(HUMANO) Respostas Comportamentais e Estruturais à Cocaína Crônica Requerem um Loop de Feedforward Envolvendo ΔFosB e Proteína Quinase II Dependente de Cálcio / Calmodulina no Nucleus Accumbens Shell (2013)

O fator de transcrição ΔFosB e a proteína quinase II dependente de cálcio / calmodulina (CaMKIIα) enriquecida pelo cérebro são induzidas no nucleus accumbens (NAc) por exposição crônica à cocaína ou outras drogas psicoestimulantes de abuso, nas quais as duas proteínas mediam respostas de drogas sensibilizadas . Embora ΔFosB e CaMKIIα regulem a expressão e função do receptor de glutamato AMPA no NAc, formação de espinha dendrítica em neurônios espinosos médios (MSNs) e sensibilização locomotora à cocaína, até o momento nenhuma ligação direta entre essas moléculas foi explorada. Aqui, demonstramos que ΔFosB é fosforilado por CaMKIIα no Ser27 estabilizador de proteína e que CaMKII é necessária para a acumulação mediada por cocaína de ΔFosB na NAc de rato.

Por outro lado, mostramos que ΔFosB é necessário e suficiente para a indução de cocaína da expressão do gene CaMKIIα in vivo, um efeito seletivo para D₁tipo MSNs na sub-região de shell NAc.

Além disso, a indução de espinhas dendríticas em MSNs de NAc e a maior responsividade comportamental à cocaína após a superexpressão de ΔFosB de NAc são dependentes de CaMKII.

Importante, nós demonstramos pela primeira vez a indução de ΔFosB e CaMKII no NAc de viciados em cocaína humana, sugerindo possíveis alvos para futuras intervenções terapêuticas. Esses dados estabelecem que ΔFosB e CaMKII se envolvem em uma alça de alimentação direta específica para o tipo de célula e para a região cerebral como um mecanismo chave para a regulação do circuito de recompensa do cérebro em resposta à cocaína crônica.

Introdução

Evidências crescentes apóiam a visão de que mudanças na expressão gênica contribuem para mecanismos de dependência de drogas (Robison e Nestler, 2011). Um importante mediador dessas mudanças é ΔFosB, um fator de transcrição da família Fos (Nestler, 2008). A administração crónica de virtualmente qualquer droga de abuso induz a acumulação duradoura de ΔFosB no núcleo accumbens (NAc), uma região límbica essencial para comportamentos de recompensa. SA indução de uch parece específica para a classe de neurônios espinhosos médios de NAc (MSN) que expressam receptores de dopamina D1. A sobreexpressão indutível de ΔFosB nestes MSNs de NAc do tipo D1 aumenta as respostas locomotoras e recompensadoras à cocaína e à morfina (Kelz et al., 1999; Zachariou e outros, 2006), incluindo o aumento da auto-administração de cocaína (Colby e outros, 2003). Além disso, o bloqueio genético ou viral da atividade transcricional de ΔFosB reduz os efeitos recompensadores dessas drogas (Zachariou e outros, 2006), indicando que essa indução sustentada de ΔFosB é um mediador crítico das mudanças duradouras induzidas na NAc pela administração crônica de medicamentos.

A estabilidade incomum de ΔFosB (em relação a todas as outras proteínas da família Fos) é uma propriedade intrínseca da molécula, devido ao truncamento de domínios degron presentes em FosB de comprimento total (Carle e outros, 2007) e um processo regulado. ΔFosB é fosforilado in vitro e in vivo em Ser27, e esta reação estabiliza ainda mais ΔFosB, 10 vezes, em cultura de células e NAc in vivo (Ulery-Reynolds e outros, 2009). Embora o Ser27-ΔFosB tenha demonstrado ser um substrato para a caseína quinase-2 in vitro (Ulery et al., 2006), seu mecanismo de in vivo a fosforilação permanece desconhecida.

A proteína quinase II dependente de cálcio / calmodulina (CaMKII) é uma serina / treonina quinase altamente expressa cujas isoformas α e β formam homo e hetero-holoenzimas dodecaméricas in vivoe são essenciais para múltiplas formas de neuroplasticidade (Lisman et al., 2002; Colbran e Brown, 2004). CaMKIIα é induzido seletivamente na camada de NAc por anfetamina crônica (Loweth et al., 2010) e o bloqueio farmacológico da atividade da CaMKII na concha de NAc reduz a sensibilização comportamental à anfetamina (Loweth et al., 2008) e cocaína (Pierce e outros, 1998), enquanto a superexpressão viral de CaMKIIα nesta subregião de NAc aumenta a sensibilização locomotora e auto-administração de anfetamina (Loweth et al., 2010). CaMKIIα pode afectar comportamentos de recompensa através da modulação de subunidades do receptor de glutamato de AMPA (Pierce e outros, 1998), já que a atividade de CaMKIIα tem sido associada à função do receptor de AMPA e ao direcionamento sináptico em várias formas de neuroplasticidade (Malinow e Malenka, 2002).

Esta literatura demonstra vários paralelos entre ΔFosB e CaMKII: ambos são necessários e suficientes para múltiplos efeitos comportamentais de drogas de abuso, ambos regulam positivamente espinhas dendríticas em vários tipos de células neuronais in vivo (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010), e ambos exercem pelo menos alguns dos seus efeitos comportamentais através da modulação dos receptores AMPA (Kelz et al., 1999; Malinow e Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Apesar destes paralelos, não é conhecida qualquer ligação funcional entre ΔFosB e CaMKII. Aqui, nós estabelecemos regulação recíproca entre ΔFosB e CaMKII, e demonstramos que as duas proteínas formam um loop de feed-forward específico do MSN do tipo D1 na concha de NAc que é induzida pela cocaína e regula uma gama de respostas de cocaína in vivo.

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Materiais e Métodos

Experimento 1: Análise Proteômica do iTRAQ do NAc Shell e Core Após o Tratamento da Cocaína (Fig 1A)

Ratos machos adultos (8 semanas) foram administrados 20 mg / kg cocaína ou veículo salino IP uma vez por dia durante sete dias. 24 h após a última injecção, a casca e o núcleo de NAc foram microdissecados (Fig 1A) e flash congelado. As análises do iTRAQ foram realizadas conforme descrito anteriormente (Ross et al., 2004; Davalos e outros, 2010).

Figura 1

Indução específica de Shell de CaMKII em NAc por cocaína

Experimento 2: Quantificação de Mudanças de Proteína no Núcleo NAc de Ratos e Shell Após o Tratamento com Cocaína (Fig 1B – D)

Ratos machos adultos (8 semanas) foram administrados 10 mg / kg de cocaína ou veículo salino IP uma vez por dia durante sete dias em câmaras de gravação locomotoras. As respostas locomotoras a uma única injeção de cocaína (5 mg / kg IP) foram registradas naqueles animais tratados previamente com cocaína (chamada “crônica”) e uma porção daqueles tratados com solução salina (chamada “aguda”), e respostas locomotoras à solução salina. só foi registado nos restantes animais tratados com solução salina crónica (denominados “solução salina”). Os ensaios de atividade locomotora foram realizados conforme descritoHiroi et al., 1997). Resumidamente, ratos machos adultos foram colocados em caixas de gravação de campo aberto 18 ”× 24” PAS (San Diego Instruments) para 30 min a habituar, receberam uma única injecção IP de solução salina e foram monitorizados durante mais 30 min e receberam uma Injecção IP única de 5 mg / kg de cocaína e monitorizada para 30 min.

24 h após esta injecção final, os ratos foram decapitados sem anestesia para evitar efeitos de anestésicos nos níveis de proteína neuronal e estados de fosfo. Os cérebros foram cortados em série numa matriz 1.2 mm (Braintree Scientific) e o tecido alvo foi removido em solução salina tamponada com fosfato contendo inibidores de protease (Roche) e fosfatase (Sigma Aldrich) utilizando um punção de calibre 14 para núcleo NAc e um punção de calibre 12 dos restantes tecido para concha NAc (Ver Fig 1A) e imediatamente congelado em gelo seco. As amostras foram homogeneizadas por sonicação leve em tampão RIPA modificado: 10 mM Tris base, 150 mM cloreto de sódio, 1 mM EDTA, 0.1% dodecil sulfato de sódio, 1% Triton X-100, 1% deoxicolato de sódio, pH 7.4, inibidores de protease e fosfatase como acima. Após a adição do tampão Laemmli, as proteínas foram separadas em gel de gradiente 4-15% poliacrilamida (Criterion System, BioRad), e Western blotting foi realizado utilizando o sistema Odyssey (Li-Cor) de acordo com os protocolos do fabricante.

Experimento 3: Quantificação de Mudanças de Proteína no Núcleo NAc de Ratos e Concha Após a Retirada de Cocaína (Fig 1E)

Ratos machos adultos (8 semanas) foram administrados 10 mg / kg cocaína ou veículo salino IP uma vez por dia durante sete dias. 14 dias após a injecção final, os animais tratados com solução salina receberam outra injecção de solução salina (chamada "solução salina") e os animais tratados com cocaína receberam outra injecção de solução salina (chamada 14 dia withdrawal ou 14d WD) ou uma única injecção de cocaína ( chamado “14d WD Chal” para desafio). Uma hora após a injecção final, os animais foram decapitados e o Western blotting foi Experiment 2.

Experimento 4: Quantificação de Mudanças de Proteína no Núcleo NAc de Ratos e Shell Após Autoadministração de Cocaína (Fig 2A – C)

Os ratos foram treinados para auto-administrar 0.5 mg / kg / infusão de cocaína em sessões de uma hora sob um regime 1 de razão fixa durante nove dias. Após nove sessões de base, os ratos foram divididos em dois grupos equilibrados pela ingestão de cocaína nas duas últimas sessões. Um grupo de ratos foi autorizado a auto-administrar cocaína (0.5 mg / kg / infusão) em sessões de uma hora (acesso curto, ShA) enquanto o outro grupo de ratos se auto-administrou cocaína em sessões de seis horas (acesso longo, LgA ) por mais dez dias (sessões de escalonamento).

As secções do cérebro foram processadas para imunohistoquímica como descrito (Perrotti e outros, 2004). Os c�ebros foram perfundidos 18-24 h depois da �tima exposi�o ao f�maco, resultando na degrada�o de qualquer prote�a FosB de comprimento total residual de tal modo que toda a imunorreactividade remanescente reflecte ΔFosB. Esta degradao foi confirmada por Western blotting, que n apresentou colorao significativa com um anticorpo dirigido contra o terminal C de FosB de comprimento total que n reconhece? FosB (dados n apresentados). Após cortar em secções 35 µm, o número de células imunopositivas ΔFosB foi quantificado por um observador cego em duas secções através do NAc de cada rato, e os valores médios por campo 40 × foram então calculados por região para cada animal. Cada animal foi considerado uma observação individual para análise estatística. Regiões de interesse foram identificadas utilizando Paxinos e Watson (Paxinos e Watson, 2007).

A quantificação da imunorreactividade de CaMKIIα foi realizada utilizando um sistema Licor como descrito (Covington et al., 2009). Intensidades integradas de CaMKII e GAPDH foram determinadas com o software Odyssey. Os resultados são apresentados como valores de intensidade integrados por mm² e são apresentados como médias ± sem (n = 4 – 10 por grupo). Valores para GAPDH foram usados ​​como referência para normalizar a intensidade de CaMKII para espessura de corte e condições.

Figura 2

Indução de CaMKII na camada de NAc de ratos auto-administrados e viciados em cocaína humana

Experimento 5: Quantificação dos níveis de proteína em humanos dependentes de cocaína (Fig 2D)

Procedimento

Os tecidos cerebrais humanos post-mortem foram obtidos do Quebec Brain Bank Suicide (Instituto Universitário Douglas Mental Health, Montreal, Quebec, Canadá). A preservação do tecido prosseguiu essencialmente como descrito (Quirion et al., 1987). Resumidamente, uma vez extraído, o cérebro é colocado em gelo úmido em uma caixa de isopor e levado às instalações do Quebec Suicide Brain Bank. Os hemisférios são imediatamente separados por um corte sagital no meio do cérebro, tronco cerebral e cerebelo. Vasos sanguíneos, glândula pineal, plexo coróide, metade cerebelo e metade do tronco encefálico são tipicamente dissecados do hemisfério esquerdo que é então cortado coronalmente em fatias de 1 cm de espessura antes do congelamento. A segunda metade do cerebelo é cortada sagitalmente em fatias com espessura de 1cm antes do congelamento. Os tecidos são congelados em 2-metilbutano a –40 ° C durante ~ 60 seg. Todos os tecidos congelados são mantidos separadamente em sacos plásticos a –80 ° C para armazenamento a longo prazo. As regiões cerebrais específicas são dissecadas a partir de fatias coronais congeladas numa placa de aço inoxidável com gelo seco em todo o lado para controlar a temperatura do ambiente. Western blotting foi realizado como descrito em Experiment 2.

grupo

A coorte foi composta por indivíduos do sexo feminino 37 do sexo masculino e feminino do 3, com idades variando entre 15 e 66 anos. Todos os indivíduos morreram repentinamente sem um estado agonal prolongado ou doença médica prolongada. Em cada caso, a causa da morte foi averiguada pelo escritório do Coroner de Quebec, e uma triagem toxicológica foi realizada com amostras de tecido para obter informações sobre o uso de medicamentos e substâncias ilícitas no momento do óbito. O grupo de sujeitos consistiu em indivíduos 20 que preencheram os critérios SCID-I para dependência de cocaína. O grupo controle foi composto por indivíduos 20 sem histórico de dependência de cocaína e sem grandes diagnósticos psiquiátricos. Todos os indivíduos morreram subitamente de causas que não tiveram influência direta no tecido cerebral. Os grupos foram pareados por idade média, atraso de refrigeração e pH. Para todos os indivíduos, as autópsias psicológicas foram realizadas conforme descrito anteriormente (Dumais et al., 2005), permitindo-nos ter acesso a informações detalhadas de casos sobre história psiquiátrica e médica, bem como outros dados clínicos e sociodemográficos relevantes. Em resumo, um entrevistador treinado conduziu Entrevista Clínica Estruturada para o DSM-IV Transtornos Psiquiátricos (SCID-I) com um ou mais informantes do falecido. Um painel de clínicos revisou as avaliações do SCID-I, relatos de caso, anotações do legista e registros médicos para obter diagnósticos psiquiátricos de consenso.

Experimento 6: Imunoprecipitação da Cromatina para NAc de Rato (Fig 3A – C)

Ratos machos adultos (8 semanas) foram administrados 10 mg / kg cocaína ou veículo salino IP uma vez por dia durante sete dias. 24 h após a última injecção, a casca e o núcleo de NAc foram microdissecados. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) foi realizada agrupando punções NAc bilaterais de concha ou núcleo de sete ratos por grupo em grupos totais 14 (total de animais 98, piscinas de cocaína 7, piscinas salinas 7). Os tecidos foram reticulados, lavados e armazenados a −80 ° C até o cisalhamento da cromatina por sonicação. A cromatina cortada foi incubada durante a noite com anticorpos previamente ligados a esferas magnéticas (Dynabeads M-280, Invitrogen). A IgG não imune foi usada como controle. Após a reticulação reversa e a purificação do ADN, utilizou-se qPCR para medir os níveis de ADN promotor de CaMKIIa. Os iniciadores foram desenhados para amplificar uma região contendo uma sequência de consenso AP-1 localizada ~ 450 pb antes do local de início da transcrição (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Figura 3

Indução ΔFosB específica de tipo de célula e região de CaMKIIα in vivo

Experimento 7: Medindo o Transcrito de CaMKII e Expressão de Proteína com Superexpressão ΔFosB Específica do Tipo de Célula (Fig 3D)

Ratinhos bitransgênicos machos derivados de NSE-tTA (linha A) × TetOp-ΔfosB (linha 11) e NSE-tTA (linha B) × TetOp-FLAG-ΔfosB camundongos (linha 11) (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou e outros, 2006) foram concebidos e criados em 100 µg / ml de doxiciclina para suprimir a expressão de ΔFosB durante o desenvolvimento. As ninhadas foram divididas ao desmame: metade permaneceu em doxiciclina e metade foi transferida para a água, e os animais foram usados ​​8 11 semanas mais tarde, quando os efeitos transcricionais de ΔFosB são máximos (Kelz et al., 1999; McClung e Nestler, 2003). Para as análises transcricionais, os camundongos foram rapidamente decapitados e os cérebros foram removidos e colocados em gelo. As dissecções de NAc foram tomadas com um punção com agulhas 14 e rapidamente congeladas em gelo seco até o ARN ser extraído. Isolamento de RNA, qPCR e análise de dados foram realizados conforme descrito anteriormente (LaPlant et al., 2009). Resumidamente, o RNA foi isolado com o reagente TriZol (Invitrogen), posteriormente purificado com o micro kit da RNAeasy da Qiagen, e checado a qualidade com o Bioanalyzer da Agilent. A transcrição reversa foi realizada usando o iScript (BioRad). O qPCR foi realizado com um sistema 7900HT RT PCR da Applied Biosystems com os seguintes parâmetros de ciclo: 10 min a 95 ° C; 40 de 95 ° C para 1 min, 60 ° C para 30 sec, 72 ° C para 30 sec; aquecimento graduado a 95 ° C para gerar curvas de dissociação para confirmação de produtos de PCR únicos. As análises imuno-histoquímicas da expressão da proteína ΔFosB e CaMKIIα foram realizadas conforme descrito Experiment 4.

Experimento 8: Efeitos dos Antagonistas dos Receptores de Dopamina Intra-NAc D1 e D2 na Alteração da Proteína Mediada por Cocaína (Fig 3H)

Ratos machos adultos (8 semanas) foram administrados 10 mg / kg cocaína ou veículo salino (grupo "veículo") IP uma vez por dia durante sete dias. 30 min antes de cada injecção de cocaína, administrou-se aos ratos o antagonista do receptor D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg, grupo “D1 Ant”) ou o antagonista do receptor D2 eticlopride (0.5 mg / kg, grupo “D2 Ant”) ou uma injeção de controle salino (grupo "cocaína"). 24 h após a injecção final, os animais foram decapitados e as proteínas quantificadas por Western blotting Experiment 2.

Experimento 9: efeitos da superexpressão ΔFosB mediada pelo AAV na expressão de proteínas (Fig 4 A – C)

A cirurgia estereotáxica foi realizada em ratos machos adultos (semanas 8) para injetar AAV-GFP (proteína verde fluorescente) ou AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). Agulhas de calibre 33 (Hamilton) foram empregues em todas as cirurgias, durante as quais 0.5 de vírus de alto título purificado foi infundido bilateralmente durante um período de tempo mínimo de 5, seguido de um período adicional de descanso 5 min pós-infusão. Todas as distâncias são medidas em relação a Bregma: ângulo 10 °, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 dias após a cirurgia, os animais receberam uma injeção IP única de 10 mg / kg de cocaína nas câmaras de monitoramento locomotor para avaliar os efeitos comportamentais da superexpressão de ΔFosB. 24 h após esta injecção final, os ratos foram decapitados conforme Experiment 2e a microdissecção de tecidos foi realizada sob orientação microscópica de fluorescência para obter tecido NAc GFP-positivo. Western blotting foi então realizado conforme Experiência 2.

Figura 4

ΔFosB é necessário e suficiente para a indução de CaMKIIα dependente de receptor D1 mediada por cocaína na concha de NAc

Experimento 10: Efeitos da superexpressão de Juniper mediada pelo AAV na expressão de proteína dependente de cocaína (Fig 4 D – F)

A injeção estereotáxica de AAV-GFP ou AAV-GFP-ΔJunD foi realizada conforme Experiência 8. 14 dias após a cirurgia, os animais foram administrados 10 mg / kg de cocaína ou veículo salino IP uma vez por dia durante sete dias em câmaras de gravação locomotoras. As respostas locomotoras a uma única injeção de cocaína (5 mg / kg IP) ou salina foram registradas. 24 h após essa injeção final, os ratos foram decapitados, o tecido colhido e os Western blots foram Experiência 9.

Experiência 11: In Vitro Ensaios de Proteína Quinase (Fig 5A – D)

CaMKIIα e ΔFosB recombinantes foram purificados a partir de células deBrickey e outros, 1990; Jorissen et al., 2007), e ensaios de proteína quinase foram realizados (Colbran, 1993), como descrito anteriormente. Resumidamente, CaMKII foi pré-incubado em gelo com 2.5 µM ​​(ou concentração indicada) de ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, Calmodulina 15, e HEPES 200 mM pH 7.5. A fosforilação foi iniciada pela adição de 200 µM ​​ATP com ou sem [γ-³²P] ATP e deixada prosseguir para 10 min à temperatura ambiente (Fig 5A e B) ou 2 min no gelo (Fig 5C e D). Os produtos foram resolvidos por Western blotting (Fig 5A e B) ou por autorradiograma e contagem de cintilação (Fig. B - D).

Figura 5

ΔFosB é um potente substrato para CaMKIIα

Experimento 12: Identificação da fosforilação de Ser27 ΔFosB (Fig 5E)

In vitro ensaios de cinase foram realizados conforme Experiment 11, as proteínas foram separadas por SDS-PAGE, e as bandas correspondentes a ΔFosB foram cortadas e submetidas a espectrometria de massa em tandem. As atribuições m / z dos fragmentos de íons correspondentes em todos os painéis são marcadas no topo dos picos iônicos. Nem todos os íons de fragmento são rotulados devido a limitações de espaço. Geralmente, o texto para os rótulos de íons de fragmento são coloridos em preto, exceto quando confirmam diretamente ou adicionam evidências à presença dos locais de fosforilação de interesse, caso em que são marcados em vermelho. A evidência para os produtos de fragmentação da estrutura principal é apresentada na leitura da sequência do fosfopéptido com o local detectado do resíduo de fosforilação indicado em vermelho com uma designação de letra de aminoácido único. A descrição numérica dos iões do fragmento observados é também marcada na sequência peptídica como iões b e y. Os fatores de zoom para as seções do eixo m / z para mostrar os íons do fragmento de menor intensidade são marcados no topo de cada espectro de massa do fragmento. Os iões do fragmento mostrados no painel H confirmam a presença da isoforma fosforilada Ser27, no entanto, dentro de uma mistura de outras isoformas fosforiladas nos locais Ser28, Ser31, Ser34 e Thr37. A presença dos íons pa5, pa5-P, pb5 e pb5-P confirmam exclusivamente a fosforilação do resíduo Ser27.

Experimento 13: Quantificação da fosforilação de Ser27 (Fig 5F)

Os péptidos padrão foram concebidos simulando as formas fosfo e não fosfo de Ser27 ΔFosB. Após a síntese e purificação, cada péptido idiotípico “pesado” foi dissolvido num tampão de acetonitrilo 50 / 50 / água e enviado para análise de aminoácidos para determinar a concentração absoluta na solução de reserva de péptido sintético. Cada peptídeo “pesado” foi então infundido diretamente no espectrômetro de massas 4000 QTRAP (MS) para determinar a melhor energia de colisão para fragmentação MS / MS e duas a quatro transições MRM. Em seguida, os peptídeos puros “pesados” foram submetidos a LCMS no 4000 QTRAP para garantir a separação dos peptídeos. O instrumento foi executado no modo triplo quadrupolo, com Q1 ajustado no valor m / z de precursor específico (Q1 não está varrendo), e Q3 ajustado ao valor m / z específico correspondente a um fragmento específico daquele peptídeo. No modo MRM, uma série de reações únicas (transições de íons precursoras / fragmentadas onde a energia de colisão é ajustada para otimizar a intensidade dos íons de interesse do fragmento) foram medidas seqüencialmente, e o ciclo (tipicamente 1-2 seg) foi o tempo todo da separação por HPLC. As transições de MRM foram determinadas a partir dos espectros de MS / MS dos péptidos existentes. Duas transições por peptídeo, correspondentes a íons de fragmento de alta intensidade, foram então selecionadas e a energia de colisão otimizada para maximizar a intensidade do sinal de transições de MRM usando software de automação. Picos resultantes de p�tidos padr� e amostras de? FosB expostos a CaMKII ou controlo foram ent� comparados para determinar a abund�cia absoluta de cada forma de p�tido na reac�o. A análise de dados nos dados do LC-MRM é realizada usando o software AB Multiquant 1.1.

Experimento 14: Indução de ΔFosB em camundongos superexpressores de CaMKII (Fig 5G e H)

Ratos transgênicos superexpressando T286D CaMKII (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) e ninhadas do tipo selvagem foram criados na ausência de doxiciclina para permitir a expressão do transgene. Ratinhos adultos foram administrados 20 mg / kg de cocaína ou solução salina IP uma vez por dia durante 14 dias. 24 h após a injeção final, os animais foram decapitados e a imuno-histoquímica e quantificação da expressão de ΔFosB foi realizada Experiment 4.

Experimento 15: Efeitos da sobreexpressão ΔFosB e da inibição da CaMKII mediada pelo HSV em espinhas dendríticas de NAc (Fig 6A – E)

Camundongos machos adultos (8 semanas) foram estereotaxicamente injetados em NAc com HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson e outros, 2006), HSV-GFPAC3I ou HSV-GFPAC3I-ΔFosB. Nestas construções, o AC3I, um inibidor da atividade de CaMKII baseado em peptídeos, é fundido ao C-terminal da GFP. O GFPAC3I foi clonado por PCR utilizando o vector pMM400 contendo GFPAC3I como molde com os seguintes iniciadores: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). O produto de PCR resultante foi inserido nos vectores p1005 + e p1005 + -A FosB utilizando os locais NheI e BspEI. O constructo foi validado por sequenciamento. As coordenadas estereotáxicas foram: ângulo 10 °, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = −4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfusão e seccionamento cerebral foi realizado conforme Experiment 4.

A análise da coluna foi realizada conforme descrito (Christoffel et al., 2011). Resumidamente, os segmentos dendríticos 50 150 longe do soma foram escolhidos aleatoriamente a partir de células infectadas pelo HSV que expressam GFP. As imagens foram adquiridas em um LSM 710 confocal (Carl Zeiss) para análise morfológica usando o NeuronStudio com o algoritmo de rayburst. O NeuronStudio classifica as espinhas como finas, em forma de cogumelo ou grossas, com base nos seguintes valores: relação de aspecto (1), (2) relação cabeça / pescoço e diâmetro da cabeça (3). Espinhas com pescoço podem ser classificadas como finas ou cogumelo, e aquelas sem um pescoço significativo são classificadas como grossas. Espinhos com um pescoço são rotulados como finos ou com base no diâmetro da cabeça.

Figura 6

Bloqueio da atividade de CaMKII impede os efeitos morfológicos e comportamentais de ΔFosB em NAc

Experimento 16: efeitos da superexpressão ΔFosB e da inibição da CaMKII mediada pelo HSV nas respostas à cocaína (Fig 6F)

Camundongos machos adultos foram injetados com vírus conforme Experiment 15e as respostas locomotoras a uma única injeção de 5 mg / kg de cocaína foram medidas conforme Experiência 9. Os dados locomotores são expressos como interrupções totais do feixe ao longo de 30 min após a injeção de cocaína.

Informação adicional

Habitação Animal

Ratos machos Sprague Dawley (250-275g; Charles River Laboratories) foram alojados em pares. Ratinhos machos C57BL / 6J de oito semanas de idade (The Jackson Laboratory) foram alojados em grupo com um máximo de cinco animais por gaiola. Todos os animais foram habituados à instalação de animais por ≥1 semana antes de manipulações experimentais e alojados em salas climatizadas (23 – 25 ° C) num ciclo de luz / escuridão 12 hr (luzes acesas no 7: 00 AM) com acesso a alimentos e água ad libitum. Os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Society for Neuroscience e do comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) no Mount Sinai.

Drogas

Os fármacos foram administrados IP e dissolvidos em solução salina estéril, incluindo cocaína (5-20 mg / kg por 10 µl para ratinhos, por 1 ml para ratos, NIDA) e SCH 23390 ou cloridrato de eticloprida (0.5 mg / kg por 1 ml, Tocris) . Para cirurgia estereotáxica, os camundongos foram anestesiados com um “coquetel” de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) (Henry Schein) em solução salina estéril.

Anticorpos

CaMKIIα (total): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (total): Sinalização Celular 5G4, 1: 250

ΔFosB phospho-Ser27: Phosphosolutions, 1: 500

GluA1 (total): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o pacote de software Prism 6 (GraphPad). Os testes t de Student foram usados ​​para todas as comparações emparelhadas (indicadas em Resultados onde o valor t é dado), e ANOVA unidirecionais foram usadas para todas as comparações múltiplas (indicado na seção de resultados onde o valor F é dado).

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Resultados

Cocaína Crônica Induz CaMKII na Concha NAc

Muitos estudos indicaram que os MSNs no shell e no core do NAc têm diferentes respostas bioquímicas e fisiológicas à exposição crônica a drogas de abuso (Kourrich e Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) e que as duas sub-regiões regulam diferencialmente comportamentos de busca de drogas (Ito et al., 2004). Determinar os efeitos diferenciais da cocaína nos constituintes proteicos da concha de NAc vs Núcleo, usamos Tagging Isobárico Multiplexado (iTRAQ) e espectroscopia de massa em tandem (MS / MS). Ratos machos adultos foram injetados IP com cocaína (20 mg / kg) ou solução salina diariamente por 7 dias; 24 h após a última injecção, a casca e o núcleo de NAc foram microdissecados (Fig 1A) e flash congelado. As proteínas nessas amostras foram então quantificadas usando o iTRAQ. Todas as quatro isoformas de CaMKII exibiram grandes aumentos na expressão após o tratamento com cocaína que eram específicos para a concha de NAc em comparação com o núcleo. Várias proteínas fosfatases, incluindo as subunidades catalítica e reguladora PP1 e PP2A, que foram previamente associadas a vários substratos CaMKII em outros sistemas (Colbran, 2004), seguiu um padrão similar. Estas descobertas forneceram evidências novas e imparciais de que a via de sinalização de CaMKII é proeminentemente regulada pela cocaína no NAc de uma maneira específica.

Para validar este resultado de forma mais quantitativa, tratámos os ratos como acima com cocaína (em doses variáveis) ou solução salina e medimos as respostas locomotoras a uma dose de cocaína (5 mg / kg) ou solução salina. A exposição repetida a 10 mg / kg de cocaína resultou no padrão típico de sensibilização locomotora (Fig 1B). Outros estudos com este regime de dosagem revelaram, através da utilização de Western blotting, que a cocaína repetida induz CaMKIIα selectivamente na concha de NAx 24 h após a injecção final de cocaína (Fig 1C e D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Além disso, a fosforilação do substrato canônico CaMKII Ser831 da subunidade GluA1 do receptor AMPA foi significativamente aumentada na concha de NAc e não no núcleo (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), enquanto a autofosforilação de CaMKIIa Thr286 teve um forte, mas não tendência significativa de indução apenas na casca (Fig 1D). Vários outros receptores de glutamato não foram afetados. Em contraste com estas medidas de CaMKII, as mesmas amostras de tecido exibiram indução de ΔFosB em ambos os invólucros (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) e núcleo (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) do NAc (Fig 1C e D), consistente com os resultados anteriores (Perrotti e outros, 2008).

Uma vez que vários estudos prévios da regulação da cocaína dos receptores AMPA analisaram os animais após dias de retirada da cocaína crônica (ver Discussão), repetimos essas análises bioquímicas neste momento. Descobrimos que, 14 dias após a injeção final de cocaína, ΔFosB permanece elevado em NAc (p = 14; F = 0.0288; df = 4.258), enquanto nem CaMKII nem a fosforilação de GluA22 Ser1 permanece aumentada (Fig 1E). Contudo, 1 h após uma dose única de 10 mg / kg de cocaína, níveis de CaMKII total (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) e de GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforilação são ambos elevados a um grau semelhante ao encontrado após a exposição inicial crônica à cocaína (Fig 1E). Estes dados indicam que os neurónios da concha de NAc são preparados para a indução de CaMKII durante períodos prolongados de abstinência, talvez através de iniciação directa do promotor do gene CaMKII (ver Discussão). Além disso, o fato de a indução de ΔFosB ser mais persistente do que a indução de CaMKII sugere a existência de mecanismos adicionais, baseados em cromatina ou não, que exercem um "freio" na regulação da CaMKII, como discutido na Discussão.

Para fortalecer ainda mais essas observações, exploramos modelos de auto-administração de cocaína, que envolvem a ingestão volitiva de drogas. Ratos machos adultos receberam acesso curto ou longo à cocaína; como esperado (Ahmed e Koob, 1998), apenas as longas condições de acesso levaram à escalada da auto-administração do medicamento (Fig 2A). ΔFosB foi induzido em maior extensão por longos vs acesso curto a cocaína em ambos os shell NAc (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) e núcleo (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Em contraste, o CaMKIIα foi induzido na concha de NAc apenas por um longo acesso à cocaína (Fig 2B e C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). É interessante comparar a ingestão diária média de cocaína entre animais de acesso curto (~ 12 mg / kg IV), animais de acesso longo (~ 70 mg / kg IV) e animais administrados pelo experimentador (10 mg / kg), e perguntar por que este último induz a indução robusta de ΔFosB e CaMKII, enquanto que o acesso de curta distância não o faz. Esta discrepância é provavelmente devida a diferenças nos níveis máximos de cocaína (a cocaína administrada pelo experimentador é administrada como um único bolus IP, enquanto a cocaína autoadministrada é administrada através de múltiplas doses IV) ou por diferenças no comprimento da exposição ao fármaco (7 dias para experimentador administração, 19 dias para auto-administração).

Apesar da grande literatura sobre ΔFosB e CaMKII na ação da cocaína, não há estudos sobre essas proteínas em usuários humanos de cocaína. Aqui, apresentamos a primeira evidência de que os níveis de ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) e CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) estão aumentados em NAc de humanos dependentes de cocaína (Fig 2D, tabela 1). Estes dados indicam que o nosso exame da indução de ΔFosB e CaMKII pela cocaína na NAc de roedores é clinicamente relevante para a dependência humana de cocaína.

tabela 1

Caracterização de amostras de viciados em cocaína humana e grupo controle pareado

ΔFosB regula a transcrição de CaMKII seletivamente em MSNs D1-Type do NAc Shell

A descoberta de que ambos CaMKII e ΔFosB são regulados positivamente pela cocaína na NAc de roedores nos levou a determinar se ΔFosB pode regular a transcrição do gene CaMKII. Anteriormente, havíamos relatado CaMKIIα como um possível alvo para ΔFosB em uma análise de microarray de NAc (McClung e Nestler, 2003), mas esse achado não foi mais validado naquele estudo. Primeiro usamos ChIP quantitativo (qChIP — ChIP seguido de PCR quantitativo) para determinar se ΔFosB se liga ao promotor do gene CaMKIIα em NAc de ratos machos adultos, e notamos que essa ligação é significativamente aumentada, pela administração crônica de cocaína, na casca ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), mas não o núcleo, sub-região (Fig 3A). Para entender melhor os mecanismos relacionados a essa diferença específica na sub-região na ligação de ΔFosB ao promotor de CaMKIIα, utilizamos qChIP para caracterizar o estado das modificações de histonas nessa região genômica. Estudos anteriores demonstraram a indução da acetilação de H3 pela cocaína no promotor CaMKIIα em NAc total de ratinho (Wang et al., 2010). Em contraste, descobrimos que a cocaína diminui a acetilação H3 no promotor CaMKIIα seletivamente no núcleo NAc (Fig 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), sem alteração aparente na concha, consistente com alterações de cromatina específicas da sub-região além da ligação de ΔFosB. qChIP para a marca repressiva, H3 lisina 9 dimetilada (H3K9me2), revelou tendências para reduções nas sub-regiões da casca e do núcleo (Fig 3C).

Determinar se ΔFosB regula a transcrição de CaMKIIα in vivoutilizamos duas linhas de mouse bitransgênicas que superexpressam indutivamente ΔFosB especificamente em D1 vs MSNs tipo D2 de uma maneira controlada pela administração de doxiciclina em água potável (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Camundongos machos adultos superexpressando ΔFosB somente em MSNs do tipo D1 apresentaram níveis significativamente aumentados de mRNA de CaMKIIα em NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), um efeito não observado em camundongos superexpressando ΔFosB predominantemente em MSNs do tipo D2 (Fig 3D). O aumento do ARNm de CaMKIIα, induzido pela expressão de ΔFosB em MSNs do tipo D1, foi acompanhado por um aumento concomitante da proteína CaMKIIα tanto no invólucro de NAc (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) quanto no núcleo (p = 0.0392; = 2.275; df = 14; Figos 3E e F). Estes dados demonstram que ΔFosB é capaz de conduzir a expressão do gene CaMKIIα em MSNs do tipo D1 em ambas as sub-regiões, embora Figura 3B sugere que as alterações da cromatina mediadas por cocaína no promotor CaMKIIα (por exemplo, acetilação reduzida) impedem que ΔFosB regule positivamente CaMKII na sub-região central após a cocaína.

Como nossos dados de camundongos transgênicos indicaram que a indução ΔFosB da expressão do gene CaMKII é específica para MSNs do tipo D1 em NAc, procuramos determinar se a regulação positiva de CaMKII dependente de cocaína requer ativação do receptor de dopamina D1. Ratos machos adultos receberam cocaína crônica ou solução salina como antes, mas 30 min antes de cada injeção, os ratos do grupo de cocaína receberam injeção IP de solução salina, o antagonista D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg) ou o antagonista do receptor D2 eticloprida (0.5 mg / kg). Os animais foram analisados ​​24 horas após a última injeção de cocaína. O Western blotting revelou que o antagonista D1, mas não o D2, bloqueou completamente o aumento mediado pela cocaína em ΔFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), conforme relatado anteriormente (Nye et al., 1995), bem como no CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig 3G e H). Estes dados suportam a hipótese de que a cocaína envolve um aumento mediado por ΔFosB na expressão do gene CaMKII, especificamente em MSNs do tipo D1 da camada NAc. Seria importante em estudos futuros demonstrar diretamente esse efeito específico do tipo celular da cocaína na expressão de CaMKII dentro dessa região do cérebro.

ΔFosB é necessário e suficiente para a indução de cocaína de CaMKII na concha de NAc

Para complementar o uso de camundongos bitransgênicos, em seguida, estudamos o papel de ΔFosB na mediação da indução de cocaína de CaMKIIα pelo uso de transferência gênica mediada por vírus em ratos. Nós injetamos, bilateralmente, partículas virais adeno-associadas (AAV) na casca de NAc de ratos machos adultos (onde a casca pode ser direcionada seletivamente) para superexpressar ΔFosB mais GFP ou GFP sozinho. Os animais receberam então uma injeção IP única de 10 mg / kg de cocaína. Os animais com superexpressão de ΔFosB / GFP exibiram uma resposta locomotora aumentada em comparação com animais que superexpressam GFP sozinhos (Fig 4A). 24 h após a injecção única de cocaína, o tecido NAc GFP-positivo foi excisado destes animais por dissecção sob uma fonte de luz fluorescente. Western blotting deste tecido (Fig 4B e C) revelou forte superexpressão de ΔFosB, bem como um aumento significativo na proteína CaMKIIα total em comparação com animais GFP (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), semelhante à indução observada com a administração crônica de cocaína. Além disso, a autofosforilação de CaMKIIα em Thr286 (indicativa de ativação enzimática) foi aumentada pela superexpressão ΔFosB (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), assim como a fosforilação do substrato CaMKII, Ser831 de GluA1 (p = 0.0540; t = 2.012; df = 28), novamente imitando as ações da cocaína crônica (Fig 1C e D). TJuntamente, esses dados fornecem evidências adicionais de que a expressão de ΔFosB no invólucro de NAc é suficiente para a sensibilização locomotora à cocaína e para a indução e ativação de CaMKII nesta sub-região.

Usamos uma abordagem similar para determinar se ΔFosB é também necessário para indução mediada por cocaína de CaMKIIα na camada de NAc. O AAV foi usado para superexpressar uma proteína JunD truncada, denominada ΔJunD, que é um regulador negativo da ativação transcricional de ΔFosB (Winstanley et al., 2007) mais GFP ou GFP sozinho. Duas semanas mais tarde, quando a expressão transgénica é máxima, os animais receberam cocaína (10 mg / kg) ou solução salina diariamente durante 7 dias e testaram as respostas locomotoras a um desafio com cocaína (5 mg / kg) 24 h após a última injecção crónica (Fig 4D). A superexpressão de JunD evitou a sensibilização locomotora à cocaína, e também preveniu a indução e ativação de CaMKIIα na camada de NAc (Fig 4E e F; p = 0.0437; F = 2.997; total df = 38), indicando que a atividade transcricional de ΔFosB é necessária para a indução mediada por cocaína de CaMKIIα nesta sub-região. Curiosamente, descobrimos que ΔJunD reduziu os níveis de ΔFosB sob ambas as condições tratadas com salina e cocaína (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), aumentando a possibilidade de que ΔFosB dependa da atividade AP-1 para seus próprios níveis de expressão.

Fosforilatos CaMKII ΔFosB na Ser27

utilização in vitro ensaios de proteína-quinase, determinamos que ΔFosB purificado é um substrato robusto para CaMKIIα. Incubação de His₆-ΔFosB com CaMKIIα e ATP causou um deslocamento para cima na mobilidade eletroforética de ΔFosB (Fig 5A); as várias bandas resultantes sugeriram múltiplos locais de fosforilação. Semelhante in vitro ensaios de quinase usando [γ-³²P] ATP mostrou incorporação de fosfato radiomarcado nas bandas ΔFosB deslocadas (Fig 5B), demonstrando a fosforilação direta da proteína. Geramos um anticorpo fosfo-específico para o Ser27 de ΔFosB previamente caracterizadoUlery et al., 2006). Embora este anticorpo não produza um sinal contra extratos cerebrais que contenham ΔFosB fosforilado por Ser27 (dados não mostrados), fomos capazes de detectar a fosforilação de Ser27 na in vitro ensaio de quinase utilizando CaMKII (Fig 5B). Análises cinéticas da fosforilação de CaMKII de ΔFosB indicam que é um potente substrato para a quinase (Fig 5C), com um K aparente_M de 5.7 ± 2.0µM e K_CAT de 2.3 ± 0.3min^-1. Estes resultados são comparáveis ​​a muitos bem caracterizados in vivo substratos de CaMKII (Colbran e Brown, 2004). Além disso, determinamos que CaMKII fosforila ΔFosB com uma estequiometria de 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig 5D), indicando que existem pelo menos três locais de fosforilação de CaMKII dentro da₆Proteína -ΔFosB, de acordo com Fig 5A.

Para investigar locais individuais de fosforilação, empregamos análises de MS de amostras de nossa in vitro ensaios de cinase. Fig 5E demonstra a fosforilação de AfosB no Ser27 previamente caracterizado e em vários locais adicionais (dados não mostrados). Dada a caracterização funcional prévia do Ser27, focalizamos este local gerando peptídeos sintéticos marcados simulando os estados fosfo e não fosfônico de Ser27, em seguida, usamos quantidades conhecidas desses peptídeos como padrões nas análises MRM de ΔFosB antes e depois in vitro fosforilação por CaMKII. Quantificação subseqüente (Fig 5F) confirma que Ser27 é um potente substrato para CaMKII. Estes resultados indicam que, entre múltiplos resíduos fosforilados dentro de ΔFosB, Ser27 é um substrato particularmente eficaz para CaMKII.

CaMKII Mediata Cocaína Acumulação de ΔFosB na Shell NAc

Como CaMKII pode fosforilar ΔFosB in vitro em um site que aumenta drasticamente sua estabilidade in vitro e in vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds e outros, 2009), determinamos se a atividade de CaMKII controla os níveis de ΔFosB no NAc in vivo. Para abordar esta questão, primeiro usamos uma linha de rato sobre-expressando um mutante independente de cálcio de CaMKIIα (T286D) em múltiplas regiões cerebrais incluindo NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). Injectámos na mesma ninhada machos mutantes e ninhadas de tipo selvagem com 20 mg / kg de cocaína ou solução salina uma vez por dia durante 14 dias, depois analisámos os animais um dia após a injecção final. Descobrimos que os níveis basais de ΔFosB foram aumentados nos animais mutantes na concha de NAc (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), mas não no núcleo (Fig 5G e H). Surpreendentemente, a indução dependente de cocaína de ΔFosB foi bloqueada nos animais mutantes tanto no invólucro quanto no núcleo, sugerindo que, embora CaMKII possa regular diretamente a estabilidade de ΔFosB no invólucro de NAc, ele também pode estar a montante de ΔFosB em vias ativadas por cocaína em ambas as sub-regiões. .

A Atividade CaMKII é Necessária para a Plasticidade Estrutural e Comportamental Mediada por ΔFosB

A indução de espinha dendrítica pela cocaína nos MSNs do NAc é uma das adaptações induzidas por drogas mais bem estabelecidas nesta região do cérebro, e essa indução da coluna foi correlacionada com respostas comportamentais sensibilizadas à droga (Robinson e Kolb, 2004; Russo et al., 2010) e relatado como seletivo para MSNs do tipo D1 (Lee et al., 2006). Nós demonstramos recentemente que a indução de cocaína de espinhas dendríticas em NAc é dependente de ΔFosB e seu programa de transcrição a jusante (Maze et al., 2010). Embora haja uma extensa literatura sobre o envolvimento de CaMKII na morfologia da espinha dendrítica e indução em outras regiões cerebrais e sistemas experimentais (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), o seu papel na formação de espinha dorsal do MSN NA não foi estudado. Portanto, determinamos se a atividade de CaMKII é necessária para a indução de espinhas dendríticas mediada por ΔFosB utilizando a superexpressão mediada por HSV do peptídeo inibidor de CaMKII AC3I fundido a GFP, uma construção previamente mostrada para inibir a atividade de CaMKII in vivo (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012) A superexpressão viral de ΔFosB na concha NAc de camundongos adultos induziu um aumento significativo na densidade da coluna dendrítica de MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Fig 6A e B) como relatado anteriormente (Maze et al., 2010), e este aumento foi impulsionado principalmente pelos tipos de coluna delgado (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) e espesso (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) (ambos pensados ​​serem espinhos imaturos) (Fig 6C – E). Nenhum efeito foi observado em espinhos mais maduros, em forma de cogumelo. No entanto, quando a GFP-AC3I foi co-expressa, a indução de espinhos ΔFosB foi completamente anulada (Fig 6A – E), indicando que a atividade de CaMKII é necessária para a indução de espinhos dendríticas com ΔFosB na concha de NAc.

Em seguida, usamos as mesmas ferramentas virais para determinar se a atividade da CaMKII é necessária para os efeitos da ΔFosB na sensibilidade comportamental à cocaína. 72 h após injecção viral na concha de NAc, os animais receberam uma injecção única de 5 mg / kg de cocaína e a sua actividade locomotora foi registada. Como mostrado anteriormente com superexpressão AAV mais estendida de ΔFosB (Fig 4A), A superexpressão de ΔFosB mediada pelo HSV aumentou a sensibilidade locomotora à cocaína (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Fig 6F). Como na indução de espinhas dendríticas, a inibição da atividade de CaMKII pela coexpressão de GFP-AC3I bloqueou completamente o aumento da sensibilidade à cocaína mediado por ΔFosB, indicando que a atividade de CaMKII é necessária para alterações induzidas por ΔFosB nos efeitos comportamentais da cocaína.

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Discussão

O presente estudo delineia um novo mecanismo de feed-forward, onde a cocaína induz ΔFosB em NAc, que aumenta a transcrição do gene CaMKIIα seletivamente em conchas de NAc.. CaMKIIα subseqüentemente fosforila e estabiliza ΔFosB levando ao maior acúmulo de ΔFosB e à posterior indução de CaMKIIα (Fig 6G). Os níveis de co-escalonamento das duas proteínas durante a exposição crônica à cocaína contribuem de maneira essencial para respostas comportamentais sensibilizadas à droga. Essa é uma hipótese particularmente atraente, já que tanto a ΔFosB quanto a CaMKII já foram demonstradas previamente como necessárias para respostas comportamentais aumentadas à cocaína. (Pierce e outros, 1998; Peakman e outros, 2003), e replicamos este achado para ΔFosB na concha de NAc usando especificamente uma abordagem viral (Figos 4 e E66).

Embora a superexpressão ΔFosB transgênica em MSNs do tipo D1 possa direcionar a indução de CaMKII em ambos os animais, no contexto da cocaína, o acúmulo de ΔFosB endógeno, que ocorre em ambas as sub-regiões, induz a indução de CaMKII especificamente na concha de NAc . Essa diferença pode estar relacionada aos altos níveis de ΔFosB induzidos em nosso modelo bitransgênico, no entanto, também pode refletir a capacidade da cocaína em alterar diferencialmente o promotor CaMKIIα na concha. vs MSNs centrais para promover a ligação de ΔFosB na primeira ou excluí-la na última sub-região. De fato, nossos dados de ChIP, que revelam uma desacetilação mediada por cocaína de histonas no promotor do gene CaMKIIα somente no núcleo NAc, suportam o possível envolvimento de um mecanismo de cromatina. De acordo com essa hipótese, a superexpressão de ΔFosB em MSNs do tipo D1 foi capaz de induzir CaMKIIα no núcleo NAc na ausência de cocaína (Fig 3F), sugerindo que existem modificações ativas do promotor CaMKIIα que impedem essa indução durante a exposição crônica à cocaína. A regulação da paisagem da cromatina no promotor de CaMKII também pode explicar porque o CaMKII é induzido por uma dose de desafio de cocaína em conchas de ratos com retirada crônica de cocaína.Fig 1E) mas não de animais virgens de droga (Fig 1D). Isso poderia representar um efeito epigenético de "gene priming" de ΔFosB (Robison e Nestler, 2011), e pode, assim, ser um mecanismo molecular da incubação do craving da cocaína (Pickens et al., 2011). No entanto, para esta mudança de cromatina estar causalmente ligada à incubação do desejo, ela teria que aumentar com o tempo. Será interessante determinar se esse é o caso, e estudar se outros genes mostram a regulação específica para sub-região, dependente de FosB, pela cocaína. Também é importante notar que o loop de feed-forward que descrevemos não leva a um acúmulo infinito de CaMKII ou ΔFosB (Fig 1E); descobrir o "freio" molecular responsável por isso é um objetivo importante de estudos futuros.

As funções conhecidas de ΔFosB e CaMKII em vários sistemas experimentais e regiões cerebrais convergem em muitos níveis (Fig 6F). Ambas as moléculas estão intimamente ligadas ao crescimento da espinha dendrítica: CaMKII interage com o citoesqueleto de actina (Okamoto et al., 2009), regula o tamanho da cabeça da coluna (Matsuzaki et al., 2004), e é necessária e suficiente para aumentos de filopodia e número de sinapses induzidos por plasticidade em culturas organotípicas de hipocampo (Jourdain et al., 2003), WA ΔFosB é necessária e suficiente para a formação de espinha dendrítica induzida por cocaína em MSNs de NAc (Maze et al., 2010). Além disso, ambas as moléculas foram associadas à regulação dos receptores de glutamato AMPA. CaMKII não regula os níveis totais de subunidades do receptor AMPA, mas impulsiona a inserção de receptores AMPA em sinapses e aumenta a condutância do canal AMPA ao fosforilar GluA1 no Ser831 em neurônios piramidais do hipocampo em cultura e in vivo (revisto em (Malinow e Malenka, 2002; Colbran e Brown, 2004)). Esse aumento do tráfico de GluA1 para a sinapse também foi implicado na ação crônica da cocaína (Boudreau e lobo, 2005). Além disso, as respostas comportamentais à ativação do receptor AMPA no NAc são aumentadas pela superexpressão de CaMKIIα em um modo dependente do receptor de dopamina D1 (Singer et al., 2010). Foi demonstrado que a superexpressão específica de D1 a longo prazo de ΔFosB induz a transcrição de GluA2 em NAc (Kelz et al., 1999), que atenua as respostas de AMPA mediadas via GluA1, enquanto mostramos aqui que a superexpressão de ΔFosB a curto prazo - bem como a exposição a cocaína a curto prazo - não tem efeito sobre essa subunidade (Fig 1). No entanto, descobrimos recentemente que a superexpressão de ΔFosB a curto prazo, no entanto, reduz as respostas de AMPA em MSNs do tipo D1 em NAc (Grueter et al., 2013). Esses dados sugerem mecanismos temporalmente distintos que podem constituir uma série de neuroadaptações dependentes do tempo à cocaína, subjacentes a diferentes aspectos da progressão da dependência ainda não bem compreendidos. No nível comportamental, tanto a CaMKII como a ΔFosB são necessárias para a sensibilização locomotora à cocaína (ver acima), e ambas são necessárias para a autoadministração sustentada de cocaína em roedores (videColby e outros, 2003; Wang et al., 2010), sugerindo que as duas proteínas são importantes para adaptações comportamentais de curto e longo prazo à exposição a drogas, embora via mecanismos subjacentes parcialmente distintos. Presumivelmente, FFosB e CaMKII regulam tais adaptações comportamentais complexas através de mudanças na função sináptica do NAc, embora muito mais trabalho seja necessário para ligar diretamente os fenômenos sinápticos à mudança comportamental.

A holoenzima CaMKII interage simultaneamente com uma variedade de proteínas associadas a sinapses (Robison e outros, 2005) que se pensa que regulam a sua focalização para a densidade pós-sináptica (PSD), um fenómeno sugerido como sendo importante para a plasticidade sináptica. Em particular, a interação de CaMKII com a subunidade GluN2B do receptor de glutamato do tipo NMDA demonstrou recentemente regular tanto a plasticidade sináptica como a aprendizagem (Halt et al., 2012). Enquanto o peptídeo AC3I mimetiza o domínio autoinibitório de CaMKII e, portanto, inibe a atividade catalítica da enzima, também bloqueia múltiplas interações proteína-proteína (Strack et al., 2000; Robison e outros, 2005). Assim, os efeitos comportamentais e morfológicos do HSV-GFP-AC3I relatados aqui podem ocorrer através da redução da fosforilação das proteínas alvo de CaMKII, alterações no direcionamento de CaMKII ou uma alteração no papel estrutural proposto por CaMKII nas sinapses (Lisman et al., 2002).

A restrição da alça ΔFosB-CaMKII proposta para a concha de NAc é de especial importância, pois trabalhos recentes demonstraram várias diferenças fisiológicas entre a concha e núcleo de NAc em resposta à administração de cocaína, uma noção confirmada por nossos dados imparciais de iTRAQ (Tabela S1) . MSNs na shell NAc mostram uma depressão na capacidade de disparo após cocaína crônica que é sustentada por semanas, enquanto MSNs centrais dos mesmos animais exibem um aumento transitório (1-3 dia) na capacidade de disparo que retorna aos níveis basais nas semanas 2 (Kourrich e Thomas, 2009). Além disso, numerosas proteínas sinápticas são reguladas diferencialmente na camada NAc. vs núcleo de animais expostos a cocaína crónica, incluindo GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Como a anfetamina crónica induz CaMKIIα especificamente na concha de NAc (Loweth et al., 2010), não é de surpreender que encontremos um efeito similar com a cocaína. No entanto, como ΔFosB é induzido na casca e no núcleo de NAc pela cocaína crônica (Perrotti e outros, 2008), e uma vez que mostramos que a indução de CaMKIIα na casca é dependente de ΔFosB, nossos achados fornecem novas evidências de mecanismos transcricionais distintos no promotor CaMKIIα entre essas duas sub-regiões, responsáveis ​​pela indução seletiva de CaMKIIα na casca.

Uma grande parte do trabalho recente concentrou-se em delinear as diferenças entre os MSNs NAc do tipo D1 e D2. Embora os receptores D1 e D2 estejam envolvidos nos efeitos recompensadores da cocaína (Self, 2010), Um trabalho recente demonstra que a ativação optogenética de MSNs do tipo D1 aumenta as respostas comportamentais à cocaína, enquanto a ativação MSN do tipo D2 tem o efeito oposto (Lobo et al., 2010). Em consonância com esses achados, camundongos knockout para receptor D1 são deficientes na aquisição de autoadministração de cocaína (Caine et al., 2007), enquanto os nocautes D2 não são (Caine et al., 2002). A administração de agonistas D1 diretamente na NAc desencadeia comportamento de procura de cocaína em paradigmas de reintegração (Self, 2010). Curiosamente, este efeito requer aumentos dependentes do receptor D1 na atividade de CaMKII na camada de NAc, mas não no núcleo (Anderson et al., 2008), um resultado que se encaixa muito bem com a malha ΔFosB-CaMKII específica para D1 e shell aqui proposta.

Relatamos anteriormente que o Ser27 em ΔFosB pode ser fosforilado pela caseína quinase-2 (Ulery et al., 2006), no entanto, nós estabelecemos aqui que CaMKII fosforila ΔFosB neste e em outros locais com cinética e estequiometria muito maiores e pode replicar o maior M aparente._r observado para ΔFosB (Fig 5A) com exposição à cocaína in vivo (Nestler, 2008). Já sabemos que a fosforilação de Ser27 aumenta a estabilidade de ΔFosB e a atividade transcricional (Ulery et al., 2006; Ulery e Nestler, 2007; Ulery-Reynolds e outros, 2009). O trabalho futuro focará agora na identificação e nas conseqüências funcionais de novos sítios de fosforilação ΔFosB indicados pelo presente estudo.

O loop de feed-forward descrito aqui fornece um novo mecanismo plausível pelo qual a administração repetida de cocaína conduz a anormalidades progressivas no NAc. Como tal, este caminho bioquímico pode fornecer um alvo importante para futuras intervenções terapêuticas em transtornos aditivos. Como o CaMKII é onipresente e necessário para muitas funções neuronais e comportamentais basais, o uso direto de inibidores de CaMKII tem sido evitado como um tratamento para dependência. Nossos dados sugerem que o direcionamento mais sutil do mecanismo de indução da CaMKII, que é específico para um tipo de célula individual e sub-região do circuito de recompensa do cérebro, poderia fornecer um alvo terapêutico que evitaria as complicações da inibição sistêmica da CaMKII.

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Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional sobre Drug Abuse (EJN), NIDA-Yale Proteomics Center DA018343 (AJR e EJN), e Hartwell Foundation (AJR). Os autores gostariam de agradecer a Gabby Rundenko pelo generoso presente de ΔFosB e Roger Colbran purificados pelo generoso presente de CaMKIIα purificado.

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