PLoS One. 2012; 7 (4): e34700. doi: 10.1371 / journal.pone.0034700. Epub 2012 Apr 18.
Jarros KK, Schmid S, Di Sebastiano AR, Wang X, Lavioleta SR, Lehman MN, Coolen LM.
fonte
Departamentos de Anatomia e Biologia Celular, Escola Schulich de Medicina e Odontologia, Universidade de Western Ontario, Londres, Ontário, Canadá.
Sumário
A recompensa natural e as drogas de abuso convergem no sistema mesolímbico que medeia os comportamentos de motivação e recompensa. Drogas induzem adaptações neurais nesse sistema, incluindo mudanças transcricionais, morfológicas e sinápticas, que contribuem para o desenvolvimento e expressão de memórias e dependências relacionadas à droga. Anteriormente, havia sido relatado que a experiência sexual em ratos machos, um comportamento natural de recompensa, induz uma neuroplasticidade semelhante no sistema mesolímbico e afeta a recompensa natural e o comportamento relacionado à droga.
O estudo atual determinou se a experiência sexual provoca mudanças duradouras no acasalamento, ou tráfico de receptor de glutamato ionotrópico ou função no nucleus accumbens (NAc), após 3 diferentes períodos de abstinência de recompensa: 1 dia, 1 semana ou 1 mês após a sessão final de acasalamento.
Ratos machos Sprague Dawley acasalaram durante 5 dias consecutivos (experiência sexual) ou permaneceram sexualmente ingênuos para servir como controles. Homens sexualmente experientes demonstraram facilitação de iniciação e desempenho de acasalamento em cada ponto de tempo. Em seguida, a expressão da superfície intracelular e da membrana N-metil-D-aspartato (NMDA: subunidade NR1) e Receptores α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propionato (AMPA: GluA1, GluA2) no NAc foi determinado utilizando um ensaio de reticulao de protea bis (sulfossuccinimidil) suberato (BS (3)) seguido de anise Western Blot.
NR1 expressão foi aumentada em 1 dia abstinência tanto na superfície e intracelular, mas diminuiu na superfície em 1 semana de abstinência. O GluA2 foi aumentado intracelularmente na semana 1 e aumentou na superfície após o mês 1 de abstinência. Por fim, os registros eletrofisiológicos de pinça de retalho de célula inteira Relação AMPA / NMDA reduzida das correntes sinápticas nos neurônios do casco de NAc após estimulação de aferentes corticais em homens sexualmente experientes após todos os períodos de abstinência de recompensa.
Juntos, estes dados mostram que a experiência sexual provoca alterações a longo prazo na expressão e função do receptor de glutamato no NAc. Embora não idêntica, essa neuroplasticidade induzida pela experiência sexual tem semelhanças com as causadas por psicoestimulantes, sugerindo mecanismos comuns para o reforço da recompensa natural e da droga.
Introdução
O sistema mesolímbico consiste de áreas cerebrais interconectadas, incluindo a área tegmentar ventral, o córtex pré-frontal medial (mPFC) e o núcleo accumbens (NAc) . Juntas, essas áreas do cérebro mediam comportamentos naturalmente recompensadores, incluindo a alimentação , , , , bebendo comportamento materno , vinculo social , e behavio sexualr , , , , . Estudos comportamentais demonstraram que o comportamento sexual de ratos machos é recompensador e reforçador à medida que os ratos machos formam uma preferência condicionada pela cópula , , , desenvolva velocidades de corrida mais rápidas em labirintos em T pista de braço reto ou escalada e realizar tarefas operantes para obter acesso a mulheres sexualmente receptivas , . Além disso, A experiência sexual provoca a facilitação do comportamento sexual subsequente, incluindo maior motivação e desempenho sexual e influencia a expressão da preferência de lugar condicionado por acasalamento . Essas mudanças comportamentais sugerem a ocorrência de aprendizado e memória relacionados à recompensa natural, que é hipotetizado como sendo mediado por alterações no sistema mesolímbico induzido pela experiência de comportamento de acasalamento. .
Em apoio a essa hipótese, mostramos anteriormente que a experiência sexual causou uma sobrerregulação de deltafosB no NAc, que por sua vez, foi fundamental para facilitar a iniciação e a realização do comportamento sexual após a experiência sexual. .
Além disso, a experiência sexual causou um aumento na arborização dendrítica e no número de espinhos no NAc. . Mudanças similares na transcrição e morfologia são induzidas por psicoestimulantes , , . Demonstrou-se que a experiência sexual altera a capacidade de resposta às drogas de abuso, incluindo a sensibilização à atividade locomotora induzida pelo psicoestimulante (sensibilização cruzada) e melhora da recompensa do psicoestimulante , , . Foi demonstrado que um período de abstinência ou abstinência após a exposição ao medicamento é crítico para um aumento do desejo pelo medicamento, denominado incubação do desejo compulsivo. . Da mesma forma, um período de abstinência de acasalamento após a experiência sexual é crítico para a melhora induzida pela experiência sexual da recompensa do psicoestimulante e o aumento da ramificação dendrítica e das espinhas no NAc. . Assim, a experiência sexual e a subseqüente abstinência dessa recompensa natural causam alterações de longo prazo no sistema mesolímbico que são similares àquelas induzidas por psicoestimulantes, e afetam as respostas comportamentais tanto à recompensa natural quanto à droga.
Tem sido relatado que os psicoestimulantes induzem numerosas alterações adicionais no NAc, várias das quais dependem do período de abstinência do medicamento. Estas alterações incluem alterações no tráfico e função do receptor de glutamato , . Repetida cocaína seguido de um longo período de abstinência (3-7 semanas), causa um aumento na expressão de superfície das subunidades do receptor α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propionato (AMPA) e N-metil-D-aspartato (NMDA) subunidades do receptor, enquanto que nenhuma alteração foi observada curto período de abstinência (dia 1).
Além disso, diferentes subunidades dos receptores AMPA e NMDA são diferencialmente afetadas pela exposição ao fármaco e subsequentes períodos de abstinência, uma vez que a expressão da superfície dos AMPARs sem GluA2 é regulada positivamente após períodos prolongados de abstinência (5-7 semanas) , . O PFC fornece uma importante entrada glutamatérgica para o NAc e estudos eletrofisiológicos mostraram que a cocaína repetida provoca alterações na relação AMPA / NMDA em neurônios da casca de NAc e alterações na excitabilidade intrínseca de neurônios NAc que podem ser dependentes de um período de abstinência de drogas e sub-região NAc , , , , , , , . Tal plasticidade neural induzida por drogas contribui para mudanças na sensibilização comportamental do psicoestimulante , , , e busca de drogas , , .
Atualmente, não se sabe se adaptações semelhantes do tráfico e da função do receptor de glutamato ocorrem após a experiência de recompensa natural e subseqüente abstinência da recompensa natural. Portanto, o objetivo do presente estudo foi testar a hipótese de que a experiência sexual provoca alterações no tráfego do receptor AMPA ou NMDA no NAc e alterações na força sináptica dos neurônios do shell NAc que respondem ao PFC. Além disso, essas medidas foram determinadas em 3 diferentes vezes após a sessão final de acasalamento para investigar os efeitos de um período de abstinência da recompensa natural (1 semana ou 1 mês após o acasalamento final) sobre plasticidade no NAc comparado a um período de abstinência (1 dia após o acasalamento final).
Consistentes
Experiência 1: Facilitação Sexual
O objetivo do experimento 1 foi determinar um curso de tempo para facilitar o comportamento sexual após a experiência sexual. Anteriormente, a facilitação do comportamento sexual foi detectada até a semana 1 após a sessão final de acasalamento. , mas não foi investigado anteriormente se a facilitação induzida pela experiência sexual do comportamento sexual é mantida após um prolongado período de abstinência. Aqui, dois grupos de ratos machos foram testados para expressão a longo prazo de facilitação do comportamento sexual, quer na semana 1, quer no mês 1 após a última sessão de acasalamento. Primeiro, ambos os grupos mostraram a facilitação do comportamento sexual durante cinco sessões diárias de acasalamento, como demonstrado por latências significativamente mais curtas para montar (Figura 1A; 1 semana, p
=0.028; 1 mês, p=0.019), intromissão (Figura 1B; 1 mês, p=0.016; tendência na semana 1, p=0.078) e ejaculação (Figura 1C; 1 semana, p=0.016; 1 mês, p=0.008) no dia 5 comparado ao dia 1 da experiência sexual. Além disso, a facilitação do comportamento sexual foi mantida tanto na semana 1 como no mês 1 após a última sessão de acasalamento, como latências para os parâmetros de acasalamento foram mais curtos no dia do teste (1 semana ou 1 mês após dia 5 de experiência sexual) em comparação com o dia de acasalamento 1 (Figura 1A: latência de montagem, mês 1, p=0.016; Figura 1B: latência de intromissão, mês 1, p=0.046; Figura 1C: latência da ejaculação, semana 1, p=0.016; 1 mês, p=0.008) e não existiam diferenças significativas entre o dia de acasalamento 5 e o dia do teste para qualquer parâmetro comportamental a qualquer momento (exceto para a latência de montagem no mês 1; p=0.016). Assim, a facilitação do comportamento sexual induzida pela experiência foi mantida durante um período de abstinência de acasalamento no mês 1.
Experimento 2: Redistribuição / Expressão da Subunidade do Receptor Ionotrópico de Glutamato
O objetivo do experimento 2 foi determinar a expressão de subunidades do receptor de glutamato ionotrópico em machos sexualmente experientes e ingênuos após diferentes períodos de abstinência de acasalamento. A superfície da subunidade AMPAR e da subunidade NMDAR e os pools intracelulares foram quantificados usando um reagente de reticulação de membrana impermeabilizante (BS3), que modificou seletivamente a proteína expressa na superfície permitindo a distinção de proteínas intracelulares não modificadas usando SDS-PAGE e análise de Western Blot. Blots representativos que ilustram a superfície (alto MW,> 250 kDa) e bandas intracelulares são apresentados em Figura 2M.
Um dia após a experiência sexual, a expressão da subunidade NR1 na superfície (S), intracelular (I) e total (S + I) aumentou significativamente (S, Figura 2A, P=0.025; EU, Figura 2D, P=0.035; S + I Figura 2J, P=0.023) em animais sexualmente experientes em comparação com controles sexualmente ingênuos (Figura 2N). Uma semana após o último acasalamento, houve uma diminuição significativa na expressão da razão superfície para intracelular de NR1 (relação S / I; Figura 2G, P=0.024) sem alterações significativas na expressão superficial ou intracelular, em comparação com animais sexualmente ingênuos. A expressão de GluA2 aumentou significativamente uma semana após o último acasalamento, na expressão intracelular e total, sem alterações na expressão da superfície (I, Figura 2E, P=0.026; S + I Figura 2K, P=0.014) em animais sexualmente experientes em comparação com ingênuos (Figura 2O). Considerando que, um mês após o último acasalamento, GluA2 foi significativamente aumentado na relação S / I (Figura 2H, P=0.046) acompanhada de uma tendência estatística para um aumento da expressão da superfície (Figura 2B, P=0.055) em animais sexualmente experientes em comparação com controles ingênuos. Alterações no GluA1 não foram detectadas no dia 1 ou na semana 1 após o último acasalamento. Após o mês 1, a expressão da superfície de GluA1 e relação S / I pareceu estar aumentada em animais sexualmente experientes, em comparação com os controlos naïve, embora apenas se tenham detectado tendências estatísticas (S, Figura 2C, P=0.098; SI, Figura 2I, P=0.083). Assim, em resumo, inicialmente no 1 dia de abstinência, um aumento total da expressão de NR1 foi detectado, seguido por aumento da expressão intracelular de GluA2 após 1 semana de abstinência e aumento da expressão de superfície de GluA2 e GluA1 após 1 mês de abstinência como tendência estatística).
Experiência 3: Eletrofisiologia
O objetivo do experimento 3 foi determinar se a experiência sexual altera a força sináptica em neurônios do tipo NAc que respondem ao PFC. Correntes sinápticas foram registradas em neurônios espinhosos médios na camada NAc de machos sexualmente experientes e ingênuos após a estimulação de fibras presumidamente derivadas do CPF. A relação AMPA / NMDA foi significativamente reduzida em animais sexualmente experientes no dia 1 (p=0.005), 1 semana (p=0.016) e 1 mês (p=0.005) após a sessão final de acasalamento em comparação com o grupo de controle sexualmente ingênuo (Figura 3A, B, C). A fim de determinar se houve uma mudança na probabilidade de liberação do transmissor pré-sináptico, as razões de pulso pareado foram investigadas. A magnitude da facilitação da liberação do transmissor que ocorreu em resposta à estimulação de pulso pareado não diferiu entre animais sexualmente experientes e ingênuos em qualquer intervalo de tempo (Figura 3D).
Discussão
O presente estudo demonstrou que a experiência sexual provoca mudanças na distribuição e função dos receptores de glutamato ionotrópicos no NAc de ratos machos e que algumas dessas mudanças variaram com o período de abstinência do comportamento sexual. Em comparação com machos sexualmente ingênuos, os machos sexualmente experientes mostraram um aumento de curto prazo na expressão total da subunidade NR1 devido a aumentos nos pools de receptores superficiais e intracelulares. A expressão de GluA2 foi aumentada intracelularmente e na superfície após a semana 1 e mês 1 de abstinência de recompensa, respectivamente. Finalmente, a expressão GluA1 não foi alterada significativamente a qualquer momento. Além disso, os animais sexualmente experientes tiveram uma relação AMPA / NMDA diminuída imediata e duradoura, registrada a partir dos neurônios da casca de NAc que responderam ao PFC, em comparação com os controles virgens. Nossos resultados indicam que o tráfico de receptores de glutamato depende da duração de um período de abstinência do comportamento sexual, enquanto alterações na força sináptica em sinapses formadas por aferentes corticais pré-frontais à concha de NAc não. Estes achados principais são semelhantes aos relatados após cocaína repetida em termos de subunidade AMPAR, aumento da expressão da superfície após longa abstinência de drogas e uma diminuição imediata na relação AMPA / NMDA, mas diferem em relação à expressão da subunidade NMDAR de curto prazo, e uma diminuição persistente no AMPA Relação / NMDA.
O comportamento sexual é altamente gratificante e reforçador. Assim, à medida que um rato macho ganha experiência sexual, ele exibe maior motivação sexual e desempenho, que são demonstrados por latências mais curtas para iniciar o acasalamento e exibir a ejaculação, além de aumentar a eficiência da cópula. , . Aqui, foi confirmado que esta facilitação do comportamento sexual estava presente na semana 1 após o acasalamento, e foi determinado que o comportamento sexual facilitado foi mantido até ao mês 1 de abstinência de acasalamento. O perfil temporal da facilitação induzida pela experiência sexual do comportamento sexual corresponde ao nosso estudo anterior que mostra a sensibilização cruzada aos efeitos indutores da locomotora da anfetamina quando testados nos mesmos períodos de abstinência sexual. . Estudos anteriores implicaram o NAc como um mediador da manutenção do comportamento sexual facilitado. Ambos os neurônios do núcleo e da casca do NAc são ativados por acasalamento ou sugestões associadas ao acasalamento. e experiência sexual resulta em ramificação dendrítica aumentada e espinhas no núcleo NAc e casca uma semana após o acasalamento . Além disso, a diminuição da atividade do fator de transcrição deltaFosB no NAc via transferência gênica mediada por vetor viral atenua a facilitação induzida pela experiência do comportamento sexual , .Estas descobertas sugerem que o NAc está especificamente associado ao reforço do comportamento sexual e é potencialmente crítico para os efeitos de drogas com sensibilidade cruzada da experiência sexual. .
O presente estudo demonstrou que a experiência sexual causou mudanças na síntese e / ou tráfico de AMPAR que foram dependentes da duração do período de abstinência sexual. Primeiro, um aumento na expressão intracelular da expressão de GluA2 foi evidente na semana 1, potencialmente indicando aumento da síntese do receptor GluA2 e / ou endocitose. Então, uma relação superfície / intracelular de GluA2 aumentada (em grande parte devido ao aumento na superfície) foi detectada em 1 mês após o último acasalamento, sugerindo redistribuição de receptores para a superfície celular. Mudanças no tráfico de AMPAR após a exposição à cocaína, também foram dependentes da duração do período de abstinência da droga . Em geral, os níveis GluA1 e GluA2 / 3 da superfície e synaptosomal da célula são aumentados após uma semana de abstinência de cocaína e são mantidos em níveis elevados por até 3 semanas após a última injeção de cocaína , , , , . Após um período mais prolongado de abstinência da droga (5 semanas), a expressão da superfície de GluA1 permaneceu elevada e houve uma pequena diminuição na relação superfície / intracelular de GluA2 e, portanto, os AMPARs sem GluA2 foram regulados positivamente , . Esta expressão aumentada de receptores sem a presença de GluA2 na superfície foi detectada após a retirada prolongada (5-7 semanas) da auto-administração de cocaína de acesso estendido, mas não após a retirada prolongada de cocaína não contingente . Além disso, o bloqueio de AMPAR sem GluA2 impediu a procura de drogas , . As mudanças no tráfico de receptores AMPA após a experiência sexual e a abstinência variam ligeiramente daquelas induzidas pela cocaína. Em termos de expressão de superfície aumentada de GluA1, os dados presentes indicam um aumento modesto nos receptores GluA1 na superfície da membrana que não alcançaram significância estatística em 1 mês após experiência sexual e, portanto, sugerindo que a expressão da superfície de GluA1 pode exigir períodos de abstinência mais longos -regulação, semelhante às alterações induzidas pela cocaína após 5 semanas de abstinência . Além disso, os dados atuais diferem em termos de GluA2 que sofreram uma pequena diminuição após 5 ou mais semanas sem cocaína, enquanto a experiência sexual e o mês 1 de abstinência resultaram em aumento da expressão da superfície de GluA2. Nossa hipótese é que a regulação positiva do receptor de AMPA na NAc pode ser crítica para os efeitos a longo prazo da experiência sexual no comportamento de recompensa subsequente e aumento da recompensa de anfetamina. seguindo os prolongados períodos de abstinência testados no presente estudo. Em contraste, alterações na expressão ou tráfico de receptores AMPA não são críticas para os efeitos de curto prazo da experiência sexual no comportamento de recompensa. Em apoio, numerosos relatos demonstraram que a transmissão AMPAR alterada não é necessária para a sensibilização comportamental induzida por drogas a psicoestimulantes (para revisão ). Sensibilização e sensibilização cruzada foram observadas após 1 dia de abstinência de recompensa sem alterações na regulação positiva de AMPAR , . Além disso, foi demonstrada sensibilização comportamental com exposição repetida ao psicoestimulante anfetamina, que não foi associada a nenhuma alteração na transmissão AMPAR , , .
O papel dos NMDARs tem sido muito menos estudado do que os AMPARs em relação à sensibilização do comportamento e ao tráfico de receptores. Um antagonista não seletivo de NMDAR (MK-801) preveniu o desenvolvimento de sensibilização locomotora com cocaína ou anfetamina, mas não bloqueou a expressão dessa sensibilização , . O papel do NMDAR no comportamento sexual foi minimamente examinado através da administração de área pré-óptica sistêmica ou intra-medial de MK-801, que prejudicou o comportamento sexual em ratos machos ingênuos e experientes , , . O NMDAR também medeia outras recompensas naturais, uma vez que os antagonistas do NMDAR diminuíram a ingestão de alimentos em babuínos e maior desejo por comida em ratos . A expressão de NMDAR no NAc é alterada pela exposição à cocaína, e períodos de abstinência mais longos (3 semanas) mas não curtos (1 day) de cocaína repetida aumentaram a expressão das subunidades NMDAR (NR1, NR2A, NR2B) , . Os resultados atuais demonstram que a experiência sexual causou um aumento na expressão total de NR1 no dia 1 devido ao aumento dos níveis nos reservatórios de superfície e receptor intracelular, além da diminuição da razão superfície / intracelular após um período de abstinência da semana 1. Portanto, supomos que um aumento inicial na transmissão do NMDAR pode ser crítico para os efeitos a curto prazo da experiência sexual no comportamento subsequente da recompensa.
Além disso, o aumento de curto prazo na subunidade NR1 após a experiência sexual pode ser indicativo de formação de sinapses silenciosas induzidas pela experiência sexual. Huang e cols. demonstraram que a cocaína repetida gerava sinapses silenciosas na camada NAc, na qual o recrutamento pós-sináptico do novo NMDAR era fundamental. Sinapses glutamatérgicas silenciosas expressam correntes mediadas por NMDAR funcionais na ausência de correntes mediadas por AMPAR , , . Já foi demonstrado que a exposição prévia à cocaína pode gerar sinapses silenciosas por todo o cérebro e que essas sinapses recém-geradas fornecem um substrato para a experiência subsequente , . Os NMDAR são compostos de pelo menos uma subunidade NR1 em combinação com uma ou mais subunidades NR2 (A – D). NR1 é necessário para a formação de canais funcionais; portanto, mudanças na expressão de NR1 podem fornecer um índice para mudanças no número de receptores NMDA funcionais. A cocaína repetida conduz a inserção de NMDARs contendo NR1 e NR2B e gera sinapses silenciosas no invólucro NAc. Estas sinapses silenciosas contendo NR2B foram inibidas durante a administração de cocaína que atenuou a sensibilização locomotora subsequente com cocaína . O número de sinapses silenciosas diminuiu após vários dias de abstinência de cocaína, enquanto a sensibilização locomotora persistiu, sugerindo que as sinapses prematuras podem se envolver na formação de novos circuitos plásticos que podem ser alterados (potencialmente pela abstinência de recompensa) para mediar esses comportamentos persistentes. Assim, hipotetizamos que a supra-regulação da expressão total de NR1 logo após a experiência sexual pode ser devido ao aumento do número de NMDAR em sinapses silenciosas recém-formadas. Além disso, a experiência sexual seguida de abstinência prolongada pode resultar em sinapses silenciosas diminuídas, explicando tanto a diminuição da superfície / relação intracelular de NR1 quanto o aumento das subunidades AMPAR com períodos de abstinência prolongados, uma vez que as sinapses não são afetadas.
Os achados atuais de que a experiência sexual e os períodos de abstinência de recompensa causaram alterações no tráfego e na expressão do receptor de glutamato sugeriram alterações na força sináptica nas sinapses excitatórias no NAc. Portanto, um procedimento de eletrofisiologia baseado em um estudo prévio de Thomas e colaboradores foi utilizado para estudar a função do receptor de glutamato em neurônios do casco de NAc, seguindo os mesmos períodos de abstinência que resultaram em comportamento sexual e farmacológico sensibilizado, e redistribuição do receptor de glutamato. Semelhante a estudos anteriores após exposição à cocaína, a plasticidade foi determinada em sinapses de conchas de NAc que respondiam à entrada de PFC. PFC está bem estabelecido para desempenhar um papel fundamental no comportamento compulsivo e abuso de drogas , . Da mesma forma, o CPF é crítico para o desenvolvimento ou expressão de comportamento sexual compulsivo, já que as lesões do CPF causam uma busca mal-adaptativa de comportamento sexual em ratos machos. . Os dados atuais mostraram que a experiência sexual causou uma diminuição imediata e duradoura na relação AMPA / NMDA nos neurônios da casca de NAc que respondem ao PFC.
Anteriormente, hipotetizava-se que a principal diferença entre a recompensa natural e a da droga é que as mudanças na relação AMPA / NMDA após a recompensa natural são temporárias e se dissiparão com o tempo, enquanto as mudanças induzidas pelos medicamentos persistirão. . Esta hipótese foi baseada em achados de que a cocaína, mas não a comida ou a sacarose, induziram um aumento prolongado da relação AMPA / NMDA no VT.A . Em contraste, o presente estudo demonstra que a experiência sexual de fato causou uma mudança duradoura na relação AMPA / NMDA no NAc.
No entanto, a plasticidade da concha induzida pelo sexo difere da exposição à cocaína, que se mostrou associada a uma mudança bidirecional na excitabilidade mediada por AMPAR.. Após a exposição à cocaína e um dia de abstinência de drogas, uma redução nas proporções de AMPA / NMDA e depressão na capacidade de disparo foi encontrado, semelhante aos resultados obtidos para efeitos de curto prazo da experiência sexual. No entanto, após um período de abstinência da cocaína, os neurónios da concha NAc aumentaram as taxas de AMPA / NMDA, sugerindo que a abstinência da cocaína aumentou a força sináptica na NAc. . HPor exemplo, a exposição à cocaína resulta em uma mudança bidirecional na plasticidade sináptica com respostas mediadas por AMPA reduzidas logo após a exposição ao fármaco, mas aumenta a excitabilidade mediada por AMPAR com a abstinência prolongada do medicamento. Em contraste, abstinência prolongada da experiência sexual resultou em diminuição da excitabilidade mediada por AMPAR na concha de NAc, embora a sensibilização da atividade locomotora e a recompensa associadas à anfetamina sejam observadas durante esses períodos de abstinência . No entanto, outros relatos mostraram diminuição da excitabilidade da membrana intrínseca tanto no núcleo quanto na casca no curto e longo período de abstinência após exposição à cocaína , , , , , , , mostrando uma falta de mudança bidirecional, semelhante aos efeitos da experiência sexual. Além disso, os resultados atuais mostram que a experiência sexual não causa mudanças na probabilidade de liberação de glutamato pré-sináptico com base na falta de diferenças entre os grupos para a relação de pulso pareado. Kalivas e colegas demonstraram que a cocaína repetida induz mudanças nos mediadores de pools de glutamato não-sinápticos extracelulares no NAc, se tais alterações ocorrem com a experiência sexual ainda a ser determinada (para revisão). ).
É provável que entradas glutamatérgicas no NAc de outras áreas do cérebro que o PFC desempenhem um papel funcional nos efeitos da experiência sexual no comportamento de recompensa subsequente. To NAc recebe entrada glutamatérgica da amígdala basolateral (BLA) e do subículo do ventre do hipocampo . O BLA desempenha um papel no comportamento natural de busca de recompensa , , é crítico para a associação de estímulos ambientais com recompensa sexual e para o comportamento instrumental para iniciar o acasalamento . Portanto, é tentador especular que alterações induzidas pela experiência sexual na força sináptica também nas sinapses que respondem ao BLA.
A diminuição da razão AMPA / NMDA nas sinapses do CPF na camada de NAc é consistente com o aumento da expressão de NR1 logo após a experiência sexual, mas inconsistente com o aumento de GluA2 e GluA1 após períodos prolongados de abstinência. Uma explicação é que o tráfico de receptores ocorreu em sinapses que recebem entrada glutamatérgica proveniente de outras áreas do cérebro além do CPF. Além disso, a inclusão do núcleo NAc, além da concha de NAc, nas amostras de proteína exclui a possibilidade de fazer correlações precisas entre a expressão da proteína e os dados de força sináptica. No entanto, as descobertas atuais demonstram claramente que o comportamento da recompensa natural e a subseqüente abstinência da recompensa causam plasticidade sináptica no NAc com semelhanças e diferenças daquelas induzidas pelos psicoestimulantes.
In conclusão, a experiência sexual e a subseqüente abstinência de recompensa em ratos machos mostraram causar facilitação imediata e duradoura no comportamento sexual, semelhante aos efeitos da experiência sexual na sensibilização aos efeitos indutores da locomotora do anfetamine e foi associado com uma diminuição imediata e duradoura nas proporções de AMPA / NMDA nas sinapses na concha de NAc. Além disso, a experiência sexual causou uma rápida regulação positiva do NMDAR e lentamente desenvolveu a redistribuição do AMPAR para a superfície dos neurônios do NAc. Assim, similar aos efeitos dos psicoestimulantes, o comportamento da recompensa natural pode causar alterações duradouras na expressão, tráfico e excitabilidade dos receptores de glutamato. Contudoa abstinência prolongada da experiência sexual, ao contrário da que se seguiu à cocaína, resultou na diminuição persistente da relação AMPA / NMDA na concha de NAc. Uma série de hipóteses testáveis para possíveis fatores contribuintes subjacentes para essa discrepância foram propostas, incluindo alterações das sinapses que respondem ao BLA, seguindo a experiência de recompensa natural. Esses dados mais uma vez mostram semelhanças e diferenças entre as consequências a longo prazo da exposição à recompensa natural e às drogas e podem contribuir para uma melhor compreensão de como as drogas podem agir nesse caminho natural de recompensa.
O Propósito
Declaração de ética
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Western Ontario e conformados às diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais envolvendo animais vertebrados em pesquisa.
Animais
Ratos Sprague Dawley machos adultos (experiência 1 e 2: 10-12 semanas; experiências 3, 8-10 semanas na altura do início das experiências) foram obtidos de Charles River Laboratories (Senneville, QC, Canadá). Os animais do mesmo sexo foram alojados em gaiolas de Plexiglas com um tubo de túnel em uma sala com temperatura regulada mantida em um ciclo 12 / 12 hr claro escuro com alimentos e água disponíveis ad libitum exceto durante o teste comportamental. Fêmeas de estímulo (210-220 gramas) para sessões de acasalamento receberam um implante subcutâneo contendo 5% de benzoato de estradiol e 95% de colesterol após ovariectomia bilateral. A receptividade sexual foi induzida pela administração de 500 µg de progesterona em 0.1 mL de óleo de gergelim aproximadamente 4 horas antes do teste.
Experiência Sexual
Todos os ratos machos foram sexualmente ingênuos antes do início dos experimentos. As sessões de acasalamento ocorreram durante a fase escura inicial (entre 2 – 6 horas após o início do período escuro) sob iluminação vermelha fraca. Durante cada sessão de acasalamento, ratos machos foram autorizados a copular para ejaculação ou até 1 hora, e os parâmetros para o comportamento sexual foram registrados, incluindo: latência de montagem (ML; tempo desde a introdução da fêmea até a primeira montada), latência intromissão (IL; tempo de introdução do sexo feminino até a primeira montagem com penetração vaginal) e latência da ejaculação (EL; tempo desde a primeira intromissão até a ejaculação) . Controles sexualmente ingênuos eram manipulados, alojados nos mesmos cômodos dos animais de acasalamento e, portanto, expostos aos mesmos níveis de ruído, perturbação geral e distantes odores de fêmeas de cio, mas não podiam interagir ou acasalar com fêmeas receptivas.
Experiência 1: Facilitação Sexual
Ratos machos Sprague Dawley acasalaram em suas gaiolas em casa para 5 sessões de acasalamento diárias consecutivas. Os animais foram divididos em grupos experimentais 2 e foram testados quanto ao comportamento sexual quer na semana 1 quer no mês 1 após a última sessão de acasalamento (Dia do Teste; n=7 por grupo). Grupos foram pareados em parâmetros de comportamento sexual e não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos para qualquer medida de comportamento sexual durante qualquer sessão de acasalamento, enquanto ganham experiência sexual.
Análise de Dados
Dentro de grupos, foram feitas comparações avaliando o Dia 1 e 5 da experiência sexual para determinar a facilitação do comportamento sexual com experiência sexual, entre o Dia 1 e o Dia do Teste e entre o Dia 5 e o Dia do Teste (para 1 ou 1 após o Dia 5) , latências de intromissão e ejaculação utilizando teste de Wilcoxin Signed Rank com nível de significância de 5%.
Experimento 2: Redistribuição / Expressão da Subunidade do Receptor Ionotrópico de Glutamato
Para examinar a redistribuição de receptores ionotrópicos, utilizou-se um paradigma semelhante ao experimento 1. Ratos Sprague Dawley machos sexualmente ingênuos foram divididos em grupos sexualmente experientes e ingênuos. Para os grupos sexualmente experientes, a experiência sexual foi adquirida através de sessões de acasalamento diárias consecutivas 5 (como descrito acima). Os machos sexualmente experientes foram então divididos em grupos experimentais 3 (pareados por parâmetros de comportamento sexual) para coleta de tecido, seja 1 dia, 1 semana, ou 1 mês após a última sessão de acasalamento. Cérebros de controles sexualmente ingênuos (manipulados como descrito acima) foram coletados em momentos idênticos após o manuseio final. Os grupos incluíram: experiência sexual (AMPAR: 1D, n=9; 1W, n=12; 1M, n=12; NMDAR: 1D, n=9, 1W ou 1M, n=6) ou sexualmente ingênuo (AMPAR: 1D, n=9; 1W, n=12; 1M, n=12; NMDAR: 1D, n=9, 1W ou 1M, n=
Cross-Linking de Receptor de Superfície
Os animais foram sacrificados com pentobarbital sódico (270 mg / kg; ip) seguido de decapitação. Após a decapitação, cada cérebro foi removido rapidamente e imediatamente colocado em solução salina gelada. O NAc bilateral foi dissecado usando uma matriz de cérebro de rato (ASI Instruments, Warren, MI, EUA) e lâmina de bisturi de acordo com os limites de NAc definidos por Paxinos & Watson (1998). Em seguida, o tecido NAc foi cortado em cubos de 400 × 400 µm usando um cortador de tecido McIlwain (Vibratome, St. Louis, MO, EUA). A metodologia para a reticulação da subunidade do receptor de AMPA e NMDA foi baseada em Boudreau & Wolf . Imediatamente após o corte, o tecido cerebral foi rapidamente transferido para um tubo Eppendorf contendo 1 mL de aCSF gelado, misturado com o reagente de reticulação de proteína bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS32 mM; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) e incubadas por 30 minutos em um agitador a 4 ° C. BS3 não atravessa as membranas celulares, permitindo-lhe cruzar seletivamente proteínas expressas na superfície com ligações de sulfeto, formando assim agregados de alto peso molecular, enquanto as proteínas intracelulares permanecem inalteradas. Esta reac�o permite distinguir bancos de prote�a de superf�ie e intracelular com base em MW utilizando electroforese em gel de dodecilsulfato de s�io-poliacrilamida (SDS-PAGE) e an�ise de transfer�cia de Western. A reac�o de reticula�o foi extinta pela adi�o de 100 � de 1 M glicina para 10 min a 4�. O tecido foi sedimentado por centrifugação a 14 000 rpm durante 2 minutos a 4 ° C e o sobrenadante foi rejeitado. Os sedimentos foram ressuspensos em 400 µl de tampão de lise gelado [25 mM Hepes (pH 7.4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 20 mM NaF, 0.1% Nonidet P-40 (0.1 %), coquetel de inibidores de protease (Ministop, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e coquetel inibidor de 1 × fosfatase (Phosstop, Roche Diagnostics GmbH,)]. As amostras foram sonicadas por 5 segundos para romper o tecido, depois centrifugadas a 14 000 rpm para 2 min a 4 ° C e imediatamente colocadas de volta no bloco de gelo. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf, a partir do qual 30 de amostra foram colocados em gelo e o sobrenadante remanescente foi armazenado a -80 ° C para análise Western Blot. Para cada amostra, a concentração proteica de lisados reticulados foi determinada utilizando um ensaio BCA (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA) e um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA).
Análise de Western Blot
Amostras de proteína (20 µg) foram carregadas e submetidas à eletroforese em géis de Tris-HCl 4-15% (Bio-Rad Laboratories Ltd., Mississauga, Ontário, Canadá) usando um sistema Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad Laboratories Ltd.). e tampão de corrida Tris-Glicina-SDS [25 mM Tris, 192 mM Glicina, 0.1% SDS (pH8.3)]. Os padrões da proteína Precision Plus All Blue (Bio-Rad Laboratories Ltd.) foram utilizados como marcadores de peso molecular. Após a separação, as proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno Millipore Immobilon-FL (PVDF; Millipore, Billerica, MA, EUA) utilizando o sistema de transferência húmida Trans-Blot Cell (Bio-Rad Laboratories Ltd.) para imunotransferência. A transferência de proteína foi efectuada em tampão de transferência (20% metanol e 0.037% SDS em Tris-Glicina [25 mM Tris, 192 mM Glicina (pH 8.3)] a 82 V durante 1 h à temperatura ambiente (TA). pelo menos duplicado, equilibrado entre grupos e através de géis individuais.
Em seguida, as membranas foram incubadas em um 2![[ratio]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
Solução 3 de tampão de bloqueio Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) e solução salina tamponada com Tris (TBS; 50 mM Tris e 150 mM NaCl (pH8.0)) para 1 h num tabuleiro agitador à temperatura ambiente. As membranas foram então incubadas individualmente durante 16 horas num agitador a 4 ° C com anti-GluA1 policlonal de coelho (∼106 kDa; 11K; Millipore, Cat # AB1504) e GluA2 (∼100 kDa; 14K; Millipore, Cat # AB1768) ou anticorpo monoclonal de rato anti-NR1 (∼130 kDa; 12K; Upstate (Millipore), Cat # 05-432). Estes anticorpos primários foram previamente utilizados e validados , e produziu uma única banda no peso molecular apropriado que foi impedida por pré-absorção do anticorpo com péptido quando utilizado em tecido não reticulado. Todos os anticorpos foram diluídos em um 23 mistura de Odyssey Blocking Buffer com TBS-T (TBS + 0.05% Tween-20 (pH8.0). Após três lavagens 10-min em TBS-T, as membranas foram incubadas em anticorpos secundários diluídos num 23 mix de Odyssey Blocking Buffer e TBS-T para 1 hr em RT. Os anticorpos secundários incluíram anti-coelho de cabra conjugado com Alexa-680 (15K; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) ou IR anti-mouse de cabra conjugado com Dye800 CW (110K; LI-COR Biosciences). A imunorreatividade fluorescente foi visualizada e as imagens capturadas usando um scanner Odyssey 2.1 (LI-COR Biosciences).
Quantificação e análises estatísticas
Para cada amostra de proteína, os níveis de intensidade de fluorescência para cada banda (alto MW,> 250 kDa para expressão de superfície e bandas no MW específico listado acima para expressão intracelular) foram determinados usando o software Odyssey e as médias foram calculadas para cada animal. Os valores de densidade de banda de superfície (S), intracelular (I), razão (S / I, medida da distribuição da subunidade do receptor) e total (S + I, medida da expressão da subunidade total do receptor) foram normalizados para os valores médios do controle sexualmente ingênuo correspondente grupos. Não houve diferença na intensidade de fluorescência entre as repetições de cada amostra (carregadas em géis diferentes), confirmando a falta de variabilidade no carregamento das amostras de proteínas. Todos os dados de Western Blot foram analisados entre controles sexualmente experientes e sexualmente ingênuos no mesmo ponto de tempo usando testes t não pareados com um nível de significância de 0.05
Experiência 3: Eletrofisiologia
O mesmo desenho experimental foi utilizado como descrito acima para as experiências 1 e 2. Os machos sexualmente experientes foram divididos em grupos experimentais 3, pareados para o desempenho do comportamento sexual, e com base no tempo de coleta de tecido 1 dia, 1 semana ou 1 mês após a última sessão de acasalamento (1 dia, n=7; 1 semana, n=9; 1 mês, n=10). O comportamento sexual nesses ratos machos mais jovens não diferiu do comportamento sexual dos ratos machos mais velhos nos experimentos 1 e 2. Os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico (270 mg / kg; ip) seguido de perfusão transcardial com oxigenação gelada (95% O2, 5% CO2) solução de preparação contendo [250 mM Sacarose, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO44 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl226 mM NaHCO3, 10 mM glicose, 3 mM mioinositol, 2 mM piruvato de sódio e 0.5 mM ascorbat]. O cérebro foi extirpado e colocado em solução de preparação oxigenada gelada. Foram obtidas fatias cerebrais sagitais de 400 de espessura de cada animal utilizando um vibratomo (Microm, Walldorf, Alemanha). Um total de fatias 4 por cérebro foi transferido para uma câmara de retenção com líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) [125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO41.3 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl226.2 mM NaHCO3 e 10 mM glucose], aquecido a 32 ° C durante 30 min e depois deixado recuperar até à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h antes da colocação de uma única fatia numa câmara de gravação. Esta câmara foi superfusada com aCSF oxigenado a 22 ° C. Não houve diferenças entre os grupos para quaisquer parâmetros comportamentais sexuais. Os cérebros foram coletados de controles sexualmente ingênuos em cada um dos pontos de tempo 3 após o manuseio final (n=3 – 4 cada).
Os neurônios da casca foram examinados em fatias medianas de NAc que não continham estriado dorsal . Microeletrodos bipolares de aço inoxidável foram colocados na borda pré-límbica do córtex-NAc rostralmente ao eletrodo de registro para estimulação pré-sináptica das fibras aferentes corticais. Os neurônios espinhais médios vitais foram visualmente identificados pelo seu tamanho de soma (em torno do diâmetro 30-35 µM) e um potencial de membrana de repouso relativamente negativo fo-75 para -85 mV. As gravações foram feitas usando um amplificador Axopatch 200A e uma taxa de amostragem de 20 kHz (Digidata 1340), com um filtro passa-baixo 10 kHz. PClamp 9.0 foi usado para protocolos e análises de experimentos. Os aferentes foram estimulados com pulsos pareados (50 ms ISI) em 0.1 Hz e neurônios usando um eletrodo de tungstênio concêntrico bipolar. As células foram fixadas em voltagem a -80 mV e despolarizadas para + 40 mV para 500 ms antes da estimulação sináptica, a fim de aliviar o bloqueio de magnésio das correntes NMDA. As razões AMPA / NMDA foram determinadas tomando a média de EPSCs a + 40 mV na ausência ou presença do antagonista de NMDAR AP5 (50 µM; todas as correntes de células 30 × controle e 30 × na presença de AP5). A resposta NMDA foi calculada subtraindo as gravações de AP5 do controle. O pico de AMPAR EPSC foi dividido pelo pico do EPSC de NMDAR para produzir uma razão AMPA / NMDA. Para determinar as relações de pulso pareadas, as medidas foram tomadas em −80 mV com estimulação pré-sináptica (30 ×).
Análise de Dados
Dados dos controles sexualmente ingênuos foram combinados para formar um grupo de controle (n=Neurônios 10 em animais 10), uma vez que não foram detectadas diferenças estatísticas entre os pontos de tempo dentro dos controles. Grupos sexualmente experientes (1 dia, n=7; 1 semana, n=9; 1 mês, n=Neurônios 10; tipicamente um neurônio por animal) foram comparados ao grupo de controle sexualmente ingênuo usando uma ANOVA unidirecional (fatores: intervalo de tempo) seguido por um LSD da Fisher para post hoc comparações com um nível de significância de 5%.
Agradecimentos
Agradecemos à Dra. Marina E. Wolf e Mike Milovanovic, da Universidade de Medicina e Ciência Rosalind Franklin, pelo aconselhamento técnico.
Notas de rodapé
Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Financiamento: Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde para LMC e ARD, e Conselho de Pesquisas de Ciências Naturais e Engenharia para LMC e KKP. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Referências