L'inhibition neuronale transitoire révèle des rôles opposés des voies indirectes et directes dans la sensibilisation (2011)

Abstract

En dépit des conséquences négatives accablantes de la toxicomanie, l'usage et l'abus de psychostimulants demeurent répandus. La progression de l’exposition initiale à l’utilisation régulière du médicament, puis finalement à un comportement compulsif habituel et à la perte du contrôle inhibiteur implique une série d’adaptations moléculaires dans des neurocircuits discrets.^1,2,3. Le striatum a été identifié comme un site clé pour de nombreuses adaptations comportementales et neurobiologiques censées former les processus centraux de la dépendance^1,2,3. La majorité des neurones du striatum (~ 95%) sont des neurones à projection épineuse moyenne GABAergique (MSN) tqui diffèrent par leur expression neuropeptidique et forment deux voies principales efférentes⁴.

• Les MSN striatopallidaux contiennent de l’enképhaline (ENK) et constituent la voie indirecte.
• considérant que les MSN striatonigral contiennent de la dynorphine (DYN) et de la substance P et forment le trajet direct.

De nombreux modèles conceptuels supposent que ces populations de MSN s’opposent mécaniquement et fonctionnellement.^5,6. Cependant, il existe peu de preuves empiriques à l’appui de leur rôle différentiel dans le contrôle du comportement, car ces populations de cellules sont physiquement mélangées et impossibles à distinguer morphologiquement, rendant ainsi la manipulation sélective techniquement insaisissable.

Pour examiner le rôle de ces populations de cellules striatales dans le développement de comportements suite à une exposition répétée à des drogues d'abus, nous avons combiné deux stratégies novatrices: des vecteurs viraux utilisant les promoteurs du gène ENK ou DYN pour cibler l'expression du transgène en neurones striatopallidaux ou striatonigraux. , respectivement, et un GPCR conçu (G_{i / o}muscarinique humain couplé M₄ DREADD; Designer Receptor exclusivement activé par un médicament de designer; hM₄D)⁷ qui est activé par un ligand par ailleurs pharmacologiquement inerte, la clozapine-N-oxyde^8,9 (CNO; Fig. 1a, h). Après expression dans des neurones en culture, l’administration de CNO stimule la G_{i / o}couplé hM₄Les récepteurs D activant ainsi les canaux de potassium 3 (Kir3) rectifiant intérieurement, entraînant une hyperpolarisation de la membrane et un silençage neuronal transitoire⁹.

  

Figure 1

Atténuation transitoire et ciblée de la signalisation cellulaire striatale. (a, h) Cartes d'amplicon de pENK-hM₄D/pENK-GFP (a) et PDYN-hM₄D/pDYN-GFP (h) vecteurs de ciblage. (b, je) La microscopie confocale a montré que pENK-hM₄D les récepteurs ont été sélectivement exprimés en striatopallidal ...

Pour tester la spécificité phénotypique cellulaire des vecteurs viraux, nous avons utilisé la microscopie à immunofluorescence double étiquette après la perfusion dorsale de striatum de virus (Fig. Supplémentaire 1) exprimant le hM marqué par l'hémagglutinine₄Récepteurs D sous le contrôle du promoteur ENK (pENK-hM₄D) ou le promoteur DYN (pDYN-hM₄D). Nous avons trouvé que pENK-hM₄D l'expression était principalement dans les MSN contenant ENK (90% des cellules d'hémagglutinine étaient ENK +, 85 sur 94; 6% des cellules d'hémagglutinine étaient la substance P +, 4 sur des cellules 70; Fig. 1b) alors que pDYN-hM₄D l'expression était principalement dans les substances MSN contenant la substance P (95% des cellules d'hémagglutinine étaient la substance P +, 109 sur des cellules 115; 5% des cellules de l'hémagglutinine étaient des cellules ENK +, 5 sur des cellules 97; Fig. 1i). Des résultats similaires ont été obtenus après perfusion de virus spécifiques du promoteur exprimant la protéine fluorescente verte (pENK-GFP et pDYN-GFP; SupplémentairesFigs. 2a et 3a).

Etant donné que les MSN striatopallidaux s’adressent principalement au globus pallidus external (GPe) et les striatonigraux MSN à la substantia nigra pars reticulata (SNpr), nous avons utilisé des injections du traceur rétrograde Fluoro-Gold dans ces régions du cerveau, suivies d’une immunohistochimie à double étiquette fluorescente. pour confirmer que le pENK et pDYN les virus ont donné une infection spécifique à la voie. Nous avons observé que pENK-GFP cellules co-localisées avec l’expression striatale de Fluoro-Gold après des perfusions dans le GPe mais pas dans le SNpr (Fig. Supplémentaire 2b) alors que pDYN-GFP cellules co-localisées avec l’expression striatale de Fluoro-Gold à la suite de perfusions dans le SNpr mais pas dans le GPe (Fig. Supplémentaire 3b). L'expression des vecteurs viraux n'a pas modifié le nombre de neurones ENK + ou de substance P + dans la région d'infection virale, ce qui suggère que l'utilisation de ces promoteurs pour le transfert de gène à médiation virale n'interfère pas avec les niveaux de neuropeptides endogènes. Tous ces résultats démontrent que le pENK et pDYN Les vecteurs viraux expriment des gènes dans leurs populations de cellules striatales séparées de manière appropriée.

Bien que₄Des techniques basées sur le récepteur D ont été démontrées pour moduler l'activité d'autres types de neurones⁹, leur capacité à affecter les neurones striataux n’a pas été examinée. Par conséquent, nous avons infecté les neurones à épines striatales moyens avec hM₄Récepteurs D sous le contrôle d'un promoteur du virus de l'herpès simplex (HSV), ont préparé des tranches coronales de striatum dorsal deux jours plus tard et ont examiné comment hM₄Les neurones striataux épineux moyens exprimant D réagissent au CNO. Nous avons observé que l'application locale de CNO (10 µM) induisait une hyperpolarisation du potentiel membranaire (~ 7 mV, le potentiel membranaire de base était ajusté à -80 mV; Fig. 1c) et réduit la résistance des neurones en entrée après l’application de CNO (Fig. 1d, e), suggérant que la conductance du potassium (c'est-à-dire le courant médié par Kir3) est activée par CNO dans hM₄Neurones exprimant le récepteur D. En outre, la perfusion de CNO a considérablement diminué le nombre de potentiels d’action évoqués chez les hM.₄Neurones exprimant D, mais pas dans les cellules de contrôle, inhibant ainsi efficacement la sortie fonctionnelle des neurones infectés par le virus Expression de hM₄Les récepteurs D seuls n’ont pas modifié la résistance d’entrée (P = 0.84) ou potentiel d’action ((P = 0.64). (Fig. 1f, g). Pris ensemble, ces données suggèrent que, semblable aux neurones de l'hippocampe⁹, le hM₄La méthode à base de D / CNO peut effectivement diminuer l’excitabilité des neurones striataux chez le rat.

En guise de preuve de concept supplémentaire, nous avons vérifié si hM₄Les récepteurs D bloqueraient la neurotransmission dans un circuit bien établi où l'activité neuronale est évoquée de manière prévisible par des stimuli pertinents pour le comportement. En conséquence, nous avons infecté les neurones de la région tegmentale ventrale (VTA) avec hM₄Récepteurs D sous le contrôle d'un promoteur du HSV, qui s'exprime fortement dans les neurones à dopamine¹⁰et a utilisé la voltamétrie cyclique à balayage rapide pour mesurer les changements dans la libération de dopamine dans le noyau accumbens après la délivrance inattendue d’une récompense alimentaire.¹¹. L’administration de CNO atténue de manière significative la libération de dopamine évoquée dans les aliments dans le noyau accumbens par rapport au véhicule (Fig. Supplémentaire 4). Enfin, nous avons testé si l’activité décroissante de types de cellules neuronales spécifiques dans le striatum in vivo pourrait altérer la capacité de l'amphétamine à stimuler l'expression de Fos. Les psychostimulants, tels que l’amphétamine, sont de puissants activateurs de lafos dans le striatum¹² et va augmenter c-fos dans les deux neurones striatonigral et striatopallidal dans nos conditions expérimentales¹³. En plus de son utilisation comme marqueur de l’activité neuronale, l’induction psychostimulante de c-1fos est considéré comme jouant un rôle important dans l'initiation et le maintien des adaptations neuronales associées à la sensibilisation psychomotrice^1,14. Nous avons constaté que l'activation médiée par CNO de pENK-hM₄D récepteurs ont considérablement réduit le nombre total de cellules c-Fos induites par l'amphétamine dans le striatum (Fig. 1k ainsi que le Fig. Supplémentaire 5a). Cette réduction s’est produite dans les deux neurones positifs pour l’hémagglutinine (c’est-à-dire ceux exprimant₄Récepteurs D) et des neurones négatifs pour l'hémagglutinine (c'est-à-dire ceux qui n'expriment pas hM₄Récepteurs D; Fig. 1l), suggérant un effet de diaphonie neuronale entre hM et₄Neurones D-exprimants et neurones non infectés. Des réductions significatives du nombre total de cellules c-Fos évoquées par l'amphétamine et du nombre de cellules c-Fos positives pour l'hémagglutinine ont également été observées lorsque₄Les récepteurs D ont été activés dans les neurones à voie directe (Fig. 1n, o ainsi que le Fig. Supplémentaire 5b). Fait important, ces effets ne sont pas simplement causés par l’expression virale d’un nouveau récepteur, car l’expression deENK-hM₄D ou pDYN-hM₄D En l'absence de traitement par CNO, les récepteurs n'ont eu aucun effet sur le nombre de cellules Fos évoquées par l'amphétamine (Figures supplémentaires 6 et 7). Ainsi, ces résultats démontrent que l’activation médiée par CNO de hM₄Les récepteurs D peuvent également entraîner une diminution de l'activité neuronale en réduisant la libération de neurotransmetteur et en atténuant la signalisation intracellulaire.

Une exposition répétée à des drogues entraînant une dépendance peut entraîner une augmentation progressive et persistante de la réactivité comportementale, souvent appelée sensibilisation au comportement. Fait important, la sensibilisation implique certains des mêmes circuits neuronaux impliqués dans le développement de la toxicomanie humaine³. Ici, nous utilisons nos nouveaux outils pour étudier l’effet de l’atténuation spécifique de l’activité neuronale striatale sur le développement de la sensibilisation aux amphétamines. Nous avons émis l'hypothèse que les neurones à voie directe et indirecte ont des rôles opposés dans lesquels les neurones du striatonigral favorisent la sensibilisation et les neurones du striatopallide suppriment la sensibilisation, conformément à leurs rôles conceptuels proposés dans l'activation et l'inhibition du comportement^5,6. En conséquence, nous avons vérifié si l’excitabilité neuronale diminuant biochimiquement des neurones striatopallidaux induirait une sensibilisation à un régime posologique d’amphétamine entraînant un seuil de sensibilisation et si une diminution de l’excitabilité neuronale des neurones striatonigraux l’empêche dans un protocole produisant normalement une sensibilisation robuste.

Pour la première étude, nous avons utilisé un schéma thérapeutique qui induit un seuil de sensibilisation locomotrice chez les témoins GFP (exposition à quatre médicaments). Après une période d'attente, une dose d'amphétamine d'épreuve modérée (2 en mg / kg) a été administrée en l'absence d'atténuation de l'activité neuronale induite par le CNO afin de déterminer si la sensibilisation était persistante. Activation médiée par CNO de pENK-hM₄D traitement par les amphétamines n’a pas modifié la réponse locomotrice aiguë à l’amphétamine (Fig. 2a). Cependant, la perturbation de l’activité neuronale induite par les CNO dans les neurones à voie indirecte a facilité le développement d’une sensibilisation beaucoup plus robuste que celle des témoins GFP (Fig. 2b). Cette sensibilisation accrue a été maintenue lors de la provocation par amphétamine, réalisée une semaine plus tard en l'absence de traitement par CNO (Fig. 2c, d). Ces effets peuvent être attribués à une réduction dépendante du CNO de l'activité des neurones striatopallidaux par hM₄Récepteurs D parce que hM₄L’expression de récepteurs D sans traitement par CNO ne provoque pas de sensibilisation locomotrice à ce schéma posologique léger d’amphétamine (Fig. Supplémentaire 6).

  

Figure 2

La réduction transitoire de l'excitabilité des neurones striatopallidaux ou striatonigraux a eu des effets opposés sur la sensibilisation aux amphétamines. (a, e) Réponses locomotrices aiguës à l'amphétamine après l'activation de p par le CNOENK-hM₄D (a) et PDYN-hM₄D (e) récepteurs. ...

Afin de déterminer si les neurones du striatonigral peuvent réguler la réponse aux médicaments de manière opposée, nous avons ensuite testé l’effet de l’excitabilité diminuant biochimiquement des neurones du striatonigral dans le striatum dorsomédial au cours d’un traitement médicamenteux à base d’amphétamine qui produit une forte sensibilisation chez les contrôles de ) ainsi que pendant une dose d'amphétamine d'attaque faible (0.5 mg / kg) en l'absence de perturbation de l'activité neuronale induite par les récepteurs. Comme pour l'amortissement indirect de la voie, la diminution de l'excitabilité des neurones à voie directe induite par le CNO pendant le traitement par l'amphétamine n'a pas modifié la réponse locomotrice aiguë à l'amphétamine (Fig. 2e). Bien que le développement de la sensibilisation soit apparu similaire aux contrôles de la GFP après l'activation induite par le CNODYN-hM₄D récepteurs au cours de la phase de traitement (Fig. 2f), la sensibilisation n'a pas persisté dans leDYN-hM₄D groupe, mais était toujours bien maintenu dans les contrôles GFP (Fig. 2g, h). Ces effets peuvent également être attribués à une diminution de l'activité des neurones du striatonigral dépendante du CNO₄Récepteurs D parce que hM₄L'expression du récepteur D en l'absence de traitement par CNO n'a pas bloqué le développement d'une sensibilisation locomotrice, une sensibilisation ayant été observée pendant la phase de traitement et lors de l'administration du médicament (Fig. Supplémentaire 7). Ces données suggèrent que les neurones du striatonigral pourraient être particulièrement importants pour réguler les adaptations comportementales à long terme qui sont la conséquence d'une consommation répétée de drogues.

En conclusion, ces données fournissent la première preuve des rôles critiques et opposés des neurones striatopallidaux et striatonigraux dans la régulation de la plasticité du comportement dépendant de l'expérience du médicament. De plus, l'absence d'effet de l'inhibition neuronale sur la réponse locomotrice aiguë à l'amphétamine fournit une preuve supplémentaire que les mécanismes régulant les réponses aiguës aux médicaments sont distincts de ceux qui modulent les adaptations durables qui se produisent lors d'une exposition répétée au médicament. Enfin, l'association de vecteurs viraux phénotypiques spécifiques à des récepteurs de concepteur capables de modifier l'activité neuronale sans perturber en permanence la fonction cellulaire offre une approche nouvelle et puissante pour déconstruire les bases moléculaires de la dépendance.

Matériel complémentaire

Remerciements

Notes

Bibliographie