COMENTÁRIOS: Evidências de que deltafosb deixa traços por muito tempo após a recuperação do vício. Especificamente, a dependência provoca alterações epigenéticas, que resultam em indução muito mais rápida de deltafosb quando a recidiva ocorre. Isso explica como a recaída, mesmo depois de anos, pode se transformar rapidamente em um estado viciado completo.
J Neurosci. Manuscrito do autor; disponível em PMC 2013 January 25.
Sumário
ΔFosB, um Fosb produto do gene, é induzido em nucleus accumbens (NAc) e putamen caudado (CPu) por exposição repetida a drogas de abuso, como a cocaína. Esta indução contribui para padrões aberrantes de expressão gênica e anormalidades comportamentais observadas com exposição repetida a drogas.
Aqui, nós avaliamos se uma história remota de exposição a drogas em ratos pode alterar a indutibilidade do Fosb gene induzido pela exposição subsequente à cocaína. Mostramos que a administração prévia de cocaína crônica, seguida de retirada prolongada, aumenta a indutibilidade de Fosb em NAc como evidenciado pela maior indução aguda do RNAm de ΔFosB e acúmulo mais rápido da proteína ΔFosB após repetida reexposição de cocaína. Nenhum tal preparado Fosb indução foi observada na CPu, de fato, a indução aguda subseqüente do RNAm de ΔFosB foi suprimida na CPu.
Esses padrões anormais de Fosb expressão estão associadas às modificações da cromatina no Fosb promotor do gene. A administração prévia de cocaína crônica induz um aumento duradouro na ligação da RNA polimerase II (Pol II) no Fosb promotor no NAc apenas, sugerindo que o Pol II "stalling" primes Fosb para indução nesta região após reexposição à cocaína. Um desafio de cocaína, em seguida, desencadeia a liberação de Pol II do promotor do gene, permitindo a rápida Fosb transcrição. Um desafio com cocaína também diminui as modificações repressivas das histonas no Fosb promotor no NAc, mas aumenta essas marcas repressivas e diminui as marcas de ativação no CPu.
Estes resultados fornecem uma nova visão sobre a dinâmica da cromatina no Fosb promotor e revelar um novo mecanismo para preparado Fosb indução no NAc após reexposição à cocaína.
Introdução
A toxicodependência é caracterizada pela procura e adopção compulsivas de drogas, apesar das graves consequências adversas (Kalivas e outros, 2005; Hyman et al., 2006). A exposição crônica a medicamentos causa alterações persistentes na expressão gênica no estriado ventral (ou nucleus accumbens; NAc) e estriado dorsal (ou putâmen caudado; CPu), estruturas estriatais implicadas na recompensa e dependência de drogas (Freeman et al., 2001; Robinson e Kolb, 2004; Shaham e Esperança, 2005; Labirinto e Nestler, 2011). ΔFosB, uma proteína truncada e estável codificada pelo gene imediato-precoce, Fosb, é um fator de transcrição bem caracterizado induzido em NAc e CPu por exposição crônica a virtualmente todas as drogas de abuso, onde medeia respostas comportamentais sensibilizadas à administração repetida de drogas (Nestler, 2008). Entretanto, se a exposição crônica prévia a uma droga de abuso altera a indução subseqüente de ΔFosB permanece desconhecida.
Nós hipotetizamos recentemente que modificações na cromatina em resposta à exposição crônica a drogas podem alterar a indutibilidade de genes específicos em regiões cerebrais alvo (Robison e Nestler, 2011). Evidências crescentes têm mostrado que drogas de abuso após administração crônica alteram a estrutura e acessibilidade transcricional da cromatina através de numerosos tipos de modificações, incluindo fosforilação, acetilação e metilação de caudas de histonas. Trabalhos mais recentes em sistemas de cultura de células focaram no recrutamento de RNA polimerase II (Pol II) para o promotor de genes “indutíveis” antes de sua expressão, com Pol II ligado persistentemente a regiões promotoras proximais e ao redor do local de início da transcrição ) em estado “parado” (Núcleo e Lis, 2008; Nechaev e Adelman, 2008). Acredita-se que a ativação da Pol II paralisada seja responsável por sua fuga das regiões do promotor e do SST e sua transcrição desses genes “iniciados” (Zeitlinger et al., 2007; Saha et al., 2011; Bataille e outros, 2012).
Aqui, mostramos que a exposição crônica anterior à cocaína, seguida por um período prolongado de retirada, altera a indutibilidade da Fosb gene para a administração subseqüente de cocaína, sendo o NAc preparado para a indução enquanto a CPu não é. Em seguida, identificamos assinaturas distintas de cromatina no Fosb promotor do gene em NAc e CPu que estão associados com tal indutibilidade aberrante do Fosb gene, incluindo o recrutamento de Pol II paralisada no Fosb promotor proximal no NAc, bem como alterações em várias modificações de histonas ativadoras ou repressivas em ambas as regiões cerebrais. Estes resultados fornecem uma nova visão sobre a dinâmica da cromatina no Fosb promotor do gene e indicar pela primeira vez um mecanismo pelo qual a paralisação dos primos Pol II Fosb para maior ativação no NAc após reexposição à cocaína.
Materiais e Métodos
Animais
Ratos machos Sprague Dawley (250-275g; Charles River Laboratories), utilizados em todas as experiências, foram alojados em quartos climatizados num ciclo de luz / escuridão 12 hr (luzes ligadas em 7 AM) com acesso a alimentos e agua ad libitum. Todos os animais foram injectados duas vezes por dia durante dez dias com cocaína (15 mg / kg, ip) ou solução salina (ip) nas suas gaiolas. Experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) no Monte Sinai.
Medições locomotoras
Os animais foram habituados na câmara locomotora no primeiro dia para 1 h e depois monitorados quanto à atividade locomotora após uma injeção de solução salina usando o Photobeam Activity System (San Diego Instruments). Após XnUMX hora de habituação nas câmaras locomotoras todos os dias, administrou-se cocaína (1 mg / kg, ip) diariamente durante 15 dias e os animais foram novamente monitorizados quanto à actividade locomotora para 2 h.
Imunohistoquímica
Os animais foram perfundidos 24 h após a sua última exposição ao fármaco. A imunorreatividade de ΔFosB / FosB foi detectada como descrito (Perrotti e outros, 2004). Western blotting confirmou que toda a imunorreactividade semelhante a? FosB / FosB observada 24 hr ou mais depois das injeces de cocaa reflectia? FosB, com FosB sendo indetectel (n mostrado).
Isolamento de RNA, transcrição reversa e PCR
Golpes bilaterais com calibre 12 de NAc e CPu dorsolateral / dorsomedial foram obtidos conforme descrito (Perrotti e outros, 2004), congelados em gelo seco e processados de acordo com os protocolos publicados (Covington et al., 2011). O ARNm de ΔFosB e FosB foi medido utilizando PCR quantitativo (qPCR) com iniciadores específicos de isoforma ΔFosB e FosB (Alibhai et al., 2007). Os n�eis de ARNm de FFosB e FosB foram normalizados para os n�eis de ARNm de GAPDH, que n� foram afectados pela exposi�o a coca�a (n� mostrada).
Western blotting
Perfurações de NAc e CPu foram coletadas como acima e processadas para Western blotting, conforme descrito (Covington et al., 2011), usando anticorpos contra ERK44 / 42 [quinase regulada por sinal extracelular-44 / 42] e fosfoerkxnumx / xnumx (pERK), AKT [proto-oncogene viral timoma] e p-AKT, SRF (fator de resposta sérica) e pSRF, CREB [prote�a de liga�o ao elemento de resposta de cAMP] e pCREB. A quantidade de proteína transferida para cada faixa foi normalizada para níveis de actina ou tubulina, que não foram afetados pela exposição à cocaína.
Imunoprecipitação cromatina (ChIP)
Perfurações de NAc e CPu recentemente dissecadas foram preparadas para ChIP como descrito (Maze et al., 2010). Cada condição experimental foi analisada em triplicata a partir de grupos independentes de animais. Para cada amostra de ChIP, os golpes bilaterais de NAc e CPu foram agrupados de cinco ratos (10 punções). Os anticorpos utilizados para modificações específicas das histonas são os mesmos que os publicados (Maze et al., 2010); Anticorpos contra Pol II fosforilados em Ser5 da sua região de repetição do domínio do terminal carboxilo (CTD) (Pol II-pSer5) foram obtidos a partir da abcam 5131. Quatro conjuntos de primers ChIP foram projetados para Fosb (Lazo et al., 1992; Mandelzys et al., 1997): 1F: GTACAGCGGAGGTCTGAAGG, 1R: GAGTGGGATGAGATGCGAGT; 2F: CATCCCACTCGGCCATAG, 2R: CCACCGAAGACAGGTACTGAG; 3F: GCTGCCTTTAGCCAATCAAC, 3R: CCAGGTCCAAAGAAAGTCCTC; 4F: GGGTGTTTGTGTGTGAGTGG, 4R: AGAGGAGGCTGGACAGAACC. Os níveis de modificações da cromatina são comparados com os do DNA de entrada, como descrito (Maze et al., 2010).
Análise estatística
Todos os valores relatados são média ± sem. Os dados para atividade locomotora e contagem de células foram analisados por ANOVAs de duas vias com tratamento e injeção como fatores. Os experimentos de qPCR foram analisados por ponto de tempo por ANOVAs de uma via com tratamento como um fator. Quando efeitos principais significativos foram observados (p <0.05), os testes post-hoc de Bonferroni foram conduzidos para comparações com animais tratados com solução salina virgens de tratamento (^ em figuras) e animais tratados com cocaína virgens de drogas (* em figuras). Testes t de Student bicaudal não pareados foram usados para dados de Western blotting e ChIP, com correções para comparações múltiplas.
Resultados
Maior Indutibilidade de Fosb em NAc, mas não em CPu, de ratos experientes em cocaína
Examinar a influência de um curso crônico prévio de cocaína, seguido por um período prolongado de abstinência, na indutibilidade do Fosb gene em resposta a um desafio subsequente à cocaína, ratos que foram previamente injetados ip duas vezes por dia com soro fisiológico ou cocaína (15 mg / kg) durante 10 dias receberam doses de desafio do fármaco após 28 dias de retirada (Fig 1A). Primeiro medimos as respostas locomotoras em um grupo de animais para confirmar a indução da sensibilização locomotora por exposição prévia à cocaína, uma conseqüência esperada e duradoura da administração de drogas. Ratos experientes e não cocaína apresentaram atividade locomotora de base equivalente, com um desafio de cocaína para animais virgens de drogas aumentando sua locomoção (Fig 1B. Repetidas medidas two-way ANOVA, tratamento: F1,66 = 30.42, p <0.0001; desafio de cocaína: F2,66= 58.39, p <0.0001; tratamento x desafio de cocaína: F2,66= 8.56, p = 0.0005, pós-testes de Bonferroni ^p <0.001). Este desafio de cocaína induziu atividade locomotora significativamente maior, isto é, sensibilização, em ratos experientes em cocaína (pós-testes de Bonferroni * p <0.001).
Para avaliar os efeitos deste regime de pré-tratamento de cocaína na expressão de ΔFosB em NAc e CPu, medimos a proteína ΔFosB com métodos imuno-histoquímicos 24 h após o tratamento de animais não tratados previamente com cocaína e cocaína com 0, 1, 3 ou 6 desafio diário de cocaína injecções (15 mg / kg; ver Fig 1A). Como previamente estabelecido (Nye et al., 1995), As injecções de cocaína 3 foram suficientes para induzir significativamente a proteína ΔFosB em NAc e CPu de animais virgens de droga e a sua acumulação permaneceu significativa após 6 dias de injecções de cocaína (Fig 1C. Medidas repetidas ANOVA two-way, core NAc, tratamento: F1,28= 23.5, p <0.0001; desafio de cocaína: F3,28= 49.16, p <0.0001; tratamento x desafio de cocaína: F3,28= 6.83, p = 0.0014; Shell NAc, tratamento: F1,28= 18.69, p <0.0001; desafio de cocaína: F3,28= 31.52, p <0.0001; tratamento x desafio de cocaína: F3,28= 3.21, p <0.05; CPu, tratamento: F1,28= 9.47, p <0.001; desafio de cocaína: F3,28= 19.74, p <0.0001; tratamento x desafio de cocaína: F3,28= 0.94, p> 0.05. No núcleo NAc, shell e CPu, pós-testes de Bonferroni ^p <0.05). Em animais experientes em cocaína, não houve evidência de indução ΔFosB persistente em NAc ou CPu após 28 dias de retirada, consistente com relatórios anteriores de que o sinal ΔFosB se dissipa totalmente neste ponto de tempo (Nye et al., 1995), este motivo foi utilizado neste estudo. Surpreendentemente, no entanto, ratos experientes em cocaína que receberam injeções de desafio de 3 ou 6 mostraram significativamente maior indução de proteína ΔFosB em NAc, um efeito aparente em ambas as sub-regiões do núcleo e da casca (Fig 1C. Pós-testes de Bonferroni * p <0.05). Em contraste, nenhuma indução maior da proteína ΔFosB foi observada no CPu; em vez disso, a indução de ΔFosB equivalente foi vista nesta região após 3 ou 6 dias de injeções de desafio de cocaína em ratos virgens de cocaína e experientes (Fig 1C).
Para obter informações sobre as alterações transcricionais ocorrendo em NAc e CPu em resposta a um desafio com cocaína, estudamos o tempo transcorrido (45, 90 e 180 min) da indutibilidade dos transcritos de ΔFosB e FosB após uma única injeção de cocaína ou soro fisiológico ratos não experientes e sem consumo de cocaína após 28 dias de Fig 1A). Em relação a um desafio salino, um desafio com cocaína induziu um aumento rápido nos níveis de ARNm de ΔFosB e FosB em todos os três momentos em ambos NAc e CPu de animais não tratados com cocaína (Fig 1D. Repetidas medem uma maneira ANOVA por ponto de tempo; Pós-testes de Bonferroni ^p <0.05). Em NAc, observamos maior indução de mRNA de ΔFosB e FosB em animais experimentados com cocaína em comparação com animais virgens de cocaína após o desafio de cocaína, o efeito sendo significativo em 90 min, enquanto, em contraste, a indutibilidade de mRNA de ΔFosB e FosB em CPu foi significativamente diminuiu em animais experientes em cocaína (Fig 1D. Pós-testes de Bonferroni %p = 0.08, * p <0.05).
Caracterização de vias de sinalização a montante em NAc e CPu de ratos experientes em cocaína
Uma possível explicação para a indutibilidade alterada do Fosb O gene no NAc e no CPu após um curso crônico prévio de cocaína é que uma história remota de exposição à cocaína pode induzir mudanças duradouras nas vias de sinalização que estão a montante de Fosb indução génica de tal forma que um desafio com cocaína induz o gene a um grau anormal. Para estudar esta hipótese, analisamos os dois fatores de transcrição, SRF e CREB, que se mostraram recentemente necessários para a indução de cocaína de ΔFosB nestas regiões cerebrais (Vialou et al., 2012) juntamente com as proteínas quinases a montante, ERK e AKT, também implicadas na ação da cocaína (Valjent e outros, 2000; Lu et al., 2006; Boudreau et al., 2009). Não conseguimos detectar quaisquer alterações nos níveis totais ou fosforilados dessas várias proteínas que pudessem explicar a indutibilidade alterada de Fosb observado, incluindo sem alterações na SRF, CREB ou AKT (Fig 2B, C). A falta de mudança no pSRF e pCREB no NAc em resposta a um desafio com cocaína é consistente com um relatório recente, que encontrou ambos induzidos significativamente apenas por cocaína crónica (Vialou et al., 2012).
Em NAc e CPu de animais sem drogas, 20 min após uma exposição inicial ao fármaco (Fig 2A), um único desafio com cocaína diminuiu os níveis de pERK42 / 44 (Fig 2B, C. Teste t de Student bicaudal: * p <0.05). Existem relatos anteriores de níveis elevados de pERK nessas regiões após a administração aguda de cocaína (Valjent e outros, 2000). Isto é difícil de comparar com outros documentos que examinam a fosforilação de ERK no NAc durante a retirada de injeções repetidas de cocaína (Boudreau et al., 2007; Shen et al., 2009), como em nosso estudo, o pERK foi quantificado após 28 dias de retirada e após um desafio com cocaína ou solução salina. Em relação aos animais não sujeitos a consumo de drogas que experimentaram cocaína pela primeira vez, a reexposição à cocaína em ratos com experiência em cocaína, após 28 dias de retirada, causou um aumento significativo nos níveis de pERK42 / 44 na CPu (Fig 2B, C. Teste t de Student bicaudal: * p <0.05).
Cromatina paisagem no Promotor do gene Fosb em NAc e CPu de ratos experientes em cocaína
Em seguida, investigamos se as mudanças na Fosb A indutibilidade do gene está associada a alterações na estrutura da cromatina. A chIP foi realizada em NAc e CPu utilizando anticorpos dirigidos contra três formas bem caracterizadas de modificações de histonas: trimetilação de Lys4 da histona H3 (H3K4me3) associada à ativação do gene e H3K27me3 e H3K9me2 associada à repressão gênica. Analisamos ratos virgens de cocaína e experientes após 28 dias de retirada, sem ou com uma injeção de desafio de cocaína, com animais examinados 1 h mais tarde (Fig 3A). Em NAc, não encontramos alterações significativas na ligação de qualquer uma dessas três modificações histonas ao Fosb promotor do gene na ausência de um desafio com cocaína, embora houvesse uma tendência para níveis reduzidos de H3K9me2 (Fig 3B-D. Teste t de Student de duas caudas. #p = 0.2 em comparação com os respectivos controlos de Naïve de fármaco). Este efeito tornou-se significativo após um desafio com cocaína e foi específico para a região promotora proximal do gene (Fig 3C. * p <0.05). Embora os níveis de H3K9me2 sejam muito baixos em alguns genes, o Fosb promotor de gene mostra níveis apreciáveis desta marca no NAc sob condições de controle (Maze et al., 2010, dados não mostrados). Em contraste, no CPu, encontramos diminuições pequenas, mas significativas, na ligação H3K4me3, e aumento na ligação H3K27me3, no Fosb promotor na ausência de um desafio com cocaína, efeitos perdidos após o desafio (Fig 3D. * p <0.05).
Em seguida, investigamos a ligação da Pol II ao Fosb gene, baseado em recentes descobertas em cultura de células, que a paralisação da Pol II em SSTs, que é caracterizada por sua fosforilação em Ser 5 em sua região de repetição de CTD, está associada à iniciação de genes (ver Introdução). Analisamos assim a ligação Pol II-pSer5 Fosb em quatro regiões distintas do gene (Fig 3B). Esta análise revelou um enriquecimento significativo de Pol II-pSer5 no Fosb gene em sua região promotora proximal e em torno de seus TSS em NAc de animais experientes em cocaína, após retirada prolongada, na ausência de um desafio com cocaína em comparação com controles (Fig 3E. * p <0.05). Este enriquecimento não foi aparente em duas regiões do corpo do gene de Fosb, consistente com o travamento Pol II descrito em sistemas experimentais mais simples. Curiosamente, após um desafio com cocaína, a ligação Pol II-pSer5 ainda mostrou sinais de enriquecimento, embora não mais Fosb região promotora proximal (Fig 3E. %p = 0.1), mas retornou aos níveis de controle no TSS. Os achados no CPu foram mais variáveis, sem padrão claro de ligação Pol II-pSer5 observado.
Discussão
O presente estudo fornece uma nova visão sobre a regulação sustentada de Fosb semanas após a cessação da exposição repetida à cocaína. Mostramos que a administração prévia de cocaína crônica torna o Fosb gene mais indutível em NAc, resultando em um acúmulo mais rápido de ΔFosB na re-exposição ao fármaco. Dada a preponderância da evidência de que a indução de ΔFosB no NAc media respostas comportamentais sensibilizadas à cocaína (Nestler, 2008), nossos achados revelam um novo mecanismo para a reintegração mais rápida de tais respostas sensibilizadas após retirada prolongada.
Demonstramos que a indução aumentada de ΔFosB no NAc está associada a alterações na cromatina no Fosb gene que seria esperado para prime-lo para maior indução. Assim, mostramos aumento da ligação da Pol II às regiões do promotor proximal e TSS do gene que estão presentes após as semanas 4 de retirada da administração prévia de cocaína crônica. Tal enriquecimento de Pol II no TSS é perdido rapidamente após o desafio da cocaína e Fosb indução, consistente com um modelo em cultura de células que interrompeu Pol II é liberado de SSTs após a ativação do gene (ver Introdução). Um desafio com cocaína também induz uma diminuição rápida na ligação de H3K9me2 - uma marca de repressão genética - ao Fosb promotor. Em contraste, não detectamos indução duradoura de vários fatores de transcrição, ou de suas quinases a montante, que são conhecidos por mediar Fosb indução por cocaína. Estes resultados suportam nossa hipótese de que a indução aumentada de ΔFosB em NAc é mediada via priming epigenético da Fosb gene e não através da regulação positiva dos eventos a montante.
Resultados muito diferentes foram obtidos para CPu. Não houve evidência de estagnação de Pol II em Fosb em ratos experientes em cocaína antes de um desafio com cocaína, embora houvesse modificações pequenas, mas significativas, de histonas consistentes com a repressão do gene: aumento da ligação a H3K27me3 e diminuição da ligação a H3K4me3. Também não houve alteração nos fatores de transcrição a montante ou quinases consistentes com Fosb indução. Esses achados sugerem que após a administração crônica de cocaína, modificações epigenéticas servem para Fosb indutibilidade do gene em CPu, em contraste com o priming visto em NAc. No entanto, enquanto estes efeitos reprimem a indução de ARNm de ΔFosB por reexposição a cocaína, não há perda na acumulação da proteína ΔFosB. O mecanismo subjacente a este paradoxo agora requer mais investigação.
De maneira mais geral, nossos resultados apóiam um modelo em que alterações na paisagem da cromatina em genes específicos em resposta à administração crônica de cocaína servem para preparar ou embotar esses genes para indução subsequente após reexposição ao fármaco. Tais mudanças na cromatina, que podem ser vistas como “cicatrizes epigenéticas”, seriam perdidas em análises de níveis de genes de mRNA em estado estacionário. Desta forma, a caracterização do epigenoma da dependência promete revelar novas informações sobre a patogênese molecular da doença, que pode ser explorada para o desenvolvimento de novos tratamentos.
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