DeltaFosB regula indiretamente a atividade do promotor Cck (2010)

Cérebro Res. 2010 pode 6; 1329: 10 – 20.

Publicado on-line 2010 March 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Paddock Madison,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ e Colleen A. McClung^{2 *}

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Sumário

Algumas das importantes alterações bioquímicas, estruturais e comportamentais induzidas pela exposição crônica a drogas de abuso parecem ser mediadas pelo fator de transcrição altamente estável ΔFosB. Trabalhos anteriores mostraram que a superexpressão de ΔFosB em camundongos por 2 semanas leva a um aumento na expressão de numerosos genes no corpo estriado, a maioria dos quais são posteriormente regulados negativamente após 8 semanas de expressão de ΔFosB. Curiosamente, um grande número desses genes também foi supra-regulado em camundongos superexpressando o fator de transcrição CREB. Não ficou claro a partir deste estudo, no entanto, se ΔFosB de curto prazo regula esses genes via CREB. Aqui encontramos que semanas 2 de superexpressão ΔFosB aumenta a expressão de CREB no estriado, um efeito que se dissipa por 8 semanas. A indução precoce está associada ao aumento da ligação de CREB a determinados promotores do gene alvo nesta região do cérebro. Surpreendentemente, um gene que era uma suspeita de alvo CREB com base em relatórios anteriores, colecistocinina (Cck), não foi controlado pelo CREB no estriado. Para investigar ainda mais a regulamentação Cck Após a superexpressão de ΔFosB, confirmamos que a superexpressão de ΔFosB a curto prazo aumenta tanto Cck atividade promotora e expressão gênica. Também aumenta a atividade de ligação em um site de ligação CREB putativo (CRE) no Cck promotor. No entanto, enquanto o local CRE é necessário para a expressão basal normal de Cck, não é necessário para a indução ΔFosB de Cck. Em conjunto, esses resultados sugerem que, embora a indução de ΔFosB de curto prazo aumente a expressão e a atividade de CREB em certos promotores de genes, esse não é o único mecanismo pelo qual os genes são suprarregulados nessas condições.

Palavras-chave: nucleus accumbens, transcrição, vício

INTRODUÇÃO

A exposição crônica a drogas de abuso causa alterações bioquímicas e estruturais em várias regiões do cérebro. Acredita-se que essas mudanças envolvam alterações nos perfis de expressão gênica no sistema mesolímbico. Este sistema é composto de neurônios dopaminérgicos que se projetam da área tegmental ventral (VTA) no mesencéfalo para neurônios espinhosos médios no nucleus accumbens (NAc) (corpo estriado ventral), bem como em várias outras regiões cerebrais. Alterações na atividade de dois fatores de transcrição, proteína de ligação ao elemento de resposta cAMP (CREB) e ΔFosB (proteína da família Fos), têm sido propostas para mediar muitas das mudanças bioquímicas, estruturais e comportamentais vistas com exposição crônica a drogas de abuso ( revisados pela Nestler, 2005).

CREB é um fator de transcrição ubiquamente expresso que é um membro da família CREB / ATF. Os homodimeros CREB ligam-se a variações de uma sequência CRE (consenso: TGACGTCA) encontrada nos promotores de muitos genes. A fosforilação da CREB (predominantemente na serina 133, embora outros locais tenham sido identificados) pode ser estimulada por várias cascatas de sinalização, incluindo aquelas a jusante de receptores de dopamina (Cole et al., 1995). Após a fosforilação na serina 133, a CREB recruta a proteína de ligação ao CREB co-ativadora (CBP) ou proteínas relacionadas, levando ao aumento da expressão gênica (revisada por Johannessen et al., 2004). Exposição crônica a drogas de abuso de opiáceos ou psicoestimulantes induz aumentos transitórios na atividade de CREB no nucleus accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman e outros, 2002, 2003), uma adaptação pensada para diminuir as propriedades recompensadoras dessas drogas e contribuir para o estado emocional negativo da abstinência de drogas (Nestler, 2005).

LAcredita-se que as adaptações duradouras a drogas de abuso sejam mediadas em parte por ΔFosB, uma variante de emenda altamente estável de FosB. (Nestler e outros, 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Os membros da família Fos dimerizam com membros da família Jun para formar um complexo ativador de proteína 1 (AP-1). Os complexos de transcrição AP-1 se ligam a variações do elemento de resposta AP-1 (consenso: TGACTCA) para regular a transcrição (revisado por Chinenov e Kerppola, 2001). Enquanto a exposição aguda a drogas de abuso leva à indução de curta duração (h) de membros da família Fos (assim como aumento da atividade de CREB), a exposição repetida ao medicamento leva ao acúmulo de ΔFosB altamente estável (Hope et al., 1994; Perrotti e outros, 2008), cuja expressão persiste por semanas.

Camundongos bi-transgênicos que superexpressam indutivamente ΔFosB ou CREB no estriado adulto exibem muitos dos fenótipos bioquímicos e comportamentais observados em animais expostos repetidamente a psicoestimulantes ou outras drogas de abuso. UMAA análise de alterações de expressão gênica nestes animais transgênicos identificou numerosos genes regulados por superexpressão de curto prazo (2 semanas) de ΔFosB, mudanças associadas a uma diminuição concomitante na recompensa de drogas. As mudanças na expressão gênica e na resposta comportamental com ΔFosB de curto prazo foram notavelmente similares àquelas observadas em animais que expressam em excesso CREB nas semanas 2 ou 8 (McClung e Nestler, 2003). Em contraste marcante, a superexpressão a longo prazo (8 semanas) de ΔFosB diminuiu a expressão de muitos desses mesmos genes e levou a um aumento na recompensa do fármaco (Kelz et al., 1999; McClung e Nestler, 2003).

Um gene identificado nesses estudos é colecistoquinina (Cck), um neuropeptídeo produzido em várias regiões do cérebro, incluindo o estriado (Hokfelt e outros, 1980). CCK pode modular a transmissão dopaminérgica (Vaccarino, 1992), está envolvida na recompensa e reforço de drogas (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld e outros, 2002; Rotzinger e outros, 2002), e é induzido no estriado por cocaína crônica (Ding e Mocchetti, 1992). Além disso, o Cck O promotor demonstrou ser responsivo aos complexos CREB e AP-1 (Haun e Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Como muitos dos genes (incluindo Cck) que mostraram expressão aumentada após a CREB e a expressão de ΔFosB a curto prazo eram genes suspeitos ou suspeitos de CREB (McClung e Nestler, 2003), queríamos determinar se a expressão de ΔFosB a curto prazo leva à regulação desses genes (com foco em Cck) através da regulação do CREB ou através de mecanismos mais complexos de regulação gênica.

RESULTADOS

A superexpressão de ΔFosB transitoriamente aumenta os níveis de CREB

Usamos Western blotting para investigar se a superexpressão de ΔFosB aumenta os níveis de proteína CREB no estriado de camundongos. Para este estudo, utilizamos camundongos bi-transgênicos (linha 11A) que transportam tanto um transgene NSE-tTA como um transgene TetOp-ΔFosB. Na ausência de doxiciclina, esses camundongos mostram um aumento robusto na expressão de ΔFosB nos neurônios positivos para o dinostro no estriado (Kelz et al., 1999). Este método de superexpressão de ΔFosB tem sido amplamente documentado e permite a superexpressão específica da região, o que se assemelha à indução de ΔFosB observada em animais expostos à cocaína crônica (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Descobrimos que em camundongos 11A superexpressando ΔFosB, os níveis de proteína CREB foram significativamente suprarregulados após 2 semanas de expressão e esses níveis retornaram à linha de base após 8 semanas de expressão (Figura 1A, n = 8). Para determinar se as mudanças nos níveis de CREB com superexpressão de ΔFosB de curto prazo poderiam ser replicadas em outro sistema, superexpressamos transitoriamente ΔFosB em células PC12 e descobrimos que os níveis de CREB aumentaram significativamente (p <0.05) quando comparados aos controles (Figura 1B, n = 4). Estes resultados demonstram que a expressão de ΔFosB a curto prazo aumenta os níveis de proteína CREB.

Os níveis de CREB aumentam com a superexpressão de ΔFosB. Análise Western blot dos lisados de (UMA) estrias de ratinhos de 11A de dox para 2 ou 8 semanas ou (B) Células PC12 com superexpressão de ΔFosB. Dados em A são mostrados como alteração percentual em off dox em comparação ...

Ambos ΔFosB e CREB ligam-se a promotores de genes alvo específicos no estriado após superexpressão de ΔFosB a curto prazo

Usamos ensaios de ChIP (imunoprecipitação de cromatina) de tecido do estriado para determinar se a ligação de ΔFosB ou CREB ocorreu em certos promotores do gene alvo e se esta ligação foi aumentada após a superexpressão de ΔFosB a curto prazo. Analisamos a ligação no BDNF e Cck promotores, uma vez que ambos os genes são altamente regulados após a superexpressão de ΔFosB de curto prazo, superexpressão de CREB ou tratamento crônico de cocaína (McClung e Nestler, 2003). Também analisamos a ligação no CDK5 promotor, já que é um alvo direto conhecido de ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Finalmente, medimos a ligação no prodinorfina promotor, uma vez que estudos anteriores descobriram que ele pode ser ligado tanto a ΔFosB quanto a CREB sob condições diferentes (Andersson et al., 2001; Zachariou e outros, 2006).

A análise de ChIP foi realizada em estrias de camundongos 11A superexpressando ΔFosB por 2 semanas usando anticorpos que reconhecem CREB ou ΔFosB. Em condições normais, descobrimos que ΔFosB se liga ao CDK5 e prodinorfina promotores, enquanto não há ligação detectável no BDNF or Cck promotores (tabela 1). Além disso, a superexpressão de ΔFosB aumentou a ligação de ΔFosB no CDK5 promotor, mas não no prodinorfina promotor. Em seguida, medimos a ligação do CREB a esses promotores e descobrimos que o CREB se liga ao CDK5, BDNF e prodinorfina promotores, mas não ao Cck promotor, no estriado normal, e que a superexpressão de ΔFosB nas semanas 2 aumenta a ligação do CREB no BDNF e prodinorfina promotores, mas não o CDK5 promotor. Em conjunto, esses resultados mostram que ΔFosB e CREB podem se ligar a certos promotores de genes, como prodinorfina e CDK5, no entanto, a ligação do CREB é específica para outros promotores, como BDNF. Além disso, a sobreexpressão de ΔFosB leva a aumentos na ligação de ΔFosB em certos promotores, como seria de se esperar, mas também à ligação de CREB a promotores específicos, consistente com a indução de CREB mediada por ΔFosB observada nesse momento.

Ligação de proteínas reguladoras putativas a vários promotores em camundongos superexpressando ΔFosB por duas semanas.

Trabalhos anteriores mostraram que alterações na expressão gênica induzida pela superexpressão de ΔFosB a longo prazo estão associadas a modificações da cromatina, em particular, a acetilação da histona H3, em promotores de genes específicos (Kumar et al., 2005). Para determinar se isso poderia explicar as alterações na expressão gênica sobre a superexpressão de ΔFosB a curto prazo, medimos a ligação da histona acetilada H3 (uma modificação de histona associada à cromatina transcricionalmente ativa), ou uma histona metilada H3 (Lys9, uma modificação de histona associada à transcrição cromatina inativa). Descobrimos que a superexpressão de ΔFosB por 2 semanas não resultou em alterações na ligação de H3 acetilada em qualquer um dos promotores de genes estudados (tabela 1). Nós encontramos uma diminuição significativa na ligação da histona metilada H3 no prodinorfina promotor, mas sem vinculação no Cck promotor e nenhuma mudança na ligação no CDK5 e BDNF promotores, sugerindo que este não é um mecanismo geral pelo qual ΔFosB, a curto prazo, regula a expressão gênica. Ficamos surpresos e interessados pelo fato de não termos encontrado diferenças em nossos testes de ChIP que pudessem explicar o aumento Cck expressão de mRNA nos camundongos 11A após 2 semanas de expressão de ΔFosB e decidiu investigar este mecanismo ainda mais.

Aumentos de ΔFosB a curto prazo Cck expressão em múltiplos sistemas

A caracterização microarray de camundongos 11A bi-transgênicos com superexpressão de ΔFosB no estriado Cck os níveis de expressão aumentam após 2 semanas de superexpressão e, em seguida, diminuem gradualmente com períodos mais longos de expressão de ΔFosB (Figura 2A, n = 3). Nós validamos este efeito para Cck usando PCR em tempo real em um grupo separado de animais nas semanas 2 e 8 e os resultados encontrados nos dois pontos de tempo para ser semelhante à análise de microarray (dados não mostrados).

Superexpressão de curto prazo de ΔFosB aumenta Cck expressão genetica. (A) Cck Expressão de mRNA no estriado após superexpressão de ΔFosB em camundongos 11A nas semanas 1, 2, 4 ou 8. A análise de microarranjos foi realizada em amostras estriatais e Cck níveis ...

Para investigar ainda mais a capacidade de ΔFosB para regular Cck expressão, utilizamos células PC12 transientemente transfectadas com Cckplasmídeo repórter de -luciferase e um plasmídeo de expressão ΔFosB ou uma quantidade igual de pCDNA. Ambos os dois (n = 5-9) e três (n = 11-13) dias de superexpressão ΔFosB resultaram em um aumento significativo na Cck-luciferase. Além disso, três dias de superexpressão ΔFosB resultaram em mais Cck-luciferase quando comparado a dois dias de superexpressão (Figura 2B). A sobreexpressão de ΔFosB não induziu a expressão de uma construção de luciferase sem promotor (dados não mostrados). Sob nenhuma condição de tratamento houve redução Cck-luciferase aparente. Estes resultados mostram que a expressão de ΔFosB de curto prazo aumenta a atividade do Cck promotor, e deixa sem resposta o mecanismo pelo qual a superexpressão ΔFosB a longo prazo suprime Cck expressão.

A superexpressão de ΔFosB aumenta a ligação em um local de ligação putativo de CREB no Cck promotor

Nossas análises descobriram que Cck a expressão é aumentada após a expressão de ΔFosB a curto prazo, no entanto, os nossos ensaios ChIP verificaram que nem o CREB nem o ΔFosB se ligam à Cck promotor. Para determinar se há alguma alteração na ligação de proteínas no Cck promotor após a superexpressão de ΔFosB, utilizamos ensaios de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA) com uma sonda contendo o suposto local semelhante ao CRE presente dentro do Cck promotor. Usando extratos nucleares de estrias de camundongos 11A superexpressando ΔFosB por 2 semanas, encontramos um aumento na ligação ao local putativo de CRE no Cck promotor (Figura 3 A, C, n = 4). Curiosamente, os camundongos 11A superexpressando ΔFosB por 8 semanas, que mostram uma diminuição Cck expressão, também mostrou aumento da ligação neste local (Figura 3B, C, n = 4). Como comparação, examinamos a ligação a um local de consenso CRE em camundongos superexpressando ΔFosB por 2 semanas e descobrimos uma ligação robusta de CRE em extratos estriatais, mas nenhum aumento na ligação após a indução de ΔFosB (Figura 3F, n = 4). Assim, apesar de um aumento induzido por ΔFosB nos níveis totais de CREB observados neste momento, estes resultados estão de acordo com os nossos testes ChIP que verificam que a ligação aumentada de CREB a promotores após a sobreexpressão de ΔFosB é específica de apenas determinados genes e não é um fenómeno global . Para determinar se o CREB está vinculado ao Cck promotor em nossa análise EMSA, realizamos ensaios supershift com um anticorpo específico para CREB. De acordo com nossos testes de ChIP, não encontramos nenhuma ligação de CREB a um Cck sonda contendo o local putativo CRE em ensaios EMSA, enquanto CREB ligou significativamente e superou um local de consenso CRE (Figura 3D, E, n = 4). A atividade de ligação ao DNA no Cck o promotor tamb n foi afectado por um anticorpo para? FosB (dados n apresentados), sob condies mostradas em diversos estudos anteriores para bloquear a ligao? FosB a sios AP-1 de boa-fada (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Também realizámos ensaios ChIP em estrias de animais 11A após semanas 8 de expressão de ΔFosB e ainda não encontramos ligação de CREB ou ΔFosB ao Cck promotor (dados não mostrados). Assim, a expressão de ΔFosB leva a um aumento na ligação de proteínas no Cck promotor após ambas as semanas 2 e 8 de expressão; no entanto, a identidade desses fatores permanece desconhecida.

Ligação de proteínas no Cck promotor. (A, B) Ensaio de deslocamento eletroforético de mobilidade Cck Local semelhante ao CRE com tecido estriado de animais com superexpressão de ΔFosB por 2 semanas (A) ou 8 semanas (B). Em (A), competição com excesso de competidor não rotulado ...

O putativo site CRE no Cck O promotor não é responsável pelo aumento da atividade do promotor

Desde que encontramos um aumento na ligação de proteínas usando um fragmento do Cck promoter, que contém o site de CRE putativo, após a sobreexpressão de ΔFosB, queríamos determinar se esse site é necessário para aumentar Cck expressão após a sobreexpressão de ΔFosB. Para testar esta possibilidade, transfectamos células PC12 com um Cck-luciferase contendo o seu local semelhante a CRE intacto ou um contendo uma mutao no local que abolir qualquer interaco com CREB. Curiosamente, a mutação do sítio semelhante ao CRE diminuiu Cck atividade promotora por 32% (Figura 4A, n = 9), mas não afetou o Cck indução do promotor por superexpressão de ΔFosB (Figura 4B, n = 11-13). Isto sugere que, embora o Cck o promotor requer um local semelhante a CRE intacto para actividade basal completa, a actividade promotora aumentada induzida pela sobreexpressão de ΔFosB não requer a sequência do tipo CRE.

O Cckcomo o site CRE não é necessário para Cck indução por ΔFosB. (A) CckA actividade da alfa-luciferase foi medida 2 dias após a transfecção com Cck-luciferase ou aquele em que o local semelhante a CRE foi mutado. * p <0.05 (B) Cck-luciferase ...

cFos liga-se ao Cck promotor

Estudos anteriores descobriram que cFos O mRNA aumenta com a expressão de ΔFosB a curto prazo, no entanto, após a expressão prolongada de ΔFosB, a capacidade do tratamento com cocaína para induzir cFos no estriado é reduzida (McClung e Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Portanto, pode ser possível que o cFos contribua para o aumento de Cck expressão após a expressão de ΔFosB a curto prazo. Realizamos testes ChIP com um anticorpo específico para cFos e medimos a ligação cFos no Cck promotor com e sem a expressão de ΔFosB a curto prazo. Enquanto descobrimos que o cFos se liga ao Cck promotor, esta ligação não aumentou significativamente após a superexpressão de ΔFosBFigura 5, n = 5). Isto sugere que, desde cFos liga o Cck promotor, pode contribuir para a regulamentação geral Cck expressão, mas provavelmente não está envolvido na regulação do Cck promotor por ΔFosB.

cFos liga-se ao Cck promotor. Os ensaios de imunoprecipitação de cromatina foram realizados com um anticorpo específico para cFos usando tecido estriado de camundongos superexpressando ΔFosB ou em dox, ou após 2 semanas de remoção do dox. A análise de PCR em tempo real foi ...

DISCUSSÃO

Este estudo confirma e expande as descobertas anteriores mostrando que ΔFosB regula a expressão gênica no corpo estriado e achamos que ele o faz através de múltiplos mecanismos após a expressão de curto prazo. Mostramos que, após 2 semanas de superexpressão, ΔFosB se liga diretamente aos promotores em certos genes, levando a mudanças na expressão (ie CDK5). Além disso, aumenta os níveis de proteína CREB, um efeito observado em células cultivadas, bem como no estriado, levando ao aumento da ligação de CREB em outros promotores de genes (ou seja, dinorfina e BDNF). Em um estudo anterior, descobrimos que a superexpressão de curto prazo de ΔFosB no estriado leva a muitas das mesmas alterações de expressão gênica que são encontradas quando o CREB é superexpresso, e leva a respostas comportamentais semelhantes em medidas de preferência por cocaína (McClung e Nestler, 2003). Assim, a presente descoberta de que ΔFosB leva a uma indução de CREB, assim como a ligação de CREB a certos promotores de genes, ajuda a explicar por que tantas das mudanças de expressão gênica foram compartilhadas por esses dois fatores de transcrição.

A indução de CREB por ΔFosB é interessante, uma vez que foi demonstrado que as drogas de abuso induzem alterações nos níveis de CREB fosforilada em serina 133 (Mattson e outros, 2005) e aumentar a transcrição mediada por CRE (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman e outros, 2002, 2003), sem alterar os níveis gerais de CREB. É possível que mudanças nos níveis de CREB possam ser transitórias e, portanto, facilmente perdidas em outros estudos. Em nossas mãos, vimos aumentos induzidos pela cocaína no mRNA do CREB em experimentos específicos, no entanto, este efeito é altamente variável (observação não publicada). Uma vez que ambos os camundongos transgênicos 11A e PC-12 mostram indução de CREB após a superexpressão de ΔFosB a curto prazo, isso sugere que CREB é de fato induzido por ΔFosB (ou um alvo de ΔFosB), fornecendo mais um mecanismo para explicar mudanças induzidas por drogas no gene expressão.

Surpreendentemente, descobrimos que nem o CREB nem o ΔFosB se ligam ao Cck promotor, embora Cck a expressão é claramente regulada após a expressão de ΔFosB a curto prazo. Cck é um neuropeptídeo abundante expresso tanto na VTA como NAc (Hokfelt e outros, 1980) e está provavelmente envolvido em respostas comportamentais a drogas de abuso (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld e outros, 2002; Rotzinger e outros, 2002). Em ensaios de cultura de células, o Cck O promotor foi extensivamente caracterizado e mostrou-se responsivo aos membros da família CREB e AP-1 (revisado por Hansen, 2001). Haun e Dixon (1990) mostrou que os complexos AP-1 podem se ligar ao Cck Site semelhante ao CRE in vitroe, mais tarde, foi demonstrado, usando células de neuroblastoma SK-N-MC, que a mutação do sítio tipo CRE reduziu a resposta do promotor a cFos / cJun superexpressa (Rourke et al., 1999). De fato, também encontramos Cck atividade promotora (Figura 2) e ligação ou em torno do elemento do tipo CRE (Figura 3) sobre a superexpressão de ΔFosB, outro membro da família AP-1, mas não encontramos nenhuma ligação direta de ΔFosB ao Cck promotor in vivo or in vitro, mesmo em sua superexpressão.

Muito trabalho demonstrou um papel para o CREB na regulação de Cck atividade promotora. o Cck O local semelhante ao CRE é conservado em todos os vertebrados (Hansen, 2001) e, em alguns ensaios de cultura de células, os complexos CREB e AP-1 se ligam a este local e são necessários Cck atividade promotora (Haun e Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Além disso, vários ativadores conhecidos de Cck expressão (incluindo bFGF, PACAP, peptonas e despolarização) demonstraram agir via CREB (Hansen, et al., 1999; Deavall, et al, 2000; Bernard, et al., 2001; Gevrey, et al., 2002; Hansen, et al., 2004). Nosso CckOs dados do gene repórter da -luciferase suportam um papel essencial para o site semelhante ao CRE na regulação de Cck atividade promotora, uma vez que a mutação deste local reduz a Cck atividade promotora e CckA expressão de -luciferase induzida por VP16-CREB, uma forma constitutivamente ativa de CREB, é perdida quando este sítio é mutado (observação não publicada). Assim, ficamos surpresos ao descobrir que o CREB não parece se ligar ao Cck promotor em extratos estriados tanto no início como na superexpressão de ΔFosB de curto prazo quando os níveis de CREB estão aumentados. Isso argumenta que os níveis de CREB per se não são o único fator na determinação da quantidade de ligação neste site, e isso é apoiado pelo trabalho de outros (Cha-Molstad, et al., 2004). Como os promotores de outros genes-alvo CREB previamente identificados, como BDNF e prodinorfina, ligou CREB, estamos confiantes em nossa constatação de que CREB não é vinculativo para o Cck promotor em extratos nucleares estriados. Além disso, a indução de CckA atividade de alfa-luciferase por ΔFosB não foi dependente do sítio intacto de CRE, sugerindo que ΔFosB não regula Cck expressão, regulando a vinculação direta da CREB ao Cck promotor.

Nossa incapacidade de detectar CREB interagindo com o Cck promotor é apoiado por Renthal et al. (2009), que usaram uma abordagem ChIP-chip para observar as mudanças globais na ligação CREB (pCREB) fosforilada e na ligação de ΔFosB no estriado após a exposição crônica à cocaína. Nestas expericias, os complexos ADN-protea foram imunoprecipitados com anticorpos? FosB ou pCREB e o ADN precipitado, ap marcao, foi hibridado para um microarranjo de promotor. Embora muitos dos genes-alvo CREB previamente caracterizados tenham sido identificados com essa abordagem (por exemplo, BDNF, prodinorfina), Cck não foi identificado. Além disso, foi demonstrado que a ligação de CREB a um local CRE de consenso varia muito entre linhas celulares cultivadas (Cha-Molstad, et al., 2004). Todos os estudos anteriores que encontraram interações CREB com o Cck Os promotores foram realizados em cultura celular (não no cérebro a partir do qual as nossas amostras EMSA e ChIP foram derivadas) e utilizaram ensaios de deslocamento de gel para investigar as interacções proteína-ADN. Enquanto um EMSA pode avaliar o potencial de um fator para se ligar a uma seqüência de DNA, os testes ChIP fornecem uma nova visão dessas interações in vivo. Além disso, muitos dos dados que demonstram a indução de Cck atividade promotor ou ligação CREB ao Cck Os promotores foram obtidos a partir de células estimuladas por fatores como peptonas (Bernard et ai., 2001), despolarização (Hansen, et al., 2004), ou uma variedade de activadores de cascatas de sinalização intracelular incluindo cAMP e ERK (Hansen et al., 1999). Em nossos experimentos, o único “estímulo” usado foi a superexpressão de ΔFosB, que é suficiente para induzir Cck expressão. Em conjunto, isso sugere que a capacidade do CREB de se ligar (e potencialmente regular) Cck O promotor é altamente dependente do tipo de célula e da ativação de vias de sinalização particulares. Além disso, o Cck O elemento promotor do tipo CRE (pelo menos em células PC12 não induzidas e no estriado de camundongo) não é um alvo direto de CREB ou ΔFosB. Curiosamente, o regulamento de FosB A expressão por CREB também é específica para o tipo de célula e o tipo de estimulação. Um estudo de Andersson et al. descobriram que a injeção de oligonucleotídeos antisense CREB no estriado de camundongo inibiu parcialmente a indução de FosB após administração de cocaína (Andersson et al., 2001). No entanto, eles também descobriram que a capacidade da L-Dopa para induzir FosB A expressão no estriato lesionado com 6-OHDA não foi influenciada pela presença de oligonucleótidos antisense CREB.

Uma vez que o CREB e ΔFosB parecem regular indiretamente Cck promotor, e alterações na estrutura da cromatina foram documentadas em resposta a uma variedade de estímulos que induzem ΔFosB (Tsankova e outros, 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), raciocinamos que ΔFosB pode indiretamente modular a atividade do promotor alterando a estrutura da cromatina. No entanto, em camundongos superexpressando ΔFosB por 2 semanas, não houve alteração na acetilação de histonas H3 na Cck promotor (tabela 1). Isto é suportado pelos dados do chipset ChIP Renthal et al. (2009), que relataram nenhuma mudança na ligação de H3 acetilada no Cck promotor em camundongos expostos à cocaína crônica. Desde o Cck o promotor é activo no corpo estriado, não se esperava ou observou qualquer ligação repressiva de histona metilada H3. Curiosamente, também não houve mudança devido à superexpressão de ΔFosB na ligação acetilada de H3 no BDNF promotor (que mostrou aumentar a ligação do CREB) ou no CDK5 e prodinorfina promotores (que apresentaram aumento da ligao? FosB). Uma vez que há uma infinidade de modificações de histonas associadas a mudanças na atividade do promotor (revisado por Rando e Chang, 2009), provavelmente outras modificações da cromatina associam-se à indução desses genes. Qualquer modificação única da cromatina, embora muitas vezes preditiva do nível de atividade do promotor, não pode mudar durante a ativação de um gene em particular. Em trabalhos futuros, seria interessante observar outras mudanças potenciais na estrutura da cromatina em torno do Cck promotor após a sobreexpressão de ΔFosB. Curiosamente, cocaína crônica (provável via A indução ΔFosB) induz a expressão de sirtuínas 1 e 2, histona desacetilases classe III que parecem alterar a fisiologia neuronal, a sinalização de ERK e as respostas comportamentais à cocaína (Renthal et al., 2009). A indução de uma histona desacetilase teria a capacidade de regular simultaneamente a expressão de um grande número de genes via mudanças globais na estrutura da cromatina.

Um possível candidato envolvido Cck regulação após a sobreexpressão de FFosB foi o membro da família AP-1 cFos. A expressão de cFos é regulada pelo CREB (Sheng e outros, 1990; Impey et al., 2004), e a superexpressão de cFos (concordante com a superexpressão de seu parceiro de ligação cJun) aumenta Cck atividade promotora (Rourke et al., 1999). Portanto, o aumento nos níveis de CREB devido à superexpressão de ΔFosB de curto prazo pode aumentar os níveis de cFos e resultar em aumento da ligação ao Cck Site semelhante ao CRE. cfos O mRNA é induzido em camundongos após duas semanas de superexpressão ΔFosB (McClung e Nestler, 2003) e diminuiu em camundongos expostos à cocaína crônica ou à superexpressão ΔFosB a longo prazo (Renthal et al., 2008). Aqui encontramos que o cFos se liga diretamente ao Cck promotor no tecido estriado, no entanto, a superexpressão de ΔFosB não aumenta significativamente a ligação. Isso sugere que, embora os cFos possam estar envolvidos Cck expressão em geral, uma mudança na ligação de cFos sozinho não é provável o mecanismo pelo qual ΔFosB regula Cck expressão. É possível, no entanto, que ΔFosB possa induzir alterações pós-traducionais em cFos (por exemplo, fosforilação alterada) ou induzir a expressão de um parceiro de ligação (como cJun) ou proteína co-ativadora. Contudo, uma vez que o sítio semelhante a CRE intacto (que anteriormente se demonstrou ser um local de ligação para os complexos AP-1, ver Haun e Dixon, 1990) não é necessário para o aumento Cck atividade do promotor observada com a superexpressão de ΔFosB (conforme avaliado em nossos experimentos de gene repórter), é lógico que outros fatores de ação trans também sejam regulados por ΔFosB.

O Cck O fragmento de promotor utilizado nas nossas expericias do gene repter de luciferase cont um sio de ligao de Sp1 conservado e uma caixa de E (revisto por Hansen, 2002). Em particular, demonstrou-se que as sequências da caixa-E ligam vários fatores de transcrição (revisados por Forrest e McNamara, 2004). Usando as células PC12, vimos que a mutação da caixa de e-reduções diminui Cck atividade promotora, mas não altera a resposta do promotor para ΔFosB (dados não mostrados). Curiosamente, um CckAs mutações contendo repórter de alfa-luciferase em ambos os locais CRE e E-box não têm actividade basal detectável e não respondem à sobreexpressão de ΔFosB (observação não publicada). Outro potencial mediador da ação ΔFosB no Cck promotor são ATFs, algumas formas das quais são conhecidas por serem induzidas em estriado por exposição crônica a psicoestimulantes (Green et al., 2008). No entanto, não encontramos nenhuma evidência para a indução de ΔFosB desses ATFs (dados não mostrados), e não se espera que os ATF se liguem ao local mutado do tipo CRE no Cck promotor.

Uma advertência deste estudo é que estamos usando um sistema bi-transgênico para superexpressar ΔFosB e, portanto, é preciso ser conservador ao traçar paralelos entre esse paradigma e a administração de cocaína crônica. No entanto, os camundongos transgênicos 11A fornecem a oportunidade única de observar os efeitos específicos de ΔFosB no estriado, uma vez que a superexpressão é limitada a essa região do cérebro (Chen et al., 1998), enquanto a administração de cocaína induz mudanças em uma ampla variedade de outras regiões cerebrais que podem afetar indiretamente o corpo estriado. Além disso, vários estudos documentaram fenótipos comportamentais e moleculares similares nos camundongos 11A quando comparados a animais não transgênicos tratados com cocaína crônica (Kelz et al., 1999; McClung e Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Além disso, Bibb et al. (2001) relataram níveis semelhantes de estriado Cdk5 indução de mRNA e proteína nessa mesma cepa 11A quando comparada com ninhadas não transgênicas tratadas com cocaína, bem como mudanças similares nos alvos CDK5, p35 e DARPP-32.

Em conclusão, descobrimos que a expressão de ΔFosB a curto prazo leva à indução de genes no estriado através de múltiplos mecanismos. Estes incluem ligação directa ao promotor, indução da proteína e actividade de CREB, modificação da cromatina, além de vias a serem determinadas.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Animais

Animais 11A bi-transgênicos machos (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) foram utilizados neste estudo e são caracterizados Kelz et al., 1999. Para superexpressar ΔFosB, os camundongos foram removidos da doxiciclina entre 3 e 6 semanas de idade, enquanto os camundongos controle foram mantidos em doxiciclina. Todos os ratos foram alojados em grupo e mantidos num ciclo de luz / escuridão 12: 12, luzes acesas a 7 am e luzes apagadas a 7 pm, com ad lib acesso a comida e água. Todos os experimentos com camundongos estavam em conformidade com protocolos aprovados pelo comitê de cuidados e uso de animais do Centro Médico da Universidade do Texas, em Dallas.

Reporter e plasmídeos de expressão

O tipo selvagem (WT) Cck O repï¿½ter promotor-luciferase foi preparado inserindo um fragmento de PCR de aproximadamente 200 pb no vector pGL3-luc (Promega). Este fragmento foi obtido a partir de ADN genómico de ratinho (iniciadores: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' a montante, e 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' a jusante) e inicialmente inserido no vector pGEM-T Easy (Promega, #A1360). O fragmento promotor foi então clonado nos locais da enzima de restrição Kpn1 / Xho1 de pGL3-luc.

Para criar a mutação do ponto CRE no Cck promotor, um iniciador mutagênico direcionado contra um local semelhante a CRE relatado anteriormente (iniciador sentido: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', iniciador antisense: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') foi usado em combinação com o kit de mutagênese de modificação por Strat II) . Isso converte o site semelhante a CRE relatado (ACTGCGTCAGC) em ACTGAGCTCC. Todos os plasmídeos repórter foram confirmados por sequenciação de DNA. O plasmídeo de expressão ΔFosB contém uma sequência ΔFosB de comprimento total inserida no local de clonagem múltipla de pCDNA 3.1 e foi descrito anteriormente (Ulery e Nestler, 2007).

Cultura de células e transfecções de DNA

Células de feocromocitoma de rato (PC12) foram mantidas em meio F-12 de Eagle modificado por Dulbecco, suplementado com 10% de soro de cavalo, 5% de soro fetal de bovino e 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C e 5% de CO₂. As células foram transfectadas por eletroporação usando um eletroporador BTX 360 (350V, 0 ohms e 850 μF) em 800 μL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco em cuvetes de lacuna de 4 mm com 10 μg do repórter e 5 μg do construto de expressão. O plasmídeo de vetor vazio (pCDNA) foi usado para normalizar as quantidades totais de DNA. Após a transfecção, as células foram cultivadas em placas revestidas com colágeno de 35 mm durante os períodos de tempo indicados.

Ensaios de luciferase

Dois ou três dias após a transfecção, as células foram lavadas 3 vezes em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, lisadas (usando glicilglicina 25 mM, MgSO 15 mM₄, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), recolhidos e clarificados por meio de centrifugação. 30 μL de lisado foi combinado com tampão de ensaio de luciferase 140 μL (25 mM glicilglicina, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM fosfato de potássio, 1 mM coenzima A, pH 7.8). A actividade de luminescência foi medida utilizando um leitor de fluorescência de microplacas FLx-800 após uma injecção automatizada de 40 μL 1 mM de luciferina por poço. A actividade da luciferase foi normalizada para o teor de proteína total, conforme determinado por um ensaio de proteína BioRad.

Ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforético

Extratos nucleares de fatias bilaterais de corpo estriado de camundongos 11A bi-transgênicos (aqueles mantidos em ou fora de doxiciclina para as semanas 2 ou 8) (McClung e Nestler, 2003) foram preparados de acordo Huang e Walters (1996). ³²As sondas oligonucleoticas de cadeia dupla marcadas com P foram preparadas utilizando o protocolo do sistema Promega Gel Shift Assay (#E3300) e as sondas foram purificadas utilizando Colunas Quick Spin da Roche. As sequências da sonda CRE e AP-1 de consenso foram da Promega (#E328A e E320B, respectivamente) e as Cck As sequï¿½cias CRE foram (sentido Cck-CRE: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE anti-sentido: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

As reações de ligação e eletroforese foram realizadas usando modificações do procedimento do sistema Promega Gel Shift Assay (#E3300). 50,000 CPM da sonda marcada foi combinado com 10 μg extrato nuclear estriado. DNA ou anticorpos competidores frios foram adicionados antes da introdução das sondas radiomarcadas. Para experimentos de supershift, 2 μg de anticorpo CREB (Upstate Biotechnology # 06-083) foi usado. As reacções foram submetidas a electroforese em gel de poliacrilamida 4%, secas e expostas a película (utilizando ecrãs de intensificação para 1 hora a 2 dias).

Imunoblotting

Para as células PC12, placas de 35 mm de células transfectadas foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco gelada e lisados foram preparados em tampão de lise RIPA gelado (Tris 50 mM pH 7.4, NaCl 5 mM, EDTA 5 mM, desoxicolato 1%, 1 % Triton X-100, 0.1% dodecil sulfato de sódio) contendo inibidores de protease. Após sonicação, limpeza e ensaio de proteína de Bradford, os lisados foram totalmente desnaturados e 50 μg de cada amostra foram submetidos à eletroforese em géis de poliacrilamida SDS a 10%. As proteínas foram transferidas para membrana de PVDF, bloqueadas por 1 hora em leite em pó desnatado a 3% em solução salina tamponada com Tris contendo Tween-0.1 a 20% (leite TBS-T) e sondadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, usado a 1: 1,000; GAPDH-Sigma # G8795, usado a 1: 80,000) diluído em leite TBS-T. Após lavagens múltiplas em TBS-T, os blots foram sondados durante uma hora à temperatura ambiente usando anticorpos secundários conjugados com fosfatase alcalina (Sigma) diluídos 1: 5,000 em leite TBS-T. Após várias lavagens em solução salina tamponada com Tris, a reação de cor foi realizada de acordo com as instruções do BioRad (# 170-6432). As membranas foram secas durante a noite, digitalizadas em um scanner de mesa e densitometria realizada usando ImageJ (ver abaixo).

Para os extratos do estriado, os ensaios de Western blot foram realizados conforme publicado anteriormente (Hope et al., 1994). O tecido foi removido de ratinhos decapitados, colocado em gelo e seccionado numa matriz cerebral com uma espessura de 1 mm. Socos de tecido foram então retirados e congelados a -80 ° C até serem utilizados. O tecido foi sonicado em gelo num tamp modificado com base em detergente contendo fosfatase e inibidores de protease (Roche, Sigma). Após sonicação, as amostras foram desnaturadas em água a ferver e centrifugadas a 15,000xg por 15 minutos; o sobrenadante foi subsequentemente coletado e processado; quantidades de concentração de proteína foram então quantificadas usando um ensaio de Bradford (Bio-Rad). As amostras foram corridas num gel de 10% acrilamida / bisacrilamida, transferidas para uma membrana de PVDF, bloqueadas em 5% de leite e incubadas com anticorpos primários (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Os blots foram subsequentemente visualizados usando um sistema de quimiluminescência (Pierce). Todas as amostras foram normalizadas para GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Curvas padrão foram executadas para garantir que estamos na faixa linear do ensaio.

Análise de densitometria

Para imunoblots de PC12, a análise densitométrica foi realizada usando ImageJ com calibração de rodbard. O sinal de fundo médio foi subtraído de cada medição e a razão entre o sinal CREB e GAPDH foi calculada para cada amostra. Para as análises de immunoblots estriatais e EMSA, a Scion Image 1.62c foi usada com subtração de fundo.

Imunoprecipitação cromatina (ChIP)

Os testes de chip foram realizados de acordo com os métodos de Tsankova et al. (2004) e Kumar et al. (2005). Resumidamente, as amostras estriadas bilaterais de camundongos 11A mantidos dentro ou fora da doxiciclina foram reticuladas com formaldeído a 1% e a reticulação foi extinta com glicina (concentração final de 0.125 M). Essas amostras eram de fatias inteiras do cérebro tomadas no nível do nucleus accumbens com o córtex removido. A cromatina foi cortada em fragmentos de aproximadamente 0.2 a 1 kb por meio de sonicação, depurada com esferas de Proteína G (Thermo Scientific # 22852) e amostras de entrada congeladas a -80 ° C. Entre 60 e 100 μg de cromatina foram usados para cada precipitação. 5-10 μg de cada anticorpo primário foram usados (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, H3 acetilado: Upstate Biotechnology # 06-599, H3 metilado (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x). Os complexos de anticorpo-cromatina foram imunoprecipitados com Proteína G mais esferas de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Scientific # 22852). Após a reticulação reversa das amostras de entrada e precipitadas, cada amostra foi submetida a PCR quantitativo (qPCR). O uso de todos esses anticorpos para ChIP foi amplamente validado (Tsankova e outros, 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Os nï¿½eis de ligaï¿½o proteica a cada promotor de gene de interesse foram determinados medindo a quantidade de ADN associado por qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). ADN de entrada ou total (não imunoprecipitado) e ADN imunoprecipitado foram amplificados em triplicado na presença de SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Os valores de Ct de cada amostra foram obtidos usando o software Sequence Detector 1.1. A quantificação relativa do DNA molde foi realizada usando o método ΔΔCt (Tsankova e outros, 2004). Iniciadores utilizados: promotor de BDNF 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; Promotor AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Promotor Cck: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Promotor de prodinorfina: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Análise estatística

Todos os dados são apresentados como médias ± erro padrão da média. A diferença estatística foi determinada pelo teste t de Student bicaudal (p <0.05). Quando comparações múltiplas foram feitas, os valores de p foram ajustados usando a correção de Bonferroni.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Will Renthal e Arvind Kumar pelas discussões úteis. Gostaríamos também de agradecer ao NIDA pelo financiamento dessas experiências.

Notas de rodapé

Isenção de responsabilidade do editor: Este é um arquivo PDF de um manuscrito não editado que foi aceito para publicação. Como um serviço aos nossos clientes, estamos fornecendo esta versão inicial do manuscrito. O manuscrito será submetido a edição de texto, formatação e revisão da prova resultante antes de ser publicado em sua forma final citável. Observe que, durante o processo de produção, podem ser descobertos erros que podem afetar o conteúdo, e todas as isenções legais que se aplicam ao periódico pertencem a ele.

Termos de classificação:

Seção: #1 Biologia Celular e Molecular de Sistemas Nervosos

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