COMENTÁRIOS: Estudo descobriu que a autoadministração de álcool induziu um acúmulo pronunciado de deltafosb. A eletroacupuntura aplicada especificamente inibiu muito o consumo de álcool, o que foi acompanhado por um declínio em deltafosb. No bloqueio do vício, o DeltaFosB bloqueia os principais efeitos da exposição à droga. O mecanismo de ação sugere que a eletroacupuntura suprime a dopamina, inibindo assim o acúmulo de deltfosb.
fonte
Departamento de Anestesiologia, Farmacologia e Fisiologia, Universidade de Medicina e Odontologia de Nova Jersey, Faculdade de Medicina de Nova Jersey, Newark, Nova Jersey, Estados Unidos da América.
Sumário
Novas terapias são necessárias para álcool abuso, um grande problema de saúde pública nos EUA e no mundo. Existem apenas três medicamentos aprovados pela FDA para o tratamento de álcool abuso (naltrexona, acamprosato e dissulfuram). Em média, esses medicamentos produzem apenas sucesso moderado na redução de longo prazo álcool consumo. Eletroacupuntura demonstrou aliviar várias drogas de abuso, incluindo álcool. Embora estudos anteriores tenham demonstrado que eletroacupuntura reduzido álcool consumo, os mecanismos subjacentes não foram totalmente elucidados. ΔFosB e FosB são membros da família Fos de fatores de transcrição implicados na plasticidade neural na dependência de drogas; uma conexão entre eletroacupunturatratamento de álcool abuso e a família Fos não foi estabelecida. Neste estudo, treinamos ratos para beber grandes quantidades de etanol em um procedimento de escolha de duas garrafas de acesso intermitente modificado. Quando os ratos atingiram uma linha de base estável de etanol consumo, eletroacupuntura (100 Hz ou 2 Hz, 30 min cada dia) foi administrado em Zusanli (ST36) por 6 dias consecutivos. O nível de FosB/ ΔFosB in recompensar-relacionado cérebro regiões foi avaliada por imuno-histoquímica. Descobrimos que a ingestão e a preferência por etanol em ratos abaixo de 100 Hz, mas não 2 Hz eletroacupuntura regimento foram drasticamente reduzidos. O Energia foi mantida por pelo menos 72 horas após o término do eletroacupuntura tratamento. Por outro lado, 100 Hz eletroacupuntura não alterou a ingestão e a preferência pelo agente recompensador natural sacarose. Além disso, FosB/ ΔFosB níveis no córtex pré-frontal, na região estriatal e na região posterior da área tegmentar ventral foram aumentadas após excessivo etanol consumo, mas foram reduzidos após seis dias de 100 Hz eletroacupuntura. Assim, este estudo demonstra que seis dias de 100 Hz eletroacupuntura tratamento reduz efetivamente o etanol consumo e preferência em ratos que bebem cronicamente excessivo quantidade de etanol. Este efeito de eletroacupuntura pode ser mediada pela regulação negativa de FosB/ ΔFosB in recompensar-relacionado
Introdução
O abuso de álcool é um grande problema de saúde pública nos EUA e no mundo. Até o momento, existem apenas três medicamentos aprovados pela FDA para o tratamento do abuso de álcool (naltrexona, acamprosato e dissulfuram). Em média, esses medicamentos produzem apenas sucesso moderado na redução do consumo de álcool a longo prazo , , . Portanto, novas terapias são necessárias. A acupuntura, que consiste em estimular certos pontos do corpo por meio de agulhas, é usada na China há milhares de anos. Embora ainda não esteja completamente claro como os sinais de acupuntura do ponto de acupuntura, como Zusanli (ST36) são transmitidos ao sistema nervoso central, foi caracterizado que os impulsos aferentes induzidos pela acupuntura são transmitidos principalmente pelas fibras Aβ e AΔ . A acupuntura ativa pequenas fibras nervosas mielinizadas no músculo, que enviam impulsos para a medula espinhal e, em seguida, ativa três centros (medula espinhal, mesencéfalo e hipófise-hipotálamo) e a liberação de três endorfinas (encefalina, beta endorfina e dinorfina) e outras monoaminas, provocando profundos efeitos fisiológicos e mecanismos de autocura. . Assim, a acupuntura tem sido amplamente considerada um meio eficaz para algumas condições médicas, incluindo náuseas, dores e abuso de drogas . Comparado com as intervenções farmacológicas disponíveis atualmente, uma vantagem clara da terapia de acupuntura é que ela tem o potencial de ajudar os abusadores de drogas a ficarem longe das drogas sem grandes efeitos colaterais adversos. Estudos clínicos e pré-clínicos anteriores mostraram que a acupuntura ou a acupuntura combinada com estimulação elétrica (eletroacupuntura, EA) é um tratamento eficaz para a síndrome de abstinência alcoólica e abuso de álcool , , . Recentemente, mostramos que a EA de 2 Hz reduziu a ingestão voluntária de álcool em ratos . Entretanto, muitas questões relativas aos mecanismos básicos da acupuntura em geral e do abuso de álcool em particular não foram bem abordadas.
Investigações sobre alterações de longo prazo na estrutura e função do cérebro que acompanham a exposição crônica a drogas de abuso sugerem que alterações na regulação genética contribuem substancialmente para o fenótipo aditivo . oEm particular, dois fatores de transcrição – ΔFosB e CREB (proteína de ligação ao elemento responsivo ao AMPc) foram implicados na plasticidade neural relacionada ao vício . O fator de transcrição Δ FosB, uma variante truncada C-terminalmente anormalmente estável do produto do gene inicial imediato FosB, acumula-se no circuito de dependência após a maioria das drogas de abuso, incluindo cocaína, morfina, Δ9-tetrahidrocanabinol e etanol . Uma vez expressa, é relativamente estável e pode persistir no cérebro por semanas após a última exposição à droga. Ao regular vários genes que estão relacionados à arquitetura da espinha dendrítica e à função sináptica e plasticidade, como a cinase 5 dependente de ciclina e a dinorfina , , ΔFosB media a plasticidade sináptica que contribui para vários fenótipos comportamentais em resposta à exposição a medicamentos. PrEstudos anteriores do nosso e de outros laboratórios demonstraram que a exposição crônica ao álcool induz o acúmulo de ΔFosB nas sub-regiões do estriado e do córtex pré-frontal (PFC) , , que envolve a ativação de sistemas opioides endógenos . Dado que as evidências existentes indicam que a EA aliviou o consumo de álcool e a dependência de morfina através da interação com os receptores opioides , , ; e que a acupuntura atenua a recaída de cocaína induzida pelo estresse, suprimindo a expressão de Fos e a ativação de CREB nas sub-regiões do estriado , nós hipotetizamos que a supressão de EA no consumo de álcool pode ser mediada por fatores de transcrição, como a proteína FosB/ΔFosB em regiões cerebrais relacionadas à recompensa. Para testar essa possibilidade, múltiplas sessões de EA foram administradas no acuponto bilateral ST36 de ratos que bebem cronicamente grandes quantidades de etanol sob um procedimento de escolha de duas garrafas de acesso intermitente modificado (IE). A expressão de FosB/ΔFosB em várias regiões cerebrais relacionadas à recompensa foi avaliada usando imuno-histoquímica, que tem maior sensibilidade do que o Western blotting e fornece maiores detalhes anatômicos .
O Propósito
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Medicina e Odontologia de Nova Jersey, Newark, Nova Jersey.
Animais e habitação
Ratos Sprague-Dawley (SD) adultos (250–350 g, no início dos experimentos, Taconic Farm, NY) foram alojados individualmente em gaiolas ventiladas, em uma sala com clima controlado (20–22°C), mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 horas (luzes apagadas às 6h). Comida e água estavam disponíveis ad libitum.
Procedimento para consumo de álcool
Os animais foram primeiramente aclimatados ao ambiente da gaiola por uma semana e foram treinados para beber etanol voluntariamente sob o procedimento de acesso intermitente de duas garrafas de escolha, conforme descrito anteriormente. , , , , . Resumidamente, os animais receberam acesso simultâneo de 24 horas a uma garrafa de etanol a 20% (v/v) em água e uma garrafa de água, começando às 6:00 na segunda-feira. Após 24 horas, a garrafa de etanol foi substituída por uma segunda garrafa de água que estava disponível pelas próximas 24 horas. Esse padrão foi repetido nas quartas e sextas-feiras. Nos outros dias da semana, os ratos tiveram acesso ilimitado a duas garrafas de água. Nos dias em que o etanol estava disponível para os ratos, a colocação da garrafa de etanol foi alternada para controlar as preferências laterais. Neste estudo, modificamos o procedimento adicionando 5% de sacarose à solução de etanol a 20% nas três primeiras sessões de etanol. Essa modificação acelerou rápida e acentuadamente a ingestão de etanol (FIG. 1). A quantidade de etanol ou água consumida foi determinada pela pesagem dos frascos antes do acesso e após 24 h de acesso. O peso de cada rato foi medido diariamente de segunda a sexta-feira para monitorar a saúde e calcular os gramas de ingestão de etanol por quilo de peso corporal. O consumo de etanol foi determinado pelo cálculo de gramas de álcool consumido por quilo de peso corporal. A taxa de preferência da ingestão de etanol foi calculada pela seguinte fórmula: Taxa de preferência (%) 
= Ingestão de solução de etanol (ml/24 h)/ingestão total de fluidos (ml/24 h de solução de etanol + ml/24 h de água). Os ratos foram mantidos em procedimento de escolha de dois frascos de acesso intermitente de etanol a 20% por 4 semanas (12 sessões de acesso de etanol). Um frasco contendo água em uma gaiola sem ratos foi usado para avaliar o derramamento devido às manipulações experimentais durante as sessões de teste. O derramamento foi sempre <1.0 ml (<2.5% da ingestão total de fluidos).
Figura 1
Concentrações de etanol no sangue (BEC)
No 13th sessão de consumo de etanol, foram coletadas amostras de sangue da veia lateral da cauda de ratos (n=11) após 30 min de acesso a 20% de etanol e água. As amostras foram centrifugadas a 4°C por 15 min a 8000 rpm, e 10 µl de plasma de cada amostra de sangue foram analisados usando o método espectrofotométrico da enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo-álcool desidrogenase (NAD-ADH) .
Autoadministração de sacarose
Para determinar se a redução do consumo de álcool induzida pela EA era seletiva ao álcool, um grupo separado (n=8) de ratos foram treinados para beber solução de sacarose a 5% sob procedimento de escolha de duas garrafas de acesso intermitente, semelhante ao usado para beber álcool. A sacarose a 5% foi selecionada de acordo com nossos estudos anteriores , e um estudo recente em roedores sobre o efeito dos antagonistas dos receptores opioides, SoRI-9409, na ingestão de álcool . Quando os ratos SD atingiram um nível de linha de base consistente após 12 sessões de ingestão de sacarose e água, procedimentos EA de 100 Hz ou simulados foram realizados conforme descrito abaixo.
Tratamentos EA
Para testar o efeito do EA na ingestão de etanol em ratos que consumiam cronicamente grandes quantidades de etanol, o EA de 100 Hz foi administrado em ST36 bilateral, localizado próximo à articulação do joelho do membro posterior, 2 mm lateral ao tubérculo anterior da tíbia; o EA foi aplicado 30 minutos por dia, 30 minutos antes do acesso ao etanol, por 6 dias consecutivos (quarta a segunda, três sessões consecutivas de ingestão de álcool).
Todos os ratos foram pré-manuseados por 2 min/dia por 3 dias consecutivos antes dos tratamentos com EA para reduzir o estresse e facilitar o manuseio. No dia do teste, sob anestesia leve com isoflurano, os ratos dos grupos EA e sham foram levemente contidos, o que envolveu serem fixados em um suporte com uma toalha cobrindo os olhos, conforme descrito em nosso relatório recente . Sob essas condições, os ratos estavam calmos e seus membros e caudas podiam ser livremente extrudados. Duas agulhas de aço inoxidável com diâmetro de 0.35 mm e comprimento de 13 mm foram inseridas cerca de 2–3 mm em ST36 de ambas as pernas (para o grupo EA). Após os animais acordarem da anestesia, 10 min de EA (ou simulação) foi administrado. Uma corrente constante com estimulação de onda quadrada produzida por um gerador de pulso programado (Han Actens WQ 1002F, Aeron Optoelectronic Technology Corp., Pequim, China) foi administrada através das duas agulhas para o grupo EA. A frequência EA era de 100 Hz, e a intensidade foi ajustada para provocar tremores leves nos músculos (cerca de 0.2–0.3 mA). Para o grupo simulação, as agulhas foram colocadas em pontos não acupunturais da cauda (1/5 do comprimento da cauda a partir da região proximal da cauda). , ) e nenhuma estimulação de corrente foi aplicada. As ingestões de etanol (ou sacarose) e água foram então registradas 24 h após o início da ingestão. Durante os 6 dias de tratamento, os ratos tiveram três sessões de ingestão de etanol (dia 1, quarta-feira; dia 3, sexta-feira; e dia 6, segunda-feira). A ingestão de etanol durante a sessão de ingestão imediatamente antes da administração de EA e após a última administração de EA foi registrada respectivamente como o nível de ingestão basal ou basal pós-tratamento. Os efeitos de múltiplas sessões de EA de baixa frequência (2 Hz) na ingestão de etanol em ratos que consumiam cronicamente grandes quantidades de etanol foram verificados em um grupo separado de ratos, no qual EA de 2 Hz foi administrado em ST36 bilateral (30 min por dia) por seis dias consecutivos. As ingestões de etanol e água foram registradas como no experimento acima.
Imunohistoquímica
Relatamos recentemente que a ingestão crônica de etanol induz o acúmulo de FosB/ΔFosB de maneira sub-regional específica . Para determinar se a redução induzida por EA na ingestão de etanol estava associada a mudanças na expressão de FosB/ΔFosB, analisamos a imunorreatividade (IR) de FosB/ΔFosB em áreas relacionadas à recompensa do sistema dopaminérgico mesocorticolímbico. Um grupo de ratos (n=12) foram primeiramente treinados para beber etanol usando o paradigma de acesso intermitente modificado de escolha de duas garrafas, conforme descrito acima. Quando os ratos consumiram voluntariamente grandes quantidades de etanol, eles foram divididos em dois subgrupos: um (n=6) recebeu 100 Hz EA em ST36 bilateral, o outro tratamento simulado na cauda (n=6) por 6 dias consecutivos. Durante os 6 dias de tratamento, os ratos tiveram três sessões de ingestão de etanol (dia 1, quarta-feira; dia 3, sexta-feira; e dia 6, segunda-feira). Os ratos no grupo de controle (controle sem etanol, n=5) tiveram acesso à água e comida sem limitação. Não houve diferenças significativas no peso corporal entre os ratos não tratados com etanol e os que bebiam etanol no final dos experimentos.
Ratos que bebiam etanol tratados com EA ou placebo foram sacrificados imediatamente após a última sessão de acesso de etanol de 24 h. Ratos não expostos ao etanol também foram sacrificados no mesmo momento. Os ratos receberam overdose de cetamina/xilazina (80 mg/10 mg/kg, ip) e perfundidos transcardialmente com solução salina fria, seguido de paraformaldeído a 4% em tampão fosfato de sódio 0.1 M (pH 7.4). Os cérebros foram removidos, pós-fixados (2 horas, a 4 °C) na mesma solução fixadora e crioprotegidos (durante a noite a 4 °C, sacarose a 20% em tampão fosfato 0.1 M, pH 7.4). Seções coronais seriais de 30 µm do prosencéfalo foram cortadas em um micrótomo de congelamento (Microm HM550, Walldorf e German), e uma série de 1 em 4 de seções cerebrais foi processada para detecção imuno-histoquímica de proteína FosB/ΔFosB. As seções foram incubadas na seguinte série de anticorpos: anticorpo pan-FosB (1![[ratio]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
2000, #sc-48; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Califórnia) durante a noite, a 4°C, IgG anti-coelho biotinilado (2 horas, 1200) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). As seções foram então incubadas em uma solução de complexo de avidina-biotina-peroxidase de raiz-forte (45 min) (Vector Elite Kit, Vector Labs, Burlingame, Califórnia). A atividade da peroxidase de raiz-forte foi visualizada com níquel-diaminobenzidina (Vector Laboratories, Burlingame, CA). As seções de cada grupo experimental foram processadas simultaneamente. A omissão dos antissoros primários em um subconjunto de seções resultou em perda de imunorreatividade. As seções foram montadas em lâminas de cromo-alumínio, desidratadas e cobertas com lamínula.
Quantificação da imunorreatividade FosB/ΔFosB
Mudanças na imunorreatividade de FosB/ΔFosB foram medidas em seções dos córtices pré-frontais (PrL, IL e córtex orbitofrontal (OFC)), NAc (núcleo e concha) e estriado dorsolateral (DLS) e estriado dorsomedial (DMS). Essas regiões cerebrais foram identificadas com base no Atlas de Paxinos e Watson . A medição quantitativa foi realizada usando um sistema de análise de imagem assistida, consistindo de um microscópio de campo claro Nikon Eclipse 80i (Micron Optics, Cedar Knoll, NJ) interligado a uma câmera digital colorida Nikon DS-Ri1 (Micron Optics, Cedar Knoll, NJ) e um computador com um software NIS-Elements BR 3.0 (Micron Optics, Cedar Knoll, NJ). As imagens foram obtidas com ampliação de 20× e foram calculadas a média dos hemisférios direito e esquerdo em cada sujeito. Contagens bidimensionais de núcleos marcados de cada imagem [imagens de 200× (0.1 mm2 área) de núcleos imunorreativos semelhantes a FosB/ΔFosB dentro de regiões cerebrais de interesse] foram determinados sem conhecimento das condições de tratamento de três seções separadas por animal usando o software NIS-Elements BR 3.0.
Análise Estatística
Todos os dados são expressos como média ± SEM (erro padrão da média). Os dados comportamentais foram analisados com ANOVA de medida repetida bidirecional (RM ANOVA) com os principais fatores de tratamento (EA ou sham) e dias [linha de base (0 dia), dia 1, 3, 5, pós-linha de base (7 dias)]. Tukey post hoc a análise foi conduzida usando análise de contraste quando a interação dia × tratamento foi p<0.05. Os resultados imuno-histoquímicos foram analisados com ANOVA unidirecional seguido pelo teste de Tukey.
Consistentes
Acesso intermitente a 20% de etanol (IE) com sacarose adicionada nas três primeiras sessões de ingestão induz consumo excessivo e alta preferência por etanol em ratos SD machos
Mostramos anteriormente que o procedimento IE levou a maioria dos ratos SD a beber níveis moderados de etanol . Neste estudo, adicionamos 5% de sacarose nas três primeiras sessões de ingestão de líquidos, o que aumentou muito a quantidade de etanol consumida pelos ratos SD que durou >3 semanas após a retirada da sacarose (Fig. 1A). Nestas condições, no 4.ºth para 12th sessões de bebida, ratos SD consumiram 8.2±0.1 g/kg/24 h, que foram substancialmente maiores do que 4.1±0.1 g/kg/24 h, consumidos por ratos sob o mesmo procedimento, mas sem indução de sacarose. ANOVA RM bidirecional revelou efeitos principais significativos para o tratamento (F1, 337=269.63, p<0.001), dia (F11, 337=2.09, p<0.05) e interação tratamento × dia (F11, 337=6.51, p Post-hoc análise da quantidade média de etanol consumida por ratos aos 4th para 12th as sessões de bebida mostraram diferença significativa entre os grupos com e sem indução de sacarose.
A preferência pelo etanol em ratos com indução de sacarose também foi maior do que nos ratos sem indução de sacarose (Fig. 1B). Durante o 4th para 12th sessões, a preferência média por etanol foi de 36.4±0.4% e 22.0±0.8%, respectivamente para ratos com e sem indução de sacarose. A ANOVA RM bidirecional revelou efeitos principais significativos para o tratamento (F1, 337=125.73, p<0.001) e interação tratamento × tempo (F11, 337=5.08, p<0.001) com forte tendência de tempo (F11, 337=1.79, p= Post-hoc análise da preferência pelo etanol em 4th para 12th sessões de bebida foi significativamente maior em ratos com sacarose do que em ratos que não receberam sacarose (todos p<0.001 Fig. 1B).
Medimos o BEC de ratos do grupo de indução de sacarose descrito acima na 13ª sessão de bebida imediatamente após o período de 30 min de acesso ao etanol. O BEC variou de 26.8 a 136.0 mg% com uma média de 60.5±10.4 mg%. Houve uma correlação positiva significativa entre o BEC e g/kg de etanol consumido (r2=0.75, n=11, p<0.001; dados não ilustrados).
Sessões múltiplas de tratamento com EA de alta frequência (100 Hz), mas não de baixa frequência (2 Hz), reduzem o consumo excessivo e a preferência por etanol, mas não por sacarose
Um estudo recente com ratos descobriu que sessões múltiplas de EA de alta frequência (100 Hz) foram mais eficazes do que a sessão única de alta frequência (100 Hz) no alívio da síndrome de abstinência de morfina. Além disso, o efeito posterior de sessões múltiplas de EA durou pelo menos 7 dias . Buscamos determinar se múltiplas sessões de tratamento com EA de 100 Hz podem alterar o consumo de etanol em ratos que bebem quantidades excessivas de etanol cronicamente. Aplicamos múltiplas sessões de EA de 100 Hz em ST36 ou simulação em ratos quando eles atingiram níveis basais estáveis de consumo de etanol (ver FIG. 1). Como mostrado em Fig. 2A, EA de 6 Hz de 100 dias consecutivos, 30 min cada dia, mas não o tratamento simulado reduziu significativamente o consumo de etanol durante o período de acesso de 24 horas. A ANOVA RM bidirecional revelou efeitos principais significativos do tratamento (F1, 51=18.59, p<0.001), dia (F4,51=9.81, p<0.001) e interação tratamento × dia (F4,51=5.31, p= Post hoc a análise revelou que a ingestão de etanol durante o acesso de 24 horas nos dias 3 e 6 foi claramente diminuída no grupo de tratamento com EA em comparação com o placebo (todos p<0.001 Fig. 2A). Notavelmente, quando os tratamentos com EA foram interrompidos no dia 6, a redução foi mantida na sessão de ingestão de 48-72 horas após a última administração de EA (p<0.01, AE vs farsa, Fig. 2A). Não houve efeito principal geral do tratamento simulado na ingestão de etanol em todos os dias de teste em comparação com os níveis de consumo iniciais.
Figura 2
Embora a proporção de preferência por etanol no ponto de tempo de 24 horas examinado não tenha sido significativamente diferente entre os grupos durante o período de linha de base sem EA, essa proporção foi significativamente reduzida após administração múltipla de EA de 100 Hz. A ANOVA RM bidirecional revelou efeitos principais significativos do tratamento (F1,51=11.22, p=0.004), dia (F4,51=5.49, p<0.001, e o termo de interação (F1,51=5.66, p Post hoc a análise revelou que a preferência pelo etanol no ponto de tempo de 24 horas no dia 3 e 6 nas múltiplas sessões do grupo tratado com EA de 100 Hz foi menor do que a do grupo simulado (todos p<0.001 Fig. 2B). Além disso, a redução induzida por EA na proporção de preferência foi mantida na sessão de consumo de 48–72 horas, quando as administrações de EA foram encerradas (p<0.05, AE vs farsa, Fig. 2B). Não houve efeito principal geral do tratamento simulado na preferência pelo etanol nos dias de teste em comparação com a preferência inicial pelo etanol (Fig. 2B). Curiosamente, o tratamento EA de 6 Hz por 100 dias consecutivos também produziu efeitos significativos na ingestão de água (efeito principal do tratamento [F1,51=5.21, p<0.05] e dia [F4,51=2.97, p<0.05], sem efeito da interação tratamento × tempo [F4,51=1.23, p=0.31]) (Fig. 2C). A ingestão de água no ponto de tempo de 24 horas no dia 5 e 7 foi significativamente aumentada em ratos tratados com EA em comparação com o placebo (p<0.05). Em todos os dias de teste, a ingestão total de líquidos não foi afetada por EA de 6 Hz de 100 dias consecutivos em comparação com o tratamento simulado (Fig. 2D).
Mostramos anteriormente que a EA de baixa frequência, mas não a alta, reduziu o consumo moderado de etanol . Para determinar se o efeito de múltiplas sessões de EA também depende de sua frequência, múltiplas sessões de EA de baixa frequência (2 Hz) em ST36 foram administradas a ratos que consumiam cronicamente grandes quantidades de etanol sob o procedimento IE com indução de sacarose, conforme descrito acima. Conforme ilustrado em Fig. 3A, sob essas condições experimentais, múltiplas sessões de EA de 2 Hz não alteraram a ingestão de etanol durante o período de acesso de 24 horas em todos os dias de teste (Fig. 3A). A ANOVA RM bidirecional para o consumo de etanol não revelou os principais efeitos do tratamento (F1, 37=1.43, p>0.05), dia (F3,37=1.15, p>0.05) e interação tratamento × tempo (F3,37=0.25, p>0.05). Consequentemente, sessões múltiplas de EA de 2 Hz não alteraram a proporção de preferência pelo etanol no ponto de tempo de 24 horas em todos os dias de teste [nenhum efeito principal do tratamento (F1, 37=0.003, p=0.95), dia (F3,37=0.54, p=0.65) ou interação tratamento × tempo (F3,37=0.30, p=0.82) Fig. 3B]; ou ingestão de água e fluido total (dados não mostrados).
Figura 3
Para determinar se a redução no consumo de etanol induzida por múltiplas sessões de EA de 100 Hz é específica para etanol, medimos a ingestão da substância preferida sacarose usando um acesso intermitente a 5% de sacarose em um procedimento de escolha de bebida de duas garrafas. Conforme mostrado em FIG. 4, nem a ingestão de sacarose nem a preferência por sacarose no ponto de tempo de 24 horas foram alteradas por múltiplas sessões de EA de 100 Hz em ST36. A ANOVA RM bidirecional para consumo de sacarose não revelou os principais efeitos do tratamento (F1, 18=0.23, p=0.65), dia (F3,18=1.39, p=0.27) ou interação tratamento × tempo (F3,18=0.19, p=0.90). Além disso, nenhuma diferença significativa foi encontrada entre EA e placebo para consumo de água ou fluido total (dados não mostrados).
Figura 4
Sessões múltiplas de EA de 100 Hz diminuem o acúmulo de FosB/ΔFosB induzido pelo consumo excessivo de etanol em regiões cerebrais específicas relacionadas à recompensa
O resultados descrito acima mostrou que EA de 6 Hz de 100 dias consecutivos reduziu seletivamente a ingestão e a preferência por etanol em ratos que bebem quantidades excessivas de etanol cronicamente. Muitos estudos propuseram que a ativação persistente de ΔFosB pode ser uma via comum para transtornos de dependência . Relatamos anteriormente que o consumo crônico de etanol induz o acúmulo de ΔFosB seletivamente no córtex pré-frontal e na região estriatal ; a disfunção dessas regiões cerebrais relacionadas à recompensa está associada ao desejo por etanol e ao comprometimento de novos processos de aprendizagem em alcoólatras abstinentes . Portanto, avaliamos a IR FosB/ΔFosB nas seguintes regiões cerebrais relacionadas à recompensa do sistema dopaminérgico mesocorticolímbico (FIG. 5).
Figura 5
Região estriatal
A expressão de FosB/ΔFosB foi regulada diferencialmente dentro da região estriatal como uma função do tratamento com etanol e EA. De acordo com nosso relatório recente , FosB/ΔFosB IR aumentou robustamente dentro do núcleo do núcleo accumbens (NAc-Core) e do estriado dorsolateral (DLS) (FIG. 6), mas não dentro da concha dorsal (NAc-Shell) e do estriado dorsomedial (DMS) em animais que consumiram cronicamente grandes quantidades de etanol com tratamento simulado, em comparação com controles não tratados com etanol. Múltiplas sessões de EA de 100 Hz diminuíram significativamente o IR FosB/ΔFosB dentro do DLS e do NAc-Core induzido pelo consumo excessivo de etanol a longo prazo (FIG. 6). Essas observações são apoiadas pela ANOVA unidirecional que revelou um efeito principal significativo do tratamento no NAc-Core (F2, 33=6.27, p=0.005) e DLS (F2, 33=28.54, p<0.001), mas não no NAc-shell (F2, 33=1.36, p>0.05) e DMS (F2,33=2.47, p> 0.05).
Figura 6
Córtex pré-frontal
Relatamos recentemente que a exposição crônica ao etanol aumenta significativamente a IR de FosB/ΔFosB no córtex orbitofrontal (OFC), mas não no córtex pré-frontal medial . No entanto, no estudo atual, a IR de FosB/ΔFosB aumentou significativamente tanto na área pré-límbica do córtex pré-frontal (PrL) quanto na OFC em animais que consumiram cronicamente grandes quantidades de etanol com tratamento simulado (FIG. 7, p<0.001 farsa vs etanol ingênuo). Não foram encontradas diferenças estatísticas nas contagens de núcleos positivos para FosB/ΔFosB entre o grupo sham e o grupo controle ingênuo ao etanol na área infralímbica do córtex pré-frontal (IL). Múltiplas sessões de EA de 100 Hz diminuíram significativamente a IR de FosB/ΔFosB no PrL, no OFC e no IL (todos p<0.01 grupo EA vs sham). Consequentemente, a ANOVA unidirecional produziu um efeito principal significativo do tratamento em IL (F2, 33=7.06, p=0.003), PrL (F2, 33=18.61, p<0.001) e OFC (F2, 33=13.23, p
Figura 7
A área tegmentar ventral (ATV)
Acredita-se que VTA seja uma região cerebral crítica de recompensa. Um estudo recente mostrou que a administração crônica de psicoestimulantes induz o acúmulo de ΔFosB, especificamente na cauda posterior do VTA , . Conforme ilustrado em FIG. 8, FosB/ΔFosB IR na região posterior da VTA (Bregma − 5.20 mm a Bregma −6.8 mm) aumentou robustamente em ratos que consumiram cronicamente grandes quantidades de etanol em comparação com o grupo que não consumiu etanol (p<0.001) e foi substancialmente reduzido após múltiplas sessões de EA (p<0.001, grupo EA vs sham), mas não após o tratamento sham. Houve um efeito principal geral do tratamento no FosB/ΔFosB IR no VTA posterior (F2,33=12.04, p<0.001 FIG. 8).
Figura 8
Discussão
Relatamos aqui que EA de 100 Hz por seis dias (30 min por dia) no ponto de acupuntura bilateral ST36 reduziu seletivamente o consumo excessivo e a preferência por etanol ao longo do período de acesso de 24 h. A redução foi mantida por pelo menos 72 h após o término do tratamento com EA. Além disso, esse regime de EA diminuiu a expressão de FosB/ΔFosB induzida pela exposição crônica ao etanol nas regiões cerebrais relacionadas à recompensa.
Relatamos recentemente que uma única EA de 20 minutos de frequência baixa (2 Hz), mas não alta (100 Hz) em ST36 reduziu a ingestão moderada de etanol em ratos SD . Há evidências recentes de que sessões múltiplas de EA de alta frequência são mais eficazes do que uma única sessão de EA de alta frequência no alívio da síndrome de abstinência de morfina . Neste estudo, investigamos se a EA de 100 Hz foi eficaz na redução do consumo excessivo de etanol em ratos sob um procedimento de bebida IE modificado, no qual todos os ratos consumiram altas quantidades de etanol (8.2 ± 0.1 g/kg) com alta taxa de preferência por etanol (36.4 ± 0.4%). Embora não tenhamos monitorado os sinais de abstinência no estudo atual, relatamos anteriormente que ratos sob o programa de bebida semelhante mostraram sinais leves de abstinência , . O BEC dos ratos no estudo atual foi de 60.5±10.4 mg%, o que foi quase duas vezes maior do que o dos ratos SD e semelhante ao dos ratos Long-Evans que mostraram sinais de abstinência. Assim, é altamente possível que ratos sob as condições experimentais atuais possam desenvolver dependência de etanol e apresentar sinais de abstinência. Notavelmente, a EA de 100 Hz por seis dias consecutivos reduziu a ingestão de etanol livre em quase metade ao longo do período de acesso de 24 horas. Curiosamente, esse regime de EA também aumentou significativamente a ingestão de água, sugerindo que esses animais estavam indo na direção oposta à ingestão de etanol. É importante ressaltar que a redução na ingestão de etanol foi mantida por > 72 horas após o término dos tratamentos com EA. Por outro lado, várias sessões de EA de 100 Hz não alteraram a ingestão e a preferência pela substância de recompensa natural sacarose. Nossa descoberta atual está de acordo com um estudo recente que mostra que várias sessões de EA suprimiram a síndrome de abstinência de morfina, que foi mantida por pelo menos 7 dias em um período sem tratamento. Este efeito duradouro da EA pode ser atribuído ao aumento da dinorfina, uma vez que múltiplas sessões de EA de 100 Hz são muito eficientes na aceleração da biossíntese da dinorfina, como refletido pela rápida regulação positiva do mRNA da pré-prodinorfina, que foi mantida por pelo menos 7 dias no cérebro .
Evidências anteriores indicam que a dinorfina liberada no SNC, por meio da interação com o receptor κ-opioide (KOR), desempenha um papel importante na supressão induzida por EA de 100 Hz da síndrome de abstinência de morfina , , . Além disso, sessões múltiplas de EA de 100 Hz mostraram ser mais eficazes do que EA única no bloqueio da regulação negativa do mRNA da preprodinorfina induzida pela exposição crônica à morfina . Foi demonstrado que os sistemas opioides dinorfina-κ podem ter um papel importante na condução da ingestão compulsiva de drogas . A expressão de dinorfina e KORs foi menor em roedores que consumiram altos níveis de etanol do que em seus equivalentes com baixo consumo de álcool , , . Além disso, a administração sistêmica do agonista KOR U50,488H em ratos reduz significativamente a ingestão de etanol , enquanto a administração do antagonista KOR aumenta a ingestão de etanol . É importante destacar que os polimorfismos na dinorfina e no KOR foram associados ao aumento do risco de alcoolismo em humanos . Tomados em conjunto, esses dados sugerem um papel modulador da dinorfina sobre o consumo de etanol, no qual o sistema dinorfina/KOR funciona para reduzir o consumo de etanol. Uma vez que a EA de 100 Hz pode facilitar especificamente a liberação de dinorfina , nós hipotetizamos que a dinorfina media pelo menos em parte a redução no consumo de etanol induzida por EA de 100 Hz observada no estudo atual. Entretanto, o mecanismo subjacente à redução mediada pela dinorfina no consumo de etanol não está completamente claro. Uma redução no consumo de etanol induzida pelo aumento da dinorfina também foi observada em estudos anteriores , . Esses autores interpretaram seus dados para indicar que a dinorfina pode fornecer feedback pós-ingestivo para regular episódios subsequentes de consumo de etanol.
O gene da predinorfina é um dos alvos transcricionais para ΔFosB , . A superexpressão de ΔFosB no NAc e no estriado dorsal aumentou a atividade locomotora e as respostas de recompensa à morfina, em parte por meio da supressão da expressão da dinorfina . Uma vez que a EA de 100 Hz acelerou a liberação de dinorfina na medula espinhal e restaurou a expressão do gene da prodinorfina no cérebro em animais dependentes de morfina , , propomos que a EA de 100 Hz pode alterar a função de ΔFosB no cérebro.
TEste estudo mostra que os fatores de transcrição ΔFosB no córtex pré-frontal, na região estriatal e na VTA posterior podem desempenhar um papel importante na redução induzida por EA de 100 Hz da ingestão excessiva de etanol. Destaca que a redução induzida por EA do consumo de etanol pode envolver diversas vias que contribuem para o consumo de etanol, incluindo circuitos neurais cognitivos, motivacionais e motores. O núcleo NAc pode contribuir para o comportamento de busca de drogas apoiado por estímulo condicionado . Da mesma forma, o estriado dorsal pode contribuir para a natureza compulsiva ou semelhante ao hábito do consumo de drogas . As partes lateral (DLS) e medial (DMS) do estriado dorsal têm entradas e saídas anatômicas distintas e, portanto, funções diferentes . Por exemplo, o fator neurotrófico endógeno derivado do cérebro no DLS, mas não no DMS, controla a ingestão voluntária de etanol . Em consonância com essas descobertas, mostramos que a autoadministração crônica de etanol induziu acúmulo pronunciado de ΔFosB no núcleo do NAc e no DLS, mas não no invólucro do NAc e no DMS. Mais importante, mostramos ainda que múltiplas sessões de EA de 100 Hz atenuaram significativamente o acúmulo de FosB/ΔFosB IR no núcleo do NAc e no DLS induzido pelo consumo excessivo de etanol, e a atenuação foi mais significativa no DLS do que no núcleo do NAc.
TO PFC é responsável pela função executiva, tomada de decisões e implementação de ações direcionadas a objetivos. As sub-regiões do PFC incluem o PrL que orienta o início da resposta e o IL que medeia a inibição da resposta; ambas as regiões orientam ações e resultados. O PrL e o IL podem servir como mecanismos liga-desliga tanto em respostas condicionadas a drogas quanto em respostas de medo. Além disso, a sub-região do OFC é uma região cerebral chave implicada na regulação do comportamento orientado para objetivos e da impulsividade . Acredita-se que o acúmulo de ΔFosB no PFC esteja diretamente envolvido na manutenção do vício, produzindo tolerância aos efeitos desreguladores cognitivos das drogas por meio de suas ações no PFC. .
Durante a retirada do medicamento, a superexpressão de ΔFosB aumenta a impulsividade, o que promove ainda mais a autoadministração do medicamento , . Iimportante, a superexpressão genética ou viral de ΔJunD - um mutante negativo dominante de JunD que antagoniza ΔFosB e outras atividades transcricionais mediadas por AP1 - no OFC bloqueia esses efeitos principais da exposição ao medicamento . O estudo atual mostrou que a ingestão excessiva de etanol induziu altos níveis de ΔFosB em PrL e OFC, que foram bloqueados por múltiplas sessões de EA de 100 Hz; além disso, embora a IR de FosB/ΔFosB no IL não tenha sido alterada pelo consumo excessivo de etanol, ela foi reduzida por múltiplas sessões de EA de 100 Hz.
A VTA, a origem do sistema dopaminérgico mesolímbico, é crítica para comportamentos motivados de drogas abusadas, incluindo etanol. Anteriormente, Perrotti e colegas forneceram evidências de que após exposição aguda ou crônica a vários psicoestimulantes, como cocaína e anfetamina, a expressão de FosB/ΔFosB na VTA posterior/cauda foi aumentada. É importante ressaltar que a expressão é essencialmente apresentada nos neurônios GABAérgicos, sem expressão detectável nos neurônios DA , . Em consonância com a descoberta de Perrotti, descobrimos que após exposição crônica ao etanol, a expressão de FosB/ΔFosB na VTA posterior/cauda foi aumentada. Embora não tenhamos identificado os tipos de células onde FosB/ΔFosB foi expresso no presente estudo, com base na descoberta de Perrotti descrita acima, especulamos que FosB/ΔFosB pode ser expresso nos neurônios GABAérgicos; embora o mecanismo de indução de ΔFosB somente no subconjunto de neurônios GABA da VTA posterior ainda não esteja claro. Dado que a administração repetida de um inibidor da captação de dopamina induziu FosB/ΔFosB na VTA , foi sugerido que o sistema de dopamina media a indução de ΔFosB. Curiosamente, a EA de 100 Hz por seis dias diminuiu significativamente a IR de FosB/ΔFosB no VTA posterior/cauda. Dado que a ativação de KORs na VTA pode hiperpolarizar os neurônios DA e suprimir a liberação de dopamina por ações diretas no local de liberação , propomos que, pela ativação de KORs, múltiplas sessões de EA de 100 Hz podem suprimir a liberação de dopamina, o que leva à inibição da expressão de FosB/ΔFosB nos neurônios GABA VTA , embora a consequência da inibição do neurônio GABA exija mais investigação. Além disso, estudos recentes demonstraram que os KORs são expressos funcionalmente nos neurônios DA que projetam PFC e amígdala, mas não NAc, no VTA. , ; assim, a inibição da ingestão de álcool induzida por múltiplas sessões de EA de 100 Hz pode ser devido à inibição seletiva dos circuitos VTA-PFC ou VTA-amígdala DA ou ambos por meio da ativação seletiva de KORs no VTA.
Em resumo, este estudo mostra que múltiplas sessões de EA em alta frequência (100 Hz) no ponto de acupuntura ST36 são eficazes na redução de (1) consumo e preferência por etanol em ratos que consumiam cronicamente altas quantidades de etanol, e (2) IR FosB/ΔFosB em regiões cerebrais relacionadas à recompensa. Dado que ΔFosB e FosB são membros importantes da família Fos de fatores de transcrição implicados na plasticidade neural na dependência de drogas, parece que ΔFosB e FosB nas regiões cerebrais relacionadas à recompensa são os principais participantes da ação da EA na redução do consumo excessivo de álcool.
Notas de rodapé
Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde – Instituto Nacional sobre Abuso de Álcool e Alcoolismo [Subvenções AA016964 e AA016618]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.