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O Instituto Nathan Kline, Orangeburg, Nova York, 10962, EUA. [email protegido]
Sumário
Crianças e adolescentes estão cada vez mais expostos a psicoestimulantes, seja de forma ilícita ou para o tratamento de condições neuropsiquiátricas comuns, como o distúrbio de déficit de atenção com e sem hiperatividade. Apesar do uso disseminado de estimulantes psicomotores em grupos etários mais jovens, pouco se sabe sobre as respostas neuroadaptativas moleculares crônicas a esses agentes no cérebro imaturo. Aqui demonstramos que, após a administração crônica dos psicoestimulantes cocaína e anfetamina, o fator de transcrição DeltaFosB é regulada no núcleo accumbens de periadolescente camundongos mas não no pós-desmame ou adulto camundongos. Indução de DeltaFosB também ocorre exclusivamente no putâmen caudado de periadolescente camundongos depois de anfetamina administração. Estes resultados demonstram a plasticidade única no cérebro adolescente de uma molécula crítica que regula a ação psicoestimulante e sugere que essas mudanças neuroadaptativas podem estar envolvidas na mediação de aprimorada tendências adictivas no adolescente em relação ao adulto.
Introdução
Os psicoestimulantes são usados no tratamento de distúrbios comuns na infância, como o distúrbio de hiperatividade com déficit de atenção. Além disso, o abuso de estimulantes, incluindo anfetamina e cocaína, é comum entre os adolescentes, uma idade em que há evidências de tendências aditivas aumentadas em relação aos adultos (Estroff et al., 1989; Myers e Anderson, 1991). Apesar dos dados indicativos de efeitos comportamentais regulados no desenvolvimento, pouco se sabe sobre as respostas neuroadaptativas moleculares no cérebro imaturo que ocorrem durante o tempo de administração desses agentes. A cocaína e a anfetamina podem causar alterações comportamentais de longa duração, parcialmente por meio da estimulação da dopamina D1receptores e aumentos nos níveis de fatores de transcrição, incluindo ΔFosB, no estriado dorsal (isto é, putamen caudado) e no estriado ventral (isto é, nucleus accumbens) (Chen et al., 1997). O aumento nos níveis de ΔFosB, talvez por meio da estabilização dos produtos protéicos, é sustentado por várias semanas após exposição crônica à cocaína ou à anfetamina e é regulado pelo menos em parte pela via de transdução do sinal da dopamina (Chen et al., 1997; Nestler e outros, 2001).
O sistema dopaminérgico central de animais jovens está muito em fluxo como resultado da mudança dos níveis de moléculas críticas durante o desenvolvimento normal, incluindo a dopamina D1receptor DARPP-32 (dopamina e fosfoproteína regulada por cAMP; Mr de 32 kDa) e cAMP (Ehrlich et al., 1990;Teicher e outros, 1993; Perrone-Capano e outros, 1996; Tarazi et al., 1999;Andersen, 2002). A exposição durante esse período a psicoestimulantes, que aumentam a neurotransmissão dopaminérgica, pode, portanto, resultar em respostas moleculares quantitativas e / ou qualitativamente diferentes, incluindo alterações na expressão de ΔFosB. Para testar a hipótese de que existem respostas neuroadaptativas dependentes da idade durante a exposição crônica a psicoestimulantes, três grupos de camundongos foram analisados em experimentos em série: adultos (60 d antigo no início das injeções), periadolescente (33 d antigo no início das injeções), e pós-desmame (24 d antigo no início da injeção). Esta é a primeira comparação direta das respostas neuroadaptativas moleculares à exposição crônica ao psicoestimulante nesses três grupos etários. Descobrimos que, após paradigmas de tratamento idênticos, os camundongos periadolescentes exibem aumento da regulação de ΔFosB em resposta tanto à cocaína quanto à anfetamina.
MATERIAIS E MÉTODOS
Administração de animais e drogas. Ratinhos macho CD-1 (Charles River Laboratories, Kingston, NY) foram alojados num ciclo de luz / escuridão 12 h (6: 00 AM para 6: 00 PM) com ad libitumacesso a comida e água. Permitiu-se que os animais acomodassem ao quarto do animal durante um mínimo de 10 d antes do início das injecções. Os animais foram manipulados por dois investigadores que realizaram todas as injeções na mesma sala em que os animais foram alojados. Todos os animais foram desmamados a 21 d de idade. As injeções começaram em 24 (pós-desmame), 33 (periadolescente) ou 60 (adulto) d de idade. Os animais receberam 20 mg / kg de cocaína (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg de anfetamina (Sigma) ou um volume igual de solução salina por via intraperitoneal entre 4: 00 e 5: 00 PM por dia para 7 d. Animais foram mortos por decapitação após breve exposição a CO2 no 10: 00 AM no dia após a injeção final. Os cérebros foram imediatamente removidos do crânio e o putâmen e o núcleo accumbens caudados foram rapidamente dissecados em gelo. Todas as dissecções foram realizadas a partir de cortes cerebrais coronais por um único investigador, e os extractos proteicos foram preparados a partir de tecido fresco sem congelação. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e estavam de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde. Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
Análise de Western Blot. Para análises de Western blot, quantidades iguais de proteína (40 μg para putamen caudado e 20 μg para nucleus accumbens) de cada amostra foram carregadas em cada faixa de um gel de 10% SDS-poliacrilamida após a medição das concentrações de proteína com o ensaio BCA (Pierce, Rockford, IL). O carregamento igual de proteína foi também verificado pela visualização da proteína total por Ponceau Red após transferência para nitrocelulose e / ou transferência com anticorpo anti-actina (1: 500; Sigma). O anti-soro de antigénio relacionado com Fos (FRA), que reconhece as isoformas de ΔFosB, foi generosamente fornecido pelo Dr. M. Iadarola (Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, MD) e usado numa concentração de 1: 4000. Estudos anteriores (Chen et al., 1997; Hiroi et al., 1997), incluindo a pré-adsorção do anti-soro FRA com o imunogénio do péptido M, demonstraram a especificidade deste anti-soro. O anticorpo monoclonal DARPP-32 5a, usado em 1: 10,000, foi generosamente fornecido pelos drs. Hugh Hemmings e Paul Greengard (Universidade Rockefeller, Nova York, NY). O anticorpo transportador de dopamina (DAT) era de Chemicon (Temecula, CA). Os blots foram reagidos com o sistema de quimioluminescência NEN-DuPont (Boston, MA) e expostos a filme. Os valores densitomricos para a imunorreactividade AFosB foram obtidos utilizando ScanAnalysis para Apple (Biosoft, Ferguson, MO). A significância estatística foi determinada usando uma ANOVA unidirecional, seguida por post hoc Teste de comparação múltipla de Tukey ou de Student bicaudal não pareado t teste conforme indicado nas legendas das figuras. Para os experimentos de tratamento medicamentoso, a análise de cada faixa etária foi realizada em um blot separado, e, portanto, cada grupo salino foi arbitrariamente atribuído a um valor 100% para comparação entre grupos etários. Para os estudos de ontogenia, amostras de todas as faixas etárias foram analisadas juntas em um único blot.
PREÇO/ RESULTADOS
A indução de ΔFosB após cocaína e anfetamina ocorre no núcleo accumbens de apenas camundongos periadolescentes
A expressão de ΔFosB foi medida no nucleus accumbens e no caudate putamen de camundongos pós-desmame, periadolescentes e adultos após 7 d de administração de anfetamina ou cocaína. O nucleus accumbens é a região cerebral que se acredita ser a mais crítica para mediar os efeitos recompensadores dos psicoestimulantes. A imunorreatividade de ΔFosB (35 kDa) foi seletivamente induzida no nucleus accumbens de animais periadolescentes após administração crônica de anfetamina (Fig. 1 A) ou cocaína (Fig. 1 B). Em contraste, os níveis de ΔFosB (35 kDa) não foram significativamente alterados no nucleus accumbens de animais desmamados ou adultos (Fig.1 A,B). No putâmen caudado, os níveis de ΔFosB (35 kDa) também foram significativamente suprarregulados após a administração crônica de anfetamina somente em animais periadolescentes (Fig.2 A). Todos os três grupos de idade mostraram aumentos significativos na expressão de ΔFosB (35 kDa) no putâmen caudado após a administração crônica de cocaína (Fig.2 B). A magnitude da indução, no entanto, foi maior nos animais periadolescentes, particularmente em comparação com os pós-desmamados (Fig. 2 B). Outras isoformas FRA e Fos foram inalteradas em todas as faixas etárias (dados não mostrados).
Imunorreatividade de ΔFosB no nucleus accumbens após administração de psicoestimulantes crônicos. Camundongos CD-1 foram injetados uma vez ao dia com solução salina, anfetamina ou cocaína para 7 d começando no dia 24 (P24; pós-desmame), dia 33 (P33; periadolescent), ou dia 60 (Adulto). Níveis de imunorreatividade de ΔFosB (35 kDa) no nucleus accumbens são mostrados após anfetaminas crônicas (A) ou cocaína (B) administração. Imunotransferências representativas de solução salina (S), anfetamina- (A) e cocaína- (C) injetado após o desmame (P24), periadolescente (P33), e camundongos adultos são mostrados no painéis superiores. Painéis inferiores mostra a média ± porcentagem de SEM da expressão basal de ΔFosB. n valores para cada grupo são mostrados no barras. Aumentos significativos em ΔFosB foram encontrados no nucleus accumbens de apenas camundongos periadolescentes. *p <0.05; **p <0.01 (do aluno t teste; solução salina vs droga).
Imunorreatividade de ΔFosB no putâmen caudado após administração de psicoestimulantes crônicos. Camundongos CD-1 foram injetados uma vez ao dia com solução salina, anfetamina ou cocaína para 7 d começando no dia 24 (P24; pós-desmame), dia 33 (P33; periadolescent), ou dia 60 (Adulto). Níveis de imunorreatividade de ΔFosB (35 kDa) no putâmen caudado são mostrados após anfetaminas crônicas (A) ou cocaína (B) administração. Imunotransferências representativas de solução salina (S), anfetamina- (A) e cocaína- (C) ratinhos periadolescentes injectados (P33) são mostrados nopainéis superiores. Painéis inferiores mostra a média ± porcentagem de SEM da expressão basal de ΔFosB. n valores para cada grupo são mostrados no barras. Aumentos significativos na imunorreatividade de ΔFosB, induzidos por anfetaminas, foram encontrados no putâmen caudado de apenas camundongos periadolescentes (A). A administração crónica de cocaína produziu aumentos de ΔFosB nos três grupos etários (B). *p <0.05; **p <0.01 (do aluno t teste; solução salina vs droga).
Os níveis de DAT e DARPP-32 não são alterados após cocaína crônica ou anfetamina
Várias moléculas chave expressas por neurónios dopaminérgicos e / ou dopaminoceptivos, incluindo DARPP-32, o D1 receptor de dopamina, e DAT, contribuem para respostas agudas e crônicas a psicoestimulantes (Moratalla et al., 1996; Fienberg e outros, 1998; Sora et al., 1998; Gainetdinov et al., 2001). Dados de DARPP-32, D1 Os camundongos knock-down DAT null e DAT indicam uma complicada relação entre seus níveis, a regulação da atividade dopaminérgica e as respostas aos psicoestimulantes. De fato, a indução ΔFosB não ocorre em camundongos nulos DARPP-32 que recebem cocaína crônica (Fienberg e outros, 1998). No entanto, em ratinhos adultos, a exposição ao 7 d a 20 mg / kg de cocaína não altera os níveis totais de DARPP-32 (Fienberg e outros, 1998). A regulação da proteína DAT não foi relatada anteriormente em camundongos expostos cronicamente a psicoestimulantes, embora tenham sido relatadas alterações na ligação do radioligante ao transportador de dopamina após exposição a psicoestimulantes em algumas espécies (Letchworth e outros, 2001). Aqui medimos os níveis de proteína DARPP-32 e DAT para determinar se a expressão dessas proteínas é alterada após administração de psicoestimulantes crônicos em qualquer uma das três idades de camundongos. Nossos achados indicam que não houve mudanças significativas nos níveis de DARPP-32 total ou DAT em todo o putâmen caudado ou nucleus accumbens após a administração crônica de cocaína ou anfetamina em qualquer um dos três grupos etários (Tabela 1).
Valores relativos de densitometria para DARPP-32 e DAT em ratos P24, P33 e adultos tratados com anfetaminas e cocaína em relação ao controlo, valores salinos, arbitrariamente fixados em 100%
Os níveis basais de ΔFosB são regulados por desenvolvimento
Examinamos a ontogenia de ΔFosB, pois camundongos adultos com expressão aumentada geneticamente de ΔFosB no corpo estriado têm uma resposta comportamental elevada a psicoestimulantes (Kelz et al., 1999). Descobrimos que os níveis basais de ΔFosB foram significativamente menores nos animais mais jovens em comparação com os adultos tanto no putâmen caudado quanto no núcleo accumbens (Fig.3 A). Níveis de marcadores funcionais do sistema de dopamina, incluindo DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano e outros, 1996) e receptores de dopamina (Teicher e outros, 1993; Tarazi et al., 1999) também são regulados pelo desenvolvimento. Os relatórios anteriores em camundongos CD-1 indicam um pico no DARPP-32 do estriado no dia pós-natal 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). No rato putamen caudado e nucleus accumbens, D1pico dos níveis de receptores de P28 para P40 (Teicher e outros, 1993; Tarazi et al., 1999), mas estudos semelhantes não foram realizados no rato. Em contraste, aqui descobrimos que os níveis de proteína DAT no putâmen e no núcleo accumbens caudado eram constantes entre o dia pós-natal 24 e a idade adulta (Fig. 3 B). Assim, as relações relativas entre D1 receptores, DAT, DARPP-32 e ΔFosB diferem entre grupos etários, resultando potencialmente em diferenças em D1 atividade do receptor que poderia influenciar o grau de indução de ΔFosB.
Expressão de desenvolvimento de ΔFosB e DAT. A, Imunorreatividade ΔFosB (35-37 kDa) no putâmen e núcleo acudente caudado de camundongos CD-1 virgens em função da idade. Imunoblots representativos são mostrados no painéis superiores.Painéis inferiores mostra a média ± SEM de três ratos por grupo. *p <0.05, adulto versus P24; #p <0.05, adulto versus P36 (teste de comparação múltipla de Tukey após ANOVA). BValores densitométricos da imunorreatividade do DAT no putâmen caudado e no nucleus accumbens para camundongos inoculados com CD-1 em função da idade. Os níveis de DAT não diferiram entre os três grupos etários.
DISCUSSÃO
Os efeitos comportamentais dos estimulantes psicomotores são dependentes da idade. Tendências aditivas são mais altas na adolescência, quando o uso de substâncias ilícitas aumenta (Estroff et al., 1989; Myers e Anderson, 1991). De fato, crianças mais jovens freqüentemente se tornam disfóricas quando expostas a psicoestimulantes, enquanto adolescentes e adultos experimentam euforia (Rapoport e outros, 1980). Em modelos de roedores, alguns estudos sugerem que os animais periadolescentes têm níveis de atividade basal mais elevados (Lança e freio, 1983) e respostas alteradas aos psicoestimulantes em relação aos animais mais jovens e mais velhos. Assim, eles mostram menos estimulação locomotora e busca de novidades em resposta à administração aguda de baixa dose de psicoestimulantes em relação aos animais desmamados e adultos, mas aumentam a hiperatividade após o tratamento com altas doses. Com a administração crônica, a sensibilização à locomoção induzida pela cocaína é maior em ratos periadolescentes em comparação com adultos, enquanto a sensibilização à estereotipia é menor. Além disso, os dados de microdiálise revelaram diferenças entre ratos periadolescentes e adultos quanto à sensibilização à liberação de dopamina induzida por anfetaminas (Laviola et al., 1995; Adriani e outros, 1998; Adriani e Laviola, 2000;Laviola et al., 2001). No entanto, existem estudos conflitantes sobre a reatividade a longo prazo à cocaína após a administração de metilfenidato em ratos adolescentes (Brandon e outros, 2001; Andersen et al., 2002). Estes dois últimos relatórios destacam a dificuldade em comparar estudos quando diferentes paradigmas experimentais são utilizados. Tentativas de comparar estudos comportamentais em animais mais jovens são ainda mais confundidas pelo uso de diferentes espécies e linhagens.
O rato está se tornando um modelo animal cada vez mais importante no estudo do uso e abuso de psicoestimulantes, e esta é a primeira análise sistemática de respostas neuroadaptativas moleculares em três diferentes idades de desenvolvimento em camundongos ou em qualquer outra espécie única. Estudos anteriores dos quais derivamos nossos paradigmas de tratamento demonstraram um aumento na ΔFosB no estriado dorsal e ventral isolado de ratos adultos do tipo selvagem após a administração crônica de cocaína e anfetamina (Hope et al., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon et al., 1997) mas apenas no estriado dorsal e ventral combinado ou estriado dorsal isolado de camundongos adultos de tipo selvagem após cocaína crônica (Fienberg e outros, 1998; Zachariou e outros, 2001).
Nós agora demonstramos uma diferença espacial e quantitativa em ΔFosB induzido por psicoestimulante em camundongos pós-desmame, periadolescentes e adultos. A observação de uma resposta aumentada nos animais periadolescentes em comparação com adultos e pós-desmamados é reforçada pelo fato de que a resposta é similar em camundongos tratados com cocaína e anfetamina. Os psicoestimulantes cocaína e anfetaminas aumentam a dopamina sináptica, assim como a serotonina e norepinefrina, mas por mecanismos diferentes. A cocaína liga-se aos transportadores de plasmalema por dopamina, serotonina e norepinefrina e inibe sua recaptação em terminais pré-sinápticos. Em contraste, a anfetamina promove a liberação desses transmissores. A indução seletiva de ΔFosB no núcleo accumbens de apenas o grupo etário periadolescente após 7 d de administração de estimulantes e a indução relativamente aumentada de ΔFosB no putâmen caudado pode ser uma representação neurobiológica ou causa da tendência aumentada anteriormente observada de abuso de psicoestimulantes neste grupo de idade (Estroff et al., 1989; Myers e Anderson, 1991) e outras alterações a longo prazo na expressão gênica, que diferem entre grupos etários (Andersen et al., 2002). Além disso, essas diferenças podem ser intrinsecamente reguladas por alterações de desenvolvimento nos níveis de moléculas-chave, incluindo o próprio ΔFosB. As potenciais implicações das diferenças nos níveis basais de ΔFosB entre grupos etários são análogas às propostas para as diferenças entre as estirpes de rato (Haile e outros, 2001). De fato, nós antecipamos que diferenças semelhantes de cepas serão encontradas entre camundongos consanguíneos. Também é possível que camundongos de diferentes idades mostrem diferentes adaptações moleculares em áreas do cérebro que não o nucleus accumbens. Análises adicionais usando ratos periadolescentes com alterações geneticamente modificadas nos níveis de moléculas-chave e observações comportamentais concomitantes irão testar essas hipóteses.
Notas de rodapé
- Recebido Abril 8, 2002.
- Revisão recebida Agosto 6, 2002.
- Aceito Agosto 8, 2002.
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health / Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e Derrame NS41871 (MEE e EMU) e Instituto Nacional sobre Drug Abuse Grant P30-DA13429 (EMU).
A correspondência deve ser endereçada à Dra. Michelle E. Ehrlich, Universidade Thomas Jefferson, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Filadélfia, PA 19107. O email: [email protegido].
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