Proc Natl Acad Sci EUA A. 2005 de fevereiro 1; 102(5): 1737-1742.
Sumário
A cocaína, uma droga de abuso, aumenta os níveis de dopamina sináptica no corpo estriado, bloqueando a recaptação de dopamina nos terminais axônicos. A cinase dependente de ciclina 5 (Cdk5) e seu ativador p35, proteínas envolvidas na fosforilação de substratos em neurônios pós-mitóticos, foram regulados positivamente após a exposição crônica à cocaína. Para examinar mais detalhadamente os efeitos da indução de Cdk5 e p35 na sinalização de dopamina do estriado, geramos duas linhas de camundongos transgênicos independentes nas quais Cdk5 ou p35 foram superexpressados especificamente em neurônios. Relatamos aqui que o aumento da atividade de Cdk5, como resultado do p35, mas não da superexpressão de Cdk5, leva à atenuação da sinalização de dopamina mediada por cocaína. A fosforilao mediada por Cdk5 aumentada de dopamina e fosfoprotea regulada por cAMP, massa molecular 32 kDa (DARPP-32) em Thr-75, foi acompanhada por fosforilao diminua de DARPP-32 em Thr-34. A fosforilao aumentada mediada por Cdk5 da quinase cinase 1 regulada por sinal extracelular em Thr-286 foi acompanhada por uma activao diminua da quinase 1 / 2 regulada por sinal extracelular. Estes efeitos contribuíram para a atenuação da fosforilação induzida pela cocaína da proteína de ligação ao elemento de resposta cAMP, bem como uma menor indução de c-fos no estriado. Estes resultados suportam a ideia de que a atividade Cdk5 está envolvida na expressão de genes alterados após a exposição crônica à cocaína e, portanto, afeta as mudanças de longa duração na função neuronal subjacente à dependência de cocaína.
A cocaína aumenta os níveis de dopamina sináptica no corpo estriado e altera a expressão gênica nos neurônios dopaminoceptivos, ativando as vias intracelulares que propagam o sinal inicial do receptor dopaminérgico D1 para o núcleo (1). A exposição crônica à cocaína regula de forma positiva vários fatores de transcrição, resultando em mudanças duradouras na expressão gênica que supostamente são subjacentes às adaptações neuronais da dependência de cocaína (2). ΔFosB, identificado como tal fator de transcrição (3), demonstrou aumentar a capacidade de resposta comportamental dos animais à cocaína (4, 5). Portanto, espera-se que a identificação dos genes alvo que são regulados pela indução de ΔFosB contribua para uma maior compreensão do mecanismo molecular subjacente à dependência de cocaína. Recentemente, o tratamento crônico de animais com cocaína mostrou regular positivamente a expressão de quinase dependente de ciclina 5 (Cdk5) e seu ativador p35 no estriado através da indução de ΔFosB (6, 7).
Cdk5 é um membro da família Cdk de serina / treonina quinases. Ao contrário de outros Cdks que são os principais reguladores da progressão do ciclo celular, o Cdk5 está envolvido principalmente na fosforilação de substratos em neurônios pós-mitóticos (8). A especificidade neuronal da atividade de Cdk5 é obtida através da associação com seus ativadores, p35 ou p39, que são predominantemente expressos em neurônios pós-mitóticos (8). Além do papel essencial do Cdk5 no desenvolvimento do cérebro (9, 10), it também foi implicado na transmissão dopaminérgica no cérebro pós-natal (11, 12). A inibição da atividade de Cdk5 resulta no aumento da liberação de dopamina no estriado, indicando uma função pré-sináptica de Cdk5 como um regulador negativo da liberação de dopamina (11). Além disso, o Cdk5 modula a eficácia da sinalização pós-sináptica da dopamina por fosforilação da fosfoproteína regulada pela dopamina e AMPc, massa molecular 32 kDa (DARPP-32) em Thr-75, que converte DARPP-32 num inibidor da quinase dependente de AMPc (PKA) (12).
Essas observações sugerem que Cdk5 e p35 são reguladores a jusante da ativação prolongada da sinalização da dopamina após exposição crônica à cocaína e, portanto, à dependência de cocaína. Para abordar ainda mais o papel do Cdk5 na sinalização de dopamina do estriado, geramos duas linhagens de camundongos transgênicos em que o Cdk5 ou p35 foi superexpresso especificamente em neurônios sob o controle do promotor p35. Nossos achados indicaram que a atividade de Cdk5 foi regulada positivamente com níveis aumentados de proteína p35, mas não de proteína Cdk5, sugerindo que o nível de proteína p35 é limitante da atividade de Cdk5. Nós fornecemos aqui in vivo evidência de que a atividade aumentada de Cdk5, como resultado da superexpressão de p35, leva à atenuação da sinalização de dopamina mediada por cocaína para o núcleo através de uma inibição da PKA e das cascatas de quinase reguladas por sinais extracelulares (ERK).
Materiais e Métodos
Anticorpos Anticorpos policlonais para Cdk5 (C-8) e p35 (C-19) foram adquiridos à Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos dependentes da fosforilao e independentes da ERK quinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 e protea de ligao ao elemento de resposta cAMP (CREB) foram obtidos da Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Os anticorpos para phospho-Thr-34 DARPP 32 (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), total DARPP-32 (12) e c-fos (14) foram utilizados como descrito. Um anticorpo para actina foi adquirido da Sigma.
Animais Experimentais. Nós clonamos anteriormente o gene p35 do mouse Cdk5r1, que codifica a proteína p35, e caracterizou sua estrutura genômica (15). Para gerar o camundongo transgênico com superexpressão neuronal de p35 (Tgp35), o 6-kb EcoRI-EcoO fragmento RI contendo a regi promotora 1.2-kb foi subclonado num plasmeo pGEM9Z (-) e foi inserido um marcador 45-bp derivado de SV40 no KpnEu site a jusante do poli (A+) sinal (FIG. 1A). A tag continha um SpeEu local para genotipagem dos animais. O fragmento 6-kb foi excisado do plasmídeo e purificado, seguido por injecção pronuclear do transgene para gerar os ratinhos transgénicos. Examinar o perfil de expressão do transgene sob o controle regulador do promotor 1.2-kb p35 in vivo, um camundongo transgênico duplo (Tgp35; p35 - / -) foi gerado adicionalmente usando uma estratégia de melhoramento em duas etapas pela qual o camundongo Tgp35 foi regenerado em um fundo nulo p35 endógeno. Os outros modelos de mouse usados neste estudo incluíram p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/– e um mouse transgênico com superexpressão neuronal de Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Os genótipos desses camundongos foram determinados através da realização de análise Southern blot ou PCR no DNA genômico isolado das biópsias da cauda. Os ratinhos foram alojados sob um ciclo escuro de luz 12-h / 12-h. Todos os cuidados foram dados em conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health sobre o cuidado e uso de animais de laboratório e experimentais.
Análise Southern Blot. O DNA genômico extraído das biópsias da cauda foi digerido com EcoRI e SpeI, eletroforese em gel de agarose 0.9%, e transferido para uma membrana de nylon. A membrana foi hibridizada com um iniciador aleatório 32Sonda marcada com P a 42 durante a noite. A sonda 485-bp para genotipagem de camundongos knockout p35 (p35 - / -) e Tgp35 foi gerada por PCR usando os seguintes primers: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 ′ e 5′-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3 ′. A membrana hibridizada foi lavada duas vezes em 2 × SSC / 0.1% SDS a 42 ° C para 10 min e duas vezes em 0.1 × SSC / 0.1% SDS a 65 ° C para 20 min e exposta a filme de raios X.
Tratamento de drogas. A cocaína (Sigma) foi dissolvida em solução salina estéril. Os animais foram injetados ip com cocaína (15 mg / kg) ou um volume igual de solução salina com a idade de 3 meses e mortos por decapitação em diferentes momentos (15, 30, 60 e 120 min) após a injeção. Cérebros foram rapidamente removidos e refrigerados em PBS gelado. Os estriados foram então dissecados e submetidos a análises de Northern ou Western blot. Para análise imuno-histoquímica, foram obtidos cortes estriados de camundongos 2 h após a injeção.
Análise de Northern Blot. O RNA total foi extraído dos estriados com o reagente TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) e submetido à análise de Northern blot como descrito (18). Para a detecção do ARNm de c-fos, utilizou-se um fragmento 189-pb de cDNA c-fos de ratinho como sonda como descrito (19). Os níveis de c-fos mRNA foram quantificados medindo-se a densidade óptica da banda específica usando um sistema de análise de imagem com o software de imagem nih, versão 1.62.
Análise de Western Blot. Os tecidos estriados foram sonicados em 1% SDS e fervidos por 10 min. A concentração de proteína em cada amostra foi determinada por ensaio de proteína BCA (Pierce). Quantidades iguais de proteína foram separadas por SDS / PAGE antes de serem transferidas para uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas em 1 × PBS contendo 5% de leite desnatado e 0.05% Tween 20 e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. A incubação com anti-murganho conjugado com peroxidase ou IgG de coelho (Sigma) foi realizada à temperatura ambiente durante 60 min. Um sinal foi detectado por quimiluminescência melhorada (Pierce), e as densidades ópticas das bandas foram quantificadas como descrito acima.
Cdk5 Kinase Assay. Os lisados estriados foram preparados com um tampão de lise constituído por 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fluoreto fenilmetilsulfonil / 1 μg / ml aprotinina / 1 μg / ml de inibidores de leupeptina / fosfatase (mistura inibidora da fosfatase I e II, Sigma). Os lisados foram imunoprecipitados com anticorpos anti-Cdk5 (C-8) ou anti-p35 (C-19). Os imunoprecipitados Cdk5 foram preparados por incubação de 300 μl do lisado (correspondente a 300 μg de proteína) com anticorpo anti-Cdk5 (3 μg) durante a noite a 4 ° C, seguida de posterior incubação com 25 μl de esferas de proteína A-agarose (50 % de suspensão no tampão de lise; Santa Cruz Biotechnology) para 3 h a 4 ° C. Para a preparação de imunoprecipitados p35, 500 μl do lisado (correspondente a 1 mg de proteína) foi incubado com o anticorpo anti-p35 (3 μg) como descrito acima. Os imunoprecipitados foram lavados duas vezes com o tamp de lise e duas vezes com um tamp de cinase consistindo em 50 mM Tris.HCl, pH 7.4 / 5 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 EGTA / 1 mM DTT, ressuspenso em 60 μl do tampão quinase. A actividade da quinase foi medida utilizando histona H1 como substrato (18).
Imunohistoquímica. Os ratinhos foram anestesiados por injec�es ip de avertina (250 mg / kg, Fluka) e perfundidos transcardialmente com tamp� fosfato de s�io 0.1 M, pH 7.4, seguido de Fixador Stre Teck (Streck Laboratories, La Vista, NE), um fixador n� reticulante. Os cérebros dissecados foram ainda fixados no mesmo fixador durante a noite a 37 ° C. Em seguida, os cérebros foram embebidos em parafina, cortados em cortes coronais com 5-μm de espessura e submetidos à imuno-histoquímica pela técnica do complexo avidina-biotina-peroxidase (Vector Laboratories) com diaminobenzidina como substrato. As secções foram incubadas com um anticorpo policlonal purificado por afinidade contra c-fos durante a noite a 4 ° C. A especificidade de coloração foi avaliada por omissão do anticorpo primário.
Consistentes
Geração de ratos transgênicos com superexpressão neuronal de p35. O transgene utilizado para obter expressão neuronal aumentada de p35 compreendeu o fragmento 6-kb do gene p35 de ratinho clonado contendo o promotor 1.2-kb e a sequência de codificação completa de p35 (FIG. 1 A). Os genótipos de camundongos foram determinados por análise de Southern blot usando uma sonda que foi projetada para distinguir camundongos p35 - / - e Tgp35 de camundongos selvagens (FIG. 1 A e B). Para examinar a express transgica sob o controlo do promotor 1.2-kb p35, geramos murganhos transgicos duplos (Tgp35; p35 - / -) em que a express de p35 foi conduzida apenas a partir do transgene. A expressão p35 em camundongos Tgp35; p35 - / - foi observada apenas no cérebro (FIG. 1C), onde o padrão de expressão espacial foi semelhante ao dos camundongos do tipo selvagem (FIG. 1D). A falta de p35 mostrou resultar em estruturas anormais de camadas no córtex cerebral e no hipocampo de camundongos (10). No entanto, os camundongos Tgp35; p35 - / - mostraram um completo resgate do fenótipo cerebral p35 - / - (FIG. 1E). Estes dados indicaram que o promotor 1.2-kb p35 controlou a expressão do transgene com um perfil de expressão semelhante ao do p35 do gene p35 endógeno.
O nível de proteína p35 é limitador de taxa para o Up-Regulation da atividade Cdk5. Examinamos os efeitos de dosagem gênica dos genes que codificam p35 e Cdk5 na expressão proteica em extratos estriados de camundongos p35 - / -, p35 +/–, tipo selvagem, Tgp35, Cdk5 +/– e TgCdk5 na idade de 3 meses. Os níveis de proteína p35 e Cdk5 correlacionaram-se bem com as dosagens gênicas, respectivamente (FIG. 2 A e B). Camundongos Tgp35 mostraram um aumento de ≈1.6 vezes no nível da proteína p35 em comparação com camundongos do tipo selvagem, enquanto os níveis de proteína Cdk5 não foram afetados pelos diferentes níveis de proteína p35. Camundongos TgCdk5 mostraram um aumento de 1.9 vezes no nível de proteína Cdk5 em comparação com camundongos selvagens, enquanto os níveis de proteína p35 não foram afetados pelos diferentes níveis de proteína Cdk5. Para examinar os efeitos de diferentes quantidades de proteína p35 na atividade Cdk5, Cdk5 foi imunoprecipitado a partir de extratos estriados com anticorpo anti-Cdk5 e a atividade quinase foi medida. Do mesmo modo, para examinar os efeitos de diferentes quantidades de proteína Cdk5 sobre a atividade quinase, o p35 foi imunoprecipitado a partir de extratos estriados com o anticorpo anti-p35, e a atividade quinase foi medida. A actividade Cdk5 correlacionou-se bem com o nível da proteína p35, mas não com o nível da proteína Cdk5 (FIG. 2 C e D). Estes resultados indicaram que a quantidade de proteína p35 é um fator limitante da atividade de Cdk5. Portanto, usamos camundongos Tgp35 para investigar os efeitos do aumento da atividade de Cdk5 na sinalização de dopamina do estriado.
A fosforilação induzida pela cocaína de DARPP-32 em Thr-34 é atenuada em ratos Tgp35. A função de DARPP-32 depende do seu estado de fosforilação em múltiplos locais (20). A PKA fosforila DARPP-32 em Thr-34, enquanto Cdk5 fosforila DARPP-32 em Thr-75. Assim, nós examinamos o estado de fosforilação de DARPP-32 em extratos estriados de camundongos selvagens e Tgp35. O nível de fosfo-Thr-75 DARPP-32 foi maior nos camundongos Tgp35 (FIG. 3A; 1.6 ± 0.2 vezes acima do valor de ratos do tipo selvagem). Em seguida, avaliamos os efeitos do aumento da atividade de Cdk5 na sinalização de dopamina do estriado. Examinamos a ativação de PKA induzida por cocaína em camundongos Tgp35 analisando o estado de fosforilação de DARPP-32 em Thr-34. O nível de fosfo-Thr-34 DARPP-32 foi aumentado em camundongos do tipo selvagem 15 min após a injeção de cocaína (FIG. 3B; 1.8 ± 0.2 dobrar acima do nível basal). No entanto, o efeito da cocaína na fosforilação de DARPP-34 Thr-32 foi atenuado em camundongos Tgp35 (1.2 ± 0.3 vezes acima do nível basal). Estes resultados indicaram que um aumento na atividade de Cdk5 atenuou a ativação de PKA induzida por cocaína, provavelmente através da fosforilação de DARPP-32 em Thr-75 (6, 12). Também é possível que um aumento na atividade pré-sináptica de Cdk5 leve à diminuição da liberação de dopamina, e que isso contribua para o efeito reduzido da cocaína. Notavelmente, uma única injeção de cocaína não afetou os níveis de proteína p35 e Cdk5, bem como a atividade quinase (FIG. 3 C e D). Isto está em contraste com um estudo anterior em que a exposição crônica à cocaína mostrou regular positivamente a expressão de p35 e Cdk5 (6).
Up-Regulation da atividade Cdk5 atenua a ativação induzida por cocaína de ERK1 / 2. Evidências recentes indicam que a ativação do receptor de dopamina no estriado também ativa outras cascatas de sinalização, incluindo a via ERK (21, 22), que tem um papel importante na resposta comportamental à cocaína (23). Portanto, examinamos se a atividade de Cdk5 pode afetar a ativação induzida por cocaína da via ERK. A ativação da via ERK foi observada após a injeção de cocaína em extratos estriados de camundongos selvagens, como evidenciado pelo aumento da fosforilação de MEK1 / 2 em Ser-217 e Ser-221 (1.5 ± 0.2 vezes acima do nível basal) e de ERK1 / 2 em Thr-202 e Tyr-204 (fosforilação de ERK2: 1.5 ± 0.2 vezes acima do nível basal) (FIG. 4 A e B). No entanto, a ativação induzida por cocaína de MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2 vezes acima do nível basal) e de ERK1 / 2 (fosforilação de ERK2: 1.2 ± 0.2 vezes acima do nível basal) foi atenuada em camundongos Tgp35 (FIG. 4 A e B). Além disso, os níveis basais de fosfo-ERK1 / 2 foram menores em camundongos Tgp35 (0.8 ± 0.2 vezes abaixo do valor de camundongos do tipo selvagem), enquanto esta tendência não foi estatisticamente significativa. Este último resultado pode ser atribuído à fosforilação dependente de Cdk5 de MEK1 em Thr-286, resultando em uma diminuição da atividade catalítica (24). Para avaliar essa possibilidade, examinamos o estado de fosforilação de MEK1 em Thr-286 e descobrimos que níveis mais altos de fosfo-Thr-286 MEK1 estavam presentes em extratos estriados de camundongos Tgp35 (FIG. 4C; 1.3 ± 0.1 vezes acima do valor de ratos do tipo selvagem). Além disso, o estado de fosforilação de MEK1 em Thr-286 não foi alterado por uma única injeção de cocaína, consistente com a descoberta de que a atividade de Cdk5 não foi afetada pelo tratamento (FIG. 3D).
Propagação da sinalização de dopamina para o núcleo é atenuada pelo aumento da atividade de Cdk5. A ativação induzida pela cocaína de múltiplas cascatas de sinalização envolvendo PKA e ERK leva à subsequente ativação do fator de transcrição CREB no núcleo através de sua fosforilação em Ser-133 (22, 25). Para investigar se os efeitos inibitórios mediados por Cdk5 em cascatas de ativação de PKA e ERK podem convergir na fosforilação de CREB no núcleo, examinamos o estado de fosforilação de CREB em Ser-133 em extratos estriados de camundongos selvagens e Tgp35. O nível basal de fosfo-CREB foi menor em camundongos Tgp35 (0.7 ± 0.1 vezes o valor de camundongos selvagens) (FIG. 5). Em resposta à injeção de cocaína, o nível de fosfo-CREB foi aumentado no estriado de camundongos do tipo selvagem (1.5 ± 0.1 vezes acima do nível basal), mas esta resposta à cocaína foi atenuada em camundongos Tgp35 (1.2 ± 0.1- dobrar acima do nível basal) (FIG. 5).
A fosforilação de CREB em Ser-133 aumenta sua atividade transcricional por meio de um elemento de resposta a cAMP na região promotora de certos genes, incluindo o gene c-fos (26). Portanto, examinamos a indução de c-fos no estriado de camundongos selvagens e Tgp35 após a injeção de cocaína. Em camundongos do tipo selvagem, o nível de c-fos mRNA aumentou para um valor de pico (1.8 ± 0.2 vezes acima do nível basal) 30 min após a injeção de cocaína, e subseqüentemente retornou ao nível basal por 120 min após a injeção (FIG. 6 A e B). No entanto, os níveis de c-fos mRNA foram ≈30% menores em camundongos Tgp35 do que em camundongos selvagens até 30 min após a injeção (FIG. 6 A e B). A menor indução de c-fos em camundongos Tgp35 foi ainda corroborada pela imunohistoquímica (FIG. 6 C-F). A administração de cocaína aumentou a imunorreatividade de c-fos, fortemente nas partes dorso-dorsocentrais do estriado e fracamente nas partes laterais, tanto no camundongo selvagem quanto no Tgp35. Entretanto, o aumento do número de células imunopositivas c-fos induzidas pela cocaína foi notavelmente atenuado no estriado de camundongos Tgp35 (FIG. 6G). Em conjunto, estes resultados indicaram que o aumento mediado pela cocaína da sinalização da dopamina do estriado no núcleo foi inibido em ratinhos Tgp35, um resultado provável do aumento da atividade da Cdk5.
Discussão
Cdk5 e seu ativador p35 foram identificados como genes alvo que são regulados positivamente pela exposição crônica à cocaína (6). Relatamos aqui evidências de que o aumento da atividade de Cdk5, como resultado da regulação positiva de p35, em vez da supra-regulação de Cdk5, leva à atenuação da sinalização de dopamina mediada por cocaína em neurônios do estriado. Para examinar as consequcias da express regulada positivamente de Cdk5 ou p35 na sinalizao da dopamina no estriado, analisaram-se duas linhas de ratinho transgicas, os ratinhos TgCdk5 e Tgp35. Descobrimos que a atividade de Cdk5 foi regulada positivamente em proporção ao aumento do nível de proteína p35, mas não foi afetada por um aumento do nível de proteína Cdk5. Nosso relatório anterior também demonstrou que a atividade de Cdk5 no cérebro de camundongos TgCdk5 foi menor do que no cérebro de camundongo selvagem quando a atividade foi medida usando imunoprecipitados Cdk5 (17), sugerindo que a superexpressão de Cdk5 resulta em um aumento no nível de Cdk5 monomérico se o nível de p35 não estiver aumentado. Estes resultados indicaram que o nível de proteína p35 é um fator limitante da atividade de Cdk5.
Camundongos Tgp35 exibiram uma menor indução da fosforilação de CREB e c-fos no estriado após injeção aguda de cocaína, sugerindo que a resposta estriatal à cocaína foi inibida pelo aumento da atividade de Cdk5. A atenuação da sinalização de dopamina mediada por cocaína em camundongos Tgp35 foi provavelmente alcançada através da inibição mediada por Cdk5 de múltiplas cascatas de sinalização envolvendo DARPP-32, PKA e ERK. A administração de cocaína aumentou a fosforilação de PKA de DARPP-32 em Thr-34 em camundongos selvagens, enquanto esta resposta foi atenuada em camundongos Tgp35. Foi demonstrado que a fosforilação da PKA de DARPP-32 em Thr-34 inibe a atividade da proteína fosfatase 1 (PP1), a enzima responsável pela desfosforilação de Ser-133 de CREB (27). Assim, a actividade de PP1 não seria antagonizada através da via DARPP-32 / PP1 em ratinhos Tgp35.
A ativação induzida pela cocaína de ERK1 / 2 também foi atenuada em camundongos Tgp35. Existem vários mecanismos distintos pelos quais o Cdk5 pode inibir a ativação induzida pela cocaína de ERK1 / 2. Primeiro, a fosforilação de DARPP-5 dependente de Cdk32 em Thr-75 pode inibir a PKA, levando à inibição subsequente de qualquer ativação de MEK1 / 2 mediada por PKA que é necessária para a ativação de ERK1 / 2. Um estudo recente também descobriu que a fosforilação de DARPP-32 em Thr-34 é necessária para a ativação mediada por cocaína de ERK1 / 2 por múltiplas vias envolvendo regulação indireta da ativação de MEK, bem como envolvendo a regulação da fosfatase enriquecida no estriado, uma tirosina fosfatase que atua diretamente no ERK1 / 2 (28). O suporte para essa possibilidade é sugerido pela descoberta de que a fosforilação induzida pela cocaína de MEK1 / 2 em Ser-217 e Ser-221 foi abolida em camundongos Tgp35. Outra via provável é a fosforilação de MEK5 dependente de Cdk1 em Thr-286, o que resultaria em uma diminuição de sua atividade catalítica e levaria à inibição da atividade de ERK1 / 2 (24).
A inibição da atividade de Cdk5 no corpo estriado tem demonstrado potencializar os efeitos comportamentais do tratamento crônico de cocaína em animais (6). Consistente com a hipótese de que a supra-regulação da atividade de Cdk5 pode contribuir para a adaptação neuronal para neutralizar os efeitos da administração repetida de cocaína (6), descobrimos que a fosforilação de DARPP-5 e MEK32 mediada por Cdk1 contribuiu para a atenuação da ativação induzida por cocaína de ERK1 / 2, resultando na menor indução da fosforilação de CREB e c-fos no estriado. Nossos achados suportam a ideia de que o aumento da atividade da Cdk5, como resultado da regulação positiva do p35, pode alterar a expressão gênica no estriado após a exposição crônica à cocaína. Isso pode ocorrer por meio de mudanças nas atividades dos fatores de transcrição, como CREB e c-fos. Assim, o ativador Cdk5 p35, em virtude de seus efeitos limitadores de taxa sobre a atividade de Cdk5, pode contribuir para mudanças duradouras na função neuronal subjacente à dependência de cocaína.
Agradecimentos
Agradecemos ao Drs. Mary Jo Danton, Philip Grant e Sashi Kesavapany pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde Grant Z01DE00664-05 (para ABK), EUA Public Health Grant Grant DA10044, e subvenções da Fundação Simons, a Fundação Peter J. Sharp, e da Fundação Picower (para PG).
Notas
Abreviaturas: Cdk5, quinase dependente de ciclina 5; ERK, quinase regulada por sinal extracelular; DARPP-32, dopamina e fosfoproteína regulada por cAMP, massa molecular 32 kDa; PKA, quinase dependente de cAMP; MEK, ERK quinase; CREB, protea de ligao ao elemento de resposta cAMP.
Referências