Sensibilidade de recompensa para um pico de recompensa alimentar palatável durante o desenvolvimento puberal em ratos (2010)

Design experimental

Diferentes grupos de animais foram usados ​​para todos os três experimentos: ingestão de SCM (1), teste de razão progressiva (PR) (2) e estimulação de c-fos por condicionamento de odor apetitivo (3), para avaliar o desenvolvimento de diferentes aspectos comportamentais e neurobiológicos da sensibilidade à recompensa ao longo da adolescência, em particular durante o período puberal, até a idade adulta. A puberdade em ratos machos atinge de cerca de 40 a 60 dp (Schneider, 2008). Em contraste com a puberdade, o momento exato da adolescência é bastante difícil de definir em animais de laboratório. Por definição, a adolescência abrange o período completo da infância à idade adulta, incluindo o período puberal (Sisk e Foster, 2004). Portanto, a adolescência começa no período juvenil, logo após o desmame (por volta dos 22 dias úteis), estendendo-se até a maturidade sexual no final da puberdade e continuando até o início da idade adulta (∼ 70/80 dias úteis em ratos machos).

Para todos os experimentos comportamentais, o SCM (Nestle AG, Frankfurt, Alemanha; diluído 1:3 com água da torneira) foi usado como estímulo recompensador. Dois dias antes do primeiro teste experimental, os ratos foram habituados ao SCM durante a noite em suas gaiolas. (1) A ingestão de SCM foi testada repetidamente em um grupo (n=12) de animais adolescentes em pd 30, 40, 50, 60, 70, 80 e 90 para obter dados consumatórios cobrindo todo o período da pré-puberdade à idade adulta. Além disso, o progresso do ganho de peso foi medido continuamente nesses ratos. Os pesos corporais foram registrados a cada décimo dia e o ganho de peso percentual em relação ao peso corporal anterior foi calculado usando a fórmula {[ganho de peso (t1−t2)/peso corporal (t1)] ×100}. Além disso, um segundo grupo de animais adultos (n=12) foi testado repetidamente para consumo de SCM em pd 100, 110, 120 e 130 para controlar os efeitos de testes repetidos. (2) Para o experimento de RP, três grupos de animais foram testados: ratos no início da puberdade com idade de pd 40 no dia do teste (n=15), ratos em puberdade média com idade de 50 anos no dia do teste (n=15) e animais adultos com 90 anosdias (n=11). (3) Finalmente, a estimulação c-fos induzida por estímulo foi feita em três grupos etários diferentes, com metade dos animais treinados para associação de odores e a outra metade treinada de forma simulada. A exposição ao odor ocorreu em pd 40 (n=10), pág. 50 (n=10), ou pd 90 (n=

Teste comportamental

Imuno-histoquímica para c-fos

Cérebros congelados foram fatiados em seções coronais de 10 μm em um criostato e imediatamente descongelados em lâminas de vidro Superfrost. Para o presente estudo, o núcleo accumbens (NACc) e a concha (NACs), bem como o estriado dorsal (dStr), foram escolhidos para regiões de interesse. Após a fixação das seções cerebrais com 4% de PFA, elas foram lavadas com 1× PBS e peroxidases endógenas foram extintas com 0.3% de H₂O₂ em 1× PBS. As lâminas foram lavadas em 1× PBS e 1× PBS/Tween-20 e bloqueado com soro de cabra. Para melhorar a sinalização c-fos, separe 15bloqueios min para avidina e biotina (VectorLab, Burlingame, CA, EUA) foram conduzidos. O anticorpo policlonal de coelho C-fos (Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi diluído 1:100 em 1×PBS e seções foram incubadas por 30min a 37°C. O segundo anticorpo foi um IGg anti-coelho de cabra biotinilado (VectorLab, Burlingame, CA, EUA) diluído 1:200 em 1× PBS e soro de cabra e foi incubado por 30min à temperatura ambiente. O kit Vectastain Elite ABC (VectorLab, Burlingame, CA, EUA) foi aplicado nas seções por 30min à temperatura ambiente antes da coloração DAB. A coloração foi interrompida enxaguando as lâminas com água bidestilada. Posteriormente, as seções do cérebro foram desidratadas por banhos de etanol graduados e clarificadas por Xilol antes de serem montadas em Eukitt. ​​As imagens foram capturadas usando o microscópio Axioskop 2 (Zeiss, Jena, Alemanha) com uma objetiva de ar de 20× (NA 0.5) e uma câmera Olympus ColorView 3. Em um nível de plano de seção de +2 a +1.6mm de Bregma, segundo Paxinos e Watson (1998) atlas do cérebro de rato, um 250mm×250μm foi posicionado aleatoriamente nas áreas amostradas e todas as células marcadas com c-fos nesta seção foram contadas usando ImageJ.

Proporção progressiva

Durante a sessão de teste de RP, 50 ratos em meados da puberdade pressionaram significativamente mais frequentemente a alavanca para obter SCM em comparação com ratos mais jovens e adultos (ANOVA F_2,38 =4.23 p=0.02 LSD de pescador p=0.05/0.008 para pd 40/adulto, respectivamente) (Figura (Figura 3A).3A). Consequentemente, o HCR foi significativamente maior para ratos pd 50 (ANOVA F_2,38 =4.78 p=0.01 LSD de pescador p=0.05/0.005 para pd 40/adulto, respectivamente) (Figura (Figura 3B).3B). O total de pressões de alavanca e o HCR de ratos no início da puberdade e adultos não diferiram significativamente (p>0.05). Não foi encontrada diferença no ponto de quebra para todas as três faixas etárias (ANOVA F_2,38 =1.37 p=0.27) (Figura (Figura 3C).3C). A comparação do consumo de SCM corrigido para o peso corporal dentro do teste de RP revelou diferenças altamente significativas entre todos os grupos (ANOVA F_2,38 =53,68 p≤0.001). Enquanto os ratos com 40 anos de idade apresentaram a maior ingestão, ambos os grupos púberes diferiram significativamente dos animais adultos (p≤0.001) (valores: pd 40: 5.35±0.27; pd 50: 4.18±0.17; pd 90: 2.17±0.13 todos os valores estão em ml/kg de peso corporal±SE).

 

Figura 3

Desempenho da proporção progressiva de ratos no início (pd 40), na puberdade média (pd 50) e adultos (pd 90). A figura representa o total de pressões de alavanca (UMA), RHC (B) e o ponto de ruptura (IR) (C). O desempenho dos ratos na puberdade média diferiu significativamente do desempenho dos ratos no início da puberdade. ...

Ingestão SCM gratuita e limitada

A medição repetida da ingestão de SCM em um paradigma de acesso limitado de pd 30 (pré-puberdade) a pd 90 (idade adulta) revelou uma ingestão significativamente maior, em relação ao peso corporal, durante o período puberal em comparação à idade adulta. Essa alta ingestão puberal de um líquido palatável está de acordo com os dados relatados para solução de sacarose a 1% em ratos Sprague-Dawley machos adolescentes testados entre pd 28 e pd 42 (Wilmouth e Spear, 2009). Neste estudo, a ingestão de água e 24% de sacarose durante 1 horas foi medida em um teste de escolha de 2 garrafas ao longo de 14 dias. Os ratos adolescentes beberam significativamente mais sacarose do que os adultos e também mais do que água, enquanto que nos ratos adultos a ingestão de água e sacarose não diferiu. O desenho longitudinal do nosso estudo permitiu um monitoramento sistemático da progressão do consumo de recompensa natural dos adolescentes além do pd 42. O pico no consumo de SCM foi observado no pd 50, seguido por um declínio acentuado até o pd 70 e uma diminuição adicional para um nível de consumo adulto estável que foi alcançado no pd 90. Ao usar o critério de BPS como marcador claramente definível do início da puberdade, a janela de tempo da puberdade em ratos machos é considerada aproximadamente entre o pd 40 e o pd 60 (Schneider, 2008). A partir dos dados atuais, parece, portanto, que durante a adolescência, o período restrito do desenvolvimento puberal é a janela de tempo mais sensível para a elevação da ingestão de recompensas.

O consumo de recompensas naturais é impulsionado principalmente pela palatabilidade e pelo estado homeostático do organismo. Um ponto importante a ser considerado para testes consumatórios durante o desenvolvimento é a hiperfagia adolescente, com humanos e ratos exibindo maior ingestão calórica em relação ao seu peso corporal do que em qualquer outro momento da vida (Nance, 1983; Post e Kemper, 1993). Para minimizar a interferência das demandas calóricas variadas no consumo de SCM, os ratos foram alimentados permanentemente ad libitum. Maior consumo de SCM durante o curto acesso experimental de 15min pode, portanto, refletir uma maior preferência pela recompensa em vez de compensar as demandas calóricas em ratos púberes. Isso é ainda mais apoiado por nossas descobertas sobre ganhos de peso durante a puberdade, uma vez que o aumento no peso corporal seguiu uma função logarítmica com o maior surto de crescimento observado entre pd 30 e 40. A demanda calórica deve, portanto, ser mais alta neste intervalo de tempo específico. Consequentemente, uma influência potencial da demanda calórica aumentada na ingestão de SCM também seria esperada para ser mais forte entre pd 30 e pd 40. O pico no consumo de SCM observado em pd 50 pode, portanto, ser considerado como sendo menos afetado pelas demandas calóricas e principalmente influenciado pela sensibilidade aumentada em relação às propriedades recompensadoras de SCM. Embora nenhuma correlação direta pudesse ser observada entre o pico no consumo e o maior surto de crescimento com o início da puberdade, uma preferência potencial por alimentos altamente calóricos durante períodos de crescimento dinâmico como a adolescência pode ser importante de uma perspectiva evolutiva e, portanto, uma influência das demandas calóricas não pode ser completamente excluída. No entanto, foi demonstrado que o aumento da sensibilidade à recompensa durante a adolescência não se restringe às recompensas alimentares, mas pode ser observado também em outras recompensas naturais e recompensas medicamentosas, independentemente do conteúdo calórico (Spear, 2000; Brenhouse e Andersen, 2008).

Resultados semelhantes que apoiam a suposição de que o conteúdo calórico não é fundamentalmente importante para o consumo de alimentos saborosos foram relatados anteriormente por Gilbert e Sherman (1970). Eles encontraram uma ingestão líquida comparável de sacarose e soluções de sacarina não calórica em ratos privados de alimentos, indicando que o sabor doce tem um impacto mais forte no consumo em comparação ao valor nutricional de um fluido palatável. Além disso, consistente com nossas descobertas atuais, maior preferência por sabores doces foi observada durante a puberdade em roedores e humanos (Desor e Beauchamp, 1987; Vaidya e outros, 2004), indicando um aumento transitório na sensibilidade em relação às propriedades apetitivas das recompensas alimentares durante o desenvolvimento. Outras evidências de uma sensibilidade hedônica alterada em relação aos estímulos alimentares apetitivos e aversivos durante a adolescência foram fornecidas por Wilmouth e Spear (2009). Usando o paradigma da reatividade do paladar, que se acredita medir diretamente o valor hedônico dos estímulos apresentados oralmente (Grill e Norgren, 1978), eles mediram comportamentos estereotipados positivos e negativos de ratos adolescentes (pd 30–34) e adultos (pd 72–73) em resposta a infusões orais de soluções de sacarose com concentrações diferentes ou um líquido contendo quinina. Ratos adolescentes exibiram respostas significativamente mais positivas do que animais adultos durante a infusão de 10% de sacarose e aumentaram essa resposta já em uma concentração de sacarose de 3.4% na qual o padrão de resposta de ratos adultos não diferiu da condição da água. Ao contrário, a infusão de quinina provocou apenas em ratos adultos respostas significativamente mais negativas em comparação à água.

Tomados em conjunto, esses dados indicam que a sensibilidade aos aspectos hedônicos positivos de estímulos recompensadores é temporariamente aumentada, enquanto para estímulos valorizados negativamente ela é atenuada em ratos adolescentes, e essas descobertas são consistentes com nossa observação atual de maior ingestão de SCM durante a puberdade.

Em nosso estudo, testes repetidos de ingestão de SCM em ratos adultos mostraram volumes constantes de bebida sem quaisquer efeitos de novo teste. Esses dados demonstram que testes repetidos para ingestão de SCM não produzem habituação nem sensibilização para essa recompensa alimentar e, portanto, indicam que o curso característico da ingestão de SCM durante a adolescência não está relacionado a nenhum fator de confusão.

Proporção progressiva

Para avaliar potenciais mudanças na motivação para SCM durante o início da puberdade, puberdade média e idade adulta, animais na respectiva faixa etária foram testados em um paradigma de RP. Como um número crescente de pressões de alavanca para cada reforçador subsequente é necessário nesta tarefa, o desempenho de RP tem sido comumente usado como um índice de motivação e o esforço que um sujeito está disposto a exercer para obter um reforçador (Hodos e Kalman, 1963; Stafford e outros, 1998; Sanchis-Segura e Spanagel, 2006). O desempenho em RP para SCM revelou pressões totais de alavanca e HCR significativamente maiores para ratos pd 50 em meados da puberdade em comparação com animais púberes e adultos pd 40. Os ratos púberes não diferiram em desempenho dos ratos adultos. No entanto, ao levar em conta o maior esforço físico de pressão de alavanca para ratos jovens em comparação com ratos crescidos (pd 40 e ratos adultos tinham pesos corporais médios de 147g e 331g, respectivamente), é notável que ratos no início da puberdade tiveram desempenho equivalente em pressões totais de alavanca e HCR em relação a animais adultos.

Não foram encontradas diferenças entre os diferentes grupos quanto à ocorrência do ponto de quebra (definido como inatividade durante um período de 2min). A ocorrência do ponto de quebra não é influenciada apenas por aspectos motivacionais, mas a frustração induzida pela omissão inesperada de recompensa também pode contribuir para essa primeira quebra na perseverança. Nesse contexto, pudemos mostrar antes, em um estudo anterior, que embora o total de pressões de alavanca e o HCR durante uma sessão de 30 min tenham sido altamente reduzidos pelo antagonista do receptor opioide naloxona, esse tratamento não afetou os pontos de quebra para SCM, indicando uma regulação neuronal diferencial dessas medidas (Schneider et al., 2010). Portanto, os dados obtidos em nosso estudo atual estão indicando que a idade não está influenciando a reação a eventos frustrantes, no entanto, após a ocorrência desta primeira quebra na resposta, ratos em meados da puberdade continuaram a investir mais esforço para a recompensa alimentar palatável, resultando em um número total maior de pressões de alavanca e HCR em comparação com animais no início da puberdade e adultos. Um esforço maior investido por ratos púberes para SCM pode ser mediado por um aumento potencial de incentivo motivacional para SCM durante esta idade. Relatórios anteriores já indicam motivação aprimorada para outras recompensas naturais, como brincadeiras sociais ou novidades em ratos adolescentes (para revisão Doremus-Fitzwater et al., 2010). Nestes estudos, um paradigma de preferência de lugar condicionado (CPP) foi usado como uma medida indireta de motivação para abordar um compartimento que foi previamente pareado com um parceiro social ou novos objetos, respectivamente (Douglas et al., 2003, 2004). Em ambos os casos, a proporção de tempo gasto no compartimento pareado para o não pareado foi maior para ratos adolescentes machos (pd 38) em comparação aos adultos. No entanto, ratos púberes (pd 40) e adultos, treinados para pressionar a alavanca para sacarina, não diferiram no número de pressionamentos de alavanca quando testados em esquemas fixos ou de RP (Shram et al., 2008). Apesar de respostas operantes semelhantes, um consumo significativamente maior de sacarina durante as sessões de teste foi observado em ratos adolescentes quando os reforços de sacarina recebidos foram ajustados para o peso corporal dos animais. Essa diferença foi mais pronunciada sob o esquema de razão fixa mais alta (FR 5) e com concentrações crescentes de sacarina. Ao calcular a quantidade de reforçadores (SCM) obtidos (ajustados para o peso corporal) em nosso teste de RP, detectamos um resultado semelhante. A maior quantidade de SCM em relação ao peso corporal foi obtida por ratos no início da puberdade e na puberdade média em comparação com animais adultos. O consumo ajustado durante o teste de RP apoia fortemente a interpretação da motivação aprimorada para recompensas naturais durante a adolescência, mas também aponta para uma análise cuidadosa do desempenho do comportamento instrumental em estudos de desenvolvimento. A influência de diferenças parcialmente substanciais no peso corporal, esforço físico ou capacidade de ingestão dos animais testados precisa ser considerada na interpretação do desempenho operante e na comparação de idade.

O comportamento medido em RP é influenciado por múltiplas variáveis, como incentivo motivacional e aspectos hedônicos do reforçador ou o estado interno do sujeito. A comparação da ativação e liberação de neurotransmissores em substratos neuronais relacionados com incentivo e processamento motivacional em humanos e animais adolescentes e adultos revelou mudanças maturacionais marcantes em regiões cerebrais subcorticais e pré-frontais e seus neurocircuitos (Chambers et al., 2003; Tripulações e outros, 2007; Casey e outros, 2008; Ernst et al. 2009; Geier e Luna, 2009). Durante a adolescência, ocorre uma ativação monoaminérgica aumentada do sistema frontoestriatal (Nakano e Mizuno, 1996; Andersen e Teicher, 2000; Tarazi e Baldessarini, 2000; Haycock e outros, 2003) está associado a níveis mais elevados de impulsividade e maior capacidade de resposta a recompensas e drogas (Chambers et al., 2003; Kuhn e outros, 2009; Doremus-Fitzwater et al. 2010). Da mesma forma, mudanças consideráveis ​​no desenvolvimento foram relatadas para os dois sistemas neuropeptídicos propostos para mediar os aspectos hedônicos da recompensa, a saber, o sistema opioide e o sistema endocanabinoide (Solinas e Goldberg, 2005; Solinas et al. 2007; Ellgren e outros, 2008). Uma regulação positiva transitória do sistema endocanabinoide durante a adolescência é indicada pela ligação aumentada do radioligante no receptor canabinoide 1 (CB1) nas estruturas límbicas (Rodriguez de Fonseca et al., 1993) ou aumento da expressão de anandamida no início da puberdade (pd 38) em múltiplas regiões do cérebro como, por exemplo, NAC e putâmen caudado (Ellgren et al., 2008) ou hipotálamo (Wenger et al., 2002; para uma revisão detalhada, veja Schneider, 2008). Embora níveis estáveis ​​de Met-encefalina e receptores opioides μ (μOR) tenham sido relatados durante a adolescência (Ellgren et al., 2008), efeitos estimulatórios mais elevados do agonista μOR DAMGO na facilitação social foram encontrados durante o início da adolescência (Varlinskaya e Spear, 2008).

Integrar as mudanças neurodesenvolvimentais que acompanham a adolescência indica fortemente uma maior sensibilidade em relação aos aspectos hedônicos e motivacionais de recompensas naturais, bem como de drogas de abuso durante essa fase de desenvolvimento devido a uma resposta neurobiológica aprimorada em relação aos estímulos recompensadores. O maior esforço e consumo de SCM observados para ratos púberes em RP apoiam ainda mais essa suposição. De acordo com nossos dados consumatórios para SCM, o efeito motivacional foi mais pronunciado em ratos no meio da puberdade.

Expressão C-fos

A expressão dos níveis de proteína c-fos, o produto traduzido do gene inicial imediato c-fos, é geralmente considerada um marcador de ativação neuronal em regiões cerebrais específicas em resposta a múltiplos estímulos (Hughes e Dragunow, 1995). No presente estudo, os níveis de proteína c-fos foram medidos no estriado dorsal e ventral após a apresentação de um sinal de odor associado ao SCM em ratos na puberdade (pd 40 e 50) e na idade adulta (pd 90).

Foi demonstrado que o acesso a recompensas alimentares palatáveis, como soluções de sacarose, induz de forma robusta a expressão de c-fos em diferentes áreas do cérebro em ratos (por exemplo, Streefland et al., 1996; Grippo et al., 2004; Norgren e outros, 2006; Mungarndee et al., 2008). Até mesmo a apresentação de uma sugestão que tenha sido previamente pareada com uma recompensa pode ativar a expressão de c-fos (Miller e Marshall, 2005; Zhang et al. 2005). Em nosso estudo atual, descobrimos que a expressão de c-fos após a apresentação do sinal de odor foi sempre maior em grupos que passaram por treinamento de associação de odor-recompensa, independentemente da idade, em comparação com grupos de controle treinados com simulação, indicando um aumento específico na atividade neuronal em resposta ao odor condicionado. Além disso, observamos uma expressão significativamente maior de c-fos no dStr e no NACc em ambos os grupos púberes em comparação com ratos adultos. Embora mais células marcadas com c-fos tenham sido detectadas em todos os ratos púberes, o aumento foi mais pronunciado em animais pd 50. Nos NACs, nenhuma diferença significativa entre animais púberes e adultos pôde ser encontrada.

Embora a atividade de c-fos em estruturas cerebrais associadas à recompensa seja considerada apenas uma medida correlativa da percepção e do processamento da recompensa, uma influência direta da magnitude da recompensa na indução da expressão de c-fos foi demonstrada após autoestimulação intracraniana em ratos (Panagis et al., 1997). Nossas descobertas estão indicando atividade neuronal aumentada de estruturas cerebrais relacionadas à recompensa após a apresentação da sugestão associada à recompensa em ratos púberes e, portanto, estão apoiando a hipótese de que estímulos recompensadores têm um incentivo maior durante a adolescência e não o oposto. Essa descoberta é consistente com outros estudos em humanos e roedores (Laviola et al., 2003; Ernst et al. 2005; Galvan e outros, 2006; Mungarndee et al., 2008; Kringelbach e Berridge, 2009). Por exemplo, Ernst et al. (2005) monitoraram a atividade cerebral de sujeitos humanos adolescentes e adultos durante a antecipação, ganho ou omissão de recompensas monetárias com fMRI. Adolescentes mostraram maior atividade no NAC ao ganhar uma recompensa em comparação aos adultos.

A expressão pronunciada da proteína c-fos em dStr observada em nosso estudo é consistente com outros estudos que relatam ativação aumentada e sustentada nesta região após a apresentação de recompensa (Delgado et al., 2003). Da mesma forma, os estudos de fMRI geralmente relatam aumentos nas respostas dependentes do nível de oxigenação sanguínea (BOLD) no dStr durante a antecipação de qualquer um dos eventos primários (O'Doherty et al., 2002) ou secundária (Knutson et al., 2001) recompensas. O dStr também é considerado um componente importante do sistema motivacional e de recompensa do cérebro (Wise, 2009). Sabe-se que este subsistema dopaminérgico está criticamente envolvido em processos motivacionais e associados à recompensa (Wise, 2004) e está subjacente às mudanças maturacionais durante a puberdade (Spear, 2000; Andersen, 2002). Essa maior suscetibilidade e reatividade das estruturas cerebrais relacionadas à recompensa em relação às recompensas durante a adolescência é refletida por nossa descoberta atual de células marcadas com c-fos significativamente mais altas em dStr e NACc em animais púberes em comparação com adultos. A expressão mais forte em NACc para ratos em meados da puberdade pode ser potencialmente explicada por uma sensibilidade aumentada ao SCM, levando a uma maior valorização da sugestão condicionada e uma resposta neuronal aprimorada à sua apresentação. Conforme discutido acima, ratos em meados da puberdade também mostraram o maior comportamento consumatório e motivacional para SCM. Embora os NACs tenham sido considerados uma estrutura cerebral importante na mediação da avaliação hedônica de recompensas (Pecina e Berridge, 2000), não conseguimos detectar diferenças na expressão de c-fos entre ratos púberes e adultos para esta região específica. Como em nossa configuração experimental a expressão de c-fos foi examinada após a apresentação do sinal de odor associado e não após a apresentação direta do SCM, isso pode ter contribuído para uma ativação neuronal menos aprimorada dos NACs. De fato, alguns estudos estão indicando um papel mais pronunciado do NACc na formação de associações de estímulos condicionados e não condicionados e na busca por drogas induzida por sinais (Parkinson et al., 1999; Miller e Marshall, 2005; Chaudhri e outros, 2010).

Tomados em conjunto, os achados presentes apoiam fortemente a importância das estruturas estriatais no processamento de pistas relacionadas a estímulos agradáveis. Além disso, a expressão aumentada de c-fos induzida por pistas em ratos púberes em comparação com adultos indica uma responsividade neuronal aumentada em relação a estímulos apetitivos durante o desenvolvimento puberal.

Este estudo foi apoiado por bolsas da Land BW (NAR) e DFG (SCHN 958/3-1). Somos muito gratos a Elisabeth Roebel pelo excelente suporte técnico.