PLoS One. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
fonte
Laboratório de Fisiologia Comportamental, Escola de Pós-Graduação em Ciências da Saúde Humana, Universidade Metropolitana de Tóquio, Tóquio, Japão.
Sumário
O exercício físico melhora múltiplos aspectos da função hipocampal. Em consonância com a noção de que a atividade neuronal é a chave para promover as funções neuronais, a literatura anterior demonstrou consistentemente que exercícios agudos de exercício evocam a ativação neuronal no hipocampo. Estímulos de ativação repetidos levam ao acúmulo do fator de transcrição ΔFosB, que medeia a plasticidade neural a longo prazo.
Neste estudo, nós testamos a hipótese de que a corrida voluntária de roda a longo prazo induz a expressão de ΔFosB no hipocampo, e examinou quaisquer potenciais efeitos específicos da região dentro dos subcampos do hipocampo ao longo do eixo dorso-ventral. Os ratinhos C57BL / 6 machos foram alojados com ou sem uma roda de corrida durante 4 semanas. Corrida de longa duração na roda aumentou significativamente a imunorreatividade de FosB / ΔFosB em todas as regiões do hipocampo medidas (isto é, nos subcampos DG, CA1 e CA3 do hipocampo dorsal e ventral). Os resultados confirmaram que a corrida em roda induziu a expressão específica de região da imunorreatividade de FosB / ΔFosB no córtex, sugerindo que o aumento uniforme em FosB / ΔFosB dentro do hipocampo não é uma conseqüência não específica da corrida. Os dados de Western blot indicaram que o aumento da imunorreatividade do FosB / ΔFosB do hipocampo foi principalmente devido ao aumento de ΔFosB. Estes resultados sugerem que o exercício físico a longo prazo é um potente gatilho para a indução de ΔFosB em todo o hipocampo, o que explicaria por que o exercício pode melhorar as funções dorsal e ventral dependentes do hipocampo. Curiosamente, descobrimos que a expressão de FosB / ΔFosB no GD foi positivamente correlacionada com o número de neurônios imunorreativos à duplacortina (ou seja, imaturos).
Embora os mecanismos pelos quais ΔFosB mede a neurogênese induzida pelo exercício ainda sejam incertos, esses dados implicam que a neurogênese induzida pelo exercício é pelo menos dependente da atividade. Em conjunto, nossos resultados atuais sugerem que ΔFosB é um novo alvo molecular envolvido na regulação da plasticidade do hipocampo induzida pelo exercício.
Introdução
Exercício confere diversos benefícios em aspectos moleculares, estruturais e funcionais do hipocampo em roedores1,2], alguns dos quais foram apoiados por estudos humanos [3,4]. No entanto, os mecanismos subjacentes às mudanças induzidas pelo exercício na plasticidade do hipocampo não são suficientemente compreendidos. A literatura anterior demonstrou consistentemente que o exercício evoca a ativação neuronal do hipocampo em roedores. Estudos imuno-histoquímicos utilizando c-Fos, um marcador de ativação neuronal transitória, demonstraram que tanto a corrida forçada quanto a voluntária aumentaram a expressão de c-Fos nos subcampos do hipocampo de roedores dentados (DG), CA1 e CA3 [5-7]. Além disso, um estudo anterior usando a fluxometria laser-Doppler (LDF) demonstrou que a corrida leve em esteira aumentou o fluxo sanguíneo cerebral regional (rCBF), um marcador alternativo de ativação neuronal, no subcampo CA1 em ratos [8]. Estudos imuno-histoquímicos permitem análises detalhadas específicas da região após o término do exercício, enquanto o LDF permite o monitoramento em tempo real da rCBF em uma área localizada durante o exercício. Apesar das vantagens e limitações de cada estudo, esses estudos demonstraram de forma semelhante um efeito de crises agudas de exercício na atividade neuronal do hipocampo. Estes resultados sugerem um mecanismo pelo qual o exercício regular a longo prazo promove a plasticidade do hipocampo ao desencadear repetidamente a ativação neuronal [9].
O fator de transcrição ΔFosB, uma isoforma de splits truncada de FosB de comprimento total, é induzido por vários tipos de estímulos repetidos em regiões específicas do cérebro, onde gradualmente se acumula devido à sua estabilidade única (meia-vida de semanas) [10-12]. Um crescente corpo de evidências demonstra que o aumento dos níveis de ΔFosB medeia a plasticidade neural e comportamental de longa duração associada a estímulos específicos [11,13]. Por exemplo, a administração crônica de drogas de abuso, como cocaína e morfina, comumente aumenta a expressão de ΔFosB no nucleus accumbens, representando um dos mecanismos moleculares subjacentes ao aumento da sensibilidade a essas drogas. [11,14,15]. Ssemelhante a outros estímulos de recompensa, incluindo dieta rica em gordura e experiência sexual [16,17], euO funcionamento voluntário da roda em on-term também aumentou a imunorreatividade de FosB / ΔFosB no núcleo accumbens de ratos, sugerindo que a corrida voluntária é uma recompensa natural para roedores [18,19]. No entanto, até onde sabemos, nenhuma literatura examinou se a exposição repetida ao exercício físico induz a expressão de ΔFosB no hipocampo. Como o exercício desencadeia a ativação neuronal no hipocampo, supomos que a corrida voluntária a longo prazo também induziria a expressão de ΔFosB no hipocampo. Enquanto os mecanismos exatos pelos quais ΔFosB regula a plasticidade do hipocampo permanecem incertos, estudos demonstraram que camundongos sem a fosB o gene mostra uma neurogênese hipocampal comprometida e um comportamento semelhante à depressão [20,21]. EuAlém disso, o exercício é conhecido por melhorar a neurogênese e ter propriedades antidepressivas [22-25]. EuSe nossa hipótese estiver correta, ΔFosB seria um novo alvo molecular potencial mediador da plasticidade do hipocampo induzida pelo exercício.
O hipocampo possui gradiente anatômico e funcional ao longo de seu eixo longitudinal (dorso-ventral) [26]. O hipocampo dorsal desempenha um papel fundamental na aprendizagem espacial e na memória [27,28], enquanto o hipocampo ventral está preferencialmente envolvido na regulação de comportamentos emocionais [29,30]. Além disso, estudos demonstraram que estímulos fisiológicos induzem diferentes padrões de expressão de c-Fos nas porções dorsal e ventral do hipocampo [31-33]. Porque o exercício melhora tanto dorsal [34-37] e funções dependentes do hipocampo ventral [24,25,38], é importante examinar se a corrida voluntária de longo prazo causa a expressão específica da região de ΔFosB no hipocampo.
A hipótese primária deste estudo foi que a corrida voluntária a longo prazo induzia a expressão de ΔFosB no hipocampo do camundongo. Esta hipótese foi investigada pela imuno-histoquímica FosB / ΔFosB nos subcampos do hipocampo dorsal e ventral, DG, CA1 e CA3, com ênfase extra na identificação da indução específica da região. Os resultados foram confirmados por western blotting, que foi usado para identificar a isoforma fosB produtos gênicos induzidos no hipocampo. Nós também examinamos o córtex quanto à indução de FosB / ΔFosB específica da região para descartar a possibilidade de que o exercício a longo prazo aumentasse não especificamente a imunorreatividade de FosB / ΔFosB no cérebro. Finalmente, a associação correlativa entre a expressão de FosB / ΔFosB e a neurogênese foi investigada como o primeiro passo na busca das implicações funcionais da indução de ΔFosB induzida pelo exercício na regulação da plasticidade do hipocampo.
Materiais e Métodos
1: Declaração de animais e ética
Vinte ratinhos C57BL / 6 machos (8 semanas de idade) foram adquiridos de um criador comercial (SLC, Shizuoka, Japão). Dez ratos foram usados para o Experimento 1 e os outros dez para o Experimento 2. Os camundongos foram alojados em condições controladas de temperatura (22-24 ° C) e luz (12 / 12-h ciclo claro / escuro, luz acesa em 0500), e foram fornecidos alimentos e água ad libitum. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal Experimental da Universidade Metropolitana de Tóquio.
Em cada expericia, ap chegada, os ratinhos foram aleatoriamente designados para um grupo de controlo (Controlo, n = 5) ou um grupo de corrida (Runner, n = 5). Durante a primeira semana, todos os ratos foram alojados em gaiolas de plástico padrão em grupos (5 ratinhos / gaiola) para aclimatação inicial. Em seguida, os camundongos Runner foram transferidos para uma gaiola equipada com uma roda de corrida (ENV-046, Med Associate Inc., Geórgia, VT, EUA). Porque o isolamento social é conhecido por suprimir a neurogênese induzida pelo exercício no hipocampo [39Os ratinhos Runner foram alojados como um grupo (ratinhos 5 / gaiola) durante mais semanas 4. O número de rotações das rodas foi registado todas as manhãs e o peso corporal (g) foi medido semanalmente.
2: experiência 1. Exame imuno-histoquímico da expressão de FosB / ΔFosB e neurogênese do hipocampo
2.1: Perfusão e processamento de tecidos
Na manhã seguinte (0900-1100), após o último dia do período de execução, os camundongos foram anestesiados com pentobarbital sódico e transcardially perfundidos com solução salina fria. O cérebro foi rapidamente removido e pós-fixado em 4% paraformaldeído em solução salina tamponada com fosfato 0.1 M (PBS, pH 7.4) durante a noite. O cérebro foi então crioprotegido em 30% de sacarose em PBS e congelado até processamento posterior. Cortes cerebrais coronais (40 μm) de um hemisfério foram obtidos usando um micrótomo de congelamento e coletados em PBS com 0.01% de azida sódica.
2.2: Imuno-histoquímica
Uma série de seções em um-em-seis foi selecionada aleatoriamente para imunomarcação de FosB / ΔFosB. Uma série adjacente foi usada para marcação de duplocortina (DCX), um marcador de neurônios imaturos validados para avaliar a neurogênese [40,41]. Após extinguir a atividade da peroxidase endógena com 1% H2O2 em PBS, secções de flutuação livre foram pré-incubadas com solução de bloqueio contendo 10% de soro de cavalo normal em PBS para 2 h. Após lavagens em PBS, secções foram incubadas com anticorpo pan-FosB policlonal de coelho (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotecnologia, Dallas, TX, EUA) diluído em PBS com 0.5% Triton X-100 e 0.5% BSA (PBST -BSA) para 24 h a 4 ° C. Outra sie de seces foi incubada com anticorpo anti-DCX policlonal de cabra (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) em PBST-BSA para 48 h a 4. As secções foram ainda incubadas com um anticorpo secundário biotinilado apropriado (IgG anti-coelho, 1: 1000, AP182B; IgG anti-cabra, 1: 1000, AP180B, ambos os anticorpos de EMD Millipore, Billerica, MA, EUA) em PBST-BSA para 2 h à temperatura ambiente. As secções foram então tratadas com complexo avidina-biotina-peroxidase (kit Vectastain ABC peroxidase, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, EUA) para 90 min seguindo as instruções do fabricante. Os antígenos foram finalmente visualizados com 0.02% 3,3-diaminobenzidina (DAB) em 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) contendo 0.01% H2O2. Para a imunoexpressão de FosB / ΔFosB, a reação foi intensificada com sulfato de amônio e níquel. Para a coloração DCX, os núcleos das células foram contrastados com coloração com Nissl. As secções foram montadas em lâminas revestidas com gelatina e foram colocadas lamelas.
2.3: Quantificação da imunorreatividade de FosB / ΔFosB usando o limiar de imagem
O anticorpo pan-FosB utilizado neste estudo foi gerado contra uma regi interna partilhada por FosB e a regi N-terminal de? FosB, de modo que n pode discriminar entre as duas isoformas. Portanto, as estruturas imunocoradas foram descritas como núcleos imunorreativos FosB / ΔFosB (FosB / ΔFosB-ir). Para uma quantificação cega imparcial, as lâminas foram codificadas antes da análise. O atlas do cérebro do rato [42] foi utilizado para identificar a localização das seguintes regiões de interesse (ROIs): camada celular granular (GCL) de DG (seções 3), camada celular piramidal de CA1 (seções 3) e CA3 (seções 2-3) no hipocampo dorsal (fechado para -2.2 mm do bregma); DG (secções 2), CA1 (secções 2) e CA3 (secções 2) no hipocampo ventral (fechado a -3.4 mm do bregma) (Figura 4, esquerda). As secções caudais contêm ambas as porções dorsal e ventral do hipocampo, mas a porção ventral foi alvo. No GD, as lâminas suprapiramidais (DGsp) e infrapiramidais (DGip) foram analisadas separadamente. Córtex motor (secções 2-3, fechadas a -0.6 mm do bregma), córtex do tronco somatossensorial (secções 2-3, fechadas a -0.6 mm do bregma), córtex visual (secções 3, fechadas a -2.9 mm a partir do bregma), córtex auditivo (seções 3, fechado a -2.9 mm do bregma) e bulbo olfatório (seções 3, fechadas a + 4.3 mm do bregma) também foram analisadas (Figura 6, esquerda).
Imagens digitais (2070 × 1548 pixels) de cada ROI foram tiradas usando um microscópio óptico (BX-51, Olympus, Tóquio, Japão) equipado com uma câmera CCD (DP-73, Olympus) e software de imagem (cellSens, Olympus). A ampliação objetiva da lente foi 10 × para ROIs do hipocampo e 4 × para ROIs corticais. Para identificar a imunorreatividade de FosB / ΔFosB moderada a forte (Figura 1D-G), usando várias seções antecipadamente, ambas as configurações de aquisição de imagem (intensidade de luz, tamanho da parada de campo, tempo de exposição e equilíbrio de branco) e níveis de limiar para cada um dos componentes RGB foram otimizados para ROIs hipocampais e corticais. A seguinte análise foi então realizada sob as condições otimizadas (1). ROIs foram selecionadas por um polígono de formato irregular (Figura 1A, B) (2). A imagem foi limiarizada, o que converteu os núcleos FosB / ΔFosB-ir a uma cor vermelha (Figura 1C-G) (3). O% ROI foi então calculado automaticamente da seguinte forma:% ROI = (área convertida (em vermelho) / área total de ROI) × 100.
Para validar esta análise de limiarização de imagens, as regiões 20 foram selecionadas aleatoriamente de diferentes áreas do cérebro com diferentes tamanhos de regiões. Além da quantificação da limiarização da imagem, o número de núcleos FosB / ΔFosB-ir dentro das regiões selecionadas foi contado manualmente e a densidade dos núcleos FosB / ΔFosB-ir foi obtida dividindo-se o número de núcleos FosB / ΔFosB-ir pelo área (mm2).
2.4: Quantificação de neurônios imaturos DCX-ir no giro dentado
Os neurônios imaturos de DCX-ir nos camundongos DG de Runner eram abundantes e sobrepostos, tornando difícil contar com precisão o número discreto de soma de DCX-ir usando um microscópio óptico. No entanto, em um estudo anterior, a análise de Sholl para avaliação morfológica mostrou que cada neurônio DCX-ir tem, em média, um único dendrito quando medido dentro de 40 μm do soma [43]. Portanto, a seguinte análise original foi desenvolvida para permitir a quantificação específica da região dos neurônios DCX-ir.
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(1) Uma imagem do GCL foi projetada em um monitor de computador usando software de imagem e uma lente objetiva 40 × (2). Na imagem ao vivo, um segmento de linha (150 ± 0.1 μm) foi desenhado ao longo do meio do GCL (Figura 2) (3). Alterando a profundidade focal, o número de vezes que o segmento de linha cruzou os dendritos DCX-ir foram contados (4). Os ROIs (DGs dorsal, dDGsp; DGip dorsal, dDGip; DGsp ventral, vDGsp; DGip ventral, vDGip) corresponderam às regiões onde a imunorreatividade de FosB / ΔFosB foi analisada (5). Em cada ROI, os segmentos de linha 2 – 3 foram desenhados por seção e o número de cruzamentos foi calculado em média nas seções 2 – 3 por mouse. Como a espessura do GCL é aproximadamente 60 – 80 μm, o número de cruzamentos deve refletir o número de neurônios DCX-ir dentro da região restrita analisada.
Uma imagem representativa de neurônios imaturos DCX-ir e um segmento de linha (150 ± 0.1 μm) sobrepostos para contagem do número de cruzamentos com dendritos DCX-ir.
3. Experiência 2. Identificação da isoforma FosB / ΔFosB induzida por corrida em roda
3.1: Perfusão e processamento de tecidos
Uma coorte adicional de camundongos foi tratada como acima na Experiência 1. Após 4 semanas de intervenção em execução, os ratos foram transcardially perfundidos com solução salina fria sob anestesia profunda. O hipocampo foi rapidamente dissecado e congelado com nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C. Os hipocampos de cada rato foram homogeneizados em tampão RIPA (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% desoxicolato de sódio, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, EUA) contendo protease inibidores (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Alemanha). Os lisados foram centrifugados durante 15 min a 5000 rpm a 4 ° C e os sobrenadantes foram recolhidos. As concentrações de proteína foram medidas com um kit BCA Protein Assay (#23227, Thermo Scientific, IL, EUA).
3.2: Western blotting
Quantidades iguais de proteína (30 μg / lane) foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 10%, depois transferidas para uma membrana de PVDF (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, EUA). A ligao n especica foi bloqueada por princubao da membrana para 1 h em TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20) contendo 3% BSA. A membrana foi incubada com o anticorpo pan-FosB (1: 1000) que foi utilizado acima para imuno-histoquímica, dissolvido em TBST contendo 3% BSA. Após lavagens com TBST, a membrana foi incubada com anticorpo IgG anti-coelho conjugado com HRP (1: 5000 em TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) para 1 h à temperatura ambiente. Após lavagens com TBST, as bandas de proteína foram visualizadas por incubação com Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, EUA) e capturadas usando um Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). A membrana foi então reprovada com o anticorpo anti-gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (#2275, 1: 5000 em TBS-T, Trevigen, MD, EUA) como controlo de carga. A densidade óptica das bandas de proteína foi quantificada usando Image-J e normalizada ao nível de GAPDH.
4: análise estatística
As alterações no peso corporal de ratinho foram analisadas por ANOVA de medidas repetidas de duas vias (grupo x tempo). Um teste t não pareado foi usado para determinar as diferenças estatísticas entre os grupos (Controle vs. Corredor). A análise de correlação de Pearson foi utilizada para validar a análise de imunoreatividade FosB / ΔFosB (contagem manual versus limiar de imagem) e examinar a associação entre o nível de expressão de FosB / ΔFosB e o número de cruzamentos de DCX no GD. Os dados foram apresentados como média ± EPM. O limiar para significância estatística foi estabelecido em P <0.05.
Consistentes
1: Peso corporal e distância de corrida nos Experimentos 1 e 2
As alterações no peso corporal dos camundongos Control e Runner nos Experimentos 1 e 2 são agrupadas e mostradas em Figura 3. A ANOVA de medidas repetidas de duas vias indicou uma interação significativa (grupo × tempo, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) e efeito principal do grupo F(1, 18) = 6.07, P <0.05), indicando um peso corporal significativamente menor em camundongos Runner. A distância percorrida por gaiola é mostrada em tabela 1. Embora a distância exata de corrida de cada camundongo fosse incerta porque os camundongos estavam alojados juntos, a observação regular confirmou que todos os camundongos frequentemente realizavam corrida em roda. Os camundongos Runner no Experimento 2 foram mais longos que os do Experimento 1, mas a distância média de corrida (m / dia / gaiola) foi consistente ao longo de cada experimento.
2: Validação da quantificação da imunorreatividade de FosB / ΔFosB usando o limiar de imagem
Houve correlação significativa entre a área de FosB / ΔFosB-ir obtida por limiarização de imagens e densidade de núcleos FosB / ΔFosB-ir obtidos por contagem manual (r = 0.941, P <00001, Figura 4).
3: imunorreatividade de FosB / ΔFosB no hipocampo
Imagens representativas da imunomarcação de FosB / ΔFosB nos subcampos do hipocampo dorsal e ventral foram mostradas em Figura 5. Em todas as ROIs analisadas, a imunorreatividade de FosB / ΔFosB em camundongos RunnerFigura 5, à direita) foi qualitativamente superior à dos ratinhos de controlo (Figura 5, Centro). Em camundongos Runner, a análise quantitativa indicou um aumento significativo na área de FosB / ΔFosB-ir em ambos os dorsais (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) e os subcampos hipocampais ventrais (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Figura 6).
4: imunorreatividade de FosB / ΔFosB no córtex
Imagens representativas da imunomarcação de FosB / ΔFosB nas ROIs corticais são mostradas Figura 7. A análise quantitativa revelou alterações dependentes da região na imunorreatividade de FosB / ΔFosB em longo prazo (Figura 8). Em camundongos Runner, a área de FosB / ΔFosB-ir foi significativamente maior no córtex motor (P <0.05) e o córtex de barril somatosensorial (P <0.05), mas não no córtex visual (P = 0.662) ou o bolbo olfactivo (P = 0.523). No córtex auditivo, a área de FosB / ΔFosB-ir tendeu para um aumento nos ratos Runner (P = 0.105).
5: Neurogênese
Imagens representativas da imunomarcação DCX são mostradas em Figura 9. No hipocampo dorsal, a imunorreatividade de DCX em camundongos Runner (Figura 9, à direita) foi qualitativamente superior em comparação com os ratos de controlo (Figura 9, esquerda). Em comparao com o hipocampo dorsal, a imunorreactividade da DCX no hipocampo ventral foi mais fraca tanto nos ratinhos Control como Runner. Em camundongos Runner, o número de cruzamentos foi significativamente maior no dDGsp (P <0.01) e dDGip (P <0.01; Figura 10). No hipocampo ventral, o número de cruzamentos em camundongos Runner tendeu a aumentar, mas não houve diferenças significativas entre os grupos (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Figura 10).
6: Correlação entre a expressão de FosB / ΔFosB e neurogênese
Foi realizada uma análise de correlação entre a área de FosB / ΔFosB-ir e o número de cruzamentos de DCX (Figura 11). Como cada conjunto de dados (por exemplo, DGsp dorsal em ratos de controle) consiste em apenas pares 5, a análise foi realizada primeiramente com todos os pares 40. Curiosamente, houve uma correlação significativa entre a área de FosB / ΔFosB-ir e o número de cruzamentos de DCX (r = 0.885, P <0.0001). Além disso, uma correlação significativa também foi identificada quando o GD dorsal (r = 0.762, P <0.05) e o DG ventral (r = 0.816, P <0.01) foram analisados separadamente.
7: Identificação da isoforma FosB / ΔFosB induzida por corridas a longo prazo
Finalmente, para identificar a isoforma de fosB produtos de genes induzidos no hipocampo em resposta a corrida a longo prazo, os hipocampos de uma coorte adicional de camundongos foram submetidos a western blotting usando o mesmo anticorpo pan-FosB. Múltiplas bandas de 35 – 37 kDa, representando as isoformas modificadas de ΔFosB [44], foram significativamente aumentados em camundongos Runner versusFigura 12, P <0.01). Por outro lado, a isoforma FosB de 48 kDa era indetectável em ambos os grupos. Outra banda vagamente visível acima de 25 kDa provavelmente representa a isoforma Δ2ΔFosB (27 kDa). Existiam duas outras bandas, acima de 50 kDa e 37 kDa, que eram mais provavelmente devido à ligação não específica. Quando quantificados, não foram encontradas diferenças nessas bandas não-ΔFosB entre os grupos (dados não mostrados).
Discussão
Em resumo, o presente estudo primeiro realizou uma análise imuno-histoquímica para examinar 1) se o funcionamento voluntário a longo prazo da roda induz a expressão de FosB / ΔFosB no hipocampo; e 2) se existe uma resposta específica da região ao longo do seu eixo dorso-ventral.
Quatro semanas de corrida voluntária em roda induziu um aumento significativo na imunorreatividade de FosB / ΔFosB em todas as regiões do hipocampo analisadas (isto é, os subcampos DG, CA1 e CA3 de ambas as porções dorsal e ventral do hipocampo). Confirmamos que a isoforma 35 – 37kDa ΔFosB foi a principal fosB produto gênico acumulado em resposta à corrida a longo prazo. Estes resultados apoiam claramente a hipótese de que o exercício regular a longo prazo é um potente desencadeador da indução de ΔFosB através do hipocampo, e que a sua indução pode ser um novo mecanismo molecular pelo qual o exercício afeta vários tipos de funções dorsais e / ou ventrais dependentes do hipocampo.
1: Validação e limitações da quantificação da imunorreatividade de FosB / ΔFosB usando o limiar de imagem
Uma técnica de limiarização de imagem, amplamente utilizada em estudos imuno-histoquímicos para contagem do número de células-alvo e para avaliação da morfologia celular, foi adotada neste estudo para quantificação específica da região da imunorreatividade de FosB / ΔFosB [15,45,46]. Foi demonstrada uma correlação significativa entre os níveis de imunorreatividade de FosB / ΔFosB quantificados por limiarização de imagens e por contagem manual (Figura 4) No entanto, como a densidade e a sobreposição impediram a contagem do número de núcleos FosB / ΔFosB-ir em áreas altamente densas, a correlação demonstrada implica apenas na precisão do método de limiar de imagem quando as áreas FosB / ΔFosB-ir representam <~ 40% do ROI total área. Portanto, uma interpretação cuidadosa é necessária para áreas FosB / ΔFosB-ir> 40% da área total de ROI.
Em particular, nos ratinhos DG de Runner (Figura 4), A expressão de FosB / ΔFosB foi bastante induzida pela corrida em roda e a maioria dos núcleos FosB / ΔFosB-ir se sobrepuseram. Nessas áreas, o aumento da indução da expressão de FosB / ΔFosB leva a uma maior subestimação do nível de expressão, independentemente do método de quantificação utilizado (limiar de imagem ou contagem manual). No entanto, apesar do risco de subestimação, é importante notar que o presente estudo demonstrou com sucesso aumentos significativos na área de FosB / ΔFosB-ir nos camundongos DG de Runner. Isso sugere que as limitações metodológicas não comprometem nossos achados. Em vez disso, a potencial subestimação aumenta a confiabilidade do achado de que a longo prazo aumentou a imunorreatividade de FosB / ΔFosB no hipocampo.
2: Indução uniforme de ΔFosB dentro do hipocampo por corrida de longa duração
O hipocampo possui gradientes anatômicos e funcionais ao longo de seu eixo longitudinal [26Assim, para o presente estudo, a imunorreatividade de FosB / ΔFosB nas porções dorsal e ventral do hipocampo foi analisada separadamente. Os dados demonstraram que a corrida a longo prazo uniformemente aumentou a expressão de FosB / ΔFosB em todos os ROIs do hipocampo medidos. Essa indução uniforme da imunorreatividade de FosB / ΔFosB pode ser causada não especificamente por alterações metabólicas sistêmicas associadas à corrida a longo prazo. No entanto, é importante notar que houve aumentos específicos de região da imunorreatividade de FosB / ΔFosB no córtex. Este resultado é apoiado por descobertas recentes que mostram que uma sessão aguda de corrida em esteira aumentou o fluxo sanguíneo cerebral regional no hipocampo, mas não no bulbo olfatório [8]. Além disso, Rhodes et al. (2003) demonstrou que 7 dias de corrida voluntária de roda induzida expressão de c-Fos no DG e CA2 / 3 do hipocampo (CA1 não foi medido) e no córtex sensorial, mas não no córtex visual [47]. Em conjunto, estes estudos sugerem que a indução uniforme da expressão de FosB / ΔFosB no hipocampo não é uma consequência não específica da corrida a longo prazo. Curiosamente, Hawley et al. recentemente relataram que o estresse crônico imprevisível aumentou a expressão de FosB / ΔFosB no DG dorsal, mas não no ventral, DG do hipocampo de rato [48]. Com uma investigação mais aprofundada, os padrões distintos de indução de FosB / ΔFosB, como aqueles provocados pelo exercício ou estresse, fornecerão insights contínuos sobre os impactos dependentes de estímulo no hipocampo.
O anticorpo pan-FosB primário usado neste estudo é conhecido por reconhecer todas as isoformas das proteínas FosB. Após a análise de western blotting, descobrimos que as únicas isoformas que aumentaram no hipocampo após a corrida a longo prazo foram as isoformas modificadas de ΔFosB (35-37 kDa), as únicas isoformas estáveis entre as proteínas da família Fos [11]. Esta descoberta está de acordo com o trabalho anterior usando o anticorpo pan-Fos para demonstrar que 35-37 kDa ΔFosB é a proteína predominante da família Fos induzida no córtex frontal por estresse crônico [44]. Assim, o aumento da imunorreatividade do FosB / ΔFosB no hipocampo induzido aqui pela corrida a longo prazo provavelmente reflete o nível de ΔFosB.
Sabe-se menos sobre os efeitos do exercício específicos da região nos aspectos moleculares e estruturais do hipocampo. No entanto, numerosos estudos comportamentais indicam um grande potencial para melhorias induzidas pelo exercício, tanto nas funções do hipocampo dorsal como ventral. O exercício demonstrou melhorar a aprendizagem espacial e a memória [34-38] e processamento espacial e contextual depende principalmente do hipocampo dorsal [27,28]. Em contraste, o exercício também é conhecido por exercer propriedades ansiolíticas e antidepressivas [24,25,38] e essas respostas emocionais são predominantemente reguladas pelo hipocampo ventral [29,30]. A indução uniforme de ΔFosB por longo prazo, observada neste estudo, sugere que alguma forma de alteração neuroplástica ocorreu em todo o hipocampo. Isso explicaria por que o exercício pode afetar as funções dorsais e ventrais dependentes do hipocampo.
3: Análise específica de região da neurogênese induzida por exercício
Uma dissociação funcional da neurogênese entre o hipocampo dorsal e ventral também tem recebido crescente atenção [49]. Neste estudo, aproveitando as características morfológicas dos neurônios imaturos DCX-ir [43], contamos o número de interseções entre os dendritos DCX-ir e um segmento de linha desenhado ao longo do meio do GCL. Essa medida não forneceu o número total de neurônios DCX-ir no GD, mas permitiu a quantificação específica da região necessária para conduzir uma análise de correlação com dados de expressão de FosB / ΔFosB (ver abaixo). Após a corrida a longo prazo, o número de neurónios DCX-ir aumentou significativamente na DG dorsal, mas não na ventral. Isso sugere que o exercício pode estimular a neurogênese de forma mais impressionante na região dorsal em comparação com a porção ventral do GD. No entanto, estudos prévios relataram resultados conflitantes em que o funcionamento da roda aumentou a neurogênese tanto na DG dorsal como ventral [50,51]. No presente estudo, o número de cruzamentos de DCX-ir no DG ventral tendeu a aumentar com a corrida, embora o pequeno tamanho da amostra (camundongos 5 por grupo) possa ter limitado a capacidade de detectar uma diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Portanto, é prematuro descartar a possibilidade de que a corrida voluntária da roda estimule a neurogênese ventral do hipocampo. Estudos mais detalhados são necessários para entender a especificidade da região da neurogênese induzida pelo exercício em relação ao seu processo de várias etapas (proliferação celular, diferenciação, migração e sobrevivência).
4: Implicações funcionais da indução ΔFosB induzida pelo exercício para regular a plasticidade do hipocampo
Finalmente, como o primeiro passo no reconhecimento das implicações funcionais da indução de ΔFosB induzida pelo exercício no hipocampo, examinamos a relação da imunorreatividade de FosB / ΔFosB aos cruzamentos de DCX-ir nos DGs dorsal e ventral e encontramos uma correlação positiva e significativa entre as duas variáveis. Embora os mecanismos exatos pelos quais ΔFosB regulam a neurogênese induzida pelo exercício permaneçam incertos, um estudo recente demonstrou que fosB-null ratos, que não possuem FosB, ΔFosB e Δ2ΔFosB (todos os fosB produtos), exibiram déficits na neurogênese basal do hipocampo, incluindo diminuição da proliferação de células progenitoras neuronais, aumento da migração ectópica de neurônios recém-nascidos e estruturas anormais de DG [20]. Entretanto, essas alterações não foram observadas fosB(d / d) ratos, que não possuem FosB, mas não ΔFosB / Δ2ΔFosB. Curiosamente, em fosBratos nulos, expressão de alguns genes relacionados à neurogênese, incluindo Vgf (Fator indutor de crescimento do nervo VGF) e Gal (Prepropeptídeo de galanina) foram regulados negativamente [20]. Como o VGF e a GAL são moléculas secretoras, uma proposta que é promissora considera que os neurônios que expressam ΔFosB podem regular a neurogênese por meio da atividade autócrina / parácrina [20].
Além disso, deve-se notar que a região onde a ΔFosB é induzida pela corrida espacialmente se sobrepõe à região onde a atividade neurogênica é alta. Esse achado sugere que a neurogênese induzida pelo exercício está no mínimo dependente de atividade. A ativação neuronal é fundamental para manter e melhorar a função do sistema nervoso central [9], através de mecanismos que incluem a expressão e liberação do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) [52,53], absorção do fator de crescimento semelhante à insulina sérica-1 (IGF-1) através da barreira hematoencefálica [54,55], supressão da apoptose [56], e regulação da motilidade mitocondrial [57]. Assim, o presente estudo sugere que o exercício prolongado desencadeou a ativação neuronal repetida, evidente na expressão aumentada de ΔFosB, que contribui para o aumento da plasticidade do hipocampo, potencialmente através desses múltiplos mecanismos descritos acima.
O presente estudo avaliou apenas a neurogênese induzida pelo exercício e sua associação com a expressão de FosB / ΔFosB no GD. No entanto, a imunorreatividade de FosB / ΔFosB também foi induzida nos subcampos CA1 e CA3. Embora mais estudos sejam necessários para obter mais compreensão sobre os papéis funcionais da expressão de ΔFosB induzida pelo exercício nesses subcampos, a literatura anterior oferece uma possibilidade promissora. Guan et al. (2011) demonstrou que a ablação específica da quinase dependente de ciclina 5 (Cdk5) nos neurônios piramidais CA1 ou CA3 prejudicou a consolidação ou a recuperação da memória, respectivamente [58]. Curiosamente, o Cdk5 é o destino a jusante de ΔFosB [59] e está envolvido na regulação da plasticidade sináptica [60]. Portanto, a expressão de ΔFosB induzida pelo exercício pode estar envolvida na regulação da plasticidade sináptica através da ativação de Cdk5 nos subcampos CA1 e CA3.
Conclusão
Embora surtos agudos de exercício induziriam a expressão de proteínas gênicas precoces imediatas no hipocampo, o presente estudo fornece a primeira evidência de que o exercício regular a longo prazo induz significativamente a expressão de ΔFosB em todo o hipocampo. ºA indução uniforme de ΔFosB sustenta a compreensão atual de que o exercício é uma intervenção não farmacológica eficaz, capaz de melhorar múltiplas funções do hipocampo. Juntamente com a correlação significativa entre a expressão de FosB / ΔFosB e a neurogênese, esses dados são provocativos e indicam a necessidade de mais estudos delineando o papel de ΔFosB na mediação dos efeitos do exercício na função hipocampal, incluindo a neurogênese.
Declaração de financiamento
Referências