux de recapture de la dopamine. Le tau est dérivé d'un ajustement de courbe exponentielle englobant la majorité de la courbe de clairance de la dopamine et est fortement corrélé (r = .9899) avec Km, l'affinité apparente de la dopamine pour le DAT . Pour déterminer l'effet de la cocaïne sur le pic de concentration de dopamine, nous avons comparé les valeurs obtenues avant et après l'administration (% de changement).

Histologie

Après chaque enregistrement, une électrode en acier inoxydable (AM Systems #571500, Sequim, WA) a été abaissée à la même profondeur que le CFE et une lésion (10 µA, 4) a été réalisée pour marquer l'emplacement de l'enregistrement. Les cerveaux ont été prélevés et stockés dans 10% formol. La microscopie optique a été utilisée pour identifier l'emplacement de la lésion sur des coupes coronales (50 µm) à travers le striatum. Tous les enregistrements rapportés ici ont été réalisés dans le striatum ventral .

Fractionnement subcellulaire du tissu strié

Les rats (semaine LFD-2, semaine HFD-2, semaine LFD-6 et HFD-6 semaine; n = 10 / groupe; aucune différence de poids corporel) ont été tués par décapitation. Le fractionnement biochimique a été réalisé en utilisant le protocole décrit dans , avec des modifications mineures. Les cerveaux ont été rapidement prélevés, congelés dans de l'isopentane et coupés en tranches sur un cryostat (HM505E, Microm, Walldorf, Allemagne, -20 ° C) jusqu'à atteindre le striatum. 1 Bilatéral-mm3 Les poinçons traversant le striatum ventral (poids tissulaire moyen: 15.2 mg) ont été homogénéisés pour 20 dans du TEVP 0.8 ml (base Tris 10 mM, 5 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 7.4) + tampon de saccharose 320 mM. Une partie aliquote de 100 de l'homogénat total (H) a été sauvegardée. Le reste de H a été centrifugé à 800 × g pendant 10 min à 4 ° C. Le culot (P1, noyaux et gros débris) a été remis en suspension dans du tampon 0.2 ml TEVP et sauvegardé. Le surnageant (S1) a été retiré et placé dans un tube propre sur de la glace. S1 a été centrifugé à 9200 × g pendant 15 min à 4 ° C pour générer un culot (P2, membranes synaptosomales brutes) et un surnageant (S2). P2 a été rincé une fois dans le tampon de saccharose TEVP + 35.6 mM puis remis en suspension dans 0.25 ml de tampon de saccharose TEVP + 35.6 mM, agité doucement pour les 3 et hypo-osmotiquement lysé en conservant l’échantillon sur de la glace pendant 30 min. Le surnageant (S2) a été recueilli et centrifugé à 165,000 × g pour 2 h pour générer un culot (P3, membranes légères, endosomes de recyclage) qui a été remis en suspension dans du TEVP (0.1 ml) et sauvegardé. Tous les échantillons ont été conservés à -80 ° C jusqu'à l'électrophorèse sur gel de Polyacrylamide.

Electrophorèse sur gel et Western Blot

La teneur en protéines a été déterminée en utilisant le kit Bio-Rad DC Protein Assay (Hercules, CA), et la concentration de chaque échantillon a été ajustée à 0.3 mg / ml de protéine. Un tampon d'échantillon NuPAGE LDS (lithium dodécyl sulfate) (Invitrogen, Carlsbad, CA) et du dithiothréitol 50 mM ont été ajoutés à chaque échantillon avant chauffage à 70 ° C pendant 10 minutes. Pour charger des quantités équivalentes de protéines pour chaque fraction, 3 µg de chaque échantillon ont été chargés dans des gels NuPAGE Novex 4–12% Bis-Tris (Invitrogen) pour séparation par électrophorèse sur gel. Les protéines ont ensuite été transférées sur une membrane en polyfluorure de vinylidène (PVDF) (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA). Les sites de liaison non spécifiques ont été bloqués pendant 2 heures à température ambiante dans un tampon de blocage (5% de lait en poudre sans matière grasse dans du PBS et 0.02% de Tween 20 [PBS-T]). Les transferts ont ensuite été incubés dans l'anticorps primaire (1∶3000 anti-NR2B monoclonal de souris [# 05–920, Millipore], 1∶5000 anti-DAT de lapin [# AB2231, Millipore] et 1∶1000 récepteur anti-transferrine monoclonal de souris ( TfR) [# 13–6800, Invitrogen]. Les transferts ont été coupés en 3 parties: poids élevé (> 97 kDa), moyen (46–97 kDa) et faible (<46 kDa) et chaque partie a été sondée avec un anticorps qui a reconnu une protéine dans cette plage de poids. Les poids moléculaires apparents pour les anticorps utilisés sont les suivants: NR2B, 180 kDa; DAT, 75, 64 et 50 kDa; TrfR, 95 kDa. Après avoir sondé des empreintes dans la plage de poids moyen pour DAT, les anticorps ont été éliminés par incubation avec un tampon d'extraction (Tris 62.5 mM, SDS 2%, β-mercaptoéthanol 100 mM, pH 6.8) pendant 15 min à 50 ° C.Les transferts ont ensuite été re-bloqués et sondés avec anti-TfR. SeeBlue Plus 2 (Invitrogen) pré- des standards colorés ont été exécutés pour l'estimation du poids moléculaire.

Les immunoblots de protéines ont été analysés à l'aide du logiciel d'imagerie moléculaire Carestream 5.0. L'intensité nette (la somme des pixels de la bande d'intérêt moins la somme des pixels de l'arrière-plan) a été déterminée pour chaque bande. Pour permettre des comparaisons entre les transferts, les données ont été normalisées par rapport aux témoins LFD aux semaines 2 et 6. Les données sont exprimées en tant que facteur de induction moyen comparé à LFD ± SEM.

Réaction en chaîne quantitative en temps réel de la transcriptase inverse polymérase (qRT-PCR)

Après la collecte des poinçons striataux pour l'analyse par Western blot, les cerveaux congelés ont été sectionnés coronaux sur le microtome jusqu'à atteindre le VTA / SN. 1 Bilatéral-mm3 des poinçons de tissu VTA et SN (poids moyen du tissu = 15.0 mg) ont été fabriqués et l'ARN extrait à l'aide du kit PureLink RNA Mini (Invitrogen). La qualité et la quantité d'ARN ont été évaluées à l'aide d'une nano puce ARN 6000 (Agilent, Santa Clara, CA) sur un bioanalyseur Agilent 2100. Le nombre d'intégrité d'ARN (RIN) a dépassé 7 pour tous les échantillons, indiquant une haute qualité. Un microgramme d'ARN total a été utilisé pour synthétiser de l'ADNc en utilisant le kit de synthèse de l'ADNc d'iScript (BioRad) dans un ThermoHybaid iCycler (Thermo Scientific). Amorces pour DAT (Slc6a3; Primer Forward: GGAAGCTGGAGCCCCTG, Amorce inversée: GAATTGGCGCACCTCCCCTCTG), -rangisterie des Pays-Bas (2) (1). : GCTCCTGTGCACACCATTTTCCC) les gènes (numéros d’accès Genbank NM_012694, NM_031144 et NM_001004198) ont été conçus en utilisant NCBI Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) et acheté chez Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). L'analyse de la courbe de fusion et l'électrophorèse sur gel de Polyacrylamide ont confirmé la spécificité des amorces. Les amplicons DAT, β-actine et Tbp ont respectivement une longueur de paire de bases 266, 182 et 136.

Un kit Q-PCR (iQ SybrGreen Supermix, BioRad) a été utilisé. La réaction a été effectuée sur un système de détection PCR en temps réel monochrome MyiQ (BioRad) dans un volume de 20 ul, avec 2 uL d'amorces directes et inverses 3 uM et un échantillon d'ADNc de 4 uL dilué 1®10. Les conditions de cyclage de la PCR étaient 95 ° C pour 5 min; Cycles 40 à 94 ° C pour 15, 60 ° pour 15, 72 ° C pour 15. Les données ont été recueillies à une température de lecture de 84 ° C pour 15 basée sur les températures de fusion de l'amplicon. Des courbes de dilution standard ont été générées pour chaque jeu d’amorces en diluant en série (1.00, 0.2, 0.04 et 0.008-fold) un stock d’ADNc maître comprenant un mélange égal d’ADNc de tous les groupes de traitement. Le journal10 des valeurs de dilution a été comparée aux valeurs de cycle de seuil pour les courbes standard. Le logiciel système optique MyiQ (BioRad) a été utilisé pour analyser les données. Des échantillons ne contenant pas de matrice d'ADNc et des échantillons de réactions d'ADNc ne contenant pas de transcriptase inverse ont été analysés comme contrôles pour la contamination et l'amplification de l'ADN génomique, respectivement. Les valeurs rapportées ont été normalisées aux valeurs moyennes des standards internes ß-actin et Tbp pour chaque échantillon. Les données sont exprimées en tant que niveaux relatifs moyens de DAT / standards internes ARNm ± SEM.

Analyses statistiques

L'expression DAT change de façon dynamique au cours du cycle de vie chez les deux êtres humains et des rats , . De plus, la réponse dopaminergique et comportementale à la cocaïne change également à mesure que les jeunes rats mûrissent. . Ainsi, les mesures de DAT pourraient co-varier avec l’âge et interdire toute comparaison significative entre les groupes 2 wk et 6 wk. Par conséquent, les moyennes des groupes pour l'apport alimentaire, le poids corporel, la concentration maximale de dopamine, la tau, le pourcentage de changement et l'expression relative des gènes ont été comparés séparément pour les groupes 2 et 6 wk en utilisant le test t non apparié de Student. Pour les analyses par transfert Western, les différences de groupes d'intensité de bande DAT normalisée ont été comparées séparément pour les groupes 2 et 6 wk en utilisant une ANOVA à mesures répétées (dietXfraction). Toutes les analyses statistiques ont été effectuées dans Graph Pad 5 (Prism Inc.).

Résultats

HFD favorise la consommation de graisse accrue

Avant le début de l'exposition au régime, il n'y avait pas de différence de poids corporel initial dans la semaine 2 (LFD: 275.22 +/− 4.1 g; HFD: 280.87 +/− 4.8 g; p = 0.37) ou 6 semaines (LFD: 287.31 +/- 4.9 g; HFD: 289.44 +/- 5.1 g; 6 semaines p = 0.97) groupes. Malgré la consommation de régimes de composition radicalement différente, nous n'avons trouvé aucune différence de poids corporel entre les groupes de régime après 2 ou 6 semaines (Fig. 1a – b; les deux ns). Il n’existait pas non plus de différence entre le nombre total de calories consommées entre les groupes après une exposition au régime alimentaire 2 et 6 (Fig. 1c – d; ns). Cependant, les rats HFD ont consommé nettement plus de calories de graisse (Fig. 1e – f; 2 wks: t (32) = 25.59; 6 wks: t (31) = 27.54; p<0.0001 pour les deux durées de régime).

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Figure 1. Prise de nourriture et mesures du poids corporel.

Il n’existait pas de différence entre HFD et LFD en termes de poids corporel final (un B) ou le nombre total de kilocalories consommées (CD) après des semaines d’alimentation par 2 ou 6. (e – f) Les rats HFD ont consommé significativement plus de kilocalories de graisse que les rats LFD dans les conditions de la semaine 2 et de la semaine 6 (***p

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g001

HFD prolongé réduit le taux de réabsorption de DA

Des enregistrements voltamétriques ont été réalisés dans le striatum ventral (Figure 2). Figure 3 montre des modifications électriquement représentatives évoquées dans la concentration de dopamine acquises chez des rats à la suite de régimes alimentaires 6. Au départ, l’ampleur de la dopamine évoquée ne différait pas entre les groupes de régimes et entre les durées des régimes (Fig. 4a – b, les deux ns). Cependant, l’examen des exemples individuels a suggéré que le taux de décomposition après la concentration maximale de dopamine différait d’un groupe à l’autre après l’exposition par 6 de régimesFigure 3 a – b pour des exemples). Le taux de décomposition est principalement dû à la clairance de la dopamine par le DAT , que nous avons modélisée comme une phase exponentielle pour déterminer tau. Il n’ya pas eu de différence entre les groupes de régime suivant les séances d’exposition au régime 2 (Fig. 4c). Cependant, après l'exposition au régime par 6, le tau était significativement plus élevé chez les rats HFD-6 wk par rapport à LFD-6 wk (Fig. 4d; t (11) = 2.668; p<0.05). Ainsi, 6 semaines de HFD réduit le taux de clairance de la dopamine dans le striatum ventral par rapport aux animaux qui ont consommé un LFD.

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Figure 2. Vérification histologique des sites d'enregistrement pour l'analyse de la recapture.

Les sites d’enregistrement des rats nourris au LFD sont codés par des triangles gris et ceux des rats HFD par des cercles noirs. Les nombres indiquent la distance en mm antérieure à Bregma. Figure adaptée de Paxinos et Watson 2006.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g002

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Figure 3. La stimulation électrique de la VTA / SNc évoque un pic phasique de la concentration en dopamine.

Exemples représentatifs de données acquises après 6 semaines d’alimentation. a) La courbe de couleur soustraite en arrière-plan montre les variations actuelles aux différents potentiels de l'électrode avant (−5 à 0 s par rapport à l'apparition) et après (0.1 à 10 s par rapport à l'apparition) électrostimulation (STIM) de la VTA / SNc. Le temps est l'abscisse, le potentiel de l'électrode est l'ordonnée et les changements de courant sont codés en fausse couleur. La dopamine [identifiée par ses caractéristiques oxydation (+ 0.6 V; vert) et réduction (−0.2 V; bleu)] a augmenté de façon transitoire en réponse à la stimulation chez ce rat LFD-6 wk. b) Comme en a), sauf pour un rat HFD-6 wk. c) La concentration de dopamine en fonction du temps est extraite du diagramme de couleur en a) et la protéine tau est identifiée via l'ajustement de la courbe. Deux points rouges indiquent le pic et la concentration de dopamine au moment où tau est atteint. Tau est indiqué à droite. d) Identique à c) mais les données sont extraites de b).

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g003

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Figure 4. Un régime riche en graisses de six semaines réduit le taux de recapture de la dopamine et atténue la réponse de la dopamine à la cocaïne.

Concentration maximale moyenne en dopamine évoquée par une stimulation VTA / SNpc après 2 (a) ou 6 semaines (b) d'exposition alimentaire avant l'injection de cocaïne. CD) Tau moyen après 2 (c) wks ou 6 wks (d) d'exposition alimentaire. La tau était significativement supérieure chez les rats HFD-6 wk par rapport aux rats LFD-6 wk (*p e – f) Pourcentage de variation de la concentration de dopamine évoquée maximale après injection de cocaïne pour 2 (e) et 6 (f) semaines de régime alimentaire. Le pourcentage de changement était significativement plus faible dans HFD-6 sem. Par rapport aux rats LFD-6 wk (**p

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g004

HFD prolongée diminue la réponse de la DA à la cocaïne

Pour approfondir la recherche d'altérations du DAT induites par l'alimentation, nous avons injecté à des rats le cocaïne bloquant le DAT. Le pic de concentration de dopamine consécutif à une stimulation électrique est dû à la libération de dopamine, mais est également limité par son élimination simultanée par la DAT . Nous avons caractérisé l'effet de la cocaïne sur la transmission de la dopamine en calculant la variation de l'ampleur de la dopamine évoquée par rapport aux valeurs antérieures à la consommation de drogue (variation en%). Deux semaines de HFD n’ont pas affecté le pourcentage de variation par rapport à LFD (Fig. 4e; ns). Cependant, après une exposition au régime alimentaire de 6, le pourcentage de variation était considérablement atténué dans le HFD par rapport au LFD (Fig. 4f; t (10) = 4.014; p<0.01). Nos résultats suggèrent que 6, mais pas 2 semaines, d'exposition HFD réduisent la réponse dopaminergique à la cocaïne.

Une exposition prolongée à HFD réduit l'expression de la protéine DAT dans les membranes synaptosomales

Pour déterminer si les effets de l'HFD prolongé étaient dus à des modifications du nombre de DAT, les taux de protéine DAT ont été quantifiés dans les homogénats tissulaires totaux (fraction H), les membranes synaptosomales (fraction P2) et les endosomes de recyclage intracellulaire (fraction P3). DAT est un Nglycoprotéine liée à un poids moléculaire apparent compris entre 50 et 80 kDa en raison de niveaux croissants de glycosylation à mesure que la protéine mûrit . Le fractionnement a été confirmé par une expression enrichie de la sous-unité NR2B du récepteur NMDA dans la fraction membranaire synaptosomale et du récepteur de la transferrine dans la fraction endosomale (par exemple, voir Fig. 5b). Nous n'avons trouvé aucune différence dans la protéine DAT totale après l'exposition au régime par 2 et 6 (données non présentées). Pour tester les différences de protéine DAT spécifiques à une fraction, nous avons utilisé une ANOVA à deux mesures répétées (dietXfraction). Conformément aux expériences de voltamétrie, l'exposition au régime alimentaire de 2 était insuffisante pour modifier les niveaux des isoformes de la DAT dans les fractions P2 ou P3 (Fig. 5. c, e, g; tous ns). Cependant, après une série de séances d’alimentation par 6, une interaction importante entre dietXfraction (F(1,18) = 8.361, p<0.01); Fig. 5d) pour l'isoforme 50 kD du DAT. Ainsi, une HFD prolongée a significativement réduit l'isoforme 50 kD du DAT dans la fraction P2 et a entraîné une tendance à une augmentation de la fraction P3. Nous n’avons trouvé aucun effet du régime alimentaire ou de la fraction sur le 64 kD (Fig. 5f; ns) ou le 70 kD (Fig. 5h; ns) isoformes de DAT.

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Figure 5. La consommation d'un régime riche en graisses diminue la protéine DAT associée à la membrane dans le striatum ventral.

a) Image représentative montrant les perforations tissulaires (2) 1 × 1 mm obtenues du striatum ventral combinées pour l'analyse de la protéine DAT. VStr = Striatum ventral; DStr = Striatum dorsal; cc = corpus callosum; ac = commissure antérieure. b) Les transferts Western représentatifs des données présentées dans c – h. L = LFD; H = HFD; TfR = récepteur de la transferrine; NR2B = sous-unité NR2B du récepteur NMDA. c) Il n’existait aucune différence dans la protéine 50 kD DAT pour les fractions P2 ou P3 après des semaines d’alimentation par 2. d) La protéine DAT de 50 kD est significativement réduite dans le P2 (* = p<05), mais pas la fraction P3 du tissu striatal ventral chez HFD-6 semaines par rapport aux rats LFD-6 semaines. Il n'y avait aucune différence dans la protéine DAT de 64 kD après 2 (e) ou 6 semaines (f) d'exposition alimentaire. Il n’existait aucune différence dans la protéine 70 kD DAT après l’utilisation de 2 (g) ou 6 semaines (h) d'exposition alimentaire.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g005

Pour déterminer si la diminution de la protéine DAT dans la fraction P2 était due, en partie, à une réduction de la transcription de la DAT, les taux d'ARNm de la VTA / SNc DAT ont été mesurés chez les mêmes rats que ci-dessus (Fig. 6a par exemple). Nous n’avons observé aucune différence entre les groupes de régime dans l’ARNm de DAT du cerveau moyen après une exposition au régime alimentaire de 2 ou de 6 (Fig. 6b – c; les deux ns). Ainsi, il est peu probable que les différences de niveaux de protéines DAT dans le striatum ventral soient dues à des déficits de production de DAT.

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Figure 6. Une alimentation riche en graisses ne modifie pas les niveaux d'ARNm de DAT. une)

Image représentative montrant les perforations tissulaires 1 × 1 mm extraites du VTA / SN et combinées pour l'analyse d'ARNm DAT. cp = pendoncule cérébral; pc = commissure postérieure; MM = noyau mammaire médial. Il n’existait aucune différence entre les niveaux relatifs d’ARNm de DAT après les semaines 2 (b) ou des semaines d’exposition au régime alimentaire 6 (c).

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g006

a lieu

Une consommation prolongée de HFD peut entraîner une DIO et une plasticité au sein du système nerveux central. Les neurones dopaminergiques et les récepteurs dopaminergiques striataux semblent constituer un ensemble de cibles du système nerveux central affectées par une insuffisance cardiaque en chaîne et chez les individus obèses , , . Nous rapportons ici qu'un HFD réduit le taux de recapture de la dopamine dans le striatum ventral et que cet effet dépend de la durée d'exposition. Fait important, l’effet de HFD sur la fonction DAT s’est produit en l’absence de DIO. Bien que nous n’ayons pas directement mesuré les marqueurs de l’adiposité corporelle dans cette étude, les animaux ont toujours été classés dans la catégorie DIO ou résistants au régime en se basant uniquement sur le gain de poids corporel consécutif à une exposition à une MH. . La HFD prolongée a considérablement atténué la capacité de la cocaïne, qui interfère avec le DAT, de potentialiser l'ampleur de la libération de dopamine. Nous avons quantifié les niveaux de protéine DAT dans le striatum ventral à l'aide d'une analyse par transfert Western - en distinguant les DAT localisées dans des fractions subcellulaires enrichies pour la membrane plasmique ou les endosomes recyclés. Nous avons trouvé une réduction significative d'une isoforme immature du DAT associée à la membrane plasmique. Ainsi, une HFD prolongée semble réduire le taux de recapture de la dopamine via le DAT en interférant probablement avec le trafic de DAT ou peut-être en cours de maturation, mais pas en diminuant l'expression du gène DAT ou la stabilité de l'ARNm de DAT. De plus, une période d'exposition entre deux et six semaines d'exposition à une MPC semble être le point de basculement le plus précoce pour la plasticité induite par le régime alimentaire par rapport à la DAT.

L'obésité est corrélée à de multiples aspects de la signalisation striatale de la dopamine, y compris la disponibilité de la DAT chez l'homme et la femme et des souris . Cependant, ce n’est que récemment que l’on a montré que le développement de la DIO modifiait le taux de recapture de la dopamine chez le rat. . Bien que cette étude ait mis en évidence une recapture de la dopamine après une application exogène de dopamine après seulement quelques semaines 4 de HFD, les animaux maintenus sur un HFD ont été sélectionnés sur la base de leur gain de poids initial et pourraient donc représenter une population unique. Conformément à ce point de vue, les animaux HFD ont continué à consommer plus de calories et à prendre plus de poids par rapport aux témoins LFD. Une autre étude récente a rapporté une altération de la recapture de la dopamine après plusieurs semaines de traitement par HFD chez 12 chez des rats . Cependant, il y avait des différences significatives dans le poids corporel entre les animaux nourris avec une HFD par rapport à un régime alimentaire standard de laboratoire lorsque les mesures de recapture ont été effectuées. Par conséquent, on ne savait toujours pas si des altérations de la recapture de la dopamine résultaient directement du développement de la DIO, ou la précédaient. Contrairement à ces rapports récents, nous n'avons trouvé aucune différence de poids corporel ou de consommation totale de kcal entre les groupes de notre régime lorsque nous avons mesuré la recapture. Le fait que nous ayons constaté des différences dans la recapture de la dopamine après 6, mais pas dans 2, plusieurs semaines de HFD suggère que les modifications induites par le régime dans la recapture de la dopamine sont une réponse aux changements chroniques, mais non aigus, de la composition de l'alimentation. De plus, nos résultats suggèrent qu'au lieu d'être le résultat de l'obésité, des modifications du DAT induites par l'alimentation pourraient contribuer au développement de la maladie. Les futures études devront déterminer si les populations animales qui sont différemment susceptibles à la DIO ont des différences préexistantes dans l'expression / la fonction de la DAT ou sont différentiellement sensibles aux modifications de la DAT induites par le régime alimentaire.

À notre connaissance, il s'agit de la première étude démontrant qu'un HFD réduit la réponse de la dopamine à la cocaïne. Étant donné le rôle de la dopamine dans la récompense du médicament, nos résultats sont cohérents avec ceux de travaux antérieurs démontrant que les rats nourris avec un HFD pendant environ 6 semaines prennent plus lentement la cocaïne pour s'auto-administrer que les animaux nourris avec un régime de contrôle. . Fait important, cet effet était également indépendant du développement de DIO. De plus, les rats élevés sélectivement pour leur sensibilité à la DIO montrent une préférence réduite pour la cocaïne, ce qui suggère que les propriétés enrichissantes de la cocaïne sont atténuées chez ces animaux. . La diminution de la réponse à la cocaïne observée chez les rats HFD-6 wk pourrait être due à une disponibilité réduite de la DAT striatale. Cependant, la cocaïne augmente également la signalisation de la dopamine par le biais de mécanismes non dépendants de la DAT. Plus précisément, HFD pourrait avoir altéré la mobilisation induite par la cocaïne de vésicules de dopamine de réserve . La cocaïne atténue également la transmission du GABA sur les neurones dopaminergiques au sein de la VTA et induit des oscillations dans la cadence de tir des corps cellulaires dopaminergiques . N'importe lequel de ces processus pourrait également avoir été affecté par un DFD. Les recherches futures devront porter sur les mécanismes sous-jacents à la façon dont une HFD modifie les aspects gratifiants de la cocaïne et / ou le potentiel d'adaptation neuronale induite par la drogue. . La consommation d'un HFD atténue à la fois le comportement et réponse à la dopamine , à l'amphétamine, qui interfère également avec le DAT. Il est important de noter que les rats dont la consommation de HFD était caloriquement équivalente à celle de rats nourris avec un régime de contrôle ne développent pas de DIO mais ne développent toujours pas une préférence de lieu conditionné pour l'amphétamine. . Avec les données présentées ici, il apparaît que la consommation d'un HFD émousse la réponse aux psychostimulants. Toutes les drogues d'abus influencent le système de la dopamine, et on pense que l'amélioration induite par la drogue de la signalisation de la dopamine est essentielle au développement de la dépendance . Ainsi, la réponse réduite à la cocaïne chez les rats HFD est cohérente avec les rapports selon lesquels les humains obèses ont un risque significativement plus faible de développer un trouble lié à l'abus de substances au cours de la vie. . Les travaux futurs devront déterminer si l’évaluation subjective de la récompense de la cocaïne diffère chez les personnes obèses par rapport au contrôle du poids normal.

Notre analyse par transfert Western suggère que la consommation prolongée d'un HFD n'affecte pas la protéine DAT striatale totale, mais réduit plutôt l'intégration de l'isoforme 50 kDa XNUMX non glycosylé dans les membranes synaptosomales. La glycosylation au DAT améliore le taux de transport de la dopamine et augmente la stabilité de la surface de la membrane , , DAT non glycosylée chez l'homme , ainsi que des rats transporte facilement la dopamine. En outre, des expériences d'immunomarquage révèlent que les taux de DAT non glycosylée sont plus élevés dans le ventral par rapport au striatum dorsal chez le singe et l'homme. . Prises ensemble, ces études suggèrent que la diminution des taux membranaires de 50 kDa DAT pourrait contribuer au déficit de recapture observé chez les rats 6 wk HFD. Nos données sont cohérentes avec une étude précédente montrant que la consommation de HFD réduit la disponibilité de DAT dans le striatum ventral de souris. . Cependant, cette étude n'a pas mesuré la localisation de DAT dans différents compartiments intracellulaires. De plus, nos résultats concordent avec ceux d'une étude montrant des réductions du DAT de la surface cellulaire dans le striatum de rats DIO . Cette étude a également indiqué que les niveaux de protéines DAT totales n'étaient pas affectés par l'alimentation dans le modèle DIO. Nous développons cette découverte pour montrer que la protéine DAT totale n’est pas non plus affectée par un HFD chez des rats d’élevage. Par conséquent, la consommation prolongée d'un HFD ne modifie pas l'expression de la DAT, mais peut interférer avec le trafic ou la maturation de la DAT.

L'absence de différences dans les niveaux d'ARNm de la VTA / SNpc DAT après une exposition à HFD sous 2 ou 6 renforce davantage la notion selon laquelle les niveaux globaux de DAT n'étaient pas affectés par nos manipulations diététiques. Ce résultat contraste avec un précédent rapport montrant une réduction de l'ARNm de DAT dans la VTA de souris après la consommation de plusieurs semaines avec HFD chez 17. . Cependant, dans cette étude, les taux d'ARNm de DAT ont été mesurés après que les groupes de régime avaient présenté une différence de poids corporel au cours des semaines 12. Ainsi, leurs résultats représentent probablement des adaptations tardives à la DIO. En résumé, nos données fournissent des preuves solides que l'exposition à une HFD entraîne des modifications fonctionnelles dans la réabsorption de la dopamine striatale en diminuant les DAT associés à la membrane sans modifier l'expression de la DAT totale. Il est important de noter que nous rapportons que des perturbations induites par l'alimentation dans la DAT peuvent survenir avant le début de la DIO, suggérant que ces modifications pourraient contribuer au développement de l'obésité.

Nos données s'ajoutent à une littérature de plus en plus importante impliquant le régime alimentaire dans la régulation de la fonction dopaminergique, et fournissent une preuve supplémentaire que les changements induits par le régime alimentaire dans l'expression de la DAT entraînent des changements fonctionnels pertinents dans la signalisation de la dopamine. Des modifications induites par le régime dans la dynamique de la signalisation de la dopamine dans le striatum via le DAT sont susceptibles d'avoir des conséquences sur le comportement alimentaire. Les stimuli liés à l'alimentation évoquent une augmentation phasique de la dopamine striatale , , , qui renforcent et renforcent probablement les actions en faveur de l'alimentation . Nous montrons ici que la consommation de HFD en semaines 6 prolonge la durée de la libération phasique de dopamine en diminuant les DAT associés à la membrane dans une région du striatum où la fonction dopamine est essentielle pour la prise de nourriture . Des modifications de la DAT dépendantes du régime alimentaire pourraient favoriser un mécanisme de feed-forward selon lequel des signaux prolongés de la dopamine évoqués par des stimuli alimentaires augmenteraient l'activation des récepteurs D1 de la dopamine striatale de faible affinité, qui sont essentiels pour les comportements à l'approche , , . Au fil du temps, une élévation prolongée de la dopamine striatale pourrait favoriser des adaptations, telles que la régulation négative des récepteurs D2 de la dopamine (D2R), ce qui a été démontré dans des modèles d'obésité chez l'homme et chez le rongeur , . Notre étude suggère que le développement de l'obésité n'est pas une condition requise pour modifier le recaptage de la dopamine. Ainsi, une diminution de la DAT membranaire liée au régime alimentaire pourrait précéder et contribuer à l'apparition de la régulation négative de D2R, de l'obésité et du comportement alimentaire compulsif qui se développe au cours de la consommation de HFD. .

Remerciements

Nous tenons à remercier les Drs. Jamie D. Roitman et James E. McCutcheon pour leurs commentaires utiles sur les versions précédentes du manuscrit. Le contenu de cet article n'engage que la responsabilité de ses auteurs et ne représente pas nécessairement l'opinion officielle du NIH ou du Chicago Biomedical Consortium.

Contributions d'auteur

Conçu et conçu les expériences: JJC EHC MFR. Réalisé les expériences: JJC DNP SRE. Analyse des données: JJC EHC SRE MFR. A écrit le papier: JJC EHC MFR.

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