Psychiatrie avant. 2018; 9: 81.
Publié en ligne 2018 Mar 12. est ce que je: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Yae Eun Park,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* ainsi que Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Abstract
Contexte
L'utilisation addictive d'Internet et des jeux en ligne est un trouble psychiatrique potentiel appelé trouble du jeu sur Internet (IGD). Des profils d'expression altérés de microARN (miARN) ont été rapportés dans le sang et les tissus cérébraux de patients atteints de certains troubles psychiatriques et ont été suggérés comme biomarqueurs. Cependant, aucun profil de miARN dans le sang n'a été signalé.
Méthodologie
Pour découvrir les miARN associés à IGD, nous avons analysé les profils d'expression miARN des échantillons 51 (contrôles 25 IGD et 26) à l'aide du réseau miRNA basse densité TaqMan. Pour la validation, nous avons effectué une PCR de transcription inverse quantitative avec des échantillons indépendants de 36 (contrôles 20 IGD et 16).
Résultats
Grâce à la découverte et à une validation indépendante, nous avons identifié trois miARN (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p), qui ont été considérablement régulés à la baisse dans le groupe IGD. Les personnes présentant les trois altérations du miARN présentaient un risque beaucoup plus élevé d'IGD que les personnes ne présentant aucune altération [odds ratio (OR) 22, 95% CI 2.29 – 211.11] et les OR augmentaient en fonction de la dose avec le nombre de miARN modifiés. Les gènes cibles prédits des trois miARN ont été associés à des voies neuronales. Nous avons exploré l'expression des protéines des trois gènes cibles en aval par Western blot et avons confirmé que l'expression de GABRB2 et de DPYSL2 était significativement plus élevée dans le groupe IGD.
Conclusion
Nous avons observé que les expressions de hsa-miR-200c-3p, de hsa-miR-26b-5p et de hsa-miR-652-3p étaient régulées négativement chez les patients IGD. Nos résultats seront utiles pour comprendre la physiopathologie de l'IGD.
Introduction
L’utilisation abusive d’Internet et de jeux Internet n’est pas seulement un phénomène social dans les pays dotés d’une infrastructure d’accès Internet étendue, mais aussi un trouble psychiatrique potentiel appelé trouble du jeu sur Internet (IGD) (1-3). Selon les rapports épidémiologiques, les taux de prévalence de l'IGD chez les adolescents varient d'un pays à l'autre, allant de 0.8 à 26.7% (4). Des études ont notamment montré des taux de prévalence supérieurs à 10% chez les adolescents dans de nombreux pays asiatiques tels que la Corée du Sud, la Chine, Taiwan, Hong Kong et Singapour (4). L'IGD est associé à des troubles de la cognition, des relations psychosociales et de la vie quotidienne. par exemple, la baisse des résultats scolaires ou professionnels (4-7). L’IGD est maintenant inclus dans la Section III (Conditions d’approfondissement) de la cinquième révision du Manuel diagnostique et statistique des troubles mentaux (DSM-V) (8). Cependant, malgré son importance clinico-sociale, le mécanisme génétique moléculaire à l'origine de l'IGD est mal connu.
Des études récentes sur des jumeaux à grande échelle ont suggéré un fond génétique à IGD (9, 10). Vink et al. ont étudié les différences individuelles dans l'utilisation compulsive d'Internet avec des jumeaux adolescents monozygotes et dizygotes 5,247 dans le registre néerlandais, et ont indiqué que 48% des différences étaient expliquées par des facteurs génétiques (9). Li et al. couples 825 observés de jumeaux adolescents chinois et ont indiqué que des facteurs génétiques expliquaient 58 – 66% des différences (10). En conséquence, les polymorphismes des gènes impliqués dans la neurotransmission, la cognition et l’attention, tels que le gène D2 du récepteur de la dopamine (DRD2), gène de la catécholamine-O-méthyltransférase (COMT), gène du transporteur de la sérotonine (5HTTLPR) et le gène alpha 4 des récepteurs nicotiniques cholinergiques (CHRNA4) ont été associés de manière significative à la dépendance à Internet (11-13). Récemment, Kim et al. variants sélectionnés de plus de 100 candidats gènes liés à la production, l'action et le métabolisme des neurotransmetteurs par la prochaine génération d'analyse de séquençage et a rapporté que rs2229910 de NTRK3 le gène est associé à IGD (14).
Outre les facteurs génétiques, il est également bien connu que les phénotypes neurocomportementaux sont contrôlés épigénétiquement par des ARN non codants, y compris des micro-ARN (miARN) (15, 16). Les miARN sont de petites molécules d'ARN simple brin non codantes (longueur d'environ la longueur des nucléotides 20 – 23), qui régulent négativement l'expression de gènes codant pour les protéines en dégradant les ARNm et jouent un rôle essentiel dans le processus physiopathologique de diverses maladies (17). Des éléments de preuve ont démontré que les miARN sont abondants dans le système nerveux humain et agissent pour ajuster les niveaux d’expression de leurs gènes cibles, qui sont impliqués dans le développement et la maturation du système nerveux central (15). En effet, des études récentes ont révélé que les profils d'expression des miARN sont modifiés dans les tissus cérébraux de patients atteints de troubles psychiatriques, ce qui suggère que leurs profils d'expression pourraient être des biomarqueurs des troubles psychiatriques (15, 16, 18). Par exemple, par l’analyse post mortem, Lopez et al. ont rapporté que l’expression de miR-1202, qui régule l’expression du gène 4 du récepteur métabotropique du glutamate et prédit la réponse aux antidépresseurs, a été régulée négativement dans les tissus du cortex préfrontal de patients atteints de dépression majeure (19). En termes de dépistage de biomarqueurs, cette approche a une limitation claire car il est impossible de réaliser une biopsie de tissu du SNC pour le dépistage. Puisque les miARN peuvent être détectés dans le sang (plasma ou sérum), les miARN en circulation ont un avantage certain en tant que biomarqueurs non invasifs dans les troubles neuropsychiatriques. Cependant, à ce jour, aucune étude n'a été réalisée sur les profils de miARN en circulation dans l'IGD. Une meilleure compréhension des profils d'expression des miARN en circulation pourrait aider à clarifier le mécanisme de développement de l'IGD et à faciliter la traduction clinique.
Dans cette étude, nous avons cherché à identifier les marqueurs miARN associés à l'IGD en observant des miARN plasmatiques différentiellement exprimés entre les groupes IGD et témoins et à en explorer les implications biologiques.
Matériels et méthodes
Sujets d'étude
Nous avons interrogé des adolescents 3,166 (âgés de 12 – 18) utilisant la notation DSM-V IGD. Parmi eux, 251 (hommes 168 et femmes 83) a été diagnostiqué comme IGD selon les critères du DSM-V (8). Un total d'individus 91 (contrôles 49 IGD et 42) ont fourni le consentement éclairé pour cette étude. Parmi eux, quatre personnes ont été exclues selon les critères d'exclusion. Enfin, des individus 87 (sujets 45 IGD et individus contrôles sains 42) ont été recrutés pour cette étude. Parmi eux, les participants 51 (patients 25 IGD et contrôles 26) ont été recrutés comme ensemble de découverte de 2014 à 2016. Les autres participants à 36 (patients 20 IGD et contrôles 16) ont été recrutés en tant que groupe de validation indépendant de 2016. Tous les participants étaient des Coréens inscrits à l'hôpital St. Mary's de Séoul (Séoul, Corée du Sud) et à l'hôpital national Boramae de l'Université nationale de Séoul (Séoul, Corée du Sud). Tous les participants ont passé un entretien structuré avec un psychiatre, conformément au programme coréen Kiddie pour les troubles affectifs et la schizophrénie (K-SADS-PL) (20). Tous les participants ont participé aux sous-tests de conception de bloc et de vocabulaire de la balance d'intelligence coréenne-Wechsler pour enfants, 4e édition (K-WISC-IV) (21). L’impulsivité a été évaluée par l’échelle Barratt Impulsiveness Scale (BIS) (22). Le système d'inhibition du comportement (BInS) et le système d'activation du comportement (BAS) ont été mesurés pour évaluer la dimension de la personnalité (23). Les critères d’exclusion comprenaient les troubles médicaux majeurs passés ou actuels (par exemple, diabète sucré), les troubles neurologiques (par exemple crises d'épilepsie, blessures à la tête), les troubles psychiatriques (par exemple, trouble dépressif majeur, troubles anxieux), les retards mentaux ou toute toxicomanie (par exemple , tabac, cannabis, alcool). Les caractéristiques générales des sujets d'étude sont résumées dans le tableau Table1.1. Cette étude a été approuvée par le Comité d’étude institutionnelle du Collège universitaire médical de Corée (MC16SISI0120). Tous les participants et leurs parents ont donné leur consentement écrit.
Tableau 1
Caractéristiques générales des sujets d'étude.
| Découverte | Validation | Combiné | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Control | IGD | P-valeur | Control | IGD | P-valeur | Control | IGD | P-valeur | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Années d'âge) | |||||||||
| Médiane (min – max) | 13 (12 – 17) | 13 (12 – 15) | 0.759 | 15 (13 – 18) | 14.5 (12 – 18) | 0.628 | 14 (12 – 18) | 14 (12 – 18) | 0.509 |
| Heures hebdomadaires de jeu sur Internet (h) | |||||||||
| Médiane (min – max) | 5.25 (2 – 17) | 18 (6 – 46) | 1.27E − 6a | 5.5 (2 – 23) | 8 (1 – 112) | 0.374 | 5.5 (2 – 23) | 14 (1 – 112) | 1.63E − 5a |
| Revenu mensuel du ménage (millions KRW) | |||||||||
| Médiane (min – max) | 5 (1 – 9) | 3 (1 – 9) | 0.588 | 4 (4 – 4) | 2 (2 – 2) | 1.000 | 5 (1 – 9) | 3 (1 – 9) | 0.460 |
| Education (années) | |||||||||
| Médiane (min – max) | 8 (7 – 9) | 8 (7 – 9) | 0.584 | 12 (12 – 12) | 6 (6 – 13) | 0.305 | 8 (7 – 12) | 8 (6 – 13) | 0.269 |
| K-WISC: Conception de blocs | |||||||||
| Médiane (min – max) | 10.5 (4 – 17) | 10 (4 – 16) | 0.544 | 10 (3 – 16) | 12.5 (4 – 15) | 0.125 | 10 (3 – 17) | 11 (4 – 16) | 0.598 |
| K-WISC: vocabulaire | |||||||||
| Médiane (min – max) | 9 (5 – 17) | 7 (5 – 13) | 0.174 | 9.5 (8 – 15) | 11.5 (5 – 15) | 0.595 | 9 (5 – 17) | 9 (5 – 15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Médiane (min – max) | 24 (17 – 36) | 37 (22 – 51) | 3.81E − 6a | 29 (17 – 34) | 59 (22 – 108) | 1.2E − 5a | 25 (17 – 36) | 40 (22 – 108) | 2.05E − 10a |
| BIS | |||||||||
| Médiane (min – max) | 63 (35 – 75) | 67.5 (45 – 81) | 0.080 | 61 (45 – 79) | 63 (32 – 82) | 0.835 | 62 (35 – 79) | 65 (32 – 82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Médiane (min – max) | 31 (15 – 40) | 31 (13 – 51) | 0.558 | 36.5 (22 – 48) | 34 (27 – 52) | 1.000 | 32 (15 – 48) | 34 (13 – 52) | 0.637 |
| Bacs | |||||||||
| Médiane (min – max) | 18 (10 – 26) | 17.5 (13 – 27) | 0.642 | 18.5 (12 – 25) | 20 (13 – 21) | 0.138 | 18 (10 – 26) | 19 (13 – 27) | 0.302 |
IGD, patients souffrant de troubles du jeu sur Internet; KS, échelle coréenne de prédiction de la dépendance à Internet; BIS, échelle d'impulsion de Barratt; BAS, système d'activation comportementale; BInS, Système d'inhibition comportementale; KRW, Won Coréen.
aP <0.05 (test de Mann – Whitney – Wilcoxon).
Expériences sur les matrices de miARN à faible densité (TLDA) TaqMan
Le sang périphérique a été prélevé sur chaque participant et transféré au laboratoire dans 4h pour minimiser la lyse des cellules sanguines. L'échantillon a été centrifugé à 3,000 tr / min pendant 10 min à la température ambiante. Ensuite, le surnageant (couche de plasma) a été recueilli sans contaminer les cellules sanguines. Les miARN circulants ont été extraits à l'aide du kit de purification TaqMan miARN ABC (panel humain A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) conformément aux instructions du fabricant. En résumé, les µN de 50 de l’échantillon de plasma et les µL de 100 du tampon ABC ont été mélangés. Après hybridation avec des billes magnétiques anti-miARN spécifiques de la cible, des miARN circulants liés ont été élues des billes avec 100 µL de tampon d'élution. Au cours de la phase de découverte, les miARN 381 ont été examinés à partir d'échantillons plasmatiques 51 (contrôles 25 IGD et 26) à l'aide du kit de purification TaqMan miARN ABC (panel A humain; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) conformément aux instructions du fabricant. Des réactions de transcription inverse et de pré-amplification Megaplex ont été effectuées pour augmenter la quantité d'ADNc pour l'analyse de l'expression de miARN à l'aide d'amorces MegaplexPreAmp Human Pool A et de Master Mix TaqManPreAmp (Thermo Fisher Scientific). Le panel TLDA A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé sur le système de PCR en temps réel ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) pour évaluer l'expression des miARN. Les données brutes ont été traitées à l'aide du logiciel ExpressionSuite v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) pour déterminer les valeurs de Ct pour chaque miARN.
Analyse de données pour TLDA
Nous avons d'abord mesuré les cycles de seuil (valeur Ct) de chaque miARN. Les miARN avec une valeur Ct> 35 ont été considérés comme indétectables et exclus de l'analyse ultérieure. Toutes les valeurs Ct ont été normalisées à la valeur Ct de miR-374b (valeur ΔCt), l'un des miARN exprimés de la manière la plus stable circulant dans le plasma humain (24). Un taux de changement de pli log2 (valeur ΔΔCt) d'expression a été calculé en utilisant les valeurs moyennes des échantillons de contrôle comme étalonneur dans le package HTqPCR dans le bioconducteur (25). La quantification relative (QR) de chaque cible de miARN a été définie comme 2−ΔΔCt. Pour tester de manière hypothétique la différence d’expression entre deux groupes, nous avons appliqué l’analyse par variable de substitution (SVA) pour capturer des hétérogénéités telles que les effets de lot dans les expériences utilisant la méthode de chaque paquet en bioconducteur (26). miARN avec un P-valeur <0.05 ont été considérés comme significativement différents entre deux groupes.
Analyse d'enrichissement d'ensembles de gènes
Pour l’analyse d’enrichissement en jeux de gènes, nous avons utilisé ToppFun dans ToppGene Suite (27) pour déduire une ontologie enrichie de manière significative (GO) (28) termes, filière et termes de maladie. Pour cette approche, nous avons utilisé les gènes cibles prédits par 1,230 des miARN candidats. L'analyse de la voie a été utilisée pour trouver des voies significatives des gènes cibles prédits selon les voies de KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP et MSigDBin de ToppGene. L’importance des termes d’enrichissement fonctionnel a été déterminée à partir de la valeur corrigée de Bonferroni. P-valeur.
Validation et réplication quantitatives de la PCR quantitative (qRT-PCR)
Pour valider les miARN de 10 qui étaient exprimés de manière différentielle au stade de la découverte, la PCR qRT a été réalisée à l'aide du dosage TaqMan MicroRNA (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407p, #29-mi 3; miR-000413b-125p, #5; miR-000449c-200p, #3; miR-002300, #337; xRXX -5p, #002156; et miR-411-5p, #001610) et le système ViiA423 (Life Technologies) conformément au protocole du fabricant. Dix nanogrammes d'ARN total ont été convertis en ADNc du premier brin avec des amorces spécifiques de miARN à l'aide du kit de transcription inverse TaqMan MicroRNA (#5, Life Technologies), suivi d'une PCR en temps réel avec des sondes TaqMan. Le QR de chaque miARN a été défini comme 002340−ΔCt, où ΔCt est la différence de cycles de seuil pour l'échantillon en question, normalisé par rapport au miARN endogène (miR-374b-5p, #001319). Toutes les réactions de PCR ont été effectuées en triple, et leurs valeurs de Ct ont été moyennées. Nous avons calculé un taux de changement de pli log2 (ΔΔCt) de chaque miARN de la même manière que dans l'analyse basée sur les matrices. Un test non paramétrique de Mann – Whitney – Wilcoxon a été réalisé pour tester les différences de niveaux d'expression des miARN dans deux groupes avec un seuil P-valeur de 0.05.
Analyse Western Blot
Chaque échantillon de sérum a d'abord été vidé des protéines 14 les plus abondantes (albumine, immunoglobuline G, immunoglobuline A, sérotransferrine, haptoglobine, alpha-1 antitrypsine, fibrinogène, alpha-2 macroglobuline, alpha-1, glycoprotéine acide, immunoglobuline). , apolipoprotéine A-II, complément C3 et transthyrétine) en utilisant la colonne MARS-14 (4.6 × 50, mm, Agilent Technology, Santa Clara, Californie, USA) avant l’analyse par transfert Western. La fraction non liée obtenue à partir de la colonne MARS-14 a été concentrée en utilisant un filtre centrifuge Amicon Ultracel-3 (seuil 3 kDa), puis la concentration en protéine a été déterminée en utilisant le procédé à l'acide bicinchoninique. Les mêmes quantités (de 10 à 30 µg) d'échantillons de sérum de contrôle et d'IGD ont été séparées sur un gel préfabriqué 4 – 20% Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, CA, USA) et transférées sur une membrane de polyvinylidène difluorure. Ensuite, la membrane a été bloquée dans du TBS-T (190 mM NaCl, 25 mM Tris – HCl, pH 7.5 et 0.05% Tween 20) avec du lait en poudre écrémé 5% à la température ambiante pendant 30 min. Les membranes ont ensuite été incubées avec des anticorps primaires dirigés contre DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, États-Unis), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, Massachusetts, États-Unis) et CNR1 (1: 100, XENUM Biotechnology). , Inc., Santa Cruz, Californie, États-Unis), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, Californie, États-Unis) et PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, Californie, États-Unis) au TBS-T avec 5 % de lait sec écrémé à 4 ° C pendant la nuit, puis avec des anticorps secondaires appropriés, anti-souris bovines (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) ou anti-lapin de chèvre (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, États-Unis ) conjugué à la peroxydase de raifort à la température ambiante pour 1 h. La détection du signal a été réalisée en utilisant une chimioluminescence avec le réactif ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Nous avons quantifié les résultats du transfert Western en utilisant le logiciel d'analyse TotalLab 1D (Non-linear linear, Newcastle upon Tyne, Royaume-Uni). Ensuite, la valeur du ratio densitométrie a été calculée en divisant la valeur densitométrique de chaque échantillon comme décrit par ailleurs (29). Pour contrôler la normalisation, un échantillon de sérum constitué d'un échantillon de 46 IGD et d'échantillons de contrôle a été utilisé pour chaque expérience. La signification statistique a été déterminée en utilisant un test non paramétrique de Mann – Whitney – Wilcoxon avec un seuil P-valeur de 0.05.
Résultats
Caractéristiques des sujets d'étude
Les caractéristiques démographiques et cliniques des sujets de l’étude sont présentées au tableau Table1.1. Lorsque nous avons comparé les groupes IGD et les groupes de contrôle selon l’échelle coréenne de prédiction de la toxicomanie sur Internet (K-Scale) comme décrit ailleurs (20, 30), le groupe IGD présentait une valeur médiane d’échelle K nettement supérieure au groupe témoin (37 par rapport à 24, 2006). P = 3.81 × 10-6) (Table (Table1) .1). Le temps hebdomadaire médian consacré aux jeux sur Internet dans le groupe IGD était nettement plus long que celui des témoins (18 vs 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Alors qu'il n'y avait pas de différence significative entre les deux groupes en termes d'âge, le revenu mensuel du ménage, la durée de l'éducation, la conception des blocs et le sous-test de vocabulaire, les résultats du K-WISC, du BIS, du BInS et du BAS.
MiARN exprimés différentiellement entre IGD et contrôles
Pour découvrir les miARN associés à IGD, nous avons adopté une approche en deux étapes (découverte et validation indépendante). La conception de l'étude et la stratégie globale sont illustrées à la figure S1 dans la documentation supplémentaire. Au cours de la phase de découverte, nous avons analysé les profils d’expression des miRNA d’échantillons 51 (contrôles 25 IGD et 26) à l’aide de la matrice miARN contenant les miARN 384. Les niveaux d’expression des miARN 10 étaient significativement différents entre le groupe IGD et le groupe témoin (Tableau (Table2) .2). Les niveaux d'expression relatifs de ces miARN 10 sont illustrés à la figure Figure1.1. Parmi eux, deux (hsa-miR-423-5p et hsa-miR-483-5p) ont été régulés à la hausse et huit autres (hsa-miR-15b, hsa-miR-5b, xa hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-125c-5p, hsa-miR-200-3p, et hsa-miR-337c, hsa-miR-5c, ont été diminués dans la pénalité.
Tableau 2
MicroARN exprimés différentiellement (miARN) et changements de plis.
| miARN | Découverte | Validation | Combiné | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-valeur | Changement de pli | P-valeur | Changement de pli | P-valeur | Changement de pli | |
| hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
ales miARN modifiés de manière cohérente dans les ensembles de découverte et de validation.
Validation qRT-PCR des miARN candidats
Pour valider les miARN candidats 10, nous avons effectué qRT-PCR avec un ensemble de validation indépendant (contrôles 20 IGD et 16) (tableau S1 dans les informations supplémentaires). Trois de ces miARN (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p et hsa-miR-652-3p) ont été considérablement sous-régulés dans le groupe IGD de l'ensemble de validation (Tableau (Table2) .2). Trois autres miARN (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b et hsa-miR-423-5p) ont également été sous-régulés dans le groupe IGD mais de manière non significative. Les quatre miARN restants (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p et hsa-miR-423-5p) ont été exprimés de manière opposée dans l'ensemble de validation. Lorsque nous avons combiné les ensembles de découverte et de validation (un total de sujets 45 IGD et de contrôles 42), les trois miARN validés étaient toujours significatifs (Tableau (Table2) .2). Des informations détaillées, les emplacements chromosomiques, les séquences matures et les niveaux d'expression dans le SNC de ces trois miARN sont disponibles dans le tableau S2 du matériel supplémentaire.
Effet Synergique De L'altération Simultanée Des Trois MiARN Sur Le Risque D'IGD
Pour évaluer l'effet combiné des trois miARN, nous avons observé les rapports de cotes (OR) des quatre sous-groupes (avec modifications du miARN de 0, 1, 2 ou 3). L’altération du miARN a été définie par la valeur du QR décrite dans la sectionMatériels et méthodes. »Étant donné que les trois marqueurs miARN ont été régulés négativement dans le groupe IGD, un miARN dont la valeur de QR était inférieure à un a été défié comme altéré. Des informations détaillées sur la valeur de QR de chaque sujet d'étude pour les trois miARN sont disponibles dans le tableau S3 du matériel supplémentaire. Pour chaque sous-groupe, les probabilités étaient calculées comme le rapport du nombre de contrôles à celui des IGD, puis chaque OR était calculé en divisant les probabilités de chaque sous-groupe par les probabilités du sous-groupe sans aucune altération du miARN. Les personnes présentant trois altérations de miARN présentaient un risque 22 plus élevé que celles ne présentant aucune altération de miARN (OU 22, 95% CI 2.29 – 211.11). Les OR ont montré une tendance à la hausse avec le nombre de miARN modifiés de 0 à 3 (r2 = 0.996) (Figure (Figure22).
Analyse GO et pathway des gènes cibles des miARN candidats
Pour mieux comprendre les fonctions des trois marqueurs miARN significativement régulés négativement dans le groupe IGD, leurs gènes cibles ont été prédits à l’aide de la base de données miRWalk 2.0 (31). Un total de gènes 1,230 a été systématiquement prédit comme cibles en aval par quatre algorithmes (miRWalk, miRanda, RNA22 et Targetscan) en utilisant la base de données miRWalk (32-34) (Tableau S4 dans Matériel supplémentaire). L'analyse d'enrichissement des ensembles de gènes à l'aide de ToppFun dans ToppGene Suite a montré que les gènes cibles de ces miARN étaient associés de manière significative à des voies de développement neural telles que «Axon guidance» et des termes GO tels que «neurogenèse» (tableau S5 dans le matériel supplémentaire).
Expression des gènes cibles prédits
Parmi les gènes cibles en aval des trois miARN, 140 ont été prédits simultanément pour deux miARN ou plus (tableau S4 dans le matériel supplémentaire). Pour déterminer si leurs niveaux d'expression protéique des gènes cibles en aval sont différents entre les groupes IGD et les groupes témoins, nous avons sélectionné les gènes 2 (DUSP4 ainsi que PI15), qui sont prédites comme cibles en aval de tous les miARN de 3 et de gènes 3 supplémentaires (GABRB2, DPYSL2et CNR1) parmi ceux prévus pour les miARN 2 et une analyse Western blot avec les échantillons de plasma provenant de 28 IGD et de contrôles 28 disponibles pour l’expérience. Nous avons comparé les expressions des cinq cibles entre le groupe IGD et le groupe témoin en mesurant l’intensité et la surface de la bande comme décrit ailleurs (29). Parmi eux, les niveaux d’expression de DPYSL2 (28 IGD et contrôles 28, P = 0.0037) et GABBR2 (27 IGD et 28 contrôles, P = 0.0052) étaient significativement plus élevés dans le groupe IGD (Figure (Figure3) .3). Cependant, nous n'avons pas pu observer les expressions différentielles de CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) et PI15 (P = 0.6346).
a lieu
Il a été rapporté que des miARN sont impliqués dans le développement neuronal (35, 36), et l’expression différentielle des miARN cérébraux s’observe dans des maladies psychiatriques telles que la schizophrénie (37). Par conséquent, il est plausible que les profils de miARN en circulation puissent constituer des biomarqueurs utiles de l’IGD. Les miARN circulants ont été suggérés comme biomarqueurs de divers troubles neuropsychiatriques (38-40) Cependant, les mécanismes moléculaires à l'origine du développement de l'IGD sont encore largement inconnus, malgré son importance clinique et sociale. Plus précisément, aucune étude n'a été menée sur les miARN associés à l'IGD. Le but de cette étude était double. Tout d'abord, nous avons tenté de découvrir des miARN plasmatiques associés à l'IGD. Deuxièmement, nous avons évalué l'implication biologique des candidats miARN en explorant l'expression des protéines et le GO des gènes cibles en aval. Grâce au criblage à l'échelle du génome des profils d'expression de miARN et à la validation en aval des candidats, nous avons découvert que l'expression de trois miARN (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p et hsa-miR-652-3p) était significativement plus faible chez les patients IGD que chez les témoins. Bien que les schémas d'expression d'autres sept candidats candidats au miARN n'aient pas été répliqués lors de la validation, ils peuvent être faussement négatifs en raison de la petite taille de l'échantillon dans cette étude. À notre connaissance, il s'agit du premier rapport sur la possibilité que les profils d'expression de miARN dans le sang soient des biomarqueurs utiles de l'IGD. La combinaison des trois marqueurs miARN pourrait constituer un outil peu invasif pour l'identification précoce des personnes présentant un risque de IGD.
Les miARN identifiés dans cette étude auraient été impliqués dans diverses maladies neuropsychiatriques. On a signalé que l’expression de hsa-miR-200c dans le sang était régulée négativement dans plusieurs troubles psychiatriques tels que la schizophrénie (41) et les épisodes dépressifs majeurs (42). Il a été rapporté que miR-200c était plus fortement exprimé dans les fractions synaptiques que dans le cerveau antérieur total (43) et être associé à la mort des cellules neuronales (44). Sur la base de ces rapports antérieurs, miR-200c est impliqué dans le développement neurologique et peut être associé à des troubles neuropsychiatriques si son expression est perturbée. Plusieurs études ont suggéré une association entre miR-652 et le risque de troubles neuropsychiatriques. Comme dans notre approche, pour identifier des biomarqueurs sanguins de la schizophrénie, Lai et al. ont effectué une analyse TLDA chez des patients schizophrènes et des témoins normaux et ont constaté que sept miARN, y compris hsa-miR-652, étaient exprimés de manière différentielle chez des patients schizophrènes (45). Dans l’étude ultérieure, ils ont conçu un modèle de prédiction utilisant les données d’expression de miARN et ont réussi à distinguer la schizophrénie du contrôle normal (46). Une expression altérée de hsa-miR-652 a également été observée chez des alcooliques (47). Hsa-miR-26b s’est révélé être activé au cours de la différenciation des cellules neuronales (48). Perkins et al. a rapporté que hsa-miR-26b était régulé négativement dans le cortex préfrontal de patients schizophrènes (49).
Bien qu'il n'y ait pas de preuve directe pour corroborer la relation entre l'expression perturbée de ces miARN et la physiopathologie de l'IGD, nous pouvons en déduire que la dysrégulation de ces miARN peut être associée à la physiopathologie de l'IGD d'après divers rapports antérieurs sur les gènes en aval que nous avions prédits. . Certains des gènes en aval des trois miARN, tels que GABRB2, CNR1, NRXN1et DPYSL2 seraient associés à des troubles neuropsychiatriques. L'acide gamma-aminobutyrique (GABA) est un neurotransmetteur inhibiteur majeur du SNC. La dérégulation du récepteur GABA est impliquée dans des troubles neuropsychiatriques, notamment la dépendance, l’anxiété et la dépression (50), qui sont également les principales caractéristiques d’IGD (8). Des polymorphismes génétiques dans les gènes du récepteur GABA seraient associés à la dépendance à l'alcool et à la schizophrénie (51, 52). Le 2 (DPYSL2), apparenté à la dihydropyrimidinase, appartient à la famille des protéines médiateurs de la collapsine, jouant un rôle dans l'assemblage des microtubules, la signalisation synaptique et la régulation de la croissance axonale. Par conséquent, cette molécule a été suggérée comme biomarqueur de troubles psychiatriques (53, 54). Polymorphisme dans le DPYSL2 le gène serait également associé à un trouble lié à l’alcool (55). Des rapports antérieurs et nos données suggèrent que la surexpression de GABRB2 et de DPYSL2, cibles en aval des miARN sous-régulés, a des implications sur la pathogenèse des troubles neuropsychiatriques, y compris l’IGD. Le récepteur aux cannabinoïdes de type 1 (CNR1) est un hétérorécepteur présynaptique qui module la libération de neurotransmetteurs et des troubles de la signalisation par les cannabinoïdes sont associés à divers troubles neuropsychiatriques (56). Polymorphisme génétique de CNR1 On sait que le gène est associé à la dépendance à une substance chez les Caucasiens (57). Dans un modèle de rat, l’activation de l’hippocampe ventral CNR1 perturbe le comportement social et la cognition normaux (58). L’altération génétique dans la famille NRXN est connue pour être impliquée dans divers troubles neuropsychiatriques, y compris la toxicomanie (59).
Pour examiner de manière plus directe l'implication biologique des trois candidats miARN, nous avons exploré l'expression protéique de leurs gènes cibles en aval. En raison de la disponibilité limitée des échantillons de plasma, des candidats 140 communs (prédits comme étant situés en aval de 2 ou de plusieurs miARN), nous avons examiné les cibles 5 (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 et PI15) par western blot et a confirmé cette expression de GABRAL. et DPYSL2 était significativement plus élevé dans le groupe IGD. Des rapports antérieurs et nos données suggèrent que la surexpression de GABRB2 et de DPYSL2, cibles en aval des miARN régulés à la baisse, pourrait avoir des implications sur la pathogenèse des troubles neuropsychiatriques, y compris l’IGD. Les résultats de l'analyse GO et de la voie des voies de développement neural corroborent également l'implication neurobiologique des marqueurs miARN. Une autre découverte intéressante était l'effet synergique de l'altération simultanée des miARN. Les individus avec une régulation à la baisse de tous les miARN de 2 présentaient un risque multiplié par 3 par rapport à ceux n'ayant pas de régulation à la baisse, et les OR augmentaient de manière dose-dépendante. Bien que l’IC ait été large pour ces trois modifications en raison de la taille réduite de l’échantillon, la corrélation clairement positive (r2 = 0.996) soutient l'effet synergique des trois miARN.
Bien que nous ayons découvert que les marqueurs miARN associés à l'IGD et que les individus présentant les trois modifications du miARN présentaient un risque 22 plus élevé que ceux ne présentant aucune modification du miARN, cette étude comporte plusieurs limites. Premièrement, la petite taille de l’échantillon augmentait la probabilité de manquer d’autres marqueurs significatifs du miARN. Deuxièmement, nos données n'étant pas suffisantes pour déterminer si les profils plasmatiques de miARN sont des causes ou des effets, nous ne pouvons pas confirmer les rôles biologiques de ces marqueurs non invasifs dans un contexte clinique. Le profilage supplémentaire des miARN et leur analyse génétique en aval utilisant des tissus cérébraux humains provenant d'une banque de tissus cérébraux peuvent donner une réponse plus directe. Une analyse des tissus cérébraux avec un modèle animal présentant des troubles du jeu serait également utile. Troisièmement, en raison de la disponibilité limitée des échantillons de plasma, nous n’avons examiné que cinq molécules candidates en aval. Explorer davantage de cibles en aval avec un plus grand ensemble d'échantillons sera utile pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire de l'IGD.
En résumé, grâce au criblage de profils d'expression de miRNA à l'échelle du génome et à une validation indépendante, nous avons découvert trois miARN associés à IGD (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p et hsa-miR-652-3p). Un grand nombre de leurs gènes en aval seraient impliqués dans divers troubles neuropsychiatriques, et la validation expérimentale de l'expression altérée de ces gènes en aval confirme l'implication des miARN identifiés dans cette étude. Nous avons constaté que les individus avec une régulation à la baisse des trois miARN présentaient un risque élevé d'IGD. Avec les facteurs de risque cliniques ou environnementaux connus et les critères de diagnostic, nos résultats peuvent faciliter une intervention précoce pour aider les personnes présentant un risque plus élevé d'IGD.
Déclaration d'éthique
Cette étude a été approuvée par le Comité d’étude institutionnelle du Collège universitaire médical de Corée (MC16SISI0120). Tous les participants et leurs parents ont donné leur consentement écrit.
Contributions d'auteur
ML et HC ont également contribué à cet article. L'étude a été conçue par ML, D-JK et Y-JC. SJ, S-MC, YP, DC et JL ont effectué des expériences et généré des données. Les échantillons de sang et les informations cliniques ont été recueillis par J-WC, S-HP, J-SC et D-JK. ML, HC, S-HY et Y-JC ont analysé les données. ML, HC, S-HY et Y-JC ont décrit le manuscrit. Y-JC a supervisé le projet.
Déclaration de conflit d'intérêts
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l'absence de toute relation commerciale ou financière pouvant être interprétée comme un conflit d'intérêts potentiel.
Notes
Le financement. Ce travail a été financé par une subvention du programme de recherche sur le cerveau par le biais de la Fondation nationale pour la recherche de Corée (NRF), financée par le Ministère de la science et des TIC et de la planification de l'avenir (NRF-2015M3C7A1064778).
Matériel complémentaire
Le matériel supplémentaire pour cet article peut être trouvé en ligne à http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Bibliographie
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