Efeito da superexpressão ΔFosB na sinalização mediada por receptores opiáceos e canabinóides no nucleus accumbens (2011)

Neurofarmacologia. 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Sim-Selley LJ, Cassidy MP, Sparta A, Zachariou V, Nestler EJ, Selley DE.

fonte

Departamento de Farmacologia e Toxicologia e Instituto de Estudos sobre Drogas e Álcool, Escola de Medicina da Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23298, EUA.

Sumário

O fator de transcrição estável ΔFosB é induzido no nucleus accumbens (NAc) pela exposição crônica a várias drogas de abuso, e a expressão transgênica de ΔFosB no estriado aumenta as propriedades recompensadoras da morfina e da cocaína.e. Entretanto, a base mecanicista para essas observações é incompletamente compreendida. Usamos um modelo de camundongo bitransgênico com expressão indutível de ΔFosB em dopamina Neurônios do estriado contendo o receptor D (1) / dinorfina para determinar o efeito da expressão de ΔFosB na sinalização de receptores de opióides e canabinóides no NAc. Os resultados mostraram que a atividade da proteína G mediada por opioides mu e a inibição da adenilil ciclase foram aumentadas no NAc de camundongos que expressaram ΔFosB. De modo semelhante, a inibição da adenilil ciclase kappa-opióide foi aumentada nos ratinhos que expressam ΔFosB. Em contraste, a sinalização mediada pelo receptor canabinóide não diferiu entre camundongos superexpressando ΔFosB e camundongos controle. TEstes achados sugerem que a sinalização dos receptores opiáceos e canabinóides são modulados diferencialmente pela expressão de ΔFosB, e indicam que a expressão de ΔFosB pode produzir alguns dos seus efeitos via sinalização dos receptores opióides mu e kappa no NAc.

Palavras-chave: Proteína G, adenilato ciclase, estriado

1. Introdução

Receptores opióides e canabinoides CB₁ receptores (CB₁R) são os alvos neurobiológicos para duas classes de medicamentos amplamente usados que incluem morfina, heroína e prescrição de opióides e maconha (Δ⁹-tetra-hidrocanabinol (THC)), respectivamente. Os efeitos agudos dos opióides e canabinóides são mediados por receptores acoplados à proteína G que ativam principalmente G_{eu / o} proteínas e produzir respostas efetoras a jusante, como a inibição da adenilil-ciclase (Childers, 1991, Childers, et al., 1992, Howlett, e outros, 2002). Os efeitos motores, prejudiciais à memória e psicoativos do Δ⁹-THC são produzidos por CB₁R (Huestis, et al., 2001, Zimmer, et al., 1999), que são amplamente distribuídos no cérebro, com altos níveis nos gânglios da base, hipocampo e cerebelo (Herkenham, e outros, 1991). Os efeitos analgésicos e recompensadores da maioria dos fármacos opiáceos clinicamente relevantes e abusivos são mediados principalmente pelos receptores mu opióides (MOR) (Matthes, et al., 1996), que são enriquecidas no sistema límbico e tronco cerebral (Mansour, et al., 1994). O sistema mesolímbico, composto de projeções dopaminérgicas da área tegmental ventral (ATV) ao nucleus accumbens (NAc), desempenha um papel importante nos efeitos recompensadores dos opioides e canabinóides (Bozarth e Wise, 1984, Vaccarino, et al., 1985, Zangen, et al., 2006), bem como outras drogas de abuso (Koob e Volkow, 2010). Além disso, os sistemas opioides e canabinoides endógenos estão envolvidos nos efeitos recompensadores de múltiplas classes de drogas psicoativas (Maldonado, et al., 2006, Trigo, et al., 2010). Assim, é importante elucidar os mecanismos pelos quais o opioide e o CB₁A sinalização R é regulada no NAc.

Uma questão central no campo do abuso de drogas tem sido identificar as proteínas que medeiam a transição dos efeitos agudos para os efeitos a longo prazo das drogas psicoativas. O fator de transcrição AP-1 ΔFosB é particularmente interessante porque é um produto da variante truncada estável da fosb gene que se acumula após exposição repetida a drogas de abuso ou recompensas naturais (McClung, et al., 2004, Nestler, 2008, Nestler, et al., 1999). Descobrimos que ΔFosB é induzido no cérebro após exposição repetida à morfina, Δ⁹-THC, cocaína ou etanol, com cada droga produzindo um padrão regional único de expressão de ΔFosB (Perrotti, e outros, 2008). Um achado consistente entre os fármacos foi que ΔFosB foi altamente induzido no estriado, onde todos os quatro fármacos induziram ΔFosB no núcleo NAc e todos, exceto Δ⁹-THC induziu expressï¿½ significativa na concha de NAc e putamen caudado.

Estudos farmacológicos mostraram que a administração concomitante da dopamina D₁ receptor (D₁R) o antagonista SCH 23390 bloqueou a indução de ΔFosB no NAc e no caudate-putamen após administração intermitente de cocaína ou morfina, sugerindo a importância potencial de D₁Neurônios que expressam R (Muller e Unterwald, 2005, Nye, et al., 1995). O efeito da indução de ΔFosB sobre os comportamentos mediados por drogas foi investigado usando camundongos bitransgênicos que expressam ΔFosB em populações neuronais específicas do NAc e estriado dorsal (Chen, et al., 1998). Camundongos que expressam ΔFosB em dinorfina / D₁R neurônios positivos no NAc e no estriado dorsal (linha 11A) mostram respostas alteradas às drogas de abuso, notadamente maior sensibilidade aos efeitos recompensadores da cocaína ou da morfina (Colby, et al., 2003, Kelz, et al., 1999, Zachariou, et al., 2006). Essas alterações ocorreram na ausência de alterações nos níveis de MOR ou de várias subunidades da proteína G. No entanto, os níveis de mRNA de dinorfina foram reduzidos no NAc de camundongos ΔFosB expressandoZachariou, et al., 2006), sugerindo que um alvo de ΔFosB é um gene que codifica um peptídeo opióide endógeno. A indução de ΔFosB também pode produzir mudanças comportamentais regulando a sinalização do receptor no NAc, mas essa possibilidade não foi investigada. Portanto, os presentes estudos utilizaram o modelo de camundongo bitransgênico para determinar se a superexpressão de ΔFosB em dinorfina / D₁R contendo neurónios do estriado altera a actividade da proteína G mediada por MOR e inibição da adenilil ciclase mediada por MOR e KOR no NAc. O efeito de ΔFosB no CB₁A atividade da proteína G mediada por R também foi avaliada porque Δ⁹A administração de THC induz ΔFosB no NAc (Perrotti, e outros, 2008) e o sistema endocanabinóide é conhecido por regular os circuitos de recompensa do cérebro (Gardner, 2005, Maldonado, et al., 2006), mas o efeito de ΔFosB no sistema endocanabinoide não foi investigado.

2. Materiais e métodos

2.1. Reagentes

[³⁵S] GTPγS (1250 Ci / mmol), [α-³²P] ATP (800 Ci / mmol) e [³H] cAMP (26.4 Ci / mmol) foram adquiridos da PerkinElmer (Shelton, CT). ATP, GTP, GDP, cAMP, albumina de soro bovino, creatina fosfoquinase, papaverina, imidazole e WIN-55212-2, foram adquiridos a Sigma Aldrich (St. Louis, MO). O GTP? S foi adquirido da Roche Diagnostic Corporation (Chicago, IL). DAMGO foi fornecido pelo Programa de Abastecimento de Medicamentos do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (Rockville, MD). O fluido de cintilao Econo-1 foi obtido da Fisher Scientific (Norcross, GA). O fluido de cintilao Ecolite foi obtido da ICN (Costa Mesa, CA). Todos os outros químicos foram obtidos da Sigma Aldrich ou Fisher Scientific.

2.2. Ratos

Ratinhos bitransgicos machos derivados de NSE-tTA (linha A) x TetOp-FosB (linha 11) foram gerados como descrito em Kelz et al. (Kelz, et al., 1999). Ratinhos bitransgênicos foram concebidos e criados em doxiciclina (100 µg em água potável) para suprimir a expressão do transgene. Em 8 semanas de idade, a doxiciclina foi omitida da ï¿½ua para metade dos ratinhos para permitir a expressï¿½ do transgene, enquanto que os restantes ratinhos foram mantidos em doxiciclina para suprimir o transgene. Cérebros foram coletados 8 semanas mais tarde, o tempo em que os efeitos transcricionais de ΔFosB são máximos (McClung e Nestler, 2003). Utilizou-se uma segunda linhagem de camundongos transgênicos na qual Δc-Jun, um antagonista negativo dominante de c-Jun, é expresso em D₁R / dinorfina e D₂Células R / encefalina do estriado, hipocampo e córtex parietal (Peakman, et al., 2003). C-Jun e proteínas da família Jun relacionadas dimerizam com as proteínas da família Fos e ligam-se ao local AP-1 dos genes alvo para regular a transcrição. No entanto, o truncamento do terminal N de c-Jun (Δc-Jun) torna o complexo transcricionalmente inativo e capaz de obstruir a ligação do DNA de complexos AP-1 ativos. Ratinhos bitransgicos machos derivados de NSE-tTA (linha A) x TetOp-FLAG-AC-Jun (linha E) foram gerados como descrito em Peakman et al. (Peakman, et al., 2003). Ratinhos bitransgênicos foram concebidos e criados em doxiciclina (100 µg em água potável) para suprimir a expressão do transgene. Os filhotes foram desmamados em semanas 3, genotipados e separados em grupos, com metade mantida em água contendo doxiciclina e metade em água potável regular para induzir a expressão de FLAG-Δc-Jun. Cérebros foram coletados 6 semanas mais tarde, o tempo em que os níveis máximos de FLAG-Δc-Jun foram medidos (Peakman, et al., 2003). Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Guia do Instituto Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

2.3. Preparação de Membrana

Os cérebros foram armazenados a –80 ° C até o dia do ensaio. Antes do ensaio, cada cérebro foi descongelado e o NAc foi dissecado em gelo. Cada amostra foi homogeneizada em 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, pH 7.4 (tampão de membrana) com cursos 20 de um homogeneizador de vidro a 4 ° C. O homogeneizado foi centrifugado a 48,000 × g a 4 ° C por 10 min, ressuspenso em tampão de membrana, centrifugado novamente a 48,000 × g a 4 ° C durante 10 min e ressuspenso em 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl₂, 0.2 mM EGTA, 100 mM NaCl, pH 7.4 (tampão de ensaio). Os níveis de proteína foram determinados pelo método de Bradford (Bradford, 1976) utilizando albumina de soro bovino (BSA) como padrão.

2.4. Estimulado por Agonistas [³⁵Ligação de S] GTPγS

As membranas foram pré-incubadas durante 10 minutos a 30 ° C com adenosina desaminase (3 mU / ml) em tampão de ensaio. As membranas (5 – 10 µg de proteína) foram então incubadas durante 2 h a 30 ° C em tampão de ensaio contendo 0.1% (p / v) de BSA, 0.1 nM [³⁵S] GTPγS, 30 µM GDP e adenosina desaminase (3 mU / ml) com e sem as concentrações apropriadas de DAMGO ou WIN55,212-2. A ligação não específica foi medida com 20 µM GTPγS. A incubação foi terminada por filtração através de filtros de fibra de vidro GF / B, seguida por lavagens 3 com 3 ml de 50 mM Tris-HCl gelado, pH 7.4. A radioactividade ligada foi determinada por espectrofotometria de cintilação líquida após extracção durante a noite dos filtros no fluido de cintilação Econo-1.

2.5. Adenilil Ciclase Ensaio

Membranas (5-25 µg proteína) foram pré-incubadas com adenosina desaminase como descrito acima, depois incubadas por 15 min a 30 ° C na presença ou ausência de 1µM para forscolina, com ou sem DAMGO, U50,488H ou WIN55,212-2, em tampão de ensaio contendo 50 µM ATP, [α-³²P] ATP (1.5 µCi), 0.2 mM DTT, 0.1% (p / v) BSA, 50 µM AMP cíclico, 50 µM GTP, 0.2 mM papaverina, 5 mM fosfocreatina, 20 unidades / ml creatina fosfoquinase e adenosina desaminase (3 mU / ml) num volume final de 100 µl. Nestas condições, total [α-³²P] cAMP recuperado foi geralmente menor que 1% da quantidade total de [α-³²P] ATP em cada amostra. A reação foi terminada fervendo por 3 min e [³²P] AMP cíclico foi isolado pelo método de coluna dupla (Dowex e alumina) da Salomon (Salomon, 1979). [³H] cAMP (10,000 dpm) foi adicionado a cada tubo antes da cromatografia em coluna como um padrão interno. A radioatividade foi determinada por espectrofotometria de cintilação líquida (eficiência 45% para ³H) após 4.5 ml do eluato foram dissolvidos em 14.5 ml de fluido de cintilação Ecolite.

2.6. Análise de dados

Salvo indicação em contrário, os dados são reportados como valores médios ± SE de experiências separadas com 4-8, cada uma das quais foi realizada em triplicado. Estimulado pela rede [³⁵A ligação de S] GTPγS é calculada como ligação estimulada por agonista menos a ligação basal. A actividade de adenilil-ciclase estimulada por forscolina é definida como actividade estimulada por forscolina - actividade basal (pmol / mg / min). A inibição percentual da actividade da adenilil ciclase estimulada por forscolina é definida como (actividade líquida estimulada por forscolina na ausência de actividade estimulada por forscolina agonista-rede na presença de actividade estimulada por agonista / líquido de forscolina na ausência de agonista) × 100. Todas as análises de ajuste de curvas e estatísticas foram realizadas utilizando Prism 4.0c (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). As curvas de concentração-efeito foram analisadas por regressão não linear iterativa para obter EC₅₀ e E_max valores. A significcia estattica dos dados de concentrao-efeito foi determinada por anise de varicia de duas vias (ANOVA), utilizando a dose agonista e a induo gica (ligada ou desligada) como os principais factores. Significância estatística dos valores ajustados à curva (E_max ou CE₅₀) foi determinada pelo teste t de Student bicaudal não pareado, usando a correção de Welch ou a transformação da raiz quadrada dos dados, quando necessário, para corrigir as variâncias desiguais (detectadas pelo teste F) no CE₅₀ valores.

3. Resultados

3.1. Efeito da expressão de ΔFosB na ativação da proteína G mediada por opióides e receptores canabinóides

Para determinar se MOR- ou CB₁A ativação da proteína G mediada por R foi alterada pela expressão transgênica indutível de ΔFosB no NAc, estimulada por agonistas [³⁵A ligaï¿½o S] GTP? S foi examinada em membranas isoladas preparadas a partir desta regiï¿½ de ratinhos bitransgï¿½icos condicionalmente expressando (ΔFosB on) ou nï¿½ expressando (ΔFosB off) o transgene ΔFosB. O análogo de encefalina selectivo MOR, DAMGO, foi utilizado para activar o MOR e o canabinóide aminoalquilindole WIN55,212-2 foi utilizado para activar o CB₁R. Estes ligantes foram anteriormente mostrados como agonistas totais em MOR e CB₁R, respectivamente (Breivogel, et al., 1998, Selley, et al., 1997). Não foi possível examinar a atividade da proteína G mediada por KOR porque o sinal é muito baixo no cérebro de roedores (Childers, et al., 1998). Os resultados mostraram uma estimulação dependente da concentração da atividade da proteína G por DAMGO e WIN55,122-2 no NAc de ΔFosB off e ΔFosB em camundongos (Figura 1). Para atividade estimulada por DAMGO (Figura 1A), a ANOVA bidirecional dos dados de efeito de concentração revelou efeitos principais significativos do status ΔFosB (p <0.0001, F = 22.12, df = 1) e concentração de DAMGO (p <0.0001, F = 29.65, df = 5) sem interação significativa (p = 0.857, F = 0.387, df = 5). A análise de regressão não linear das curvas de efeito de concentração revelou um DAMGO E significativamente maior_max valor em ΔFosB em camundongos (E_max = 73 ± 5.2% de estimulação) em relação a ΔFosB de camundongos (E_max = 56 ± 4.1% de estimulação; p <0.05 diferente de ΔFosB em camundongos pelo teste t de Student). DAMGO EC₅₀ os valores não foram diferentes entre os ratos ΔFosB on e ΔFosB off (302 ± 72 nM versus 212 ± 56 nM, respectivamente, p = 0.346).

Efeito da expressão de ΔFosB em estimulador de agonista [³⁵S] GTPγS ligação no NAc. Membranas de camundongos que expressam ΔFosB (ΔFosB on) ou controle (ΔFosB off) foram ensaiadas como descrito em Métodos usando concentrações variadas ...

Em contraste com os resultados obtidos com o agonista MOR DAMGO, não foram observadas diferenças dependentes do estado de ΔFosB na ativação da proteína G com o agonista canabinoide WIN55,212-2 (Figura 1B) ANOVA de duas vias dos dados de efeito de concentração WIN55,212-2 revelou um efeito principal significativo da concentração de WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 112.4, df = 7), mas não do status ΔFosB (p = 0.172 , F = 1.90, df = 1) e não houve interação (p = 0.930, F = 0.346, df = 7). Da mesma forma, não houve efeito do status ΔFosB em WIN55,212-2 E_max valores (103 ± 6% versus 108 ± 8% de estimulação em ΔFosB on e off, respectivamente, p = 0.813 pelo teste t de Student) ou EC₅₀ valores (103 ± 20 nM versus 170 ± 23 nM em ΔFosB on e off, respectivamente, p = 0.123).

Com base na forma das curvas e no fato de que nossos estudos anteriores mostraram curvas de efeito-concentração WIN55,212-2 bifásicas no cérebro (Breivogel, et al., 1999, Breivogel, et al., 1998), as curvas WIN55,212-2 também foram analisadas usando um modelo de dois sites. A análise dos dados médios mostrou uma ligeira melhoria no goodness of fit usando o modelo two-site (R² = 0.933 e 0.914, soma dos quadrados = 3644 e 5463 nos ΔFosB (on e off), respectivamente) em comparação com o modelo single-site (R² = 0.891 e 0.879, soma dos quadrados = 6561 e 6628 em ΔFosB on e off mice, respectivamente). No entanto, não foram encontradas diferenças significativas entre ΔFosB e fora de camundongos no E_max ou CE₅₀ valores dos sítios de alta ou baixa potência (Tabela suplementar 1), embora tenha havido uma tendência para um₅₀ valor no local de alta potência em camundongos com ΔFosB em (EC₅₀Alto = 28.0 ± 10.6 nM) em comparação com aqueles com ΔFosB off (EC₅₀Alto = 71.5 ± 20.2 nM; p = 0.094). Além disso, não houve efeito do status de ΔFosB no basal [³⁵S] GTPγS ligação em membranas NAc (253 ± 14 versus 226 ± 14 fmol / mg em ΔFosB ligar e desligar camundongos, respectivamente, p = 0.188). Estes dados indicam que a expressão transgênica indutível de ΔFosB no NAc de camundongos aumentou a ativação da proteína G mediada por MOR sem afetar significativamente o CB₁Atividade da proteína G basal ou mediada por R.

3.2. Efeito de ΔFosB na inibição da adenilil ciclase mediada por opióides e receptores canabinóides

Avaliar o efeito da expressão transgênica indutível de ΔFosB na modulação da atividade efetora a jusante por MOR e CB₁R, a inibição da actividade de adenilil-ciclase estimulada por forscolina de 1 foi examinada em membranas de NAc. Além de MOR e CB₁Inibição da atividade da adenilil ciclase mediada por R, os efeitos da atividade KOR também foram examinados usando o agonista total seletivo de KOR U50,488 (Zhu, et al., 1997), pois os resultados anteriores mostraram que o mRNA da dinorfina era um alvo de ΔFosB no modelo bitransgênico (Zachariou, et al., 2006). Os resultados mostraram que DAMGO, U50,488 e WIN55,212-2 produziram inibição dependente de concentração da atividade da adenilil ciclase tanto em ΔFosB off como em ΔFosB em camundongos (Figura 2). ANOVA de dois fatores de dados de concentração-efeito de DAMGO (Figura 2A) revelou efeitos principais significativos do status ΔFosB (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) e concentração de DAMGO (p <0.0001, F = 29.61, df = 6), mas nenhuma interação significativa (p = 0.441, F = 0.986 , df = 6). A análise de regressão não linear das curvas de efeito de concentração de DAMGO revelou um DAMGO EC significativamente mais baixo₅₀ valor em ΔFosB em camundongos (101 ± 11 nM) em comparação com ΔFosB em camundongos (510 ± 182 nM, p <0.05 pelo teste t de student). No entanto, não houve diferença significativa no DAMGO E_max valores (20.9 ± 1.26% versus 19.8 ± 1.27% de inibição em ΔFosB on e off, respectivamente, p = 0.534).

Efeito da expressão de ΔFosB na inibição da atividade da adenilil ciclase no NAc. Membranas de camundongos que expressam ΔFosB (ΔFosB on) ou controle (ΔFosB off) foram ensaiadas como descrito em Métodos na presença de 1 µM ...

A inibição da adenilil ciclase mediada por KOR também diferiu em função da expressão transgênica indutível de ΔFosB (Figura 2B) ANOVA de duas vias de dados de efeito de concentração U50,488 mostraram efeitos principais significativos do status ΔFosB (p = 0.0006, F = 14.53, df = 1) e concentração U50,488 (p <0.0001, F = 26.48, df = 3) , sem interação significativa (p = 0.833, F = 0.289, df = 3). A análise de regressão não linear das curvas de efeito de concentração revelou um U50,488 E maior_max valor em ΔFosB em camundongos (18.3 ± 1.14% de inibição) em comparação com ΔFosB de camundongos (12.5 ± 2.03% de inibição; p <0.05 diferente de ΔFosB em pelo teste t de Student), sem diferença significativa em U50,488 EC₅₀ valores (310 ± 172 nM versus 225 ± 48 nM em ΔFosB on e off, respectivamente, p = 0.324).

Em contraste com os efeitos observados com MOR e KOR, não houve efeito significativo da expressão de ΔFosB indutível na inibição da adenilil ciclase pelo agonista canabinóide WIN55212-2 (Figura 2C) ANOVA bidirecional de dados de efeito de concentração WIN55,212-2 mostrou um efeito significativo de concentração de droga (p <0.0001, F = 23.6, df = 2), mas não do status ΔFosB (p = 0.735, F = 0.118, df = 1) nem houve uma interação significativa (p = 0.714, F = 0.343, df = 2). Além disso, não houve efeito do status de ΔFosB na atividade da adenilil ciclase estimulada por forscolina ou basal na ausência de qualquer agonista. A atividade da adenilil ciclase basal foi de 491 ± 35 pmol / mg / min em ΔFosB em camundongos em comparação com 546 ± 44 em ΔFosB de camundongos (p = 0.346 pelo teste t de Student). Da mesma forma, a atividade da adenilil ciclase na presença de 1 µM de forscolina foi de 2244 ± 163 pmol / mg / min em ΔFosB em camundongos versus 2372 ± 138 pmol / mg / min em ΔFosB de camundongos (p = 0.555).

3.3. Efeito de ΔcJun na inibição da adenilil ciclase mediada por receptores opióides e canabinóides

Como a expressão transgênica indutível de ΔFosB aumentou a transdução do sinal inibitório de MOR e KOR para adenilil ciclase no NAc, foi interessante determinar se um inibidor negativo dominante da transcrição mediada por FFosB modularia a sinalização do receptor opióide de maneira oposta. Para abordar esta questão, a inibição da actividade da adenilil-ciclase estimulada por forscolina por DAMGO e U50,488 foi examinada em membranas preparadas a partir do NAc de ratinhos bitransgénicos expressando condicionalmente ΔcJun. Os resultados não mostraram efeito significativo da expressão de ΔcJun na inibição da atividade da adenilil ciclase por MOR ou KOR (Figura 3) A ANOVA bidirecional das curvas de efeito de concentração de DAMGO mostrou um efeito principal significativo da concentração de DAMGO (p <0.0001, F = 20.26, df = 6), mas não do status ΔcJun (p = 0.840, F = 0.041, df = 1) e não houve interação significativa (p = 0.982, F = 0.176, df = 6). Da mesma forma, não houve diferença significativa em E_max ou CE₅₀ valores entre ratos com ΔcJun on (E_max = 23.6 ± 2.6%; CE₅₀ = 304 ± 43 nM) ou ΔcJun desligado (E_max = 26.1 ± 2.5%, p = 0.508; CE₅₀ = 611 ± 176 nM, p = 0.129). Resultados semelhantes foram observados com U50,488, de modo que a ANOVA de duas vias das curvas de concentração-efeito mostrou um efeito significativo de concentração (p <0.0001, F = 11.94, df = 6), mas não de ΔcJun status (p = 0.127 , F = 2.391, df = 1) e não houve interação significativa (p = 0.978, F = 0.190, df = 6). Da mesma forma, não houve diferenças significativas em E_max ou CE₅₀ valores entre ratos com ΔcJun on (E_max = 14.8 ± 2.9%; CE₅₀ = 211 ± 81 nM) ou desligado (E_max = 16.7 ± 1.8%, p = 0.597; CE₅₀ = 360 ± 151 nM, p = 0.411).

Efeito da expressão de ΔcJun na inibição da atividade da adenilil ciclase no NAc. Membranas de camundongos de expressão ΔcJun (ΔcJun on) ou controle (ΔcJun off) foram incubadas na presença de DAMGO (A), U50,488H (B) ou WIN55,212-2 ...

A expressão de ΔcJun também não afetou significativamente a inibição da adenilil ciclase no NAc pelo agonista canabinoide. ANOVA de duas vias das curvas de efeito de concentração de WIN55,212-2 mostrou um efeito principal significativo da concentração de WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 15.53, df = 6), mas não de genótipo (p = 0.066, F = 3.472, df = 1) e não houve interação significativa (p = 0.973, F = 0.208, df = 6). Da mesma forma, não houve diferenças significativas no WIN55,212-2 E_max valores (13.0 ± 2.3% e 13.6 ± 0.9% de inibição em ΔcJun em relação aos ratos, respectivamente, p = 0.821) e ou CE₅₀ valores (208 ± 120 nM e 417 ± 130 nM em ΔcJun on versus off camundongos, respectivamente, p = 0.270). Assim, embora houvesse uma ligeira tendcia para a diminuio da potcia de WIN55,212-2 em ratinhos que expressam? CJun, o transgene n alterou significativamente a inibio canabinde da adenilil ciclase. Além disso, não houve efeito do estado ΔcJun na atividade da adenilil ciclase basal ou estimulada por forscolina. A atividade da adenilil ciclase basal foi 1095 ± 71 pmol / mg / min e 1007 ± 77 pmol / mg / min (p = 0.403) em camundongos com ΔcJun ativados ou desativados, respectivamente. A atividade da adenilato ciclase estimulada por 1 de forscolina foi 4185 ± 293 pmol / mg / min versus 4032 ± 273 pmol / mg / min (p = 0.706) em camundongos com ΔcJun ativados ou desativados, respectivamente.

3.4. Discussão

Os resultados deste estudo revelaram ativação aumentada da proteína G mediada por MOR e inibição da adenilil ciclase no NAc de camundongos com expressão transgênica indutível de ΔFosB em dinorfina / D₁R contendo neurônios. A inibição da atividade da adenilil ciclase mediada por KOR também foi aumentada no NAc de camundongos expressando ΔFosB, sugerindo que ΔFosB regula o sistema opióide endógeno no NAc. O DAMGO E_max o valor foi maior para os estimulados pelo MOR [³⁵S] GTPγS, e sua CE₅₀ O valor foi menor para a inibição da adenilil ciclase, em camundongos sobre-expressando ΔFosB, em comparação com camundongos controle. Esses achados sugerem a possibilidade de reserva de receptor para modulação efetora, mas não ativação de proteína G nas condições analisadas. A descoberta de que a inibição máxima da adenilil ciclase pelo agonista KOR foi afetada pela expressão de ΔFosB sugere baixa reserva de receptor para a resposta mediada por KOR, consistente com os baixos níveis de sítios de ligação KOR no cérebro de camundongo (Unterwald, et al., 1991). Em contraste, CB₁A atividade da proteína G mediada por R e a inibição da adenilil ciclase não foram afetadas pela expressão de ΔFosB, sugerindo que os sistemas opióide e canabinóide diferem em sua resposta a ΔFosB nesses neurônios NAc.

O efeito da ΔFosB na sinalização mediada pelo receptor opióide é consistente com o nosso relato anterior de que a expressão de ΔFosB no estriado alterou os efeitos agudos e crônicos da morfina (Zachariou, et al., 2006). Uma descoberta desse estudo foi que camundongos com expressão transgênica de ΔFosB em dinorfina / D₁Os neurônios estriatais foram mais sensíveis à morfina no condicionamento local do que os controles. Além disso, este efeito foi imitado pela expressão mediada por vírus de ΔFosB por injeção específica do local no NAc. Essas observações são consistentes com os resultados atuais que mostram a sinalização aprimorada de MOR no NAc.

Nós identificamos anteriormente o gene codificando dinorfina como alvo de ΔFosB, e propôs que a dinorfina reduzida seria consistente com propriedades de recompensa aumentadas de morfina em camundongos ΔFosB bitransgênicos (Zachariou, et al., 2006). Os presentes resultados mostram que a inibição da adenililciclase mediada por KOR no NAc é aumentada em ratinhos que expressam AFosB, o que pode reflectir um aumento compensatório na sensibilidade de KOR após redução da dinorfina. Estudos anteriores demonstraram que o KOR foi regulado positivamente em certas regiões cerebrais de camundongos knockout de prodinorfina, incluindo NAc (Clarke, et al., 2003).

Em contraste com ΔFosB, a expressão transgênica indutível de ΔcJun, o mutante truncado negativo dominante do parceiro de ligação ΔFosB cJun, não alterou a inibição da adenilil ciclase pelos agonistas MOR ou KOR. Estes resultados sugerem que os neis basais de express de? FosB, que s relativamente baixos, n desempenham um papel significativo na manuteno da sinalizao do receptor opide a este nel de transduo de sinal no NAc. O fato de que o efeito de recompensa condicionado da morfina foi diminuído pela expressão ΔcJun em nosso estudo anterior (Zachariou, et al., 2006) sugere que a indução de morfina de ΔFosB durante o procedimento de condicionamento é importante na regulação das respostas comportamentais ao fármaco ou que os efeitos transcricionais de ΔFosB diferentes daqueles que afetam a sinalização proximal pelos receptores opióides podem influenciar a recompensa de opióides. De qualquer forma, os resultados do presente estudo mostram claramente que, quando a expressão de ΔFosB é elevada acima dos níveis basais na dinorfina estriatal / D₁Exprimindo neurônios, há um aumento robusto no acoplamento de MOR e KOR à inibição da adenilil ciclase no NAc.

Os mecanismos pelos quais a sinalização mediada por MOR e KOR são aumentados pela superexpressão de ΔFosB não são claros, mas já mostramos anteriormente que os níveis de MOR, avaliados por [³Ligação de H] naloxona, não são diferentes no NAc de ΔFosB em camundongosZachariou, et al., 2006). O mesmo estudo descobriu que Gα_iOs níveis de proteína 1 e 2 não foram afetados nesta região pela expressão de ΔFosB. No entanto, análises anteriores de matriz de expressão gênica mostraram que Gα_o O ARNm foi regulado positivamente em NAc de ΔFosB em ratinhos (McClung e Nestler, 2003). Será de interesse em estudos futuros examinar exaustivamente o efeito da expressão de ΔFosB transgênica na expressão da subunidade da proteína G ao nível da proteína, bem como na expressão de muitas proteínas moduladoras da proteína G.

É interessante que a expressão de ΔFosB não melhorou a CB₁Sinalização mediada por R no NAc. É possível que alterações no CB₁A sinalização R ocorre em uma população discreta de neurônios que é obscurecida em toda a preparação do NAc. Por exemplo, a administração de Δ⁹- THC induziu significativamente ΔFosB no núcleo, mas não na casca, do NAc (Perrotti, e outros, 2008). Eundeed, foi demonstrado que o desafio com Δ⁹-THC após administração repetida de Δ⁹-THC aumentou a liberação de dopamina no núcleo NAc, mas diminuiu a liberação na casca (Cadoni, et al., 2008). Também é importante notar que a linha 11A de camundongos bitransgênicos expressa ΔFosB apenas em dinorfina / D₁Neurônios espinhosos médios positivos do estriado, mas CB₁R são expressos em ambos dinorfina / D₁R e encefalina / D₂Neurônios estriados positivos (Hohmann e Herkenham, 2000), bem como em terminais de aferentes corticais (Robbe, et al., 2001). A expressão do regulador negativo dominante da transcrição mediada por ΔFosB, ΔcJun, também não teve efeito significativo na sinalização dos receptores canabinóides, embora ΔcJun seja indutivelmente expresso em ambos D₁ e D₂-contendo populações de neurônios espinhosos médios nesses camundongos (Peakman, et al., 2003). É possível, no entanto, que a expressão ΔFosB basal seja suficientemente baixa para que ΔcJun não afete a sinalização do receptor, como sugerido pelos resultados com MOR e KOR. Também é possível que o CB₁A sinalização R é modestamente melhorada pela expressão ΔFosB basal, de modo que aumentar ainda mais a expressão de ΔFosB ou bloquear suas ações com ΔcJun teve apenas efeitos leves que não alcançaram o nível de significância estatística. O suporte indireto para esta interpretação pode ser visto comparando WIN55,212-2 EC₅₀ valores entre camundongos expressando ΔcJun versus ΔFosB. A relação do WIN55,212-2 EC₅₀ valor da inibição da adenilato ciclase em camundongos com expressão induzida de ΔcJun em sua CE₅₀ O valor para a ativação da proteína G em camundongos com expressão induzida de ΔFosB foi 4.0, enquanto que a mesma razão em camundongos sem indução de ambos os transgênicos foi 1.2.

Alternativamente, os canabinóides podem induzir a expressão de ΔFosB sem qualquer efeito direto sobre o CB₁Sinalização R. Neste cenário, os canabinóides podem modular a capacidade de resposta aos efeitos psicoativos de outras drogas através da regulação da transcrição mediada por ΔFosB. Eun fato, administração de Δ⁹-THC produz sensibilização cruzada para opióides e anfetamina (Cadoni, et al., 2001, Lamarque, et al., 2001), consistente com esta hipótese. Além disso, foi relatado que a administração repetida do agonista canabinóide CP55,940 aumenta a ativação da proteína G mediada por MOR no NAc, similarmente aos camundongos que expressam indutivamente ΔFosB no presente estudo (Vigano, et al., 2005). O efeito da expressão ΔFosB em Δ⁹Os comportamentos mediados pelo THC não foram avaliados, mas os resultados atuais não impedem uma interação. Os resultados deste e do nosso estudo anterior (Zachariou, et al., 2006) mostram alterações induzidas por ΔFosB no MOR e KOR / dinorfina no estriado. Os efeitos recompensadores de Δ⁹-THC, conforme medido por preferência de lugar, são abolidos em ratinhos nulos MOR, enquanto que a deleção de KOR atenua Δ⁹-THC aversão ao lugar e revelou Δ⁹Preferência de lugar -THC (Ghozland, et al., 2002). Similarmente, a aversão ao ambiente condicionado a Δ⁹-THC está ausente em nocautes pró-dinorfina em comparação com camundongos selvagens (Zimmer, et al., 2001). Estes dados sugerem que Δ⁹-THC pode ser mais recompensador após a indução de ΔFosB e consequente indução de sinalização de MOR com reduções na expressão de dinorfina.

Em sumay, os resultados deste estudo mostraram que a expressão de ΔFosB em D₁Os neurónios estriados positivos para R / dinorfina aumentaram a sinalização mediada por MOR e KOR ao nível da inibição mediada pela proteína G da actividade da adenilil ciclase no NAc. Este achado é consistente com estudos que demonstraram um papel para o sistema opioide endógeno na recompensa (Trigo, et al., 2010), e fornecer um mecanismo potencial para os efeitos mediados pela ΔFosB na recompensa. Em contraste, CB₁A sinalização mediada por R no NAc não foi significativamente afetada pela expressão de ΔFosB do estriado nas condições examinadas, embora estudos adicionais sejam necessários para determinar o efeito da indução de ΔFosB no sistema endocanabinoide.

Destaques da Pesquisa

Sinalização MOR é reforçada no núcleo accumbens de ratos que expressam ΔFosB
A inibição da adenilil ciclase por KOR também é aumentada em camundongos expressando ΔFosB
Expressão de ΔFosB não altera CB₁Sinalização R no núcleo accumbens

Material suplementar

01

Clique aqui para ver.^{(45K, pdf)}

Agradecimentos

Os autores agradecem a Hengjun He, Jordan Cox e Aaron Tomarchio pela assistência técnica com o [³⁵S] GTPγS. Este estudo foi apoiado pelo USPHS Grants DA014277 (LJS), DA10770 (DES) e P01 DA08227 (EJN).

Notas de rodapé

Isenção de responsabilidade do editor: Este é um arquivo PDF de um manuscrito não editado que foi aceito para publicação. Como um serviço aos nossos clientes, estamos fornecendo esta versão inicial do manuscrito. O manuscrito será submetido a edição de texto, formatação e revisão da prova resultante antes de ser publicado em sua forma final citável. Observe que, durante o processo de produção, podem ser descobertos erros que podem afetar o conteúdo, e todas as isenções legais que se aplicam ao periódico pertencem a ele.

Referências

Bozarth MA, sábio RA. Os campos de receptores de opiáceos anatomicamente distintos mediam a recompensa e a dependência física. Ciência. 1984;224: 516 – 517. [PubMed]
Bradford MM. Um método rápido e sensível para a quantificação de quantidades de microgramas de proteína utilizando o princípio da ligação proteína-corante. Anal. Biochem. 1976;72: 248 – 254. [PubMed]
Breivogel CS, Childers SR, Deadwyler SA, Hampson RE, Vogt L.J, Sim-Selley LJ. Delta crônico⁹O tratamento com tetrahidrocanabinol produz uma perda dependente do tempo de proteínas G activadas pelo receptor de canabinóides no cérebro. J. Neurochem. 1999;73: 2447 – 2459. [PubMed]
Breivogel CS, Selley DE, Childers SR. Eficácia do agonista do receptor canabinóide para estimular [³⁵A ligação de S] GTPγS a membranas cerebelares de ratos está correlacionada com diminuições induzidas por agonistas na afinidade de GDP. J. Biol. Chem. 1998;273: 16865 – 16873. [PubMed]
Cadoni C, Pisanu A, Solinas M, Acquas E, Di Chiara G. Sensibilização comportamental após exposição repetida ao Delta 9-tetrahidrocanabinol e sensibilização cruzada com morfina. Psicofarmacologia (Berl) 2001;158: 259 – 266. [PubMed]
Cadoni C, Valentini V, Di Chiara G. Sensibilização comportamental ao delta 9-tetrahidrocanabinol e sensibilização cruzada com morfina: alterações diferenciais na transmissão da concha e dopamina core. J. Neurochem. 2008;106: 1586 – 1593. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, N Sakai, Steffen C, PE Shockett, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Animais transgênicos com expressão genética dirigida indutível no cérebro. Mol. Pharmacol. 1998;54: 495 – 503. [PubMed]
Childers SR. Segundo mensageiro acoplado ao receptor opióide. Life Sci. 1991;48: 1991 – 2003. [PubMed]
Childers SR, Fleming L, Konkoy C, Marckel D, Pacheco M, Sexton T, Ward S. Opioide e inibição do receptor de canabinóides da adenilil ciclase no cérebro. Ann. NY Acad. Sci. 1992;654: 33 – 51. [PubMed]
Childers SR, Xiao R, Vogt L.J, Sim-Selley LJ. Estimulação do receptor opióide Kappa de [³⁵S] GTPγS ligação em cérebro de cobaia: A falta de provas para kappa₂Ativação seletiva de proteínas G. Biochem. Pharmacol. 1998;56: 113 – 120. [PubMed]
Clarke S, Zimmer A, Zimmer AM, Hill RG, Cozinha I. Regulação positiva da região dos receptores micro, delta e kapa-opióides mas não receptores 1 tipo receptores opióides nos cérebros de encefalina e camundongos nocauteados com dinorfina. Neurociência. 2003;122: 479 – 489. [PubMed]
Colby CR, Whisler K, C Steffen, Nestler EJ, Self DW. A superexpressão específica do tipo de célula estriatal de DeltaFosB aumenta o incentivo à cocaína. J. Neurosci. 2003;23: 2488 – 2493. [PubMed]
Gardner EL. Sistema de sinalização endocanabinóide e recompensa cerebral: ênfase na dopamina. Pharmacol. Biochem. Behav. 2005;81: 263 – 284. [PubMed]
Ghozland S, Matthes HW, Simonin F. Filliol D, Kieffer BL, Maldonado R. Os efeitos motivacionais dos canabinóides são mediados pelos receptores mu-opióides e opióides kappa. J. Neurosci. 2002;22: 1146 – 1154. [PubMed]
Herkenham M, Lynn AB, Johnson MR, Melvin LS, Costa BR, Arroz KC. Caracterização e localização de receptores de canabinoides em cérebro de ratos: um estudo autorradiográfico quantitativo in vitro. J. Neurosci. 1991;11: 563 – 583. [PubMed]
Hohmann AG, Herkenham M. Localização do RNAm do receptor de canabinóide CB (1) em subpopulações neuronais do corpo estriado de ratos: um estudo de hibridização in situ de duplo rótulo. Sinapse. 2000;37: 71 – 80. [PubMed]
Howlett AC, Barth F, Bonner TI, G Cabral, Casellas P, Devane WA, Felder CC, Herkenham M, Mackie K, Martin BR, Mechoulam R, Pertwee RG. União Internacional de Farmacologia. XXVII. Classificação de receptores canabinoides. Revisão Farmacológica. 2002;54: 161 – 202.
Huestis MA, Gorelick DA, Heishman SJ, Preston KL, Nelson RA, Moolchan ET, Frank RA. Bloqueio dos efeitos da maconha defumada pelo antagonista dos receptores canabinóides seletivos CB1 SR141716. Arco. Gen. Psiquiatria. 2001;58: 322 – 328. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Próprio DW, Tkatch T, Baranauskas G, DJ Surmeier, Neve R, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Expressão do fator de transcrição deltaFosB no cérebro controla a sensibilidade à cocaína. Natureza. 1999;401: 272 – 276. [PubMed]
Koob GF, Volkow ND. Neurocircuito da dependência. Neuropsychopharmacology. 2010;35: 217 – 238. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
Lamarque S, Taghzouti K, Simon H. O tratamento crônico com Delta (9) -tetrahidrocanabinol aumenta a resposta locomotora à anfetamina e à heroína. Implicações para a vulnerabilidade à toxicodependência. Neurofarmacologia. 2001;41: 118 – 129. [PubMed]
Maldonado R, Valverde O, Berrendero F. Envolvimento do sistema endocanabinóide na dependência de drogas. Tendências Neurosci. 2006;29: 225 – 232. [PubMed]
Mansour A, Fox CA, Thompson RC, Akil H, Watson SJ. Expressï¿½ de ARNm de receptor mu-opiï¿½de no SNC de rato: comparaï¿½o com a ligaï¿½o ao receptor mu. Cérebro Res. 1994;643: 245 – 265. [PubMed]
Matthes HWD, R Maldonado, Simonin F, Valverde O, Slowe S, Cozinha I, Bortar K, Dierich A, LeMeur M, P Dolle, Tzavara E, Hanoune J, Roques BP, Kieffer BL. Perda de analgesia induzida pela morfina, efeito de recompensa e sintomas de abstinência em camundongos sem o gene do receptor µ-opióide. Natureza. 1996;383: 819 – 823. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Regulação da expressão gênica e recompensa de cocaína pelo CREB e DeltaFosB. Nat. Neurosci. 2003;6: 1208 – 1215. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: um interruptor molecular para adaptação a longo prazo no cérebro. Cérebro Res. Mol. Cérebro Res. 2004;132: 146 – 154. [PubMed]
Muller DL, Unterwald EM. Os receptores de dopamina D1 modulam a indução de deltaFosB no estriado de ratos após a administração intermitente de morfina. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005;314: 148 – 154. [PubMed]
Nestler EJ. Reveja. Mecanismos transcricionais de dependência: papel de DeltaFosB. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2008;363: 3245 – 3255. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen J. DeltaFosB: um mediador molecular de plasticidade neural e comportamental a longo prazo. Cérebro Res. 1999;835: 10 – 17. [PubMed]
Nye HE, Esperança BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Estudos farmacológicos da regulação da indução de antígenos crônicos relacionados ao FOS por cocaína no estriado e no nucleus accumbens. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995;275: 1671 – 1680. [PubMed]
MC Peakman, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Banco JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Auto DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Indutível, a expressão específica da região cerebral de um mutante dominante negativo de c-Jun em camundongos transgênicos diminui a sensibilidade à cocaína. Cérebro Res. 2003;970: 73 – 86. [PubMed]
Perrotti LI, Tecelão RR, Robison B, Renthal W, Labirinto I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Próprio DW, Nestler EJ. Padrões distintos de indução DeltaFosB no cérebro por drogas de abuso. Sinapse. 2008;62: 358 – 369. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
Robbe D, Alonso G, Duchamp F. Bockaert J, Manzoni OJ. Localização e mecanismos de ação dos receptores canabinóides nas sinapses glutamatérgicas do núcleo accumbens do camundongo. J. Neurosci. 2001;21: 109 – 116. [PubMed]
Ensaio de Salomon Y. Adenilato ciclase. Adv. Nucleotídeo Cíclico Res. 1979;10: 35 – 55. [PubMed]
Selley DE, Sim LJ, Xiao R, Q de Liu, Childers SR. Receptor de opioide mu estimulado [³⁵S] ligação de GTPγS no tálamo de rato e linhas celulares cultivadas: Mecanismos de transdução de sinal subjacentes à eficácia agonista. Mol. Pharmacol. 1997;51: 87 – 96. [PubMed]
Trigo JM, Martin-Garcia E, Berrendero F, Robledo P, Maldonado R. O sistema opióide endógeno: um substrato comum na dependência de drogas. Álcool de Drogas Depende. 2010;108: 183 – 194. [PubMed]
Unterwald EM, Knapp C, Zukin RS. Localização neuroanatômica de receptores opióides κ1 e κ2 em cérebros de ratos e cobaias. Cérebro Res. 1991;562: 57 – 65. [PubMed]
Vaccarino FJ, Bloom FE, Koob GF. O bloqueio dos receptores opiáceos nucleus accumbens atenua a recompensa intravenosa de heroína no rato. Psicofarmacologia (Berl) 1985;86: 37 – 42. [PubMed]
Vigano D, Rubino T, Vaccani A, Bianchessi S, Marmorato P, Castiglioni C, Parolaro D. Mecanismos moleculares envolvidos na interação assimétrica entre sistemas canabinoides e opióides. Psicofarmacologia (Berl) 2005;182: 527 – 536. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Um papel essencial para DeltaFosB no nucleus accumbens na ação da morfina. Nat. Neurosci. 2006;9: 205 – 211. [PubMed]
Zangen A, Solinas M, S Ikemoto, Goldberg SR, Wise RA. Dois sítios cerebrais para recompensa canabinóide. J. Neurosci. 2006;26: 4901 – 4907. [PubMed]
Zhu J, Luo LY, JG Li, Chen C, Liu-Chen LY. A ativação do receptor opióide kappa humano clonado por agonistas aumenta a ligação de [35S] GTPγS a membranas: determinação de potências e eficácia de ligantes. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997;282: 676 – 684. [PubMed]
Zimmer A, Valjent E, Konig M, Zimmer AM, Robledo P, H Hahn, Valverde O, Maldonado R. Ausência de efeitos disféricos delta -9-tetrahidrocanabinol em camundongos deficientes em dinorfina. J. Neurosci. 2001;21: 9499 – 9505. [PubMed]
Zimmer A, Zimmer A, Hohmann AG, Herkenham M, Bonner TI. Aumento da mortalidade, hipoatividade e hipoalgesia em camundongos nocautes para receptor canabinóide CB1. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 1999;96: 5780 – 5785. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]