Un antagoniste des récepteurs de la ghréline (GHS-R1A) atténue les propriétés enrichissantes de la morphine et augmente les niveaux de peptide opioïde dans les zones de récompense chez la souris (2015)

Une exposition aussi bien aiguë que chronique à des drogues entraînant une dépendance influence profondément le système dopaminergique mésolimbique, un circuit clé important des systèmes de récompense du cerveau (Nestler, 2005). Ces effets ont été proposés pour sous-tendre, au moins en partie, le développement de la toxicomanie (Wise, 2004). La toxicomanie a un large éventail d’effets néfastes sur l’individu et sur la société. De nouvelles interventions pharmacologiques, permettant de traiter ce problème de santé publique majeur, sont justifiées (Koob et Le Moal, 2001). En clarifiant les systèmes de signalisation qui contrôlent la capacité des drogues entraînant une dépendance à activer le système dopaminergique mésolimbique, des stratégies de traitement uniques pour les troubles liés à l'utilisation de substances peuvent être identifiées.

Des recherches ont montré que des mécanismes neurobiologiques courants régulent la consommation et les récompenses induites par les aliments et les drogues provoquant une dépendance (Morganstern et al., 2011), en proposant que le rôle des peptides de régulation des intestins et du cerveau régulateurs des aliments tels que la ghréline inclue la médiation de récompense. Initialement, il a été montré que la ghréline provoque la libération de l'hormone de croissance (Kojima et al., 1999) et induit une adiposité chez le rat (Tschop et al., 2000). À ce jour, il est bien connu que la ghréline augmente l’apport alimentaire, la faim et stimule l’appétit. via circuits hypothalamiques (pour revue, voir Egecioglu et al. (2011)). En plus de l'hypothalamus, les récepteurs de la ghréline (GHS-R1A) sont exprimés dans des zones liées à la récompense telles que l'amygdale, le striatum, le cortex préfrontal, la zone tegmentale ventrale (VTA) et l'hippocampe (pour un examen, voir Engel et Jerlhag (2014)), ce qui implique que le rôle physiologique de la ghréline va au-delà de la régulation de l'homéostasie énergétique. En effet, le peptide orexigène ghréline s'est avéré être un activateur du système dopaminergique mésolimbique ainsi qu'un régulateur de la récompense, de la motivation et de la consommation d'alcool, de nicotine, d'amphétamine et de cocaïne chez la souris (pour un examen, voir Engel et Jerlhag (2014)).

Les opioïdes, comme d’autres drogues entraînant une dépendance, activent le système dopaminergique mésolimbique, ce qui provoque la libération de dopamine accumbal via activation des récepteurs opioïdes μ et / ou δ dans le noyau accumbens (NAc) (Hirose et al., 2005, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999) et dans la VTA, probablement en diminuant le GABA -inhibition des neurones dopaminergiques (Johnson and North, 1992). En outre, les récepteurs κ-opioïdes accumbaux régulent l'activité du système dopaminergique mésolimbique (Chefer et coll., 2005, Spanagel et coll., 1992). Une exposition répétée aux opioïdes produit des modifications adaptatives de plusieurs neurotransmetteurs, y compris des peptides opioïdes, dans les zones de récompense, qui contribuent au développement de la dépendance (De Vries et Shippenberg, 2002). Chez le rat, la suppression pharmacologique de GHS-R1A atténue la libération de dopamine accumale induite par la morphine ainsi que les comportements stéréotypiques (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Le but de la première partie de la présente série d’expériences était d’étudier l’effet aigu d’un antagoniste du GHS-R1A, JMV2959, sur l’aptitude de la morphine à provoquer une stimulation locomotrice, une libération de dopamine accumbal et une préférence de lieu conditionnée chez la souris. Le but de la deuxième partie de cette étude était d’évaluer l’effet du traitement répété par JMV2959 ou par la ghréline sur les taux de peptides opioïdes (Met-enkephalin-Arg⁶Phe⁷ (MEAP), la dynorphine B (DynB) et la Leu-enképhaline-Arg⁶ (LeuArg)) dans des domaines liés aux récompenses, notamment l'amygdale, le striatum, le cortex préfrontal, la VTA et l'hippocampe.

Des souris NMRI mâles appariées selon l'âge après la puberté (8 – 12 semaines et 25 – 40 g; Charles River, Sulzfeld, Allemagne) ont été utilisées. En bref, toutes les souris ont été hébergées en groupe et maintenues à un cycle lumière / obscurité 12 / 12 h (la lumière est allumée à sept heures du matin). L'eau du robinet et la nourriture (Normal Chow; Harlan Teklad, Norfolk, Angleterre) ont été fournis ad libitum, sauf pendant les montages expérimentaux. De nouvelles souris ont été utilisées pour chaque test comportemental ainsi que pour l'analyse du peptide opioïde. Les expériences ont été approuvées par le comité d'éthique suédois pour la recherche animale à Göteborg. Tous les efforts ont été déployés pour minimiser les souffrances des animaux et réduire le nombre d'animaux utilisés. Tous les animaux ont été autorisés à s'acclimater au moins une semaine avant le début des expériences.

Le chlorhydrate de morphine (hôpital Apoteksbolaget Sahlgrenska; Göteborg, Suède) a été dissous dans un véhicule (solution de chlorure de sodium 0.9%) et administré par voie intraveineuse à une dose de 20 mg / kg 10 min avant le début de l'expérience. Cette dose a été choisie car une dose plus faible (10 mg / kg, ip) n'a pas provoqué de stimulation locomotrice chez nos souris (données non présentées). La dose choisie (6 mg / kg, ip) de JMV2959 (synthétisée à l’Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR5247, CNRS, Montpellier 1 et 2 Universities, France), un antagoniste GHS-R1A, a été déterminée précédemment et a aucun effet sur l'activité locomotrice, la libération de dopamine accumbal et la préférence de lieu conditionné chez la souris (Jerlhag et al., 2009). JMV2959 a été dissous dans le véhicule (solution de chlorure de sodium 0.9%) et a toujours été administré vingt minutes avant l'exposition à la morphine ou la décapitation pour l'analyse des niveaux de peptide opioïde. La dose sélectionnée de JMV2959 n'a ​​pas affecté le comportement général de la souris dans aucune expérience. Pour les tests comportementaux, JMV2959 a été administré de manière aiguë car nos études antérieures ont montré qu'une seule injection de JMV2959 atténue la récompense induite par le médicament. JMV2014 a été administré de manière sous-chronique pendant cinq jours pour l'analyse des peptides opioïdes afin d'accroître la possibilité de détecter un effet robuste. En outre, avec des injections répétées, vous évitez le possible effet de confusion du stress d’injection aiguë sur les peptides. La ghréline de rat acylée (Bionuclear; Bromma, Suède) a été diluée dans du chlorure de sodium 2959% et la dose choisie de ghréline (0.9 mg / kg, ip) a déjà montré son efficacité chez la souris (Jerlhag, 0.33). Un design équilibré a été utilisé pour tous les défis posés par la drogue.

Des études antérieures ont montré que la morphine provoque une stimulation locomotrice chez les rongeurs (Wise et Bozarth, 1987). L'activité locomotrice a été enregistrée dans huit boîtiers locomoteurs insonorisés, ventilés et faiblement éclairés (420 × 420 × 200 mm, Kungsbacka mäto- och reglerteknik AB; Fjärås, Suède). Cinq à cinq rangées de faisceaux de cellules photoélectriques, au niveau du sol de la boîte, créant une détection de cellule photoélectrique, ont permis à un système informatisé d’enregistrer l’activité des souris. L'activité locomotrice a été définie comme le nombre cumulé de nouveaux faisceaux de cellules photoélectriques interrompus pendant une période 60-min. Dans toutes les expériences, les souris ont été autorisées à s’habituer à la boîte d’activité locomotrice une heure avant le traitement médicamenteux. Il n'y avait aucune différence entre l'habituation dans aucun des groupes de traitement (données non présentées).

Dans la première série d'expériences, les effets de JMV2959 (6 mg / kg, ip) sur la stimulation locomotrice induite par la morphine (20 mg / kg, ip) ont été étudiés. JMV2959 a été administré à 20 min avant la morphine et l’enregistrement de l’activité a commencé dix minutes après la dernière injection. Chaque souris a reçu une combinaison de traitement (véhicule / véhicule, JMV2959 / véhicule, morphine / véhicule ou JMV2959 / morphine; n= 8 par combinaison de traitement) et n’a fait l’objet que d’un seul essai expérimental.

Pour évaluer les effets de JMV2959 sur les effets gratifiants de la morphine chez de nouvelles souris, des tests de préférence de lieu conditionné ont été effectués chez des souris comme décrit précédemment (Jerlhag, 2008). En résumé, un appareil CPP à deux chambres, avec un éclairage 45 lx et des signaux visuels et tactiles distincts, a été utilisé. Un compartiment était défini par des murs rayés noirs et blancs et par un sol stratifié foncé, tandis que l’autre avait un plancher en bois peint en blanc et des murs de texture en bois. La procédure consistait en un préconditionnement (jour 1), un conditionnement (jours 2 – 5) et un post-conditionnement (jour 6). Lors du préconditionnement, les souris ont été injectées ip avec le véhicule et ont été placées dans la chambre avec un accès libre aux deux compartiments pendant 20 min pour déterminer la préférence pour le lieu (ou le côté) initial. Le conditionnement (20 min par session) a été effectué en utilisant une procédure biaisée dans laquelle la morphine (20 mg / kg) a été couplée au compartiment le moins préféré et le véhicule au compartiment préféré. Toutes les souris ont reçu une injection de morphine et de véhicule tous les jours et les injections ont été modifiées entre le matin et l’après-midi selon un modèle équilibré. Au post-conditionnement des souris (n= 16) ont été injectés avec JMV2959 (6 mg / kg, ip) ou un volume égal de solution pour véhicule et 20 min ajouté plus tard sur la ligne médiane entre les deux compartiments avec libre accès aux deux compartiments pour 20 min (créant les groupes de traitement suivants; Morph-Veh et Morph-JMV2959).

La préférence en matière de condition a été calculée comme étant la différence en% du temps total passé dans le médicament couplé (c'est à dire. moins préféré) compartiment lors des séances de post-conditionnement et de pré-conditionnement.

Etant donné que JMV2959 atténue la préférence locomotrice induite par la morphine et la préférence de lieu conditionnée chez la souris, on a étudié l'effet de la libération de JVV2959 (6 mg / kg, ip) sur la morphine induite (20 mg / kg, ip) à l'aide de in vivo microdialyse chez des souris en mouvement libre. Pour mesurer les niveaux de dopamine extracellulaire, des souris ont été implantées unilatéralement avec une sonde de microdialyse positionnée dans le noyau accumbens. Par conséquent, les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane (Isofluran Baxter; Unité d'anesthésie Univentor 400, Univentor Ldt., Zejtun, Malte), placées dans un cadre stéréotaxique (David Kopf Instruments; Tujunga, CA, USA) et conservées sur un coussin chauffant pour éviter hypothermie. L'adrénaline xylocaïne (5 μg / ml; Pfizer Inic; New York, États-Unis) a été utilisée comme anesthésique local et le carprofène (Rimadyl, 5 mg / kg ip) (Astra Zeneca; Göteborg, Suède) a été utilisé pour soulager toute douleur éventuelle. L'os du crâne a été exposé et un trou pour la sonde et un pour la vis d'ancrage ont été percés. La sonde a été alternée au hasard du côté gauche ou du côté droit du cerveau. Les coordonnées de 1.5 mm antérieur au bregma, ± 0.7 latéral à la ligne médiane et 4.7 mm sous la surface de la surface du cerveau ont été utilisées pour le noyau accumbens (Franklin et Paxinos, 1997). La pointe exposée de la membrane de dialyse (20,000 kDa coupé avec un od / id de 310 / 220, HOSPAL, Gambro, Lund, Suède) de la sonde était de 1 mm. Toutes les sondes ont été implantées chirurgicalement deux jours avant l'expérience. Après la chirurgie, les souris ont été gardées dans des cages individuelles jusqu'au jour du test (Macrolon III).

Le jour du test, la sonde a été connectée à une pompe à microperfusion (pompe à seringue U-864; AgnThós AB) et perfusée avec une solution de Ringer à une vitesse de 1.5 μl / min. Après une heure d'habituation à la microdialyse, des échantillons de perfusion ont été prélevés toutes les minutes de 20. Le niveau de dopamine de base a été défini comme la moyenne de trois échantillons consécutifs avant la première provocation au médicament / véhicule, et l'augmentation de la dopamine accumbal a été calculée en tant que pourcentage d'augmentation par rapport à la référence. Après les échantillons de base (-40 min à 0 min), on a injecté à des souris JMV2959 ou un véhicule (à 0 min), suivi d'une injection de morphine ou de véhicule (à 20 min.). Suite à ces administrations de médicament, huit autres échantillons de 20 min ont été recueillis. Collectivement les groupes de traitement suivants (n= 8 dans chaque groupe) ont été créés: véhicule – véhicule (Veh – Veh), véhicule – morphine (Veh – Morph), JMV2959-véhicule (JMV2959-Veh) et JMV2959-morphine (JMV2959-Morph).

Les niveaux de dopamine dans les dialysats ont été déterminés par HPLC avec détection électrochimique. Une pompe (Gyncotec P580A; Kovalent AB; V. Frölunda, Suède), une colonne échangeuse d'ions (2.0 × 100 mm, Prodigy 3 µm SA; Skandinaviska GeneTec AB; Kungsbacka, Suède) et un détecteur (Antec Decade; Antec Leade, Antec Leyden; Zoeterway , Pays-Bas) équipés d’une Flow Cell VT-03 (Antec Leyden) ont été utilisés. La phase mobile (pH 5.6), constituée d'acide sulfonique 10 mM, d'acide citrique 200 mM, de citrate de sodium 200 mM, de 10% EDTA et de 30% MeOH, a été filtrée sous vide à l'aide d'un filtre en membrane 0.2 µm (GH Polypro; PALL Gelman Laboratory; Lund, Suède). La phase mobile a été délivrée à un débit de 0.2 ml / min en passant par un dégazeur (Kovalent AB), et l'analyte a été oxydé à + 0.4 V.

Une fois les expériences de microdialyse terminées, les souris ont été décapitées et les sondes ont été perfusées avec de la pontamine 6BX bleu ciel pour faciliter la localisation de la sonde. Les cerveaux ont été montés sur un appareil vibroslice (752 M Vibroslice; Campden Instruments Ltd., Loughborough, Royaume-Uni) et découpés en sections 50 μm. La localisation de la sonde a été déterminée par observation globale à l'aide d'une microscopie optique. La position exacte de la sonde a été vérifiée (Franklin et Paxinos, 1997) et seules les souris avec les placements corrects ont été utilisées dans l'analyse statistique.

Les effets du traitement par JMV2959 sur les niveaux de MEAP, DynB et LeuArg dans les zones liées à la récompense ont été étudiés. Des souris ont reçu une injection de JMV2959 (6 mg / kg, ip, n= 8) ou un volume égal de véhicule (ip, n= 8) pendant cinq jours. 20 min après la dernière injection, les souris ont été sacrifiées et les cerveaux de ces souris ont été recueillis. Des souris séparées ont reçu une injection de ghréline (0.33, mg / kg, ip, n= 8) ou un volume égal de véhicule (ip, n= 8) pendant cinq jours. Cinq minutes après la dernière injection, les souris ont été sacrifiées et les cerveaux de ces souris ont été recueillis. L'amygdale, le striatum, le cortex préfrontal, la VTA et l'hippocampe ont été rapidement disséqués et immédiatement placés sur de la neige carbonique, puis stockés à -80 ° C jusqu'à leur traitement ultérieur.

Les procédures d'homogénéisation et d'extraction de peptides ont suivi une procédure standard, décrite précédemment en détail (Nylander et al., 1997). En bref, de l'acide acétique (95 M) chaud (1 ° C) a été ajouté aux échantillons congelés. Les échantillons ont été chauffés au bain-marie (95 ° C) pendant 5 min, refroidis sur de la glace puis homogénéisés avec un sonificateur Branson (Danbury, CT, USA). L'homogénat a été réchauffé à 95 ° C pendant 5 min et refroidi sur de la glace avant d'être centrifugé à 15 min à 4 ° C et 12,074 ×g dans une centrifugeuse Beckman GS-15R (Fullerton, CA, USA). Les extraits ont été davantage purifiés selon une procédure décrite précédemment (Nylander et al., 1997). Deux fractions ont été recueillies: la fraction III (Leu-Arg et MEAP) et la fraction V (DynB). Les échantillons ont été séchés dans une centrifugeuse sous vide (Savant SpeedVac Plus SC210A; Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, États-Unis) et conservés au congélateur (-20 ° C) jusqu'à l'analyse du peptide.

Les taux immunoréactifs (ir) de DynB, LeuArg et MEAP ont été analysés avec des dosages radioimmunologiques bien établis et les protocoles ont été décrits en détail ailleurs (Nylander et al., 1997). Dans le test DynB, une IgG anti-lapin de chèvre (GARGG; Bachem, Bubendorf, Suisse) a été utilisée pour séparer le peptide libre et lié à l'anticorps. L'antisérum Dyn (113 +) a été utilisé dans une dilution finale de 1: 600000. La réactivité croisée avec big Dyn était de 100% et avec DynB (1 – 29) 1%. Aucune réactivité croisée avec d'autres peptides opioïdes n'a été observée. Dans les tests LeuArg et MEAP, une suspension de charbon a été utilisée pour séparer le peptide libre et le peptide lié à l'anticorps. Pour l'antisérum LeuArg (91: 6D +, dilution finale 1: 60000), la réactivité croisée était inférieure à 0.01% pour la Leu-enképhaline et MEAP, 0.02% pour DynB, 0.04% pour la DynA et 0.08% pour la X-néoendorphine. L'antisérum MEAP 90: 3D (II) a été utilisé dans une dilution finale de 1: 160 000. Réactivité croisée avec la Met-enképhaline, la Met-enképhaline-Arg⁶, Met-enkephalin-Arg⁶Gly⁷Leo⁸, Leu-enképhaline et Leu-enképhaline-Arg⁶ était <0.1%

Un effet principal global du traitement a été trouvé sur l'activité locomotrice chez les souris après l'administration systémique de morphine (20 mg / kg) et de JMV2959 (6 mg / kg) (F (3,27) = 7.409, P= 0.0009; n= 8 pour Veh – Veh, JMV2959-Veh, JMV2959-Morph et n= 7 pour Veh-Morph). Comme représenté sur la Figure 1Une analyse post-thoc a révélé que le pré-traitement avec une seule injection de JMV2959 (P<0.001) a atténué significativement la stimulation locomotrice induite par la morphine (P<0.01 Veh – Veh vs Veh-Morph). La dose sélectionnée de JMV2959 n’a eu aucun effet sur l’activité locomotrice par rapport au traitement par véhicule (P> 0.05). Il n'y avait aucune différence dans la réponse de l'activité locomotrice chez les souris traitées avec le véhicule et les souris traitées par JMV2959-morhpine (P> 0.05).

  

Figure 1

JMV1, un antagoniste de GHS-R2959A, atténue la stimulation locomotrice induite par la morphine, la libération de dopamine accumbal et la préférence de place conditionnée chez la souris. (A) La stimulation locomotrice induite par la morphine (20 mg / kg ip) a été atténuée par une injection unique de JMV2959 (6 mg / kg ip) (n= 7 – 8 dans chaque groupe; **P<0.01, ***P<0.001 ANOVA à un facteur suivi d'un test post-hoc de Bonferroni). (B) La préférence de lieu (CPP) condition induite par la morphine (20 mg / kg ip) a été atténuée par une injection unique aiguë de JMV2959 (6 mg / kg ip) chez la souris (n= 8 dans chaque groupe, *P<0.05, test t non apparié). (C) Tout d'abord, nous avons démontré un effet significatif de la morphine (20 mg / kg ip) pour augmenter la libération de dopamine par rapport au traitement par véhicule (intervalle de temps 40-180 min (P<0.001), Veh – Veh vs Veh-Morph). Comme indiqué dans (C), le prétraitement avec JMV2959 (6 mg / kg ip) a atténué l'augmentation de la libération de dopamine induite par la morphine par rapport au prétraitement du véhicule à l'intervalle de temps 40 – 100 et 140 – 180 min (^##P<0.01, ^###P <0.001, JMV2959-Morph par rapport au traitement Veh-Morph). La dose sélectionnée de JMV2959 n'a eu aucun effet significatif sur la libération de dopamine accombale par rapport au traitement par véhicule à tout intervalle de temps (P> 0.05, Veh – Veh vs JMV2959-Veh). JMV2959 a réduit, sans toutefois le bloquer complètement, la libération de dopamine accumale induite par la morphine à un intervalle de temps 60-140 (*P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001, JMV2959-Morph par rapport au traitement Veh-Morph). Les flèches représentent les moments d'injection de JMV2959, de véhicule et de morphine. Données analysées avec une ANOVA bidirectionnelle suivie d'un test post-hoc de Bonferroni (n= 8 dans chaque groupe). Veh – Veh (carré), Veh – Morph (losange), JMV2959-Veh (Triangle), JMV2959-Morph (cercle). Toutes les valeurs représentent la moyenne ± SEM.

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La préférence de lieu conditionnée induite par la morphine (20 mg / kg) (Morph – Veh) a été significativement atténuée par une injection unique aiguë de JMV2959 (6 mg / kg) (Morph-JMV2959) le jour suivant le conditionnement (P= 0.025, n= 8 dans chaque groupe; Figure 1B).

Les mesures de dopamine effectuées par la microdialyse accumbale chez la souris ont révélé un effet principal global du traitement (F(3,33) = 24.15, P<0.0001), heure F(11,308) = 7.05, P<0.0001) et interaction traitement × temps (F(11,308) = 8.63, P<0.0001) (Figure 1C; n= 8 dans chaque groupe). La morphine a entraîné une augmentation de la libération de dopamine dans l’accumulateur par rapport au traitement avec le véhicule à un intervalle de temps 40 – 180 min (P<0.001). Comme représenté sur la Figure 1C cet effet a été réduit par le prétraitement avec JMV2959 à l’intervalle de temps 40 – 80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) et 160 à 180 min (P<0.001). JMV2959 a réduit, mais n'a pas complètement bloqué, la libération de dopamine accombale induite par la morphine car il y avait une différence entre le traitement par véhicule et le traitement par JMV2959-morphine à l'intervalle de temps 60–80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) et 160 min (P<0.05). La dose sélectionnée de JMV2959 n'a eu aucun effet significatif sur la libération de dopamine accumbale par rapport au traitement par véhicule à tout intervalle de temps (P> 0.05).

La présente étude confirme en outre l'hypothèse selon laquelle le rôle physiologique du peptide orexigénique comprend la régulation de la récompense. En effet, nous avons montré que l’administration périphérique d’un antagoniste du GHS-R1A atténue la capacité de la morphine à provoquer une stimulation locomotrice, à augmenter les taux de dopamine dans le NAc et à induire une préférence d’emplacement conditionné chez la souris. Nous avons également constaté que le traitement subchronique à JMV2959, mais pas à la ghréline, augmentait les niveaux tissulaires de MEAP dans la VTA, DynB dans l'hippocampe et LeuArg dans le striatum, fournissant la première preuve que la capacité de la ghréline à réguler le renforcement peut impliquer des peptides opioïdes .

Les données présentées ici montrent que l'antagonisme du GHS-R1A affecte la capacité de la morphine à activer le système dopaminergique mésolimbique chez la souris. En accord, les résultats montrent que JMV2959 bloque la capacité de la morphine à augmenter les niveaux extracellulaires de dopamine accombale et à provoquer un comportement stéréotypé chez le rat (Sustkova-Fiserova et al., 2014). De manière positive, l'administration centrale de ghréline augmente le point de rupture, mais pas le nombre de pressions à levier actives, dans le calendrier de renforcement du rapport progressif chez les rats auto-administrant de l'héroïne (Maric et al., 2012). L'affirmation selon laquelle la signalisation de la ghréline sous-tend la toxicomanie est en outre étayée par les résultats montrant que JMV2959 réduit l'apport ainsi que la motivation à consommer de l'alcool chez les rats et que la récompense induite par les amphétamines, la cocaïne et la nicotine est bloquée par l'antagonisme du GHS-R1A chez les rongeurs ( pour un examen, voir Engel et Jerlhag (2014)) et que les polymorphismes dans les gènes liés à la ghréline sont associés à la consommation d'alcool, de tabagisme et d'amphétamine (pour examen, voir Engel et Jerlhag (2014)).

Les présents résultats avec l'augmentation des niveaux de peptides opioïdes dans le striatum, la VTA et l'hippocampe après un traitement subchronique à JMV2959 suggèrent pour la première fois des interactions entre les peptides opioïdes et la signalisation de la ghréline. Les opioïdes endogènes sont impliqués dans les effets gratifiants, non seulement induits par les opioïdes, mais aussi par d'autres drogues d'abus et de récompenses naturelles, ainsi que dans les processus d'adaptation observés après une exposition répétée à la drogue (Trigo et al., 2010, Van Ree et al., 2000). En effet, l'activité du système dopaminergique mésolimbique est régulée par les opioïdes endogènes au niveau de la VTA et de la NAc (Hirose et al., 2005, Spanagel et al., 1992) et les actions se sont avérées directes ou indirectes. par la modulation d’autres émetteurs (Charbogne et al., 2014).

Nous avons trouvé ici que le traitement subchronique par JMV2959 augmentait les niveaux de MEAP dans la VTA. La MEAP est exclusivement dérivée de la proenképhaline et a été utilisée comme marqueur des peptides de la proenképhaline qui activent principalement les récepteurs δ-opioïdes. Nous émettons l'hypothèse que les niveaux accrus de MEAP endogène dans la VTA après le traitement par JMV2959 pourraient empêcher la morphine de diminuer l'inhibition par le GABA des neurones dopaminergiques mésoaccumbaux (Johnson and North, 1992), ce qui pourrait contribuer à la réduction des effets induits par la morphine observés après JMV2959. En support, les GHS-R1A sont situés sur les interneurones GABAergiques dans la VTA (Abizaid et al., 2006). En outre, des études antérieures ont montré que la perfusion intra-VTA de JMV2959, via des mécanismes inconnus, atténue la récompense induite par la ghréline (Jerlhag et al., 2011) ainsi que la consommation de saccharose médiée par la ghréline chez les rongeurs (Skibicka et 2011), suggèrent que le tegmental ventral GHS-R1A est important pour la régulation de la récompense. À l'appui d'une telle affirmation, les résultats montrent que d'autres peptides régulant la faim, tels que la galanine et l'orexine, assurent la médiation des propriétés enrichissantes de la morphine. via mécanismes locaux au sein de la VTA (Narita et al., 2006, Richardson et Aston-Jones, 2012).

Dans le striatum, nous avons constaté que JMV2959 subchronique augmentait les taux d'IR de LeuArg, ce qui suggère que la capacité de JMV2959 d'atténuer les préférences de lieu conditionnées induites par la morphine, la libération de dopamine et la stimulation locomotrice dépend, au moins en partie, d'une augmentation de la δ- activité des récepteurs opioïdes. Des taux accrus de LeuArg peuvent résulter d'une conversion enzymatique accrue de peptides de dynorphine en enképhalines ou d'une libération accrue de Dyn dans le NAc en réponse à une augmentation de la dopamine, suivie d'une dégradation en LeuArg. Des études antérieures ont montré que l’activité du système dopaminergique mésolimbique est régulée via Les récepteurs κ-opioïdes dans la NAc (Spanagel et al., 1992) et les récepteurs κ-opioïdes endogènes procurent une inhibition tonique de la neurotransmission de la dopamine mésoaccumbal et atténuent la libération de dopamine induite par la cocaïne dans la NAc (Chefer et al., 2005), nous n'avons pas montrer que JMV2959 modifie les niveaux de DynB dans le striatum. Par conséquent, des études supplémentaires sont justifiées sur les peptides prodynorphines pour élucider les interactions entre l'antagonisme GHS-R1A et les dynorphines.

Dans la présente étude, nous avons également montré que le traitement par JMV2959 augmentait de manière significative les niveaux de DynB dans l'hippocampe. La ghréline augmente la consolidation de la mémoire ainsi que la formation d'épines dendritiques, génère une potentialisation à long terme et favorise la facilitation de la mémoire via hippocampe GHS-R1A chez les rongeurs (Carlini et al., 2010, Diano et al., 2006). De plus, les souris knock-out GHS-R1A affichent une mémoire spatiale améliorée dans le test du labyrinthe d’eau de Morris et une mémoire contextuelle perturbée dans le paradigme du conditionnement de la peur par rapport aux souris de type sauvage (Albarran-Zeckler et al., 2012). Les peptides de Dynorphin, y compris DynB, sont abondants dans l'hippocampe et atténuent la potentialisation à long terme (Chavkin et al., 1985, Wagner et al., 1993) et nuisent à l'apprentissage spatial chez le rat (Sandin et al., 1998). Nous émettons donc l’hypothèse que l’antagoniste de GHR-R1A pourrait atténuer la mémoire de la récompense en inhibant la potentialisation à long terme de l’hippocampe. via activation de DynB. Ensemble, ces données fournissent un nouveau mécanisme potentiel par lequel JMV2959 via Les peptides opioïdes peuvent altérer le renforcement. Cependant, les récepteurs opioïdes sont largement distribués dans le cerveau, ce qui suggère que d'autres régions, non incluses dans la présente étude, pourraient être impliquées dans la récompense induite par la morphine régulée par GHS-R1A. Par exemple, la prise alimentaire induite par la ghréline ainsi que la pression sur le levier pour le saccharose sont réduites par l'administration centrale ou intra-hypothalamique d'un antagoniste des récepteurs opioïdes κ (Romero-Pico et al., 2013). Cependant, le rôle des peptides opioïdes dans d'autres domaines doit être élucidé dans les prochaines études.

Les ligands endogènes du récepteur μ, les endomorphines et la bêta-endorphine, n'ont pas été analysés ici. Nous ne pouvons donc pas exclure un effet possible de JMV2959 sur ces peptides. En effet, les propriétés enrichissantes de la morphine impliquent des récepteurs µ-opioïdes dans la VTA ainsi que dans le NAc (Hirose et al., 2005, Johnson et North, 1992, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999). Cependant, un antagoniste des récepteurs μ n'atténue pas la prise alimentaire induite par la ghréline (Naleid et al., 2005) ni la stimulation locomotrice induite par la ghréline et la libération de dopamine accumbal (Jerlhag et al., 2011), ce qui implique que le GHSR est capable L'antagoniste de 1A pour réguler le renforcement n'inclut pas les récepteurs μ. D'autre part, JMV2959 a effectivement affecté des peptides opioïdes dérivés de la proenképhaline et de la prodynorphine, ce qui montre qu'ils peuvent être impliqués dans les effets induits par les antagonistes de GHSR-1A.

Bien que des études antérieures aient montré que l’administration systémique de ghréline génèrerait des avantages (Jerlhag, 2008) et renforcerait les propriétés gratifiantes des médicaments entraînant une dépendance (voir Engel et Jerlhag (2014)), nous montrons ici que le traitement subchronique à la ghréline n’altère les niveaux tissulaires de peptides opioïdes dans l’un des domaines liés à la récompense étudiés. L'administration systémique de ghréline active l'expression de c-fos dans les zones hypothalamiques, mais pas dans les zones mésolimbiques et hippocampiques (Pirnik et al., 2011) et la liaison de la ghréline marquée par fluorescence est limitée aux neurones régulateurs de l'alimentation de l'hypothalamus (Schaeffer et al., 2013) ). Considéré conjointement avec les résultats montrant que la ghréline, à l’exception de traces dans l’hypothalamus, ne peut pas être détectée dans les zones cérébrales plus profondes après l’administration de ghréline périphérique (Furness et al., 2011, Grouselle et al., 2008, Sakata et al., 2009 ), soulève la possibilité que la ghréline systémique active le système de récompense via mécanismes indirects indépendants des opioïdes endogènes. La libération de dopamine accumbale induite par la ghréline nécessite une signalisation hypothalamique orexigène en amont (Cone et al., 2014), l'administration de ghréline périphérique ne modifie pas la consommation d'alcool chez la souris (Lyons et al., 2008) et la neutralisation de ghréline périphérique n'altère pas l'alcool -induite chez les souris ou consommation d’alcool chez le rat (Jerlhag et al., sous presse). La possibilité que l'administration subchronique de ghréline augmente les niveaux tissulaires de peptides opioïdes doit être envisagée, mais ceci devra être étudié en détail dans les études à venir.

La capacité des drogues addictives à provoquer la stimulation, la libération de dopamine et à induire une préférence de lieu conditionnée est intimement associée aux propriétés renforçantes des drogues addictives et ces paramètres sont considérés comme faisant partie du processus de dépendance (Wise, 2004). Étant donné que nous avons constaté ici que JMV2959 atténue ces paramètres de récompense chez la souris, nous émettons l'hypothèse que le GHS-R1A pourrait jouer un rôle important dans les processus de toxicomanie et que des opioïdes endogènes sont impliqués dans ces processus. Ensemble, ces données indiquent que les antagonistes de GHS-R1A doivent être élucidés en tant que traitement de la toxicomanie.

JE et EJ sont soutenus par des subventions du Conseil suédois de la recherche (subvention n ° 2011-4646, 2009-2782 et 2011-4819), la fondation suédoise du cerveau, LUA / ALF (subvention n ° 148251) de l'hôpital universitaire Sahlgrenska, Alcohol conseil de recherche du monopole suédois de la vente au détail d’alcool et des fondations d’Adlerbertska, Fredrik et Ingrid Thuring, de Tore Nilsson, de Längmanska, de Torsten et de Ragnar Söderberg, de Wilhelm et de Martina Lundgren, de NovoNordisk, de Knut et d’Alice Wallenberg, de Magnus Bergvall, d’AnERs, de Jeansons et d'Åke Wiberg , Société suédoise de médecine, Société suédoise de recherche médicale et Fondation de recherche en psychiatrie de Göteborg. Conseil de recherche sur l'alcool du monopole suédois de vente au détail d'alcool et le Conseil de recherche suédois (K2012-61X-22090-01-3) soutenu par IN. Les sources de financement n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, dans la collecte, l'analyse et l'interprétation des données, dans la rédaction du rapport et dans la décision de publication des données.