A indução de DeltaFosB no córtex orbitofrontal potencia a sensibilização locomotora apesar de atenuar a disfunção cognitiva causada pela cocaína. (2009)

2. Métodos

Todos os experimentos foram realizados em estrita conformidade com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UT Southwestern.

2.5. Quantificação de mRNA

Os ratos receberam injeções intra-OFC de AAV-GFP ou AAV-ΔFosB, seguidos de 21 duas vezes por dia injeções de solução salina ou cocaína, exatamente como descrito para os experimentos comportamentais. Os animais foram utilizados 24 h após a última injeção de salina ou cocaína. Ratos foram mortos por decapitação. Os cérebros foram rapidamente extraídos e punções de calibre 1 mm de espessura bilateral do NAc foram obtidos e imediatamente congelados e armazenados a −12 ° C até o isolamento do RNA. Os perfuradores da OFC foram também removidos para análise por microarrays de ADN que confirmaram a transferência de genes mediada por vírus bem sucedida nesta região (verWinstanley et al., 2007) para resultados mais detalhados). O RNA foi extraído das amostras de NAc usando o reagente RNA Stat-60 (Teltest, Houston, TX) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA contaminante foi removido com tratamento com DNase (DNA-Free, nº de catálogo 1906, Ambion, Austin TX). O RNA purificado foi transcrito reversamente em cDNA (Superscript First Strand Synthesis, Nde Catogo 12371-019; Invitrogen). Os transcritos para genes de interesse foram quantificados utilizando qPCR em tempo real (SYBR Green; Applied Biosystems, Foster City, CA) num termociclador de poço XxUMX da Stratagene (La Jolla, CA). Todos os primers foram sintetizados de forma personalizada por Operon (Huntsville, AL; ver tabela 1 para sequências) e validado para linearidade e especificidade antes das experiências. Todos os dados de PCR foram normalizados para níveis de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), que não foi alterado pelo tratamento com cocaína, de acordo com a seguinte fórmula: ΔC_t =C_t(gene de interesse) - C_t (GAPDH) Os n�eis de express� ajustados para ambos os ratos AAV-FosB e AAV-GFP que receberam coca�a e os ratos AAV-FosB que receberam solu�o salina cr�ica foram ent� calculados em rela�o aos controlos (grupo AAV-GFP administrado com solu�o salina cr�ica) como segue:C_t = ΔC_t - ΔC_t (grupo de controle). De acordo com a prática recomendada no campo (Livak e Schmittgen, 2001), os níveis de expressão relativos aos controles foram calculados usando a seguinte expressão: 2^ΔΔCt.

  

tabela 1

Sequência de primers usados ​​para quantificar os níveis de cDNA por PCR em tempo real.

3. Resultados

Experiment 1

A administração crônica de cocaína produz sensibilização aos efeitos hiperlocomotores da cocaína aguda, que é imitada por ΔFosB

Como seria de esperar, foi observada uma sensibilização locomotora robusta nos animais de controlo após exposição crónica à cocaína, com os animais tratados cronicamente com cocaína a mostrar hiperactividade aumentada em resposta ao desafio agudo da cocaína (Fig. 1Atratamento crônico: F_1,34 = 4.325, p<0.045). Animais que superexpressam ΔJunD, um mutante dominante negativo de JunD que atua como um antagonista ΔFosB (Zachariou e outros, 2006), no OFC eram indistinguíveis dos animais de controlo (Fig. 1C, GFP vs ΔJunD, grupo: F_{1, 56} = 1.509, NS). No entanto, os animais que exprimiam ΔFosB na OFC que receberam injeções repetidas de solução salina pareceram “pré-sensibilizados”: eles mostraram uma resposta locomotora aumentada à cocaína aguda que era indistinguível da resposta sensibilizada de suas contrapartes tratadas com cocaína crônica (Fig. 1B, GFP vs ΔFosB cirurgia × tratamento crônico: F_{1, 56} = 3.926, p<0.052; ΔFosB apenas: tratamento crônico: F_1,22 = 0.664, NS). Os animais ΔFosB foram ligeiramente hiperativos dentro do primeiro 15 min de serem colocados nas caixas locomotoras (GFP vs ΔFosB, cirurgia: F_1,56 = 4.229, p <0.04), mas os níveis de atividade locomotora eram comparáveis ​​aos controles nos 15 minutos anteriores à administração de cocaína (cirurgia: F_{1, 56} = 0.138, NS).

  

FIG. 1

Sensibilização locomotora à cocaína. A cocaína aguda produziu maiores aumentos na atividade locomotora em animais controles tratados cronicamente com cocaína versus salina (painel A). Em animais que exprimem ΔFosB (painel B), os que receberam repetidas (Mais …)

Considerando que, quando administrada cocaína durante o 5CSRT, os mesmos animais mostraram uma capacidade relativamente aumentada de evitar respostas motoras prematuras, esta hiperatividade parece específica à locomoção ambulatorial, ou seja, o tipo de movimento que é tipicamente registrado nos estudos de sensibilização locomotora. Embora a atividade aumentada em resposta a drogas estimulantes possa refletir um perfil ansiogênico, a superexpressão intra-OFC de ΔFosB não aumenta a ansiedade conforme medida usando o labirinto em cruz elevado ou teste de campo aberto (dados não mostrados). Os animais também estavam bem habituados às injeções IP, e as injeções salinas não alteraram seu desempenho cognitivo (Winstanley et al., 2007), portanto, este efeito motor não pode ser atribuído a uma resposta geral a uma injeção IP. Em resumo, esses achados indicam que a indução de ΔFosB na OFC é suficiente (mas não necessária) para a locomotora sensível à cocaína, embora ΔFosB na mesma região cause tolerância aos efeitos da cocaína na motivação e impulsividade (Winstanley et al., 2007).

3.1. ΔFosB / FosB

Níveis de mRNA de FosB no NAc não foram alterados por qualquer tratamento medicamentoso crônico (Fig. 2Adroga: F_1,14 = 1.179, ns) ou expressão de ΔFosB no OFC (cirurgia: F_{1, 14} = 0.235, ns). No entanto, os níveis de ΔFosB foram significativamente mais elevados nos animais tratados cronicamente com cocaína, de acordo com relatórios anteriores (Chen et al., 1997); Fig. 2Bdroga: F_1,14 = 7.140, p<0.022). Curiosamente, a quantidade de ΔFosB mRNA no NAc de animais tratados com solução salina foi menor naqueles em que este fator de transcrição foi sobre-expresso no OFC (droga: F_1,14 = 9.362, p<0.011). No entanto, a ausência de uma interação droga × cirurgia indica que o tratamento crônico de cocaína estava tendo o mesmo efeito em ambos os grupos tratados com AAV-GFP e AAV-ΔFosB, elevando proporcionalmente os níveis de ΔFosB em uma extensão semelhante (droga × cirurgia: F_{1, 14} = 0.302, ns).

  

FIG. 2

Mudanças no mRNA dentro do NAc de animais sobre-expressando GFP ou ΔFosB no OFC, e tratados cronicamente com solução salina ou cocaína. Os dados indicam mudanças na dobra linear na expressão como proporção dos valores de controle. Os dados mostrados são (Mais …)

4. Discussão

Aqui mostramos que a superexpressão de ΔFosB no OFC sensibilizou ratos às ações estimuladoras da cocaína, simulando as ações de administração crônica de cocaína. Mostramos anteriormente que o desempenho desses mesmos animais nos paradigmas 5CSRT e de desconto de atraso é menos afetado pela cocaína aguda, e que um efeito semelhante à tolerância é observado após a exposição repetida à cocaína. Assim, a sensibilização e a tolerância a diferentes ações da cocaína podem ser observadas nos mesmos animais, com ambas as adaptações mediadas pela mesma molécula, ΔFosB, atuando na mesma região do cérebro. O fato de ambos os fenômenos poderem ser concorrentemente induzidos pela imitação de uma das ações da cocaína em um único loco frontocortical ressalta a importância das regiões corticais nas sequelas do consumo crônico de drogas. Além disso, esses dados sugerem que a tolerância e a sensibilização refletem dois aspectos aparentemente contrastantes, embora intimamente relacionados, da resposta a drogas aditivas.

Dado que a expressão aumentada de ΔFosB no NAc está criticamente envolvida no desenvolvimento da sensibilização locomotora, uma hipótese plausível seria que a superexpressão de ΔFosB na OFC pré-sensibiliza os animais à cocaína, aumentando os níveis de ΔFosB no NAc. No entanto, o resultado inverso foi encontrado: os níveis de ΔFosB no NAc foram significativamente menores nos animais que superexpressaram ΔFosB no OFC. As conseqüências comportamentais dessa diminuição no NAc ΔFosB são difíceis de interpretar, pois inibir as ações de ΔFosB por meio da expressão excessiva de ΔJunD nessa região reduz muitos dos efeitos da cocaína em camundongos (Peakman e outros, 2003). Certos paralelos existem entre essas observações e aquelas feitas em referência ao sistema de dopamina. Por exemplo, a depleção parcial da dopamina no NAc pode levar a hiperatividade, pois pode direcionar a aplicação de agonistas da dopamina nessa região (Bachtell e outros, 2005; Costall et al., 1984; Parkinson et al., 2002; Winstanley et al., 2005b). Da mesma forma, o fato de que o aumento dos níveis corticais de ΔFosB pode diminuir a expressão subcortical se assemelha ao achado bem estabelecido de que um aumento na transmissão dopaminérgica pré-frontal é frequentemente acompanhado por uma diminuição recíproca dos níveis de dopamina no estriado (Deutch et al., 1990; Mitchell e Gratton, 1992). Como esse mecanismo de retroalimentação pode funcionar para moléculas de sinalização intracelular atualmente não está claro, mas pode refletir mudanças na atividade geral de certas redes neuronais causadas por uma mudança na transcrição gênica. Por exemplo, aumentar ΔFosB no OFC leva a uma regulação positiva da atividade inibitória local, como evidenciado por um aumento nos níveis do GABA_A receptor, receptor mGluR5 e substância P, como detectado por análise de microarray (Winstanley et al., 2007). Essa mudança na atividade OFC poderia então afetar a atividade em outras áreas do cérebro, o que poderia levar a uma mudança local na expressão de ΔFosB. Se os níveis de ΔFosB refletem mudanças relativas na atividade da dopamina é uma questão que merece uma investigação mais aprofundada.

Todos os animais apresentaram um aumento significativo nos níveis de mRNA de ΔFosB no NAc após o tratamento crônico com cocaína, de acordo com relatos anteriores de aumento dos níveis de proteína (Chen et al., 1997; Hope et al., 1992; Nye et al., 1995). No entanto, um relatório recente descobriu que os níveis de ARNm de ΔFosB não estavam mais significativamente 24 h após o tratamento crônico com anfetamina, embora tenham sido observados aumentos significativos 3 h após a injeção final (Alibhai et al., 2007). Essa discrepância pode ser devida à diferença na droga psicoestimulante usada (cocaína vs anfetamina), mas dada a meia-vida mais curta da cocaína, seria razoável esperar que seus efeitos sobre a expressão gênica se normalizassem mais rapidamente que os da anfetamina, em vez de vice-versa. Uma razão mais plausível para estes resultados diferentes é que os animais no presente estudo foram injectados com uma dose moderada de fármaco duas vezes por dia durante os 21 dias, em comparação com uma injecção de dose única elevada durante os dias 7 (Alibhai et al., 2007). O regime mais extenso de tratamento poderia ter resultado nas mudanças mais pronunciadas observadas aqui.

Embora as mudanças na expressão gênica observadas no NAc após a cocaína crônica estejam em geral de acordo com os achados relatados anteriormente, a magnitude dos efeitos é menor no presente estudo. Uma razão potencial para isso é que os animais foram sacrificados apenas após a última injeção de cocaína, enquanto a maioria dos estudos usou tecido obtido duas semanas desde a última exposição ao medicamento. Estudos explorando o curso do tempo de sensibilização locomotora indicam que mudanças mais pronunciadas tanto no comportamento quanto na expressão de genes / proteínas são observadas neste momento posterior. Embora relatemos um ligeiro aumento no mRNA para a dopamina D₂ receptor no NAc, o consenso geral é que os níveis de expressão do D₂ ou D₁ o receptor não se modifica permanentemente depois do desenvolvimento da sensibilização locomotora, embora ambos aumentem e diminuam em D₂ número de receptores foram comunicados pouco depois do fim do regime de sensibilização (verPierce e Kalivas, 1997) para discussão). A nossa observação de que o ARNm de GluR1 e GluR2 se mantiveram inalterados após o tratamento crônico com a cocaína neste momento inicial também está de acordo com um relatório anterior (Fitzgerald e outros, 1996), embora um aumento no RNAm de GluR1 tenha sido detectado em momentos posteriores após a cessação do tratamento com psicoestimulantes crônicos (Churchill e outros, 1999).

No entanto, observamos um pequeno aumento no ARNm de PSD95 no NAc de animais tratados cronicamente com cocaína. PSD95 é uma molécula de andaime, e é uma das principais proteínas dentro da densidade pós-sináptica das sinapses excitatórias. Ele ancora vários receptores de glutamato e proteínas de sinalização associadas na sinapse, e acredita-se que um aumento na expressão de PSD95 reflita o aumento da atividade sináptica e aumento da inserção e estabilização dos receptores de glutamato nas sinapses (van Zundert et al., 2004). Um papel para PSD95 no desenvolvimento da sensibilização locomotora foi sugerido anteriormente (Yao et al., 2004).

Aumentos na expressão do arco também foram associados ao aumento da atividade sináptica. No entanto, embora tenha sido observado um aumento na expressão de Arc no NAc 50 min após a injeção com anfetamina (Klebaur et al., 2002), os nossos dados indicam que a administração crónica de cocaína não regula positivamente o Arco no NAc de forma mais permanente, embora tenham sido observados aumentos do ARN após administração crónica com medicamentos antidepressivos (Larsen et al., 2007) e anfetamina (Ujike et al., 2002). Um aumento na fosforilação de CREB também é observado no NAc após a administração aguda de cocaína e anfetamina (Kano et al., 1995; Konradi et al., 1994; Self et al., 1998), mas talvez não seja surpreendente que não tenha sido observado aumento do ARNm de CREB após administração crónica de cocaína. Acredita-se que a sinalização através da via da CREB seja mais importante nas fases iniciais do uso de drogas, com fatores de transcrição como ΔFosB dominando à medida que a dependência progride (McClung e Nestler, 2003). Embora a CREB tenha sido implicada nos efeitos recompensadores da cocaína (Carlezon e outros, 1998), não houve relatos de que o aumento da expressão de CREB afeta a sensibilização locomotora, embora aumentos mediados por vírus no antagonista endógeno dominante negativo de CREB, a proteína repressora precoce induzida por cAMP ou ICER, aumentem a hiperatividade causada por uma injeção aguda de anfetamina (Green et al., 2006).

Em resumo, embora a maioria das alterações induzidas por medicamentos observadas sejam concordantes com as previsões da literatura, não encontramos nenhuma alteração na expressão gênica dentro do NAc que pudesse explicar a resposta locomotora sensibilizada à cocaína observada em animais sem drogas tratados com intra-OFC AAV-ΔFosB. Isto levanta a possibilidade de que o aumento de ΔFosB no OFC possa não estar afetando a sensibilização motora via NAc, embora muitos outros genes, não estudados aqui, possam possivelmente estar envolvidos. Evidências consideráveis ​​sugerem que a modulação do córtex pré-frontal medial (CPFM) pode alterar a atividade estriatal e, assim, contribuir para a sensibilização comportamental aos psicoestimulantes (Steketee, 2003; Steketee e Walsh, 2005), embora seja menos conhecido o papel de regiões pré-frontais mais ventrais, como a OFC. O NAc recebe algumas projeções do OFC (Berendse et al., 1992). Entretanto, um estudo mais recente e detalhado identificou pouquíssimas projeções diretas de COF-NAc: foi observada rotulagem esparsa da parte mais lateral da concha de NAC após injeções de traçador anterógrado nas áreas lateral e ventrolateral da OFC, e a OFC mais ventral região envia projeções mínimas para o núcleo NAc (Schilman et al., 2008). O caudate-putamen central recebe inervação muito mais densa. À luz desta evidência anatômica, a maioria do tecido NAc analisado em nossas reações de PCR não teria sido diretamente inervado pela OFC, diminuindo as chances de que quaisquer alterações na expressão gênica fossem detectadas com sucesso.

O OFC projeta-se fortemente para regiões que estão fortemente conectadas com o NAc, como o mPFC, a amígdala basolateral (BLA), o putâmen caudado e o núcleo subtalâmico (STN). Se as mudanças no OFC poderiam indiretamente modular o funcionamento do NAc através de sua influência nessas áreas é uma questão em aberto. Tem sido demonstrado que a atividade no BLA é alterada após as lesões OFC, e que isso contribui significativamente para os déficits na aprendizagem reversão causada por danos OFC (Stalnaker et al., 2007), mas quaisquer efeitos em áreas como o NAc ainda não foram relatados. Pode ser mais produtivo concentrar a atenção em outras áreas mais fortemente conectadas ao OFC e que também estão fortemente implicadas no controle motor. O STN é um alvo particularmente promissor, pois não só as lesões do STN e do OFC produzem efeitos semelhantes na impulsividade e na aprendizagem pavloviana (Baunez e Robbins, 1997; Chudasama et al., 2003; Uslaner e Robinson, 2006; Winstanley et al., 2005a), mas a sensibilização locomotora induzida pelo psicoestimulante está associada a um aumento na expressão de c-Fos nessa região (Uslaner et al., 2003). Futuras experiências projetadas para investigar como as mudanças induzidas por drogas na expressão gênica dentro do OFC afetam o funcionamento de áreas a jusante como o STN são garantidas. O OFC também envia uma projeção menor para a área ventral tegmental (Geisler e outros, 2007), uma região conhecida por estar criticamente envolvida no desenvolvimento da sensibilização locomotora. É possível que a superexpressão de ΔFosB no OFC possa, portanto, influenciar a sensibilização locomotora através dessa via.

A natureza exata da relação entre mudanças induzidas por drogas na função cognitiva e na sensibilização locomotora ainda não é clara, e até agora nos concentramos no OFC. Dadas essas descobertas, é possível que mudanças na expressão gênica associadas ao desenvolvimento da sensibilização locomotora em outras regiões cerebrais possam, inversamente, ter algum impacto na resposta cognitiva à cocaína. Experiências que exploram a interação entre áreas corticais e subcorticais após a administração de drogas que causam dependência podem lançar uma nova luz sobre como o estado viciado é gerado e mantido, e os papéis interativos desempenhados pela sensibilização e tolerância nesse processo.

Referências