Orexin intervient dans l'initiation du comportement sexuel chez des rats mâles naïfs, mais n'est pas critique pour la performance sexuelle (2011)

Horm Behav. Manuscrit de l'auteur; disponible dans PMC 2011 Aug 1.

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PMCID: PMC2917508

La version finale modifiée de cet article par l'éditeur est disponible à l'adresse Comportement d'horm

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Abstract

Le neuropeptide hypothalamique orexin intervient dans les comportements d’excitation, de sommeil et naturellement gratifiants, y compris la prise de nourriture. Le comportement sexuel masculin est modifié par les agonistes ou antagonistes du récepteur de l'orexine-1, ce qui suggère un rôle pour l'orexine-A dans ce comportement naturellement gratifiant. Cependant, le rôle spécifique de l'orexine A ou B endogène dans différents éléments du comportement sexuel masculin n'est pas encore clair. Par conséquent, les études actuelles ont utilisé des marqueurs d'activation neuronale et des lésions cellulaires spécifiques à l'orexine pour vérifier l'hypothèse selon laquelle l'orexine est essentielle à la motivation et aux performances sexuelles chez le rat mâle. Premièrement, l'expression de cFos dans les neurones d'orexine a été démontrée après la présentation d'une femme réceptive ou non réceptive sans activation supplémentaire par différents éléments de l'accouplement. Ensuite, le rôle fonctionnel de l'orexine a été testé en utilisant une saporine conjuguée à l'orexine-B, ce qui a entraîné des lésions du corps cellulaire de l'orexine dans l'hypothalamus. Les lésions ont été conduites chez des mâles naïfs sexuellement et un comportement sexuel ultérieur a été enregistré au cours de quatre essais d'accouplement. Les mâles des lésions ont montré des latences raccourcies pour monter et pénétrer au cours des premiers essais d'accouplement, mais non ultérieurs, suggérant que les lésions facilitaient l'initiation du comportement sexuel chez des mâles naïfs, mais non expérimentés. De même, les lésions n’affectaient pas la motivation sexuelle chez les hommes expérimentés, déterminée par des tests sur les pistes. Enfin, les tests de niveau élevé et de labyrinthe ont démontré une réduction des comportements analogues à l'anxiété chez les hommes souffrant de lésions, soutenant le rôle joué par orexin dans l'anxiété associée à l'exposition initiale à la femelle chez des animaux naïfs. Dans l'ensemble, ces résultats montrent que l'orexin n'est pas critique pour la performance ou la motivation sexuelles des hommes, mais peut jouer un rôle dans l'excitation et l'anxiété liées au comportement sexuel chez les animaux naïfs.

Mots clés: orexine, hypocrétine, comportement sexuel, copulation, activation neuronale, motivation, hypothalamus, nouveauté, éveil, anxiété

Introduction

L’orexine, également appelée hypocrétine, est un neuropeptide hypothalamique essentiel au comportement alimentaire (de Lecea et al., 1998; Sakurai et al; 1998, Sakurai, 2006; Benoit et al., 2008) l'excitation et le sommeil (Chemelli et al., 1999; Lin et al., 1999, Sakurai, 2007; Furlong et Carrive, 2007; Furlong et al., 2009; Carter et al., 2009). Les neurones à Orexin sont localisés dans la zone hypothalamique latérale (LHA) et dans l’hypothalamus dorsomédial perifornique (PFA-DMH) et produisent deux neuropeptides, l’exexine A et la B (de Lecea et al., 1998; Sakurai et al., 1998). On a montré que les neurones d’Orexine projetaient vers les structures cérébrales impliquées dans la médiation de l’excitation, y compris le locus coeruleus, le noyau tuberomammillary et le noyau tegmental de la péduculopontine (Peyron et al., 1998; Hagan et al., 1999; Horvath et al., 1999; Baldo et al., 2003). Orexin a également été impliqué dans la récompense et la motivation, en particulier en ce qui concerne les aliments et les drogues d'abus (Aston-Jones et al., 2009a; Aston-Jones et al., 2009b) et les neurones d’orexine ont projeté de récompenser les structures cérébrales associées dans le système mésolimbique, y compris l’aire du tegmental ventral (VTA) et le noyau accumbens (NAc) (Peyron et al., 1998; Fadel et Deutch, 2002; Martin et al., 2002; Baldo et al., 2003). Les neurones à Orexine sont activés par des signaux contextuels conditionnés associés à la récompense alimentaire et médicamenteuse (Harris et al., 2005; de Lecea et al., 2006; Choi et al., 2010) et ont joué un rôle dans le comportement alimentaire fondé sur les récompenses (Choi et al., 2010). De plus, l'administration intracérébroventriculaire (ICV) ou intrapéritonéale d'un antagoniste du récepteur de l'orexine 1 (ORX1) réduit la motivation à manger des aliments au goût agréable (Thorpe et al., 2005; Nair et al., 2008), alors que l’administration d’ICV orexine-A peut rétablir cette motivation (Boutrel et al., 2005).

Le rôle de l'orexine dans d'autres comportements gratifiants n'est pas encore clair, bien que plusieurs études aient impliqué son rôle dans le contrôle du comportement sexuel chez les rats mâles. Il a déjà été démontré que les neurones d’orexine sont activés par la copulation chez le rat mâle (Muschamp et al., 2007). De plus, l’administration d’orexine-A dans la région préoptique médiale (mPOA) a entraîné une amélioration des performances sexuelles, mise en évidence par une réduction du temps de latence du montage et de l’intromit, et une augmentation de la fréquence des montages et de l’intromission (Gulia et al., 2003). En revanche, l’administration par ICV d’orexin-A a atténué la motivation sexuelle en réduisant la préférence des femmes, bien que ce soit uniquement chez les hommes de forte motivation sexuelle (Bai et al., 2009). Des études utilisant des antagonistes ORX1 ont également montré des données contradictoires, car l'administration systémique d'antagoniste ORX1 altérait légèrement les performances sexuelles en augmentant le temps de latence à l'intromit sans affecter les autres paramètres du comportement sexuel (Muschamp et al., 2007), alors que l’administration par ICV de l’antagoniste d’ORX1 n’a eu aucun effet sur la motivation sexuelle (Bai et al., 2009). Ensemble, ces études suggèrent que l’administration d’orexine-A exogène affecte la performance et la motivation sexuelles; orexine endogène peut ne pas jouer un rôle important dans la médiation du comportement sexuel (Bai et al., 2009). Par conséquent, le but de la présente étude était de déterminer si l’orexine endogène était essentielle à la motivation et à la performance sexuelles chez le rat mâle.

Premièrement, il a été déterminé que, lors du comportement sexuel, les neurones orexine sont activés, en vérifiant l'hypothèse selon laquelle les neurones orexine sont activés lors de l'introduction du stimulus gratifiant. De plus, comme il a été démontré que les expériences sexuelles influent sur les performances sexuelles (Dewsbury, 1969) et les propriétés gratifiantes du comportement sexuel (Tenk et al., 2009), il a été déterminé si l’expérience sexuelle influençait l’activation du neurone exex lors de l’accouplement. Enfin, il a été testé si orexin jouait un rôle essentiel dans la motivation et la performance sexuelles en utilisant des lésions spécifiques du corps cellulaire des neurones à orexine.

Matériels et méthodes

Des rats Sprague Dawley mâles adultes (200 – 250g) ont été obtenus auprès des laboratoires Harlan (Indianapolis, IN) ou Charles River (Sherbrooke, Québec, Canada) et hébergés individuellement ou par paires selon les expériences (voir ci-dessous) dans des cages en plexiglas. La pièce de la colonie a été maintenue sur un cycle inversé lumière-obscurité 12 / 12 (lumière éteinte à 10) et de la nourriture et de l’eau étaient disponibles. ad libitum sauf lors des tests comportementaux. Des rats femelles Sprague-Dawley provenant de Harlan (Indianapolis, IN) ou de Charles River Laboratories (Sherbrooke, Québec, Canada) ont été ovariectomisés bilatéralement et implantés par voie sous-cutanée avec des capsules de benzoate de silastic 5% 17-β-estradiol. La réceptivité sexuelle a été induite par des injections sous-cutanées de progestérone (500 ug dans 0.1ml d'huile de sésame) environ 4 h avant les séances d'accouplement. Toutes les procédures ont été approuvées par les comités de protection des animaux de l'Université de Cincinnati et de l'Université Western Ontario et sont conformes aux directives définies par le National Institute of Health et le Conseil canadien de protection des animaux. Tous les tests comportementaux ont été effectués pendant la première moitié de la phase sombre sous un éclairage rouge tamisé, sauf indication contraire.

Conception expérimentale

études d'expression cFos

Des rats mâles (n = 48) ont été logés individuellement et la moitié des animaux ont eu une expérience sexuelle dans la cage de la maison lors des séances d’accouplement deux fois par semaine de 5. Des tests d’accouplement ont été effectués dans la cage de la maison afin d’éliminer l’excitation et l’expression de cFos induites par une exposition à une arène d’accouplement différente et une exposition à des signaux conditionnés associés à un accouplement antérieur (Balfour et al., 2004). Une femelle réceptive a été introduite dans la cage de la maison et les mâles ont été autorisés à s'accoupler jusqu'à une éjaculation ou pendant quelques minutes 60. Au cours de chaque test, un comportement sexuel a été observé. Le nombre total de montures et d'intromissions, ainsi que les latences avant la première monte et l'intromission (le temps écoulé entre la présentation de la femelle réceptive et la première monture ou intromission), ainsi que l'éjaculation (le temps entre la première intromission et l'éjaculation) ont été enregistrés. (Agmo, 1997). La moitié restante des animaux est restée sexuellement naïve. Ces animaux ont été logés dans la même pièce que les mâles sexuellement expérimentés, ont été manipulés et exposés aux odeurs et aux bruits associés à l'accouplement, mais ne se sont pas accouplés. Les animaux naïfs et expérimentés ont été subdivisés en groupes expérimentaux 6 (n = 4 par groupe). Les groupes 6 naïfs et expérimentés comprenaient: des hommes témoins non exposés au comportement sexuel (Home Cage); mâles exposés à une femelle non réceptive dans la cage de la maison pendant quelques minutes 15 (femme anestrique). Les mâles pouvaient enquêter et interagir, mais ne se sont pas accouplés en raison du manque de réceptivité féminine; les hommes exposés aux odeurs d'une femelle réceptive sont placés dans un boîtier en treillis métallique au-dessus de la cage de la maison pendant quelques minutes 15 (Estrous Female); les mâles qui montraient des montures, mais pas des intromissions ni des éjaculations avec des femelles masquées par le vagin (Mount); les mâles qui ne montraient que des montures et des intromissions (Intromission); et les hommes qui ont accouplé à une éjaculation (éjaculation). Une heure après la fin du test, les hommes ont été sacrifiés pour analyser l'expression de cFos. Les groupes sexuellement expérimentés ont été appariés sur les paramètres de comportement sexuel et il n'y avait pas de différence significative entre les groupes avant le test final. De plus, il n'y avait pas de différences significatives entre les groupes naïfs et expérimentés quant au nombre de montures plus les intromissions lors du test final.

Perfusions: expression de cFos

Tous les mâles ont été profondément anesthésiés avec du pentobarbitol de sodium (270 mg / mL) et perfusés par voie transcardiale avec du 4% paraformaldéhyde (500 mL; PFA). Après la perfusion, les cerveaux ont été prélevés immédiatement et post-fixés pendant une heure dans le même fixateur, puis transférés dans une solution 20% saccharose pour la cryoprotection. Les cerveaux ont été sectionnés sur un microtome de congélation (Microm, Walldorf, Allemagne) en coupes coronales de 35 µm et recueillis dans des sections parallèles 4 dans une solution de cryoprotecteur (30% saccharose dans 0.1 M PB contenant 30% éthylène glycol et 0.01% de sodium azide) et stockés à -20 ° C jusqu'à la poursuite du traitement.

Immunohistochimie

Toutes les incubations ont été effectuées à température ambiante avec une agitation douce. Les sections flottantes libres ont été abondamment lavées avec du phosphate de sodium tamponné au sérum physiologique 0.1M (PBS). Les sections ont été bloquées avec 1% H2O2 (Solution de réserve 30%) dans du PBS pendant quelques minutes 10, puis rincé à nouveau avec du PBS. Les coupes ont été incubées avec une solution d'incubation (PBS contenant 0.1% d'albumine de sérum bovin et 0.4% de Triton X-100) pendant 1 heure. Les incubations d'anticorps primaires ont été effectuées dans la solution d'incubation pendant une nuit à température ambiante. Les sections de coloration suivantes ont été rincées dans du PBS, montées sur des lames de verre chargées et recouvertes de xylphtalate de dibutyle (DPX).

cFos / Orexin

Une série de coupes a été immunisée pour cFos et orexin. Les coupes ont été incubées pendant une nuit avec un anticorps de lapin identifié reconnaissant le cFos (anti-cFos de lapin, sc-52; 1: 10, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie), puis incubées à l'heure 000 avec un anti-lapin de chèvre biotinylé (1: 1). , Vector Laboratories, Burlingame, CA) et un complexe d’avidine peroxydase au raifort (500: 1, kit ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Les coupes ont été incubées pendant quelques minutes 1000 dans 10% diaminobenzidine (DAB) (Sigma, St. Louis, MO) dans un tampon phosphate 0.02M (PB) contenant 0.1% peroxyde d'hydrogène et 0.012% sulfate de nickel, donnant un produit de réaction bleu-noir. Les coupes ont ensuite été incubées pendant une nuit avec un anticorps dirigé sur un lapin reconnaissant l'orexine-A (H-0.08-003 anti-orexine-A de lapin; 30: 1: Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA), suivie d'une incubation d'une heure 20 avec une chèvre biotinylée -bbit et ABC, comme décrit ci-dessus. Enfin, les sections ont été incubées pendant quelques minutes 000 avec 1% DAB dans 10M PB contenant 0.02% de peroxyde d'hydrogène, ce qui a donné un produit de réaction brun rougeâtre.

Tous les anticorps ont été caractérisés précédemment (Chen et al., 1999; Satoh et al., 2004; Solomon et al., 2007). Les contrôles immunohistochimiques comprenaient l’omission d’anticorps primaires, une analyse par Western blot montrant des bandes uniques à un poids approprié (cFos) et une perte du signal immunohistochimique de l’oreexine avec des lésions d’orexine B-saporine (orexine).

Analyse des données

cFos / Orexin

Les neurones marqués pour l'orexine ou l'orexine et les cFos ont été comptés de manière bilatérale dans trois sections représentatives par animal, connues pour contenir le nombre maximal de la population neuronale d'orexine (Sakurai et al., 1998) couvrant de -2.3 mm à -3.6 mm de bregma (Paxinos et Watson, 1998) (Figure 1), en utilisant un tube de dessin fixé à un microscope Leica (Leica Microsystems; Wetzlar, Allemagne), par un observateur aveuglé des groupes expérimentaux. Les PFA-DMH et LHA ont été délimités en fonction de l'emplacement du fornix (Figure 1a). Les pourcentages de neurones d'orexine exprimant des cFos ont été calculés et moyennés par hémisphère pour chaque animal, et les moyennes de groupe ont été calculées. La signification statistique entre les groupes a été déterminée en utilisant une ANOVA à deux facteurs, une expérience et un comportement sexuels au cours du test final, en tant que facteurs, suivis des tests de LSD de Fisher avec un niveau de confiance de 95.

Figure 1 

Localisation des neurones d'orexine dans l'hypothalamus. (A) Emplacement anatomique des neurones d'orexine dans l'hypothalamus. (Paxinos et Watson, 1998), Échelle graphique: 200 µm. (B) Neurones orexine à marquage unique dans le PFA-DMH chez un animal témoin non conjugué. (C) Orexin ...

Études sur les lésions à Orexin

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Les mâles ont été logés individuellement et ont eu une session d'accouplement pré-test avec une femelle réceptive avant la lésion et la chirurgie factice. Le comportement sexuel a été enregistré comme décrit ci-dessus et les groupes ont été appariés en fonction de paramètres de comportement d'accouplement. Des rats mâles ont été anesthésiés avec de l'isoflurane (Abbot Laboratories, St. Laurent, Québec, Canada) en utilisant un appareil à gaz Surgivet Isotec4 (Smiths Medical Vet Division, Markham, Ontario, Canada) et placés dans un appareil stéréotaxique (Kopf Instruments, Tujunga, CA) avec un masque à gaz couvrant le nez et la bouche pour maintenir l'anesthésie. Une incision a été faite pour exposer le crâne et lambda et bregma ont été trouvés et déterminés comme étant de niveau. Un trou a été foré dans le crâne à l’aide d’un foret Dremel (Dremel, Racine, WI) et de micropipettes de verre (40µm de diamètre, World Precision Instruments Inc, Sarasota, FL) remplies de la toxine ciblée, l’exex-B saporine (IT-20, Advanced Systèmes de ciblage, San Diego, Californie; 200ng / µL dans du PBS); ou la toxine non conjuguée BLANK-saporine (IT-21, Systèmes de ciblage avancés, San Diego, CA; 200ng / µL dans du PBS; témoins fictifs) ont été abaissées dans l'hypothalamus. Il a été démontré que cette toxine ciblée se liait avec une forte affinité pour les cellules exprimant le récepteur de l’orexine 2 (ORX2) et avec une affinité significativement inférieure pour les cellules exprimant ORX1 (Gerashchenko et al., 2001), et il a été démontré qu’il éliminait spécifiquement les neurones d’orexine dans l’hypothalamus (Frederick-Duus et al., 2007). Des infusions bilatérales de 1 µL (2 par hémisphère) ont été injectées aux coordonnées suivantes: AP = −2.8 et −3.2; ML = 0.7 et 0.8; DV = −9.0 (Paxinos et Watson, 1998). Après chaque perfusion, l'aiguille a été laissée en place pendant quelques minutes 3 pour permettre la diffusion. Les aiguilles ont été retirées lentement et les plaies ont été fermées avec des pinces pour plaie. Deux semaines après la chirurgie des lésions, tous les mâles ont été soumis à une expérience sexuelle lors de quatre essais d'accouplement et ont ensuite été soumis au test de la piste et / ou au test de labyrinthe en hauteur (voir ci-dessous). Les chirurgies ont été effectuées dans trois cohortes différentes, séparées de plusieurs semaines, pour atteindre un nombre suffisant d'animaux par groupe.

Comportement sexuel

Tous les mâles ont été soumis à des tests de comportement sexuel lors de séances d’accouplement 4 conduites tous les deux jours dans la cage de la maison. Au cours de chaque session, les hommes se sont accouplés avec une femme réceptive à une éjaculation ou pendant quelques minutes 60, selon la première éventualité. Le comportement d'accouplement a été enregistré comme décrit ci-dessus et l'efficacité de la copulation a également été calculée [nombre d'introductions / (nombre de montages + nombre d'introductions)]. Les différences statistiques dans les paramètres de performance sexuelle ont été comparées entre les groupes de lésions et de simulations pour chaque essai en utilisant une ANOVA à une facteur de lésion avec chirurgie des lésions et le test de Fisher au LSD avec un niveau de confiance de 95, ou, le cas échéant, des tests non paramétriques ANOVA unidirectionnelle de Kruskal-Wallis avec facteur de chirurgie des lésions et test de Dunn avec un niveau de confiance 95%. De plus, les données de chaque groupe ont été comparées aux données préopératoires à l'aide de tests t appariés.

Motivation sexuelle: test de piste

Après avoir testé le comportement sexuel, un sous-groupe d'hommes mâles, maintenant expérimentés sexuellement, a été testé pour sa motivation sexuelle à l'aide d'un appareil à piste droite (MED Associates Inc., St. Albans, Vermont) (120 cm de long; Lopez et al., 1999). Les hommes se sont habitués à l'appareil de piste lors de deux essais ultérieurs 10 effectués le même jour. Ensuite, deux essais ont été réalisés. Au cours du premier essai, un animal stimulant (femelle estreuse, femelle anestrique ou mâle) a été placé dans une boîte de but avec des diviseurs perforés au bout de la piste. Un ventilateur a été utilisé pour souffler les odeurs des animaux stimulants vers le mâle. Les hommes expérimentaux ont été placés dans la boîte de départ, la porte a été ouverte pour permettre l'accès à la piste et le temps nécessaire pour atteindre la boîte des buts a été enregistré. Une fois dans la zone des buts, les mâles disposent de 30 secondes pour interagir avec l'animal de stimulation situé derrière l'écran. Un deuxième essai identique a suivi 1 une heure plus tard. La signification statistique entre les moments pour atteindre la zone de but entre l'essai 1 et l'essai 2 a été analysée à l'aide de tests t appariés avec un niveau de confiance 95%. La signification statistique entre les groupes a été déterminée en utilisant une ANOVA à une voie avec chirurgie des lésions comme facteur suivi des tests de Fisher avec LSD avec un niveau de confiance 95.

Comportement angoissant: Elevé Plus Maze

Un sous-groupe d'hommes actuellement sexuellement expérimentés a été soumis à un test de comportement de type anxiété pour déterminer si les effets des lésions d'orexine sur les performances ou la motivation sexuelles étaient dus à des modifications de l'anxiété ou de l'excitation sexuelle. Les mâles ont été exposés à l'appareil surélevé et à labyrinthe (EPM; MED Associates Inc., St. Albans, Vermont) dans une pièce très éclairée à la fin de la phase lumineuse. Le module de gestion de l'énergie comprenait des bras 4 de chaque longueur de 50 cm, partant d'une jonction centrale, et s'élevait à 75 cm. Deux bras du labyrinthe étaient ouverts sur l’environnement extérieur et les deux autres étaient entourés d’un bardage sombre de hauteur 40. Les animaux ont été placés sur le EPM et surveillés pendant cinq minutes. Le temps passé dans les bras ouverts et les bras fermés et le nombre total d'entrées dans chaque bras ont été enregistrés à l'aide de matrices de faisceaux de photo. La signification statistique entre les groupes a été déterminée en utilisant une ANOVA à une voie avec la lésion en tant que facteur, suivie des tests de Fisher avec LSD avec un niveau de confiance 95.

Perfusions et cFos induits par l'accouplement

Après tous les tests comportementaux, tous les mâles ont été profondément anesthésiés avec du pentobarbitol de sodium (270mg / mL) et perfusés par voie transcardiale avec 500 mL de 4% PFA pour la vérification de la lésion, comme décrit précédemment. De plus, pour tester les effets des lésions d’orexine sur l’expression de cFos induite par l’accouplement, des groupes de mâles simulés et de mâles lésés se sont accouplés jusqu’à une éjaculation. Une heure après l'éjaculation, les mâles ont reçu une perfusion transcardiale de 4% PFA comme décrit ci-dessus. La moitié des hommes de ce groupe n'ont pas été présentés à une femme et ont été perfusés à partir de la cage de la maison pour servir de témoins non accouplés.

Immunohistochimie

Les cerveaux ont été sectionnés à l'aide d'un microtome de congélation en série parallèle 4 de sections coronales en µN 35 et conservés comme décrit ci-dessus. Pour la vérification de la lésion, une série de sections contenant l'hypothalamus de toutes les expériences sur la lésion a été marquée individuellement pour l'orexine en utilisant les mêmes protocoles d'anti-orexine-A et de DAB de lapin décrits ci-dessus. Une série de sections d'animaux accouplés a été colorée pour cFos et orexine comme décrit ci-dessus.

Vérification des lésions

Dans chaque animal, des nombres de neurones d'orexine immunoréactifs pour l'orexine ont été comptés de manière bilatérale dans les sections PFA-DMH et LHA dans des coupes 3 exprimant le nombre maximal de cellules d'orexine dans des contrôles non chirurgicaux, -2.3 mm à -3.6 mm à partir de bregma comme décrit ci-dessus. Les cellules par hémisphère ont été moyennées pour chaque animal et les moyennes de groupe ont été calculées. Des animaux témoins non chirurgicaux (issus des expériences cFos) ont été utilisés pour déterminer le nombre intact / initial des neurones à orexine et les données sont exprimées en pourcentage par rapport aux mâles témoins non chirurgicaux (Figure 2). Les hommes dont le nombre de cellules d'orexine était inférieur à 20% par rapport aux animaux témoins non soumis à une intervention chirurgicale ont été inclus dans le groupe lésions. Les animaux avec plus de 20%, mais moins de 80% ont été inclus dans un groupe de lésions partielles. Les témoins fictifs n'ont pas subi de changements significatifs dans le nombre de cellules d'orexine. La signification statistique entre les animaux atteints de lésions factice, partielle ou complète a été calculée à l'aide d'un test ANOVA à une voie et du test LSD de Fisher avec un niveau de confiance 95.

Figure 2 

Vérification des lésions. Images représentatives montrant des cellules d'orexine (A) et de MCH (B) chez un animal atteint de lésion factice ayant reçu une injection de BLANK-saporine. Images représentatives montrant la perte de cellules d'orexine (C), mais de cellules MCH intactes (D) chez un animal lésé ayant reçu une injection d'orexine ...

Spécificité des lésions

Pour vérifier que les lésions étaient limitées aux neurones à orexine, une série de sections contenant l’hypothalamus d’un sous-ensemble d’animaux témoins et lésés (n = 20) a été soumise à une immunoprocédés pour l’hormone de concentration des mélanocytes (MCH), un peptide hypothalamique colocalisation) avec les neurones à orexine (Broberger et al., 1998), en utilisant un anticorps de lapin reconnaissant MCH (anti-MCH de lapin, H-070-47; 1: 150 000, Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA) et DAB comme décrit précédemment. Les neurones MCH expriment ORX1 (Bäckberg et al., 2002) mais pas ORX2 (Volgin et al., 2004), et ne sont pas significativement réduits après le traitement par l'orexine B-saporine (Frederick-Duus et al., 2007). Les cellules immunoréactives MCH ont été comptées de manière bilatérale dans deux sections par animal (sham: n = 7; lésion n = 5), en utilisant des sections alternatives à celles analysées pour les neurones à orexine. Les lésions n’ont pas réduit significativement le nombre de neurones MCH dans les PFA-DMH ou les LHA (Tableau 1; Figure 2b, d; PFA-DMH: p = 0.47; LHA: p = 0.33). De plus, l'expression de cFos induite par l'accouplement a été comptée bilatéralement dans une section représentative par animal (sham: n = 4; lésion n = 3), en utilisant des sections alternatives à celles analysées pour les neurones à orexine. Les lésions n’affectent pas l’expression de cFos induite par la reproduction dans le PFA-DMH ou le LHA (Tableau 1; PFA-DMH: p = 0.53; LHA: p = 0.82). Enfin, des sections représentatives utilisées pour les numérations cellulaires d'orexine (animaux: sham: n = 6; lésion: n = 6) ont été contre-colorées au Nissl avec du violet de crésyl (5 g acétate de violet de crésyle (C-5042, Sigma, St. Louis, MO), 0.5 g d’acétate de sodium trihydraté (S209, Thermo Fisher Scientific, Ottawa, Ontario, Canada), 1L eau bidistillée avec de l’acide acétique glacial (AX0073-6, EMD Chemicals, Mississauga, Ontario, Canada) à pH: 3.14. Des comptages de neurones marqués au Nissl ont été effectués dans des zones d'analyse standard (250, x x 200, um) à l'emplacement général des neurones à orexine. Le nombre de neurones marqués au Nissl n’a pas différé entre les groupes simulés et les groupes lésés (Tableau 1; PFA-DMH: p = 0.23; LHA: p = 0.33).

Tableau 1 

Vérification de la spécificité des lésions: L'analyse du nombre de neurones marqués pour les cFos induits par Nissl, MCH ou l'accouplement a montré qu'il n'y avait pas de perte significative de neurones en général, de cellules MCH ou d'activation neuronale induite par l'accouplement dans le PFA-DMH ou ...

Comme il a été démontré qu'une carence en orexine contribue à la narcolepsie chez la souris (Chemelli et al., 1999), chiens (Lin et al., 1999) et les humains (Siegel, 1999; Nishino et al., 2000; Peyron et al., 2000; Thannickal et al., 2000) les animaux ont été observés pour assurer l'absence de phénotype narcoleptique. Les animaux ont été observés pendant la durée de tous les tests comportementaux rapportés dans cette étude et ne présentaient aucune caractéristique de la narcolepsie.

Expression de cFos induite par l'accouplement chez les animaux atteints de lésions

Les nombres de cellules immuno-réactives à cFos ont été comptés de manière bilatérale dans les coupes 3 par animal dans les zones d'analyse standard dans la zone tégmentale ventrale (VTA; 900 × 900 µm), mPOA (400 × 600 µm); noyau accumbens (NAc) noyau et coque (400 × 600 µm) et les sous-régions pré-limbiques, infralimbiques et cingulaires antérieures du cortex préfrontal médial (mPFC) (600 × 800 µm par sous-région) par un groupe expérimental observé en aveugle . Les comptes ont été moyennés pour chaque animal et les moyennes de groupe ont été calculées. La signification statistique a été calculée en utilisant une ANOVA à deux voies avec une expérience sexuelle et une lésion comme facteurs, suivies du test de LSD de Fisher avec un niveau de confiance 95.

Résultats

Activation des neurones à l'orexine pendant le comportement sexuel

Une augmentation significative de l’expression de cFos dans les neurones à orexine a été observée à la suite d’un comportement sexuel dans le PFA-DMH (F(5,31) 63.4; p <0.001; Figure 3a) et LHA (F(5,31) 10.4; p <0.001; Figure 3b), sans effet d'expérience sexuelle. Spécifiquement, chez les animaux sexuellement naïfs et expérimentés, tous les groupes expérimentaux de mâles présentant différents paramètres de comportement sexuel (investigation de la femelle anestrique, exposition à des odeurs de femme estreuse, affichage de montées, d'intromissions ou d'éjaculation) ont montré une induction égale de fCo par rapport à la maison contrôles de la cage avec un pourcentage plus élevé de cellules d'orexine activées dans le PFA-DMH (60 – 80%) par rapport au LHA (14 – 33%), sans différences entre les groupes expérimentaux. Ces résultats suggèrent que les neurones à orexine sont activés après une exposition à la femme sous stimulus sans autre activation lors des performances sexuelles. De plus, l'activation ne dépend pas de la saillance incitative du stimulus féminin, car les femmes non-réceptives et réceptives induisent une activation induite chez les hommes sexuellement expérimentés.

Figure 3 

Les neurones à Orexin dans PFA-DMH (A) et LHA (B) ont exprimé les cFos en suivant tous les paramètres du comportement d'accouplement chez des animaux naïfs et expérimentés. Abréviations: HC, cage d'accueil; AF: femelle anestrique; EF, femme estreuse; M, Mount; MI, intromission; E, éjaculation. ...

Effets des lésions d'orexine

Comportement sexuel

Les lésions à Orexin ont entraîné une facilitation du comportement sexuel (latence montante: F(2,47) 3.962; p = 0.034; latence d'intromission: H = 9.104; p = 0.011). Au cours du premier essai d'accouplement, les mâles de la lésion ont présenté des latences de montage et d'intromission plus courtes par rapport aux animaux factices (latence de montage: p = 0.03; latence d'intromission: p = 0.01; Figure 4a – b) et comparé aux latences lors de l’essai d’accouplement préopératoire (latence du montage: p = 0.02; latence de l’intromission: p = 0.03; données non présentées). Les mâles atteints de lésions partielles ne différaient pas significativement des mâles factices, et aucun des deux groupes ne différait de l'essai d'accouplement préopératoire. Les effets des lésions sur les latences de montage et d'intromission ont été atténués avec l'expérience sexuelle, car il n'y avait aucune différence entre les groupes, au cours des essais ultérieurs (essai 4 présenté dans Figure 4a – b). Latences d'éjaculation (Figure 4c), nombre de montures (Figure 4d) et des intromissions (Figure 4e) ainsi que l'efficacité de la copulation (Figure 4f) ne différaient pas significativement entre les groupes au cours des essais ou au sein de chaque groupe entre le premier essai d'accouplement et le test préopératoire.

Figure 4 

Les lésions à Orexin ont raccourci les latences de montage et d'intromission chez les hommes naïfs au cours de l'essai 1. Les lésions à l'orexine n'ont pas affecté l'accouplement au cours de l'essai 4, après que les hommes eurent eu une expérience sexuelle. (A) Mont Latence. (B) Latence d'Intromission. (C) l'éjaculation ...
Test de piste

Les lésions à l'orexine n'ont pas d'incidence sur la motivation sexuelle évaluée lors d'un test sur piste droite chez des hommes sexuellement expérimentés. Au cours de deux essais, les hommes de la lésion ont couru beaucoup plus rapidement vers une femme estreuse dans le deuxième essai par rapport au premier essai (p = 0.03; Figure 5). Une telle durée accrue est révélatrice de la motivation sexuelle (Lopez et al., 1999). Les hommes atteints de lésions partielles et factices ont également couru plus rapidement vers une femme estreuse au cours de l'essai 2 (p = 0.03), bien que cela n'ait pas été significatif chez les hommes factices (p = 0.052). Aucun des groupes n'a montré de vitesse accrue pour courir vers une femme ou un homme anestreux au cours de l'essai 2. De plus, aucune différence significative n'a été observée entre les mâles simulés, partiels et les mâles en course pour courir vers un animal stimulant, que ce soit dans l'essai 1 ou dans l'essai 2, ce qui démontre l'absence de différences d'activité générale sur la piste.

Figure 5 

Les lésions à l'orexine n'ont pas d'incidence sur la motivation sexuelle chez les hommes ayant une expérience sexuelle. Les temps indiqués pour atteindre une femme estreuse lors du test de piste lors des essais 1 et 2. * indique une réduction significative du temps nécessaire pour atteindre la femme participant à l'essai 2 par rapport à ...
Comportement anxieux

Les résultats obtenus jusqu’à présent suggèrent que les lésions pourraient faciliter l’initiation du comportement sexuel chez les animaux naïfs via un effet potentiel sur les réactions à la nouveauté et / ou à des comportements analogues à l’anxiété lorsque les mâles rencontrent une nouvelle femelle. À l’appui, les hommes de la lésion présentaient une diminution du comportement de type anxiété sur le MPE, exprimée en pourcentage de temps passé dans les bras fermés (p = 0.012; Figure 6) et un pourcentage accru de temps sur les bras ouverts (p = 0.023; Figure 6) par rapport aux hommes simulés. Les lésions partielles n'ont eu aucun effet significatif. Ces données confirment en outre que la lésion a diminué le comportement de type anxiété.

Figure 6 

Les lésions à l'orexine ont diminué le comportement de type anxiété sur le labyrinthe surélevé. Le pourcentage de temps passé dans les bras fermés (à gauche) a été réduit et le pourcentage de temps dans les bras ouverts (à droite) a été augmenté chez les hommes atteints de lésions. * indique une différence significative ...
cFos Expression

Pour évaluer si l'orexine endogène contribue à l'activation neuronale induite par l'accouplement dans les régions cérébrales innervées par l'orexine, une analyse de l'expression du cFos induite par l'accouplement dans les VTA, le noyau et l'enveloppe d'ACN, le mPOA et le mPFC a été réalisée. L'accouplement a augmenté de manière significative les cFos dans toutes les zones cérébrales analysées, aussi bien chez les mâles atteints de lésions que chez les témoins simulés, par rapport aux témoins non conjugués (Tableau 2). Les lésions n’affectaient pas l’activation neuronale, l’expression de la cFos induite par la reproduction ou induite par la reproduction n’étant pas différente de celle des animaux simulés et des lésions.

Tableau 2 

L'accouplement induit des cFos dans les groupes simulés, partiels et lésionnels par rapport aux témoins non accouplés du même statut lésionnel.

a lieu

Ces études ont examiné le rôle de l'orexine endogène dans la performance et la motivation sexuelles chez le rat mâle. Il a été constaté que l'orexin n'est pas essentiel pour la motivation ou la performance sexuelle. Au lieu de cela, les neurones à orexine sont activés par le stimulus féminin, indépendamment du statut hormonal de la femme ou de l'expérience sexuelle du mâle. En outre, l'élimination de l'orexine endogène par des lésions spécifiques de cellules d'orexine a diminué les comportements analogues à l'anxiété et facilité l'initiation du comportement sexuel chez les hommes naïfs de sexe. Ainsi, les résultats de cette étude confirment le rôle de l'orexine dans l'excitation sexuelle (de Lecea et al., 2006; Harris et Aston-Jones, 2006; Sakurai, 2007; Boutrel et al., 2009; Furlong et Carrive, 2009; Furlong et al., 2009) et l'anxiété (Suzuki et al., 2005; Davis et al, 2009; Li et al., 2010), mais ne supporte pas le rôle critique joué par orexin dans la motivation ou la performance sexuelle.

Les résultats de ces études clarifient davantage le rôle de l'orexine endogène et les résultats apparemment contrastés des études précédentes examinant le rôle de l'orexine dans le comportement sexuel masculin à l'aide d'outils pharmacologiques. Les perfusions intra-mPOA d'orexine-A exogène ont entraîné une augmentation de l'excitation sexuelle et une amélioration des performances sexuelles, ce qui suggère que l'orexin peut agir dans la mPOA pour augmenter la motivation et la performance du comportement sexuel (Gulia et al., 2003). Cependant, en revanche, les perfusions d’ICV d’orexine-A ont atténué la motivation et l’excitation sexuelles (Bai et al., 2009), alors qu'un antagoniste des récepteurs de l'orexine n'avait aucun effet sur l'excitation sexuelle (Bai et al., 2009), indiquant que l’orexine endogène peut ne pas jouer de rôle dans la motivation sexuelle. Enfin, il a été démontré que le blocage d'ORX1 par des injections systémiques n'altère que légèrement les performances copulatoires (Muschamp et al., 2007). Quelques études contradictoires permettent de tirer quelques conclusions. Premièrement, l'application d'orexine-A exogène peut affecter le comportement, mais le blocage d'ORX1 n'a ​​pas d'effet majeur, ce qui suggère un rôle mineur pour l'orexine endogène dans la régulation du comportement sexuel masculin (Bai et al., 2009). Les résultats actuels supportent cette possibilité. Les études actuelles utilisant l'ablation de l'orexine, par l'orexine, indiquent que l'orexine endogène n'est pas indispensable à la motivation ou aux performances sexuelles, conformément aux observations de Bai et al (2009). Il est toutefois important de noter que l'absence d'effet des lésions en orexine sur la motivation sexuelle dans la piste peut être due au fait que les animaux ont déjà eu une expérience sexuelle avant le test de motivation sexuelle. Par conséquent, l'absence d'effet sur le test de piste peut être due. à l'expérience sexuelle des hommes. Les expériences futures pourraient répondre à cette mise en garde en testant les effets des lésions d'orexine sur la motivation sexuelle chez les hommes naïfs.

Il est également possible que les deux ligands de l 'orexine et les deux sous - types de récepteurs de l' orexine (ORX1 et ORX2; Sakurai et al., 1998) peut réguler le comportement sexuel dans des directions opposées. En utilisant les techniques de lésion cellulaire à l'orexine, les ligands des deux sous-types de récepteurs à l'orexine (orexine-A et B) ont été éliminés dans la présente étude. Les deux sous-types de récepteurs sont exprimés dans différentes zones du cerveau (Trivedi et al., 1998; Marcus et al., 2001) et il a été démontré que la mémoire est régulée différemment pour la recherche de cocaïne induite par un signal (Smith et al., 2009). Les études antérieures sur le comportement sexuel ont principalement porté sur le rôle de l'orexine-A et de l'ORX1 (voir la discussion ci-dessus). L'antagoniste des récepteurs de l'orexine SB334867 utilisé dans les études jusqu'ici cible spécifiquement ORX1, qui présente une forte affinité pour l'orexine-A et une affinité significativement inférieure pour l'orexine-B (Sakurai et al., 1998). De même, l'orexine-A a été utilisée comme orexine exogène dans des études antérieures (Gulia et al., 2003; Bai et al., 2009). Des études ultérieures sont nécessaires pour étudier le rôle de l'orexine-B et de ORX2 dans la régulation du comportement sexuel masculin.

La présente étude a testé les effets de la perte d’orexine à long terme. Muschamp et al. (2007) ont suggéré qu'une réduction à long terme de l'orexine après la castration pourrait expliquer la perte de motivation et de performances sexuelles. Les résultats actuels contredisent cette hypothèse, car les lésions des cellules orexines ne réduisent pas la motivation ou les performances sexuelles. Il est possible que la perte d'orexine à long terme de l'étude actuelle ait entraîné des mécanismes compensatoires, bien qu'aucun changement d'activation neurale induite par l'accouplement dans le comportement sexuel médiant le circuit n'ait été détecté. Néanmoins, il est clair que la réduction ou l'absence d'orexin n'empêche pas les comportements sexuels. De plus, les résultats de la présente étude ne confirment pas le rôle majeur que l'orexin pourrait jouer dans l'induction de l'expression des cFos par le comportement sexuel. Il a été clairement établi que l'orexin contribue à l'activation des neurones de la VTA (Korotkova et al., 2003; Borgland et al., 2006; Narita et al., 2006; Vittoz et al., 2008). Cependant, les lésions de cellules orexines ne bloquaient pas l'activation neuronale induite par l'accouplement dans la VTA, ni dans aucune autre région cérébrale liée à la récompense analysée, malgré la présence de fibres immunoréactives à l'orexine à proximité des neurones activés chez les mâles simulés. Ainsi, l'activation neuronale induite par l'accouplement dans ces régions cérébrales ne semble pas dépendre de l'action de l'orexine.

Une découverte quelque peu inattendue de l’étude en cours a été l’effet des lésions orexines sur la facilitation de l’initiation du comportement sexuel chez des animaux naïfs, mais non expérimentés. Cela s'est avéré corrélé à une réduction des comportements analogues à l'anxiété. Par conséquent, les effets des lésions d'orexine sur la motivation et la performance sexuelles peuvent être secondaires à ses effets sur l'anxiété et l'excitation. En effet, des études antérieures ont suggéré que l'orexine joue un rôle dans l'anxiété, car la perfusion de l'orexine-A par ICV a diminué le temps d'action sur les bras ouverts de l'EPM chez la souris (Suzuki et al., 2005). L'injection d'orexine-A dans le noyau paraventriculaire du thalamus de rats mâles a permis de réduire le temps passé dans la zone centrale d'une chambre à champ ouvert et d'explorer de nouveaux objets exploratoires, ce qui indique que l'orexine pourrait être impliquée dans la génération d'un comportement semblable à celui de l'anxiété (Li et al., 2010). De plus, chez les rats mâles dominants qui présentent un risque accru de prise de l’EPM, les niveaux d’ARNm ORX1 dans la mPFC (Davis et al., 2009). Il a également été démontré que Orexin modifiait les réponses au stress (Ida et al., 1999; Ida et al., 2000), et la stimulation des récepteurs de l'orexine augmente la libération du facteur de libération de la corticotrophine (Al-Barazanji et al., 2001; Singareddy et al., 2006), corticostérone (Ida et al., 2000; Kuru et al., 2000) et l'hormone corticotrope (Kuru et al., 2000). Des antagonistes de l'orexine font actuellement l'objet d'essais cliniques pour le traitement de l'insomnie, un trouble souvent associé à des troubles anxieux (Sullivan et Neria, 2009), et il a été émis l’hypothèse que des antagonistes de l’ex-orexine pourraient potentiellement être utilisés pour traiter les troubles anxieux (Mathew et al., 2008). Etant donné le nombre croissant de preuves d’un rôle joué par orexin dans l’anxiété et l’excitation, il semble que les lésions à orexine puissent faciliter l’initiation du comportement sexuel chez les hommes naïfs en réduisant les réponses de type anxiété associées à l’introduction d’un nouveau stimulus, à savoir la femme.

Une activation significative des neurones à orexine a été observée après une excitation sexuelle et un comportement sexuel chez les animaux naïfs et expérimentés, dans les cellules PFA-DMH et LHA, avec 60 – 80% et 14% XRUMX% de cellules d’orexine exprimant respectivement les cFos. Il existe de nombreuses preuves en faveur d'une dichotomie dans la fonction neuronale de l'orexine au sein de la population de cellules d'orexine, le PFA-DMH étant impliqué de manière critique dans l'excitation et le LHA étant essentiels pour les comportements liés à la récompense (Harris et al., 2005; Harris et Aston-Jones, 2006, Aston-Jones, 2009a). Par conséquent, l'activation des cellules PFA-DMH orexin par le stimulus féminin confirme l'hypothèse selon laquelle l'orexin est activé par et est essentiel pour l'excitation sexuelle, y compris l'excitation sexuelle chez les hommes naïfs et expérimentés, et l'anxiété associée au nouveau stimulus féminin chez les hommes naïfs. Cependant, les cellules PFA-DMH ont été activées à des niveaux similaires indépendamment de l'expérience des hommes et du statut hormonal de la femme, ce qui suggère que les cellules PFA-DMH ont été activées au cours de l'excitation générale et non spécifiquement par l'excitation sexuelle. De plus, nos études ne supportent pas totalement l’existence d’une population de cellules d’exex complètement dichotomique, car il existait une activation significative du LHA suite à une exposition à tous les paramètres d’excitation et de performance sexuelles, que les comportements soient associés ou non à une récompense. Ainsi, les hommes expérimentés exposés à une femme anestrique présentaient des niveaux égaux d'activation des cellules orexine dans le LHA par rapport aux hommes expérimentés accouplant à l'éjaculation. Cependant, seul ce dernier groupe formera une préférence de lieu conditionnée pour l'accouplement (Tenk et al, 2009) suggérant que la copulation à l'éjaculation est plus enrichissante que d'autres éléments d'accouplement. La présente étude n'a pas spécifiquement testé le rôle de l'orexine dans la récompense sexuelle; par conséquent, de futures études sont nécessaires pour répondre à cette question.

En résumé, les résultats de ces études démontrent que l'orexine n'est pas critique pour la performance ou la motivation sexuelle. Au lieu de cela, il a été démontré que les lésions cellulaires orexines réduisaient l'anxiété, suggérant que l'orexine endogène est impliquée dans l'augmentation de l'anxiété. De plus, l'élimination de l'orexine a facilité l'initiation du comportement sexuel chez les hommes naïfs, suggérant que l'orexine endogène pourrait inhiber l'initiation de l'accouplement, éventuellement en augmentant l'anxiété en réponse au nouveau stimulus, c'est-à-dire la femelle. Ces découvertes permettent de mieux comprendre les circuits neuronaux impliqués dans la performance sexuelle et l'anxiété, et s'ajoutent à la littérature grandissante sur le rôle de l'orexine dans la médiation de l'excitation et de l'anxiété.

Remerciements

Cette recherche a été financée par des subventions des Instituts nationaux de la santé (R01 DA014591), des Instituts de recherche en santé du Canada (RN 014705) et du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (subvention à la découverte (341710) à LMC.

Notes

Avis de non-responsabilité de l'éditeur: Ceci est un fichier PDF d’un manuscrit non édité qui a été accepté pour publication. En tant que service à nos clients, nous fournissons cette première version du manuscrit. Le manuscrit subira une révision, une composition et une révision de la preuve résultante avant sa publication dans sa forme définitive. Veuillez noter que des erreurs pouvant affecter le contenu peuvent être découvertes au cours du processus de production, de même que tous les dénis de responsabilité qui s'appliquent à la revue.

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