A superexpressão de DeltaFosB no nucleus accumbens mimetiza o fenótipo de dependência de proteção, mas não o fenótipo de depressão de proteção do enriquecimento ambiental (2014)

Behaviour Front Neurosci. 2014; 8: 297.

Publicado online em agosto 29, 2014. doi:  10.3389 / fnbeh.2014.00297

PMCID: PMC4148937

Sumário

Enriquecimento ambiental produz dependência protetora e fenótipos de depressão em ratos. ΔFosB é um fator de transcrição que regula a recompensa no cérebro e é induzido pelo estresse psicológico, bem como drogas de abuso. No entanto, o papel desempenhado por ΔFosB nos fenótipos de proteção do enriquecimento ambiental não foi bem estudado. Aqui, demonstramos que ΔFosB é diferencialmente regulado em ratos criados em uma condição isolada (IC) em comparação com aqueles em uma condição enriquecida (EC) em resposta ao estresse por contenção ou cocaína.

O estresse crônico ou tratamento crônico com cocaína eleva os níveis de proteína ΔFosB no núcleo accumbens (NAc) de ratos CI, mas não de ratos CE, devido a um acúmulo basal já elevado de ΔFosB visto sob condições de CE.

A superexpressão mediada por vírus de ΔFosB na camada NAc de ratos alojados em pares (isto é, independente do enriquecimento / isolamento ambiental) aumenta a resposta operante à sacarose quando motivada pela fome, mas diminui a resposta em animais saciados. Além disso, a superexpressão de ΔFosB diminui a autoadministração de cocaína, aumenta a extinção da busca por cocaína e diminui a reinserção induzida por cocaína da autoadministração intravenosa de cocaína; todos os achados comportamentais consistentes com o fenótipo de enriquecimento.

Em contraste, entretanto, a superexpressão de ΔFosB não alterou as respostas de ratos alojados em pares em vários testes de comportamento relacionado à ansiedade e depressão.

Assim, ΔFosB no Imitação de shell NAc o fenótipo de dependência de proteção, mas não o fenótipo de depressão protetora do enriquecimento ambiental.

Palavras-chave: [incremento]FosB, enriquecimento ambiental, depressão, autoadministração de cocaína, vírus adeno-associado (AAV), superexpressão

Introdução

A experiência de vida, especialmente nos estágios iniciais da vida, tem um impacto profundo no comportamento dos animais ao longo da vida. O meio ambiente desempenha um papel essencial na vulnerabilidade e resistência aos transtornos mentais em humanos (Elisei et al., 2013; Akdeniz et al. 2014; Kato e Iwamoto, 2014; van Winkel et al. 2014). Em modelos de roedores, viver em um ambiente enriquecido desde o desmame até a idade adulta jovem foi relatado para produzir dependência de proteção e fenótipos de depressão (Green et al. 2002, 2003, 2010; Laviola et al. 2008; Solinas et al. 2008, 2009; El Rawas et al. 2009; Thiel et al. 2009, 2010). Neste paradigma, os animais são designados para uma condição enriquecida (EC) na qual os animais são alojados em grupos e têm acesso diário a novos objetos, ou uma condição isolada (IC) na qual os animais são alojados sem novidade ou contato social. Animais criados em condições de enriquecimento, que incluem contato social, exercício e novidade, exibem menos reforço e busca de cocaína ou anfetamina no paradigma da autoadministração de drogas intravenosas (Green et al. 2002, 2010). Além do fenótipo de dependência, tal exposição ao enriquecimento produz um efeito semelhante ao antidepressivo em modelos animais de depressão (Green et al. 2010; Jha et al. 2011). Especificamente, animais enriquecidos exibiram comportamento anhedonia-like diminuído no teste de preferência de sacarose, menos retirada social em um teste de interação social e menos imobilidade no teste de natação forçada (FST). Apesar dos efeitos antidependentes e do efeito antidepressivo do enriquecimento, os mecanismos subjacentes a esses fenótipos de proteção do enriquecimento ambiental permanecem incompletamente compreendidos, embora nossa pesquisa anterior tenha implicado um papel da diminuição da atividade do fator de transcrição, CREB, no nucleus accumbens (NAc ) na mediação de alguns dos efeitos do enriquecimento ambiental (Green et al. 2010; Larson et al. 2011). Assim, o objetivo desses estudos de criação diferenciada é usar uma abordagem básica de ciência para identificar mecanismos moleculares de resiliência que possam ser posteriormente traduzidos para a clínica. Esta abordagem é equivalente a estratégias genéticas bem estabelecidas, como a reprodução seletiva (McBride et al., 2014).

Aqui nos concentramos em outro fator de transcrição, ΔFosB, que é induzido proeminentemente no NAc por certas formas de estresse ou por virtualmente todas as drogas de abuso, incluindo cocaína, morfina, álcool, nicotina e anfetamina (Hope et al., 1992; Kelz e Nestler, 2000; Perrotti et al. 2004, 2008). Como factor de transcrição, ΔFosB dimeriza com proteínas da família Jun, preferencialmente JunD, para formar um complexo AP-1 activo que se liga ao elemento de resposta AP-1 para aumentar ou reprimir a transcrição dos seus genes alvo (Nestler, 2001), embora novas pesquisas sugiram que ΔFosB também pode atuar como um homodímero (Wang et al., 2012). A proteína ΔFosB é uma variância de splice truncada do FosB gene, que faz com que a proteína ΔFosB não possua dois domínios degron C-terminais, impedindo a proteína ΔFosB da rápida degradação observada com FosB e todas as outras proteínas da família Fos. Como ΔFosB é extraordinariamente estável no NAc, ΔFosB atua de maneira muito diferente em resposta a estímulos agudos vs. crônicos em comparação com outras proteínas Fos. Com exposição repetida a drogas de abuso ou estresse, a proteína ΔFosB gradualmente se acumula e persiste por dias a semanas, enquanto FosB e outras proteínas Fos são induzidas por pouco tempo (horas) e desenvolvem uma indução atenuada após exposição subsequente (Nestler et al., 2001; Nestler, 2008).

A importância de ΔFosB não é apenas que é altamente induzida por drogas de abuso e estresse, mas que a manipulação de ΔFosB no cérebro tem mostrado afetar o comportamento dos animais. A indução seletiva de ΔFosB nos neurônios espiniformes do meio dinorfina em camundongos adultos aumenta a sensibilidade locomotora em resposta à cocaína aguda e repetida, bem como as respostas recompensadoras à cocaína no paradigma de preferência de lugar condicionado e reforço no paradigma de autoadministração (Kelz et al. 1999; Kelz e Nestler, 2000; Colby et al. 2003).

Embora os fenótipos de dependência de proteção e depressão tenham sido descritos em detalhes para ratos enriquecidos ambientalmente, um possível papel de ΔFosB na mediação desses fenótipos de proteção ainda não foi totalmente avaliado. Estudos prévios de enriquecimento ambiental mostraram que, em comparação com o ambiente padrão (SE), um ambiente enriquecido aumenta os níveis basais de ΔFosB nos neurônios medianos espinhais D1 e D2 de regiões estriadas em camundongos (Solinas et al. 2009; Lobo et al. 2013). Além disso, ratos Wistar enriquecidos mostraram elevadas células positivas para ΔFosB no córtex pré-frontal e NAc em comparação com ratos SE, sugerindo um possível papel de ΔFosB no fenótipo de dependência à nicotina. (Venebra-Muñoz et al., 2014). Além disso, a superexpressão de ΔFosB ao longo do corpo estriado de camundongos aumenta a corrida diária das rodas, o que pode ser análogo ao aumento da atividade de ratos em um ambiente enriquecido. (Werme et al., 2002).

No presente estudo, levantamos a hipótese de que: (1) o enriquecimento ambiental aumentaria o acúmulo de níveis basais de ΔFosB no NAc; e (2) esse acúmulo de ΔFosB contribuiria para os efeitos protetores do enriquecimento ambiental.

Materiais e métodos

Animais

Para enriquecimento ambiental, ratos machos Sprague-Dawley (Harlan, Houston, TX, EUA) foram aleatoriamente designados para alojamento EC ou IC do dia pós-natal 21 ao dia 51. Os ratos EC foram alojados em grupo (20 por gaiola) numa grande gaiola de metal (70 70 X XUMUM cm) com vários objectos de plástico rígido (brinquedos para crianças, recipientes de plástico, tubos de PVC, etc.). Esses objetos foram substituídos por novos objetos e rearranjados em uma nova configuração diária. Ratos IC foram alojados individualmente em gaiolas de policarbonato padrão. Os ratos permaneceram nestas condições ao longo das experiências e todos os testes comportamentais e testes bioquímicos começaram após 70 dias de idade (ie, pelo menos 51 dias de enriquecimento / isolamento). Para a superexpressão de ΔFosB, ratos machos Sprague-Dawley (Harlan, Houston, TX, EUA) foram obtidos no tamanho 30-225g e alojados em pares em gaiolas de policarbonato padrão antes de serem estereotaxicamente injetados com um vetor viral adeno-associado (AAV250) superexpressando ΔFosB com proteína verde fluorescente (GFP) ou apenas GFP como controle (veja abaixo). A ração e água padrão para ratos estavam disponíveis gratuitamente para todos os ratos, exceto durante os testes comportamentais e a regulação alimentar. Todos os ratos foram mantidos em ambiente controlado (temperatura, 2 ° C; umidade relativa, 22%; e 50 h ciclo claro / escuro, luzes no 12 h) em uma colônia aprovada pela Associação para Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC). . Todos os experimentos seguiram o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e o Comitê de Uso e Cuidados Institucionais de Animais do Ramo Médico da Universidade do Texas.

O enriquecimento ambiental é uma manipulação composta de novidade, contato social e exercício. O par de alojamentos proporciona contato social e, portanto, representa um CE (consulte o Guia NIH). Assim, o grupo controle adequado para uma condição com novidade, contato social e exercício seria um grupo sem novidade, contato social ou exercício, a condição de CI. Ratos IC mostram menos sinais de estresse crônico do que os ratos EC. Especificamente, os ratos CE têm glândulas supra-renais aumentadas (Mlynarik et al., 2004), respostas CORT embotadas (Stairs et al., 2011), indução de gene imediato-precoce atenuado (Zhang et al., manuscrito em preparação) e acumulação de ΔFosB (Solinas et al., 2009; Lobo et al. 2013), todos os sinais de estresse crônico (Crofton et al., em revisão).

Estresse psicológico

Ratos enriquecidos e isolados foram colocados em implantes descartáveis ​​de plástico macio para roedores (DecapiCone®, Braintree Scientific Inc., MA, EUA) para 60 min para o dia 1 (agudo) ou 9 dias (repetido). Para os testes de mRNA de exposição curta, os ratos 30 (ratos 5 por grupo) foram decapitados 30 min após o início do último período de estresse de restrição, cérebros de ratos foram extraídos e o NAc foi dissecado para análise de mRNA. Para a imuno-histoquímica, os ratos 12 foram perfundidos com solução salina e% paraf ormaldeído 4, cérebros extraídos, pós-fixados em 4% paraformaldeído e armazenados em 20% glicerol em 1xPBS a 4 ° C. Cérebros de ratos foram cortados em 40 μm com um micrótomo de congelamento. Cérebros foram colhidos 24 h após o estresse final para permitir que a proteína FosB de comprimento total se degradasse (Perrotti et al., 2008).

Autoadministração intravenosa de cocaína com enriquecimento ambiental

Implantação de cateteres intravenosos

Os ratos foram anestesiados usando cetamina (100 mg / kg IP) e xilazina (10 mg / kg IP) e um cateter de Silastic foi inserido e fixado na veia jugular, saindo da pele nas costas do animal. Cada dia os cateteres foram infundidos com 0.1 ml de uma solução salina estéril contendo heparina (30.0 U / ml), penicilina G potássica (250,000 U / ml) e estreptoquinase (8000 UI / ml) para prevenir a infecção e manter a patência do cateter durante todo o período de experimentos.

Auto-administração de cocaína com enriquecimento ambiental

Vinte ratos enriquecidos e isolados com 20 foram colocados em câmaras operantes 30 × 24 × 21 cm (Med-Associates, St. Albans, VT) e deixados pressionar uma alavanca para infusões de cocaína (0.5 mg / kg / infusão, NIDA drug supply, Research Triangle Institute, NC, EUA) ou solução salina sob um regime de relação fixa 1 (FR1) para 2 h por dia, num total de 14 dias. Para manter uma ingestão semelhante de cocaína entre os grupos EC e IC, houve um máximo de infusões de 30 por sessão. A capacidade de processamento dos tecidos foi limitada a amostras 30, pelo que os ratos de resposta mais baixa de cada grupo não foram processados, deixando Ns de 8 para cocaína e 7 para grupos salinos. Assim, não houve diferenças CE / CI na ingestão total de cocaína ou no tempo de infusão entre ratos EC e IC. Cérebros de ratos foram extraídos 3 h após o início da última sessão de auto-administração e o NAc foi dissecado para análise de mRNA e proteína. Um lado do NAc foi usado para Western blot, o outro lado usado para qPCR.

Administração não-contingente de cocaína com enriquecimento ambiental

Para comparação direta com a literatura publicada anteriormente (Hope et al., 1994; Chen et al. 1995), CE (N = 12) e ratos IC (N = 12) foram injectados com soro fisiológico ou 20 mg / kg de cocaína por via intraperitoneal (IP) durante os dias 1 (agudos) ou 9 (repetidos). Uma amostra de CE foi perdida durante o processamento. O grupo agudo recebeu injeções de solução salina por dias 8 e uma injeção de cocaína no dia 9, de modo que todos os ratos receberam o mesmo número de injeções. Cérebros foram extraídos 30 min após a última injeção e o NAc dissecado para análise de mRNA.

Quantificação de mRNA usando qPCR

O RNA foi extraído por homogeneização em RNA STAT-60 (Teltest, Friendswood, TX), separando RNA de DNA e proteína usando clorofórmio e precipitando o RNA total com isopropanol. O DNA contaminante foi removido (TURBO DNA-Free, Life Technologies, CA, EUA) e 5 ug do RNA purificado foi transcrito inversamente em cDNA (SuperScript III First Strand Synthesis: Invitrogen catálogo # 18080051). O ARNm de ΔFosB foi quantificado usando PCR quantitativo em tempo real (SYBR Green: Applied Biosystems, Foster City, CA) em um termociclador rápido Applied Biosystems 7500 com primers projetados para detectar somente ΔFosB (adiante: AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT; reverso: GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG) e normalizado para primers projetados para detectar GAPDH de rato (frente: AACGACCCCTTCATTGAC; reverso: TCCACGACATACTCAGCAC). Todos os primers foram validados e analisados ​​quanto à especificidade e linearidade antes dos experimentos (Alibhai et al., 2007).

Mancha ocidental

O lado direito do NAc da cocaína ou salinas auto-administráveis ​​EC e IC foi homogeneizado em um tampão contendo sacarose, tampão Hepes, fluoreto de sódio, 10% SDS e inibidores de protease e fosfatase (Sigma-Aldrich: P-8340, P -2850, P-5726). A concentração de proteína foi avaliada usando o Kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA (Thermo Scientific, IL, EUA). Como a proteína extraída de um rato não foi suficiente para a análise, as amostras 2 do mesmo grupo foram reunidas, produzindo amostras 4 para cada grupo. Amostras de proteína foram desnaturadas a 95 ° para 5 min e corridas em gel de gradiente de poliacrilamida 10-20% (Criterion TGX, Bio-Rad Laboratories, CA, EUA) e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, MA, EUA). ). A membrana foi bloqueada com bloqueador de blotting (leite desnatado), incubada com anticorpo primário ΔFosB (coelho, 1: 1000, #2251, Cell Signaling Technology, MA, EUA) e anticorpo primário β-actina (camundongo, 1: 1000 , Cell Signaling Technology, MA, EUA), lavados com TBST e depois incubados com anticorpos secundários fluorescentes (burro anti-coelho (780 nm), anti-murganho de burro (680 nm), 1: 15000, Li-Cor Biosciences, NE, EUA). Western blots foram então visualizados (Odyssey, Li-Cor Biosciences, NE, EUA) e os níveis de proteína quantificados com o software Odyssey.

Imunohistoquímica

Para figura Figura 11 (N = 3), células contendo ΔFosB foram visualizadas e contadas através da marcação imuno-histoquímica de ΔFosB em fatias de NAc coradas com DAB (Kit de substrato de peroxidase DAB, Vector Laboratories, CA, EUA). Os cérebros foram extraídos, fixados, crioprotegidos e seccionados em fatias 40 μm contendo o NAc em um micrótomo de congelamento deslizante (Leica Biosystems, IL, EUA). As fatias permaneceram flutuando e foram lavadas com 1xPBS antes que as peroxidases endógenas fossem extintas, antes do bloqueio com 3% de soro de cabra normal (Jackson ImmunoResearch, PA, EUA) com 0.3% triton e avidina D (Vector Laboratories, CA, EUA). As fatias de NA foram incubadas com anticorpo primário FosB durante a noite (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA) com soro de cabra 3%, 0.3% triton, 1xPBS e solução de biotina (Vector Laboratories, CA, EUA). Embora este anticorpo reconheça tanto FosB quanto ΔFosB, estudos anteriores de Western blot mostraram que na 24 h pós-estimulação, a grande maioria do sinal imuno-histoquímico é composto de ΔFosB porque FosB degrada bem antes de 24 h (Perrotti et al., 2008). Após a lavagem, as fatias foram incubadas com um IgG de anticorpo secundário anti-coelho de cabra biotinilado (Vector Laboratories, CA, EUA), soro de cabra e 1xPBS. Em seguida, as fatias foram incubadas com uma coloração de peroxidase com complexo avidina-biotina (ABC) para 15 min (Thermo Scientific, IL, EUA). Finalmente, as fatias foram montadas, desidratadas usando etanol e CitriSolv (Fischer Scientific, MA, EUA) e cobertas com DPX (Fisher Scientific). Para contagem de células, foram amostradas seções de Bregma + 1.80 a + 1.44 de cada animal. O n�ero total de c�ulas imunopositivas? FosB foi contado a partir de quatro sec�es NAc do n�leo e da casca de cada rato.

Figura 1  

Stress e [incremento]FosB em ratos EC e IC. (DE ANÚNCIOS) Coloração por DAI imuno-histoquímica representativa de ΔFosB na concha de NAc e núcleo de IC (A e B) e CE (C e D) ratos com (B e D) e sem (A e C) esforço repetido (N = 3). Integridade e Excelência Quantificação ...

Vírus adeno-associado superexpressando [incremento]FosB

Um vetor baseado em AAV2 que expressa ΔFosB e renina humanizado GFP (hrGFP; Winstanley et al., 2007, 2009a,b) ou vetor de controle hrGFP (N = 10 cada) foi injetado bilateralmente no NAc de rato. Como não há seres humanos com IC, foram utilizados ratos alojados em pares, em vez de ratos com CI para este estudo, para aumentar a relevância para a comunidade científica, demonstrando os efeitos de ΔFosB de treinadores em Entrevista Motivacional do paradigma CE / IC. Um AAV que expressa hrGFP mas que não sobreexpressa ΔFosB foi usado como controle. A expressão de ΔFosB in vivo foi validado por coloração por imunofluorescência com anticorpo primário FosB (1: 200, Rabbit, Cell Signalling Technology, MA, EUA). Os vetores AAV foram injetados na camada NAc bilateralmente (1 μl / lado sobre 10 min) usando coordenadas (AP = 1.7, L = 2.0, D = −6.5). Os testes comportamentais começaram 3 semanas após a cirurgia estereotáxica. A colocação precisa foi determinada imunohistoquimicamente após a conclusão do teste comportamental.

Neofobia de sacarose

OverFosB superexpressando ratos (N = 10) e ratos controle (N = 8) foram manipulados para 1 semana antes do início dos testes comportamentais. Para testar o comportamento semelhante à ansiedade, os ratos foram avaliados quanto à neofobia a um novo sabor (sacarose). Os ratos foram separados em gaiolas individuais e a água foi removida a 1600 h. Garrafas de água de rato padrão foram cheias com uma solução de 1% p / v de sacarose na água "tap" normal dos ratos e pesadas antes de serem colocadas em cada gaiola em 1800 h. Após 30 min as garrafas foram removidas e novamente pesadas, e a diferença do peso das garrafas de sacarose antes e depois do teste foi calculada. Em seguida, a sacarose foi substituída nas gaiolas por mais 2 dias para permitir que os ratos se familiarizassem com o sabor da sacarose antes do teste de preferência de sacarose.

Labirinto mais elevado

Outro teste de comportamento semelhante à ansiedade, o labirinto em cruz elevado (EPM), foi testado 2 dias após a neofobia da sacarose. O LCE mede o comportamento exploratório modificado por vetores em um ambiente novo e produtor de ansiedade (Green et al., 2008). Dois braços fechados e dois braços abertos (Med Associates Inc., VT, EUA) medindo 12 × 50 cm estavam 75 cm acima do chão e tinham fotovoltaios na entrada de cada braço. O tempo gasto nos braços abertos foi monitorado para 5 min por quebra de fotobeam usando o software Med-PC.

Defecação induzida por estresse frio

No dia seguinte ao EPM, foi utilizado um terceiro teste de ansiedade: defecação em resposta a um ambiente levemente estressante (frio). Gaiolas de rato de policarbonato (33 × 17 × 13 cm) foram pré-refrigeradas em gelo durante 10 min. Os ratos foram colocados nas gaiolas em gelo por 30 min e o número de bolis fecais foi registado a cada 5 min.

Contato social

No dia seguinte, o comportamento semelhante à depressão foi medido usando um teste de interação social. Os ratos foram separados para o 24 h antes do teste. No dia do teste os ratos foram colocados num ambiente novo (recipiente de plástico, 45 × 40 × 45 cm) com o seu companheiro de gaiola e o comportamento foi gravado em vídeo para 30 min. A quantidade de tempo que o par de ratos passou cuidando um do outro foi medido por um investigador cego à condição dos ratos.

Preferência de sacarose

Após contato social, o teste de preferência de sacarose foi utilizado como modelo de anedonia. Ratos alojados em pares foram separados em 1600 h com alimentos, mas não foi permitido o acesso a água para 2 h. Na 1800 h colocaram-se duas garrafas de água pré-pesadas em cada gaiola, uma contendo água e a outra uma solução de 1% de sacarose em água. As garrafas de água foram colocadas na posição normal enquanto a sacarose foi colocada a aproximadamente 10 cm de distância. As garrafas foram removidas e novamente pesadas após 15 min.

Atividade locomotora

Três dias após a preferência de sacarose, a atividade locomotora foi avaliada sob condições de luminosidade normal colocando os ratos em câmaras transparentes de Plexiglas (40 × 40 × 40 cm) com uma fina camada de cama, circundada por duas matrizes 4 × 4, uma 4 cm acima o solo e um 16 cm acima do solo para gravar a deambulação horizontal e a atividade vertical (de criação). As quebras de fotobeam foram monitoradas para 2 h por um sistema de atividade de campo aberto modificado (San Diego Instruments, CA, EUA).

Teste de natação forçada

O último teste comportamental espontâneo foi o FST, um modelo sensível aos antidepressivos. Os ratos foram colocados num cilindro de Plexiglas cheio com aproximadamente 14 L da temperatura ambiente (24 ± 0.5 °) de água durante 15 min na Session 1, e 5 min na Session 2 no dia seguinte. Os ratos foram secos e colocados de novo nas suas gaiolas. A atividade de natação foi gravada em vídeo e a latência para o primeiro período de imobilidade (1 s) e tempo total imóvel foi determinada para a sessão 2 por um investigador cego às condições.

Sacarose operante respondendo

As ratazanas AAV de controlo e ratazanas que sobreexpressam ΔFosB foram reguladas para 85% do peso de alimentação livre ao longo de 7 dias. Todos os ratos foram treinados para barrar prensa para pellets de sacarose (Bio-Serv, NJ, EUA) em um programa FR1 de reforço para sessões mínimas de 15 em 5 dias consecutivos. Os ratos receberam então livre acesso aos alimentos durante 3 dias e novamente permitiram barrar os pellets de sacarose num programa FR1 para 15 min, desta vez com 100% de peso de ração livre.

Auto-administração de cocaína

Aquisição

Uma semana após a cirurgia do cateter (como descrito acima), todos os ratos (ratos controle 7 e ratos superexpressando 10 ΔFosB, um rato controle foi perdido da cirurgia do cateter) foram colocados em câmaras operantes 30 × 24 × 21 cm (Med-Associates, St. Albans, VT) e autorizada a administrar 0.2 mg / kg / unidade de infusão de cocaína por 2 h por sessão durante 4 dias; então 0.5 mg / kg / infusão por 3 dias em um agendamento FR1. Cada infusão foi administrada por via intravenosa num volume de 0.01 ml acima de 5.8 s. A infusão foi sinalizada pela iluminação de duas luzes de sinalização para 20 s, que sinalizaram um período de tempo limite durante o qual nenhuma infusão adicional poderia ser alcançada.

Extinção

Como a exposição crônica à cocaína presumivelmente induziria o acúmulo de ΔFosB nos ratos controle, o que faria com que os ratos em ambos os vetores tivessem altos níveis de ΔFosB no cérebro, os ratos foram confinados em suas gaiolas por 4 dias sem autoadministração para permitir Níveis de proteína ΔFosB para diminuir em ratos controle-vetoriais. Após a abstinência 4 dias, os ratos foram colocados na câmara operante e autorizados a auto-administrar salina em vez de cocaína sob um cronograma FR1 para 1 h sessões por 3 dias consecutivos.

Resposta de dose de razão fixa

Cada ratazana (controlo e sobre-expressão de FosB) foi autorizada a administrar a cocaína 0.00325, 0.0075, 0.015, 0.03, 0.06, 0.125 mg / kg / infusão por ordem ascendente num horário FR0.25 todos os dias durante 0.5 dias consecutivos. Os ratos auto-administraram cada dose de cocaína por 1 min.

Reintegração induzida pela cocaína

Os ratos foram submetidos a um procedimento de reintegração dentro da sessão. Os ratos receberam 0.5 mg / kg / infusão num esquema FR1 para 60 min seguido por 3 h de extinção (com sugestões contingentes de cocaína). Em seguida, eles receberam uma injeção IP (Green et al., 2010) de cocaína de uma das cinco doses (0, 2.5, 5, 10 ou 20 mg / kg) por ordem aleatória para cada rato ao longo das sessões 5 de reintegração. A última fase 3 da sessão foi a reintegração de resposta, novamente com dicas de cocaína, mas ainda sem infusões de cocaína. Após cada sessão de reintegração induzida por cocaína, os ratos receberam 2 dias de dose elevada (0.5 mg / kg / infusão) de cocaína num programa FR1 para 2 h para manter altas taxas de resposta nas sessões. Durante o processo de auto-administração de cocaína, os cateteres de alguns ratos perderam gradualmente a patência; Assim, os dados de ratos controle 6 e ratos 7 ΔFosB-overexpressing foram utilizados nesta análise.

Análise estatística

Análises de variância de duas vias (ANOVAs) e ANOVA de duas vias para medidas repetidas foram feitas para comparar os quatro grupos de tratamento e as comparações planejadas foram usadas para comparar as diferenças entre as condições. A significância entre apenas duas condições foi analisada usando uma t-teste. Todos tOs dados do teste passaram no teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Todos os dados são expressos como média ± SEM. Significância estatística foi estabelecida em p <0.05. Todos os ratos enriquecidos para um único experimento foram alojados em uma gaiola, mas tratados como sujeitos separados, fornecendo implicações em relação à questão da potencial pseudoreplicação.

Consistentes

Ratos EC exibem maiores níveis basais de [incremento]FosB em ratos NAc do que IC

Em comparação com os ratos IC, os ratos CE têm um número significativamente maior de células positivas para ΔFosB em ambos os núcleos de NAc (t(4) = −3.31, p <0.05) e casca (t(4) = −6.84, p <0.05) (Figuras 1A, C, E, F), sugerindo que o tom basal de ΔFosB é maior em ratos EC em comparação com ratos IC. Além disso, os resultados do Western Blot mostraram uma forte tendência para os ratos EC salinos com maior nível basal de proteína ΔFosB no NAc em comparação com os ratos com solução salina IC (t(6) = −2.03, p = 0.089; Figura Figura 2A) 2A) usando um teste bicaudal. No entanto, dada a expressão aumentada nas figuras 1A – F e os aumentos observados em outros trabalhos (Solinas et al., 2009), estamos confiantes nesse efeito. Os achados de Western blot também verificaram que virtualmente toda a imunorreatividade do tipo FosB detectada por imuno-histoquímica era ΔFosB e não FosB, que não era detectável em 24 h.

Figura 2  

Cocaína e [incremento]FosB em ratos EC e IC. (A – B) Proteína média de ΔFosB (UMA) e mRNA (B) (± SEM) no NAc após 14 dias de administração salina ou de cocaína em ratos CI e EC (N = 7 – 8). Bandas vermelhas no painel denota ...

[incremento]FosB é diferencialmente induzido em ratos EC e IC por estresse

Houve um efeito principal significativo do esforço de restrição repetido em ambas as conchas (F(1, 8) = 16.6, P <0.005) e núcleo (F(1, 8) = 7.9, P <0.05) do NAc e um efeito principal do enriquecimento ambiental na casca (F(1, 8) = 22.3, P <0.005; Figuras 1A – F). Mais importante, a interação entre o estresse e o enriquecimento ambiental também foi significativa em ambas as conchas (F(1, 8) = 25.6, P <0.01) e núcleo (F(1, 8) = 6.7, P <0.05). A interação foi tal que, após estresse de contenção repetido, o número de células positivas para ΔFosB aumentou significativamente em ratos IC, enquanto esse número não mudou em ratos CE após estresse repetido.

Para investigar mais detalhadamente como ΔFosB é dinamicamente regulado por estresse agudo contra repetido e para permitir comparação com pesquisa anterior (Alibhai et al., 2007), indução de ΔFosB mRNA foi estudado com estresse agudo e repetido por contenção (Figure1G) .1G). Houve um efeito principal significativo do estresse (F(2, 24) = 31.9, P <0.001) e enriquecimento ambiental (F(1, 24) = 5.1, P <0.05). Em ratos IC, ΔFosB mRNA foi fortemente induzido após estresse de contenção agudo. No entanto, com estresse repetido, a indução de mRNA ΔFosB foi significativamente atenuada em comparação com a indução aguda. Também houve uma interação significativa (F(2, 24) = 4.6, P <0.05), demonstrando que a indução aguda de ΔFosB mRNA foi menor em ratos EC em comparação com ratos IC. Assim, os ratos CE têm maiores níveis basais de ΔFosB proteína no NAc, mas menos ΔFosB mRNA indução em resposta a um estressor agudo.

[incremento]FosB é diferencialmente induzido pela cocaína no NAc de ratos EC e IC

Para determinar se ratos EC e IC respondem de maneira diferente à cocaína, estudamos a regulação da proteína ΔFosB e mRNA na NAc de ratos após a auto-administração de cocaína (Figuras 2A, B respectivamente). Um Western blot revelou um efeito principal significativo da cocaína (F(1, 12) = 24.9, P <0.001) e uma interação significativa (F(1,12) = 5.5, P <0.05). A interação foi tal que ΔFosB aumentou mais em ratos IC do que em ratos EC (Figura (Figure2A) .2A). De fato, após a auto-administração de cocaína, os níveis de proteína ΔFosB foram significativamente elevados só em ratos IC. Em relação aos níveis de mRNA, os resultados da qPCR também revelaram um efeito principal significativo da cocaína (F(1, 26) = 47.1, P <0.001) e efeito principal do enriquecimento ambiental (F(1, 26) = 13.8, P <0.005). Embora os níveis gerais fossem mais baixos em ratos EC, ambos os grupos aumentaram ΔFosB mRNA (Figura (Figure2B2B).

Embora os dados de proteína apoiassem a hipótese original, foi hipotetizado a partir da Figura Figura1G1G que os ratos CE mostrariam menos mRNA indução de ratos isolados no experimento de cocaína acima, o que não aconteceu, provavelmente porque Figura1G1G utilizou um timepoint 30 min e a experiência de cocaína utilizou um ponto de tempo 3 h. Para interrogar ainda mais a hipótese de mRNA, um ponto de tempo mínimo de 30 foi usado para explorar o tratamento agudo e repetido de cocaína como uma melhor comparação com a figura. Figura1G.1G. Como a autoadministração aguda de cocaína é problemática por natureza (isto é, aprendizado de aquisição), ratos EC e IC receberam dias agudos ou 9 de injeções repetitivas de IP por cocaína não contingente (20 mg / kg). Como hipotetizado, houve um efeito principal significativo do enriquecimento ambiental (F(1, 17) = 14.3, P <0.005), mas o efeito principal do tratamento com cocaína (F(2, 17) = 3.4, P = 0.057) e a interação (F(2, 17) = 3.4, P = 0.055) mostrou apenas tendências fortes com um teste bicaudal. No entanto, dado que tínhamos hipóteses direcionais da Figura Figura 1G, 1G, estamos extremamente confortáveis ​​em nossa opinião que os ratos CE exibem menos indução do que os ratos IC (Figura (Figure2C2C).

Superexpressão de [incremento]FosB na concha de NAc mimetiza o fenótipo de dependência induzida por enriquecimento protetor

Para investigar o efeito de ΔFosB no comportamento de ratos independente do enriquecimento / isolamento ambiental (ie, para tornar esses resultados mais relevantes para estudos não EC / IC), o vírus adeno-associado (AAV) foi usado para superexpressar ΔFosB bilateralmente no NAc. ratos alojados em par não enriquecidos. De acordo com nossos estudos anteriores, a concha de NAc é mais sensível para controlar o comportamento relacionado à depressão e ao uso de drogas / busca, de forma que os vetores de AAV foram injetados na concha de NAc neste estudo (Green et al., 2006, 2008, 2010). Figuras 3A, B mostram a imuno-histofluorescência representativa de ΔFosB com o vetor de controle (painel A; isto é, expressão ΔFosB endógena) e o vetor sobreexpressivo FFosB (painel B) no invólucro NAc.

Figura 3  

Superexpressão de [incremento]FosB no shell NAc imita o fenótipo de dependência de proteção do enriquecimento ambiental. (A – B) Imunohistoquímica representativa de ΔFosB para controle de hrGFP (UMA) e FFosB-overexpressing (B) Vetores AAV. ...

Tendo validado o título, in vivo expressão e localização geral do vetor viral, primeiro estudamos o efeito da superexpressão de ΔFosB em modelos de ansiedade. A superexpressão de ΔFosB na camada de NAc não foi suficiente para reproduzir o efeito ansiogênico do enriquecimento ambiental na neofobia da sacarose e paradigmas de defecação induzida pelo estresse pelo frio (dados não mostrados). Além disso, não houve efeito no EPM (dados não mostrados). Como o enriquecimento ambiental produz um efeito semelhante ao antidepressivo em ratos, em seguida, realizamos testes relacionados à depressão em ratos que superexpressam ΔFosB. Semelhante aos modelos de ansiedade, os resultados mostraram que a superexpressão de ΔFosB na concha de NAc não foi suficiente para diminuir o comportamento semelhante à depressão no teste de preferência de sacarose, no teste de interação social ou no FST. (dados não mostrados).

No paradigma do enriquecimento ambiental, os ratos EC exibem menor atividade locomotora basal do que os ratos IC (Bowling et al., 1993; Boliche e Bardo, 1994; Smith et al. 1997; Green et al. 2003, 2010). Para investigar o efeito da sobreexpressão de ΔFosB no invólucro de NAc, a atividade locomotora espontânea foi testada para 120 min. Usando um teste bicaudal, os resultados revelaram que a superexpressão de ΔFosB no invólucro de NAc produziu uma forte tendência de diminuição da atividade locomotora basal em ratos (Figura (Figure3C; 3C; t(16) = 1.84, p = 0.084). Apesar de não serem estatisticamente significativos com um teste bicaudal, esses dados ainda são intrigantes, já que estão de acordo com nossa hipótese direcional explícita baseada em Green et al. (2010), que é consistente com o efeito do enriquecimento ambiental.

IEm contraste com os modelos de depressão e ansiedade, a superexpressão de ΔFosB na concha de NAc foi capaz de produzir um fenótipo tipo CE em múltiplos paradigmas de dependência / reforço. EuNo teste de autoadministração de operado de pelota de sacarose, houve interação significativa entre a superexpressão de ΔFosB e a motivação de fome de ratos (F(1, 16) = 7.4, P <0.01). Ratos que superexpressam ΔFosB na casca NAc demoraram significativamente mais granulados de sacarose em condições de fome (isto é, com 85% de peso corporal de alimentação livre), mas menos peletes sob a condição de baixa motivação (isto é, 100% de peso de alimento livre; Figura Figura 3D), 3D), que imita perfeitamente o fenótipo EC (Green et al., 2010).

No paradigma do enriquecimento ambiental, os ratos da CE exibiram redução do comportamento de busca de cocaína na extinção e reintegração induzida pela cocaína (Green et al. 2010). Assim, o comportamento de obtenção e procura de cocaína foi medido em ratos que expressam FFosB usando o paradigma de auto-administração intravenosa de cocaína. Como modelo de craving, o paradigma da extinção da cocaína revelou que a superexpressão de ΔFosB na concha NAc diminuiu o comportamento de busca de drogasr (F(1, 15) = 6.7, P <0.05; Figura Figure3E) .3E). Houve também um efeito principal significativo da sessão (F(2, 30) = 74.0, P <0.001). Para manutenção respondendo sob um esquema FR1, houve um efeito principal significativo da dose (F(7, 105) = 222.6, P <0.001) e uma interação significativa (F(7, 105) = 2.3, P <0.05) na ingestão cumulativa de cocaína. A natureza da interação era tal que as diferenças eram aparentes apenas com doses mais altas de cocaína (Figura (Figure3F) .3F). Finalmente, na reincorporação induzida pela cocaína, houve um efeito principal significativo da dose (F(4, 44) = 15.5, P <0.001) e uma tendência para um efeito principal de superexpressão de ΔFosB usando um teste bicaudal (F(1, 11) = 4.1, P = 0.067). No entanto, dada a hipótese direcional de Green et al. (2010) e os resultados estatisticamente significativos e consistentes nas Figuras 3D, E, F, é provável que ΔFosB diminua a reintegração (Figura (Figure3G) .3G). A resposta na dose de 10 mg / kg foi significativamente menor para ratos que expressam FFosB. Os resultados como um todo indicam que a superexpressão de ΔFosB na concha de NAc de rato diminui o comportamento de busca e consumo de cocaína, o que é consistente com os efeitos comportamentais do enriquecimento ambiental.

Discussão

A vulnerabilidade dos indivíduos ao vício e à depressão é fortemente afetada por fatores ambientais. O enriquecimento ambiental é um paradigma que manipula o ambiente vivo dos animais, produzindo efeitos protetores contra muitas condições psiquiátricas. ΔFosB desempenha um papel fundamental na regulação da função de recompensa em múltiplas regiões do cérebro, incluindo o NAc e estriado dorsal (Koob et al., 1998; Sensato, 1998; Wallace et al. 2008; Grueter et al. 2013; Pitchers et al. 2013). Neste projeto, estudamos a regulação dinâmica de ΔFosB por estresse de restrição e cocaína em ratos enriquecidos e isolados. As principais conclusões deste projeto são:

(1) Os ratos EC apresentam níveis elevados de ΔFosB no NAc no início do estudo em comparação com os ratos IC;

(2) apenas ratos IC acumulam proteína ΔFosB adicional com estresse repetido;

(3) ratos EC apresentam indução atenuada de ARNm de ΔFosB subsequente a estresse ou cocaína; e

(4) superexpressando ΔFosB no NAc de ratos alojados em pares simula o fenótipo de dependência de proteção, mas não o fenótipo de depressão de proteção.

Pode-se esperar da literatura publicada, que mostra que os camundongos que superexpressam ΔFosB transgênicos mostram maior sensibilidade à recompensa de cocaína e à autoadministração em baixas doses de drogas (Kelz et al. 1999; Colby et al. 2003; Vialou et al. 2010; Robison et al. 2013), que os ratos que superexpressam ΔFosB no experimento atual apresentariam maior propensão à autoadministração e busca de cocaína. INos experimentos atuais, entretanto, a superexpressão de ΔFosB na concha de NAc diminuiu o consumo de cocaína e a procura de cocaína durante a extinção e a reintegração, indicando motivação reduzida para a cocaína. A discrepância pode ser devido ao fato de que os camundongos transgênicos expressaram ΔFosB ao longo de todo o corpo estriado, mas apenas em células dinorfina + (Colby et al. 2003). No presente experimento, ΔFosB foi superexpresso através de um vetor de AAV que infecta dinorfina + e encefalina + neurônios. Em segundo lugar, o presente estudo focalizou a camada NAc em vez de toda a região do corpo estriado.

Além do fenótipo de dependência, o enriquecimento ambiental produz perfis antidepressivos e ansiogênicos em ratos (Green et al. 2010; Vialou et al. 2010). No presente estudo, a superexpressão de ΔFosB no NAc não produziu efeitos em nenhuma das três depressões ou três testes de ansiedade. Embora existam muitos fatores possíveis que podem contribuir para ΔFosB mimetizando o vício de enriquecimento, mas não o fenótipo de depressão, é possível que o invólucro NAc seja mais dominante para o comportamento relacionado à dependência, enquanto o comportamento relacionado à depressão pode ser mediado de forma mais robusta por outras regiões. Nossos achados estão em desacordo com estudos em camundongos onde a superexpressão de ΔFosB no NAc (em que não se pode distinguir confiavelmente a casca versus o núcleo) produziu efeitos semelhantes a antidepressivos robustos em vários ensaios comportamentais (Vialou et al., 2010). Uma possível razão é que pode ser mais fácil ver o efeito de ΔFosB em modelos comportamentais de estresse severo, como o estresse de derrota social. O atual estudo de superexpressão investigou o comportamento semelhante à depressão na ausência de um estressor grave.

Consistentemente ao longo deste estudo, altos níveis basais de ΔFosB (por exemplo, de enriquecimento, estresse repetido ou cocaína) correlacionaram-se com a indução subseqüente mais fraca de ΔFosB. Isso pode representar um efeito teto, sem a indução adicional possível em cima dos níveis basais elevados da proteína. Também é possível que os níveis acumulados de ΔFosB possam voltar a inibir a indução adicional de mRNA de ΔFosB após estresse ou cocaína como um ciclo de realimentação negativa. Por exemplo, nos ERatos C apresentaram altos níveis de ΔFosB e mostraram uma indução atenuada de ΔFosB após estresse ou cocaína. Isso ressalta a correlação negativa entre os níveis de proteína ΔFosB e sua indução de mRNA. O feedback negativo da ΔFosB acumulada também é responsável pela indução atenuada de ΔFosB com estresse repetido em ratos IC.

Para ser claro, não fazemos nenhuma afirmação de que o paradigma do enriquecimento ambiental tenha relevância translacional direta, pois há muito poucas crianças criadas em privação real (deve-se notar que a privação socioeconômica não equivale à privação ambiental). A utilidade deste paradigma é que ele é uma manipulação não-farmacológica, não-cirúrgica e não-genética que produz fenótipos comportamentais protetores para dependência e depressão que podem ser explorados em um ambiente controlado por laboratório como uma ferramenta básica para identificar mecanismos moleculares. resiliência subjacente às condições psiquiátricas. Pesquisas anteriores descreveram os fenótipos comportamentais em detalhe (Bowling et al., 1993; Boliche e Bardo, 1994; Bardo et al. 1995; Green et al. 2002, 2003; El Rawas et al. 2009) e estudos mais recentes (Solinas et al., 2009; Green et al. 2010; Lobo et al. 2013), juntamente com o presente estudo, estão fornecendo pistas sobre os mecanismos transcricionais subjacentes a esses fenótipos comportamentais. Os genes / proteínas-alvo de transcrição a jusante que produzem os fenótipos protectores estão actualmente a ser investigados (Fan et al., 2013a,b; Lichti et al. 2014).

Nossa conceituação de enriquecimento ambiental é que o enriquecimento é um continuum com isolamento na extremidade inferior e enriquecimento total na extremidade alta. “O enriquecimento total, neste caso, é definido como um ambiente em que os sujeitos são expostos à novidade, ao contato social não ameaçador com os coespecíficos, e são permitidos espaço e objetos para o exercício. TTodos esses três fatores representam a condição composta de “enriquecimento”, porque cada um é recompensador e cada um libera dopamina no NAc e, como tal, ativa um circuito neurobiológico comum. (Louilot et al. 1986; Calcagnetti e Schechter, 1992; Crowder e Hutto, 1992; Rebec et al. 1997; Bevins et al. 2002). Nessa conceituação, o isolamento é considerado o grupo controle porque representa a ausência da manipulação (isto é, enriquecimento; Crofton et al., Em revisão). No entanto, outras conceituações são possíveis. Em uma conceituação alternativa, o continuum é o mesmo, mas o grupo de isolamento é o grupo experimental e o grupo enriquecido é o controle. Eun este modelo, privando os sujeitos de enriquecimento normal is a manipulação real. INeste caso, em vez de dizer que o enriquecimento é protetor, pode-se dizer que o isolamento confere suscetibilidade. Ainda uma terceira conceituação postula que não há continuum e que o enriquecimento e isolamento são duas manipulações fundamentalmente diferentes. Nessa visão, o enriquecimento e o isolamento devem ser separados e ambos comparados a um controle alojado em pares. A falta de um consenso universal quanto à natureza do enriquecimento representa uma limitação do paradigma, mas fornece orientação para futuros estudos. Independentemente disso, os resultados desses experimentos permanecem firmes, independentemente da interpretação subseqüente.

O ambiente e as experiências de vida têm uma forte influência no desenvolvimento e expressão de muitas condições psiquiátricas. Compreender o mecanismo dos fenótipos de dependência protetora e depressão do enriquecimento ambiental aborda uma questão fundamental na pesquisa sobre transtornos mentais, ou seja, a contribuição ambiental para a suscetibilidade ou resiliência às condições psiquiátricas. Este estudo ressalta a importância de ΔFosB na regulação de comportamentos relacionados a dependência. Em estudos futuros, a ação de ΔFosB e seus efeitos ativadores e inibitórios em genes alvo específicos precisam ser mais explorados dentro do modelo de enriquecimento ambiental.

Financiamento e divulgação

Yafang Zhang, nenhum; Elizabeth J. Crofton, nenhum; Dingge Li, nenhum; Mary Kay Lobo, nenhum; Xiuzhen Fan, nenhum; Eric J. Nestler, R37DA007359; Thomas A. Green, DA029091.

Declaração de conflito de interesse

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Esses experimentos foram financiados por doações do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas, DA029091 e R37DA007359. Cocaína fornecida pelo Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas.

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