PSMC5, uma ATPase proteasomal 19S, regula a ação da cocaína no Núcleo Accumbens (2015)

PLoS One. 2015 de maio de 1110 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Nunca8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Sumário

ΔFosB é um fator de transcrição estável que se acumula no nucleus accumbens (NAc), uma parte fundamental do circuito de recompensa do cérebro, em resposta à exposição crônica à cocaína ou outras drogas de abuso. Embora ΔFosB seja conhecido por heterodimerizar com um membro da família Jun para formar um complexo de fator de transcrição ativo, até o momento não houve uma exploração em aberto de outros possíveis parceiros de ligação para ΔFosB no cérebro. Aqui, pelo uso de ensaios de dois híbridos de levedura, identificamos PSMC5 - também conhecido como SUG1, uma subunidade contendo ATPase do complexo proteassomal 19S - como uma nova proteína interagindo com ΔFosB. Verificamos tais interações entre ΔFosB endógeno e PSMC5 no NAc e demonstramos que ambas as proteínas também formam complexos com outras proteínas reguladoras da cromatina associadas à ativação do gene. Prosseguimos para mostrar que a cocaína crônica aumenta os níveis nucleares, mas não citoplasmáticos, de PSMC5 no NAc e que a superexpressão de PSMC5 nesta região do cérebro promove as respostas locomotoras à cocaína. Juntos, esses resultados descrevem um novo mecanismo que contribui para as ações do ΔFosB e, pela primeira vez, implica o PSMC5 na plasticidade molecular e comportamental induzida pela cocaína.

Citação: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, e outros. (2015) PSMC5, uma ATPase proteasomal 19S, regula a ação da cocaína no Núcleo Accumbens. PLoS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Editor acadêmico: James Edgar McCutcheon, Universidade de Leicester, REINO UNIDO

Recebido: Dezembro 10, 2014; Aceitaram: April 7, 2015; Publicado em: 11 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ohnishi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos do Licença Creative Commons Attribution, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão no papel.

Financiamento: Este trabalho foi financiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde, do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas e da Fundação Ishibashi e da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (números KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.

Introdução

ΔFosB, um produto truncado do FosB gene, pertence à família Fos de fatores de transcrição, que também incluem c-Fos, FosB de comprimento total, Fra-1 e Fra-2. ΔFosB, como outras proteínas Fos, heterodimeriza com uma proteína da família Jun - c-Jun, JunB ou JunD - para formar um complexo ativo de fator de transcrição AP-1 (ativador proteína-1), que induz ou reprime a expressão de genes alvo específicos [1,2].

ΔFosB foi mostrado para desempenhar um papel fundamental na toxicodependência [2]. Exclusivamente entre as proteínas da família Fos, ele se acumula no núcleo accumbens (NAc) e em outras regiões cerebrais relacionadas à recompensa após a administração repetida de medicamentos devido ao seu alto nível de estabilidade [3,4], que é mediada pela falta de domínios degron C-terminais e pela fosforilação por várias proteínas quinases [5-7]. Tal indução de ΔFosB no NAc media respostas comportamentais aumentadas a drogas de abuso. Assim, a superexpressão de ΔFosB nesta região do cérebro de animais adultos, seja pelo uso de vetores virais ou camundongos indutíveis bitransgênicos, aumenta a sensibilidade de um animal aos efeitos de ativação e recompensa locomotora da cocaína e opiáceos, bem como a motivação de um animal para auto-administração cocaína [7-11]. Por outro lado, a superexpressão de antagonistas negativos dominantes de ΔFosB causa fenótipos comportamentais opostos [10-12].

Nós e outros já confirmaram, através do uso de ensaios de mudança de gel, que JunD e talvez outras proteínas da família Jun são os principais parceiros de ligação de ΔFosB no cérebro in vivo [13-15]. No entanto, até o momento, não houve uma avaliação aberta e imparcial dos parceiros de ligação de ΔFosB no cérebro. Aqui, procuramos identificar novos parceiros de ligação para ΔFosB usando um ensaio de dois híbridos de levedura [16,17]. Nossos dados revelaram que o PSMC5, também conhecido como SUG1, é um parceiro robusto de ΔFosB in vitro e no NAc in vivo, onde se une a ΔFosB como parte de um complexo de ativação de transcrição induzido por cocaína, que também contém CBP ) e p300 - ambos histona acetiltransferases (HATs) - bem como BRG1 (uma proteína de remodelação da cromatina). Vamos mostrar que a exposição crônica à cocaína altera os níveis nucleares do PSMC5, uma subunidade ATPase do complexo proteassomal 19S, no NAc e que o PSMC5, por sua vez, controla as respostas comportamentais à cocaína.

Material e Métodos

Triagem de dois híbridos de levedura

As culas de levedura MaV203 (Invitrogen Life Technologies) foram co-transfectadas com pDBLeu que conduz fragmentos diferentes da protea? FosB e uma biblioteca de cebro de murganho foi subclonada em pPC86 (Invitrogen Life Technologies). As células transformadas foram cultivadas em meio SC sem leucina, triptofano e histidina e contendo 10 mM de 3-aminotriazole. A ligação entre os fragmentos de FosB e um parceiro candidato induz três genes repórteres (His3, Ura3 e LacZ), e a indução torna os transformantes capazes de sobreviver sob as condições de cultivo utilizadas. Os clones positivos foram novamente testados com fragmentos pDBLeu-AFosB frescos por ensaios de retransformao em culas MaV203.

Linhas de celular

Células de neuroblastoma Neuro 2A de camundongo (ATCC) foram mantidas em meio essencial mínimo de Eagle (EMEM) (ATCC), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C e 5% de CO2. Células de rato 1A foram presentes de Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japão) [18] e mantido em MEM (DMEM) da Dulbecco (Life Technologies), suplementado com 10% FBS a 37 ° C e 5% CO2. A transfec�o de c�ulas com ADN plasm�ico foi realizada utilizando Effectene (Qiagen) de acordo com as instru�es do fabricante.

Construções PSMC5 e ΔFosB

Várias formas mutantes de PSMC5, cada uma marcada com FLAG no seu terminal N, foram geradas para utilização em imunoprecipitação ou experiências de transferência de genes mediadas por vírus. Estes incluíram: PSMC5-K196M, domínio de espiral enrolada PSMC5-((PSMC5-ΔCC, aminoácidos ausentes 27-68), PSMC5-NT (consistindo no fragmento N-terminal da proteína, aminoácidos 1-151) e PSMC5 -CT (consistindo no fragmento C-terminal da proteína, aminoácidos 172) (ver Fig 1). Nós também utilizamos formas N-terminais marcadas com MYC de ΔFosB de tipo selvagem bem como ΔFosB com uma mutação em seu domínio zíper de leucina (mutação de aminoácidos 182 a 205 que é conhecido por obliterar heterodimerização com proteínas da família Jun [6].

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Fig 1. ΔFosB liga-se a PSMC5 in vitro.

 

A. Esquema de ΔFosB, ΔFosB-LZM em que o domínio de fecho de leucina é mutado para obliterar a heterodimerização de ΔFosB com proteínas Jun e X2ΔFosB que não possui os primeiros aminoácidos 78 do terminal N de FFosB. B. Esquema de PSMC5, PSMC5-NT que compreende os primeiros aminoácidos 151 de PSMC5, PSMC5-CT aos quais faltam os primeiros aminoácidos 235 de PSMC5 e PSMC5-ΔCC aos quais falta o domínio de bobina enrolada (aminoácidos 28-68) . O domínio AAA corresponde a um motivo, ATPases Associadas a diversas Atividades celulares, presentes em muitas ATPases. C. 2.4 μg de pcDNA3.1-ΔFosB (pistas 1 – 4) ou FFosB-LZM (linha 5) foram co-transfectadas com 2.4 μg de PSMC5 marcado com FLAG ou vários mutantes de deleção em células Neuro2a. Dois dias ap� a transfec�o, as c�ulas foram lisadas e submetidas a imunoprecipita�o com um anticorpo anti-FLAG e depois transferidas por Western com anticorpo anti-AFosB ou anti-FLAG. Observe que ΔFosB, mas não ΔFosB-LZM, liga-se de maneira robusta a PSMC5 ou PSMC5-NT, mas não a PSMC5-CT ou PSMC5-ΔCC. Os dados mostrados na figura foram replicados em triplicado em cada uma das três experiências separadas.

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Animais

Foram utilizados ratinhos machos C11BL / 57J de nove a 6 semanas (The Jackson Laboratory) para todas as experiências. Os animais foram alojados num ciclo 12-h claro-escuro com acesso a alimentos e água ad libitum e foram habituados 1 semana antes da experimentação. Dois regimes de tratamento com cocaína foram utilizados. Para estudar os efeitos bioquímicos da cocaína, os animais receberam doses diárias de 7 de cocaína (20 mg / kg) ou solução salina e foram mortos por decapitação 24 h após a última injecção. Este é um protocolo padrão, que foi mostrado para produzir inúmeras respostas moleculares e celulares para a droga [7]. Para estudar a influência do PSMC5 no nucleus accumbens sobre as respostas comportamentais à cocaína, usamos uma dose sublimiar do fármaco (7.5 mg / kg; ver Sensibilização Locomotora abaixo) com base na hipótese de que PSMC5 aumentaria a sensibilidade de um animal para cocaína [8]. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee no Mount Sinai.

Imunoprecipitação e Western blotting

As células Neuro 2A foram transfectadas com formas selvagens ou mutantes de PSMC5. Dois dias após a transfecção, as células foram lavadas em PBS, lisadas em tampão RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% desoxicolato de sódio, 10 mM butirato de sódio, inibidor da protease) . Os lisados ​​foram separados e incubados com IgG não imune (Sigma) ou anticorpos anti-FLAG (Sigma) para 3 hr a 4 ° C. A imunoprecipitação foi realizada com esferas de Proteína G (Invitrogen) como descrito [19]. Resumidamente, prote�as imunoprecipitadas foram submetidas a SDS-PAGE e analisadas por Western blotting utilizando anticorpo anti-FosB / AFosB (Cell Signaling Technology) com base em protocolos publicados [7]. Para ensaios de ligação proteica in vivo, utilizámos fracções nucleares purificadas a partir de NAc dissecado por punch de ratinhos após tratamento crónico com cocaína (20 mg / kg IP diariamente durante 7 dias, com ratinhos utilizados 24 h após a última injecção). A co-imunoprecipitação das frações nucleares foi realizada utilizando o kit Co-IP do Complexo Nuclear (Motivo Ativo) seguindo as instruções do fabricante. Foram utilizados os seguintes anticorpos: MYC ou ß-actina, Cell Signaling Technology (Danvers, MA), PSMC5 e histona H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 e BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) e BANDEIRA M2, Sigma.

Imunohistoquímica

A imuno-histoquímica foi realizada de acordo com os procedimentos publicados [20]. Os ratinhos foram anestesiados e perfundidos intracardialmente com 4% paraformaldeo em PBS. Os cebros foram crioprotegidos com 30% de sacarose e depois congelados e armazenados a -80 atserem utilizados. Cortes coronais (40 μm) foram cortados em criostato e processados ​​para imunohistoquímica. As secções de flutuação livre foram pré-incubadas num tampão de bloqueio contendo 0.3% Triton e 3% de soro de burro normal. A ΔFosB foi detectada utilizando um anticorpo policlonal de cabra criado contra a porção N-terminal da proteína (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). O PSMC5 foi detectado utilizando um anticorpo policlonal de coelho (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). As imagens foram tiradas com um microscópio confocal (60x magnification; Zeiss).

Sensibilização locomotora

Todos os ratos receberam injeções diárias de solução salina IP por 3 dias para habituá-los ao estresse das injeções. No dia seguinte, os ratinhos foram injectados IP com solução salina ou uma dose sublimiar de cocaína (7.5 mg / kg; ver em Animais acima) e colocados imediatamente em novas caixas de locomoção. A actividade locomotora dos ratinhos foi registada utilizando um sistema de fotobolhas como interrupções do feixe ambulatório para 30 min. Estes tratamentos foram repetidos diariamente durante 3 dias.

Transferência gênica mediada por vírus

Utilizamos métodos extensamente publicados para transferência gênica mediada por vírus [7,8,11,19]. Resumidamente, plasm�eos de express� para PSMC5 ou para v�ios dos seus mutantes (ver as constru�es PSMC5 e? FosB acima) foram subclonados no plasm�eo p1005 (+) HSV bicistr�ico expressando GFP sob o controlo do promotor CMV, e PSMC5 ou seus mutantes sob o do promotor CMV. Promotor IE4 / 5. Sob anestesia com quetamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg), os ratos foram posicionados num instrumento estereotáxico de pequenos animais e a superfície craniana foi exposta. Trinta e três agulhas de seringa de calibre foram utilizadas para infundir bilateralmente 0.5 μl de um vetor HSV no NAc em um ângulo 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) a uma taxa de XUMUM 0.1 / min. Animais que receberam injeções de HSV foram autorizados a recuperar por 2 dias após a cirurgia antes da experimentação.

Estatísticas

ANOVAs e testes t de Student foram usados, corrigidos para comparações múltiplas, com significância estabelecida em p <0.05.

Consistentes

PSMC5: novo parceiro de ligação de ΔFosB

Realizamos experimentos preliminares para identificar um fragmento apropriado de ΔFosB que serviu como isca em um ensaio de dois híbridos de levedura sem autoativar o sistema. Holo-ΔFosB induziu atividade do gene repórter por conta própria, assim como o fragmento de aminoácido 1-78 N-terminal da proteína. No entanto, um ΔFosB truncado em N-terminal (Fig 1A), denominado Δ2ΔFosB, que não possui os primeiros aminoácidos 78 da proteína, não teve este efeito. Portanto, usamos Δ2ΔFosB como a proteína isca.

Para rastrear possíveis parceiros de ligação, usamos uma biblioteca de cérebro de rato subclonada em pPC86. Identificamos candidatos 11 para parceiros de ligação. Embora essas proteínas incluíssem os parceiros de heterodimerização conhecidos de FFosB, c-Jun e JunD (tabela 1), o candidato mais prevalente foi de longe o PSMC5. Embora surpreendente, este foi um achado interessante, uma vez que o PSMC5 foi mostrado em um único relatório anos atrás para se ligar a c-Fos in vitro [21]. No entanto, não há relatos anteriores de envolvimento do PSMC5 na ação da cocaína. No entanto, devido à força do sinal PSMC5 no ensaio de dois híbridos de levedura, nos propusemos a estudar melhor as possíveis interações de ΔFosB-PSMC5.

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Tabela 1. Resultados da pesquisa de dois híbridos de levedura com Δ2ΔFosB.

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Primeiro, para confirmar a interação física entre ΔFosB e PSMC5, realizamos experimentos de co-imunoprecipitação in vitro. Descobrimos que PSMC5 com a tag FLAG (Fig 1B), transfectadas em células Neuro 2A, efetivamente retiraram ΔFosBFig 1C). Segundo, para identificar a região em PSMC5 que é responsável por sua ligação a ΔFosB, geramos vários mutantes PSMC5 marcados com FLAG (Fig 1B) e repetiu a experiência de co-imunoprecipitação. ΔFosB foi efetivamente reduzido com os aminoácidos 151 N-terminais de PSMC5 (PSMC5-NT), mas não com o fragmento de aminoácido 172 C-terminal da proteína (PSMC5-CT) (Fig 1C). PSMC5 sem o seu domínio bobinado (PSMC5-ΔCC) também foi ineficaz na precipitação de ΔFosB. Estas descobertas sugerem que PSMC5 se liga a ΔFosB através do seu domínio espiral enrolado (aminoácidos 27-68). Além disso, PSMC5 com marcação FLAG não precipitou uma forma mutante de ΔFosB com um domínio de zíper de leucina mutado (ΔFosB-LZM) (Fig 1C), indicando que ΔFosB se liga a PSMC5 através deste domínio ou, mais provavelmente, que a heterodimerização ΔFosB é necessária para a ligação de PSMC5.

Ligação de PSMC5-ΔFosB em NAc após administração crônica de cocaína

Com base nesses achados in vitro, estudamos se os níveis de PSMC5 no NAc estão alterados em resposta à administração crônica de cocaína. Nós descobrimos por fracionamento subcelular e Western blotting que a cocaína crônica aumenta os níveis nucleares de PSMC5 nesta região do cérebro sem uma alteração nos níveis citoplasmáticos (Fig 2A). Este efeito não foi observado após doses únicas de cocaína (dados não mostrados). Em seguida, examinamos a localização de PSMC5 e ΔFosB em NAc por microscopia de imunofluorescência confocal. Analisamos camundongos 24 h após a última dose repetida de cocaína, um momento em que ΔFosB é a única dose detectável. FosB produto do gene (veja Nestler 2008). Encontramos forte imunorreatividade do PSMC5 no NAc, incluindo um forte sinal nuclear. ~ 85% de núcleos ΔFosB + co-corados para PSMC5 (Fig 2B). Além disso, realizamos experimentos de co-imunoprecipitação em extratos de NAc e descobrimos que, após o tratamento crônico com cocaína, ΔFosB foi eficientemente reduzido por um anticorpo anti-PSMC5 (Fig 2C). Em contraste, a análise do NAc virgem de droga (após repetidas injeções de solução salina) não revelou nenhum desvio de ΔFosB detectável (dados não mostrados). Estes dados são consistentes com nossos achados em cultura de células e confirmam que ΔFosB e PSMC5 interagem no NAc in vivo.

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Fig 2. Regulação PSMC5 no NAc do mouse.

 

A. Western blotting de frações nucleares e citosólicas de NAc de camundongos tratados diariamente com solução salina ou cocaína (20 mg / kg) por 7 dias, com os animais analisados ​​24 horas após a última injeção. A cocaína aumenta os níveis nucleares, mas não citosólicos, de PSMC5. Histona H3 e ß-actina, que não foram afetadas pela cocaína, foram usadas como controles de carga. Os dados são média ± SEM (n = 8–10 / grupo, * p <0.05). B. A co-localização de PSMC5 endógeno (verde) e ΔFosB (azul) em NAc de camundongos tratados cronicamente com cocaína como em AC Nuclear lisados ​​de NAc de camundongo após tratamento com cocaína crônica foram submetidos a imunoprecipitação com anticorpo anti-PSMC5 ou IgG de camundongo como controle e então Western blotted com anticorpo anti-FosB / ΔFosB. A figura demonstra as interações PSMC5-ΔFosB no NAc in vivo. Os dados em B e C foram replicados em triplicado em cada um dos três experimentos separados.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 aumenta a expressão de ΔFosB in vitro

Como o PSMC5 é um membro conhecido do complexo proteassoma, testamos se ele regula os níveis de ΔFosB usando células 1A de Rato. A superexpressão de PSMC5 não teve efeito sobre os níveis basais de ΔFosB, mas causou um aumento pequeno, mas significativo, da indução de ΔFosB na estimulação sérica das células (Fig 3A). Uma tendência semelhante foi observada para o FosB de comprimento total, mas o efeito não alcançou significância estatística. Por outro lado, a supressão da expressão endógena de PSMC5 em células Rat 1A, alcançada pelo uso de siRNAs que visam PSMC5, não afetou os níveis basais de ΔFosB, mas inibiu fortemente a indução de ΔFosB por estimulação sérica (Fig 3B). Efeitos similares foram vistos para o FosB de comprimento total. Estes dados sugerem que o PSMC5 não promove a degradação proteasomal de ΔFosB, como seria de esperar como uma subunidade central do proteassoma, mas é necessário para a acumulação máxima de FosB produtos de genes in vitro, talvez através da estabilização das proteínas.

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Fig 3. Regulação de PSMC5 da expressão de FosB / ΔFosB em células Rat 1A.

 

A. As células 1A de rato foram transfectadas com 4 μg de PSMC5 ou DNA de controle. A superexpressão de PSMC5 não teve efeito sobre os níveis de expressão basal de FosB ou proteína ΔFosB conforme determinado por Western blotting, mas produziu um aumento pequeno, mas significativo na indução de ΔFosB por estimulação sérica (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. As células IA de rato foram transfectadas com 1 pmol de qualquer um de dois siRNAs ou RNA codificado (controle). Ambos os siRNAs diminuíram efetivamente os níveis de proteína PSMC5 em comparação com as condições de controle (siRNA # 5, 1 ± 23% do controle; siRNA # 5, 2 ± 18%; p <6; n = 0.05). O knockdown de PSMC4 não teve efeito sobre os níveis basais de FosB ou ΔFosB, mas atenuou a indução de FosB e ΔFosB por estimulação sérica (FosB: F (5) = 2,6, p = 20.99; ΔFosB: F (0.002) = 2,6 , p = 22.83).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB e PSMC5 formam complexos com CBP, p300 e BRG1 em NAc

Para entender melhor os mecanismos de transcrição pelos quais o PSMC5 pode influenciar a função ΔFosB, investigamos possíveis parceiros de ligação adicionais para as duas proteínas no NAc sob condições crônicas tratadas com cocaína. Há um relato de que o PSMC5 se liga ao CBP - um HAT - e aumenta a acetilação da histona H3 no promotor proximal do MHC-II em células HeLa [22]. Além disso, camundongos deficientes em CBP apresentaram sensibilidade comportamental à cocaína, bem como redução da acetilação de histonas no FosB promotor [23]. Assim, testamos se PSMC5 pode se ligar a ΔFosB como parte de complexos que também contêm CBP e talvez outros ativadores transcricionais.

Primeiro demonstramos que ΔFosB efetivamente derrubou tanto o CBP quanto o p300, um HAT relacionado, em células Neuro2A (Fig 4A). Em contraste, a forma mutante de zíper de leucina de ΔFosB, como esperado, não exibiu essa atividade. Da mesma forma, o PSMC5 efetivamente desativou o CBP eo p300 (Fig 4B). Curiosamente, este efeito também foi observado para PSMC5-ΔCC, que não reduziu ΔFosB, indicando que PSMC5 interage com CBP e p300 através de outros domínios da proteína e independentemente da sua ligação a ΔFosB.

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Fig 4. ΔFosB e PSMC5 interagem com CBP, p300 e BRG1 in vitro e in vivo.

 

A. As células Neuro2A foram transfectadas com 2.4 μg de ΔFosB-LZM marcado com MYC FFosB ou MYC-marcado. Os extractos celulares foram imunoprecipitados com anticorpo anti-CBP ou anti-p300 e os precipitados foram transferidos por Western com o mesmo anticorpo ou com anticorpo anti-MYC. Tanto o CBP quanto o p300 interagem com ΔFosB e tais interações requerem um zíper de leucina intacto. B. As células Neuro2A foram transfectadas com 2.4 μg de PSMC5 marcado com FLAG ou PSMC5-ΔCC marcado com FLAG. Os extractos celulares foram imunoprecipitados com anticorpo anti-CBP ou anti-p300, e os precipitados foram transferidos por Western com o mesmo anticorpo ou com anticorpo anti-FLAG. Tanto o CBP quanto o p300 interagem com o PSMC5 e essas interações não exigem o domínio CC. C. Os lisados ​​nucleares de NAc de ratinho após tratamento crónico com cocaína foram sujeitos a imunoprecipitação com anticorpo anti-CBP ou anti-p300. A transferência subsequente de Western dos precipitados resultantes com o anticorpo anti-FosB / ΔFosB mostrou interacções endógenas entre ΔFosB e CBP / p300. D. Alíquotas dos mesmos lisados ​​nucleares foram submetidas a imunoprecipitação com anticorpo anti-BRG1 ou anti-PSMC5, seguido por Western blotting de precipitados com anticorpo anti-FosB / ΔFosB ou anti-BRG1. Os resultados mostram interações endógenas entre ΔFosB e BRG1, e BRG1 e PSMC5. E. Ilustração esquemática do complexo de ativação transcricional composto de heterodímeros ΔFosB: JunD interagindo com CBP / p300, BRG1 e PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Para confirmar que essas interações também ocorrem in vivo, nós administramos cocaína cronicamente para induzir os níveis de ΔFosB e nuclear de PSMC5, então os extratos de NAc imunoprecipitados com anticorpos anti-CBP ou anti-p300. Consistente com os nossos dados de cultura de células, a imunoprecipitação de CBP ou de p300 removeu eficazmente ΔFosB (Fig 4C). Nós testamos se BRG1, uma subunidade central do complexo de remodelação de cromatina SWI-SNF, também pode se ligar a ΔFosB e PSMC5, com base em nossa descoberta anterior de que BRG1 é recrutado para certos genes alvo ΔFosB em conjunto com sua ativação no NAc após cocaína crônica24]. Descobrimos que a imunoprecipitação de BRG1 reduziu ΔFosB nos extratos de NAc e que a imunoprecipitação de PSMC5 também do BRG1 endógeno coprecipitado (Fig 4D). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que ΔFosB-PSMC5 formam complexos no NAc que também incluem CBP / p300 e BRG1 (Fig 4E).

A superexpressão do PSMC5 aumenta as respostas locomotoras à cocaína

A ligação proeminente de PSMC5 com ΔFosB na NAc levou-nos a investigar se o aumento dos níveis de PSMC5 nesta região do cérebro regula as respostas comportamentais à cocaína. Geramos um vetor de Vírus de Herpes Simplex (HSV) que superexpressa o PSMC5 de tipo selvagem ou um de seus mutantes e validamos os vetores no NAc in vivo (Fig 5A). A expressão mediada por vírus de PSMC5 predomina no núcleo celular (Fig 5B). Camundongos superexpressando PSMC5 de tipo selvagem não apresentaram respostas alteradas para doses iniciais de cocaína, mas exibiram ativação locomotora aumentada em resposta a doses repetidas de cocaína em comparação com camundongos controle que expressam GFP. Em contraste, camundongos superexpressando uma forma mutante de PSMC5 que não possui seu domínio de bobina enrolada (PSMC5-ΔCC) não exibiram esse efeito (Fig 5B). Interessantemente, a superexpressão de PSMC5-K196M, que não possui a atividade ATPásica da proteína do tipo selvagem, também potencializou as respostas locomotoras da cocaína.

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Fig 5. A superexpressão do PSMC5 no NAc aumenta as respostas locomotoras à cocaína.

 

A. Expressão de transgene mediada por HSV representativa em NAc medial. AC, comissura anterior. As sub-regiões do núcleo e do shell do NAc estão indicadas na figura. B. Ampliações maiores representativas (60x) de coloração imuno-histoquímica de PSMC5 em neurônios NAc após injeção de HSV-PSMC5 mostrando que a proteína é predominantemente nuclear, conforme marcado por coloração DAPI. C. Os camundongos receberam injeções bilaterais de HSV em NAc seguidas por injeções IP diárias de doses subliminares de cocaína (7.5 mg / kg). As respostas locomotoras são mostradas em resposta à primeira e à última das 3 doses diárias da droga. A superexpressão de PSMC5 ou PSMC5-K196M aumenta as respostas locomotoras à cocaína repetida, um efeito não observado com PSMC5-ΔCC. Não houve efeito significativo dos transgenes nas respostas locomotoras às doses iniciais de cocaína. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 pelo teste posthoc de Dunnett.

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Discussão

Os resultados do presente estudo revelam um novo mecanismo pelo qual ΔFosB medeia seus efeitos sobre o cérebro e um novo mecanismo envolvido na ação da cocaína. Utilizando uma abordagem imparcial, um ensaio de dois híbridos de levedura, identificamos PSMC5 como um novo parceiro de ligação para ΔFosB. Nós validamos este achado tanto em células cultivadas in vitro quanto no NAc in vivo demonstrando robusta ligação de PSMC5-ΔFosB. É importante ressaltar que os níveis nucleares de PSMC5 são induzidos em NAc pela administração crônica de cocaína. Mostrámos ainda que a ligação de PSMC5-ΔFosB ocorre em conjunto com várias outras proteínas activadoras da transcrição, nomeadamente CBP e p300 (duas HATs) e BRG1 (um constituinte chave dos complexos de remodelação da cromatina SWI-SNF). Juntos, nossos achados suportam a hipótese de que PSMC5 é parte do complexo de ativação transcricional que é recrutado para pelo menos certos genes induzidos por ΔFosB durante um curso de administração crônica de cocaína (Fig 4E). Consistente com essa hipótese está o achado adicional de que a superexpressão do PSMC5 no NAc, como a superexpressão do próprio ΔFosB, promove respostas comportamentais à cocaína. Seria interessante em estudos futuros acompanhar essas observações in vivo com a caracterização das interações de PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 pelo uso de ensaios de repórter in vitro.

O envolvimento do PSMC5 na ação da cocaína é completamente novo. Identificado inicialmente como membro de uma grande família de ATPases que compõem o proteassoma, o PSMC5 demonstrou ao longo dos anos interagir com vários fatores de transcrição, incluindo c-Fos, p53, receptores de hormônios nucleares e constituintes do complexo de transcrição basal.25], no entanto, poucos estudos funcionais foram realizados ao longo dos anos [26]. Sua ação mais bem estabelecida é promover a atividade de fatores de transcrição MYC em células cultivadas [27]. A implicação do PSMC5 em mecanismos de transcrição sugeriu um papel potencial para a atividade ubiquitination-proteasomal na regulação da transcrição do gene, mas o envolvimento do PSMC5 em tal regulação permanece virtualmente não testado até o momento [28,29].

Muito pouco se sabe sobre a função PSMC5 no cérebro. Um estudo anterior demonstrou ampla expressão do mRNA PSMC5 em todo o cérebro [30], mas a sua atividade funcional não foi estudada. Nossos achados agora sugerem novas investigações desta proteína interessante para entender melhor o seu papel na regulação da transcrição gênica e sua relação com a função ubiquitinação-proteasomal no cérebro. A ligação de PSMC5 a ΔFosB é mediada pelo domínio bobina enrolada de PSMC5. Além disso, a capacidade do PSMC5 de promover respostas locomotoras à cocaína, embora exijam o domínio da espiral enrolada, não requer a atividade da ATPase intrínseca à proteína. Estes resultados levantam a possibilidade de que, pelo menos em nosso sistema, a principal atividade do PSMC5 possa ser mediada por sua ligação a ΔFosB e outras proteínas reguladoras da transcrição e não por sua atividade relacionada com o proteassoma per se. É necessário mais trabalho para testar diretamente essas possibilidades e alternativas. A hipótese de que a superexpressão mediada por vírus de PSMC5 aumenta a resposta locomotora à cocaína via interações com ΔFosB é plausível, apesar do uso de um regime de tratamento de cocaína 3 day, porque é conhecido que níveis apreciáveis ​​de ΔFosB se acumulam no cérebro dentro deste período de tempo [3].

As presentes descobertas reforçam a utilidade do uso de abordagens experimentais imparciais e abertas no estudo da base molecular da regulação cerebral. Nossa atenção inicial ao PSMC5 foi baseada somente em sua ligação proeminente a ΔFosB em um ensaio de dois híbridos de levedura, embora pareça ser um componente importante de mudanças transcricionais que são recrutadas em NAc pela administração repetida de cocaína. Uma melhor compreensão dos mecanismos detalhados pelos quais os níveis nucleares de PSMC5 são induzidos pela cocaína e, por sua vez, pelos quais o PSMC5 então contribui para os complexos de ativação transcripcional induzidos pela cocaína são o foco das investigações atuais. Entretanto, o nosso ensaio de dois híbridos de levedura revelou vários parceiros de ligação putativos adicionais de ΔFosB (tabela 1), que também agora justifica o exame direto em modelos de cocaína. Juntos, este trabalho está contribuindo para uma crescente compreensão dos complexos mecanismos moleculares através dos quais a cocaína altera a função do NAc.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas, e pela Fundação Ishibashi e da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (números KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010).

Contribuições do autor

Concebido e projetado os experimentos: YHO YNO EJN. Realizou os experimentos: YHO YNO PJK RN. Analisou os dados: YHO YNO EJN. Reagentes / materiais / instrumentos de análise: TN MO OY AN RN TT. Escreveu o artigo: YHO EJN.

Referências

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Genes imediatos precoces: dez anos depois. Tendências Neurosci 18: 66 – 67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Mecanismos transcricionais de dependência: papel de deltaFosB. Philos Trans R Soc Londres B Biol Sci 363: 3245-3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. pmid: 18640924
  3. Ver artigo
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Ver artigo
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Ver artigo
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Ver artigo
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Ver artigo
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Ver artigo
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Ver artigo
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Ver artigo
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Ver artigo
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Ver artigo
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Ver artigo
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Ver artigo
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Ver artigo
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Ver artigo
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Ver artigo
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Ver artigo
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Ver artigo
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Ver artigo
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Ver artigo
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Ver artigo
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Ver artigo
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Ver artigo
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Ver artigo
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Ver artigo
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Ver artigo
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Ver artigo
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Ver artigo
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Ver artigo
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Ver artigo
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Esperança BT, Nye HE, Kelz MB, Auto DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. (1994) Indução de um complexo AP-1 de longa duração composto de proteínas alteradas semelhantes a Fos no cérebro por cocaína crônica e outros tratamentos crônicos. Neurônio 13: 1235 – 1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB camundongos mutantes: Perda de indução crônica de cocaína de proteínas relacionadas a Fos e sensibilidade aumentada aos efeitos psicomotores e recompensadores da cocaína. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Regulação da estabilidade de ΔFosB por fosforilação. J Neurosci 26: 5131 – 5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi, YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) A ausência do domínio degron C-terminal conservado contribui para a estabilidade única de ΔFosB. Eur J Neurosci 25: 3009-3019. pmid: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, J Feng, Kourrich S, Collins M, et al. (2013) As respostas comportamentais e estruturais à cocaína crônica requerem um loop de feed-forward envolvendo ΔFosB e CaMKII na casca do nucleus accumbens. J Neurosci 33: 4295 4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. pmid: 23467346
  95. 8. Kelz MB, J Chen, Carlezon WA Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, et al. (1999) A expressão do fator de transcrição ΔFosB no cérebro controla a sensibilidade à cocaína. Natureza 401: 272 – 276. pmid: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB aumenta o incentivo à cocaína. J Neurosci 23: 2488 – 2493. pmid: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulação da expressão gênica e recompensa de cocaína pelo CREB e DFosB. Nat Neurosci 11: 1208-1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, K. Cassidy, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: Um papel essencial para ΔFosB no nucleus accumbens na ação da morfina. Nature Neurosci 9: 205-211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, T Carle, Ulery P, et al. (2003) A expressão indutível da região cerebral de um mutante dominante negativo de c-Jun em camundongos transgênicos diminui a sensibilidade à cocaína. Res do cérebro 970: 73 – 86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Regulação de proteínas delta FosB e FosB por convulsões eletroconvulsivas e cocaína. Mol Pharmacol 48: 880-889. pmid: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, YeH, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) Papel essencial do gene fosB nas ações moleculares, celulares e comportamentais das crises eletroconvulsivas. J Neurosci 18: 6952 – 6962. pmid: 9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP O parkinsonismo é acompanhado pela expressão persistente de uma proteína semelhante a D-FosB nas vias dopaminérgicas. Mol Brain Res 53: 41-52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Convertendo um inibidor da transcrição eucariótica em um ativador. Célula 55: 443 – 446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Campos S (1991) O sistema de dois híbridos: um método para identificar e clonar genes para proteínas que interagem com uma proteína de interesse. Proc Natl Acad Sci EUA 88: 9578 – 9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Ativação proliferativa de células Rat-1A quiescentes por delta FosB. Biol de Células Mol 13: 4157 – 4166. pmid: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Papel essencial da poli (ADP-ribosil) atião na ação da cocaína. Proc Natl Acad Sci EUA 111: 2005 – 2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. pmid: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Labirinto I, Yazdani S, e outros. (2008) Padrões distintos de indução ΔFosB no cérebro por drogas de abuso. Sinapse 62: 358 – 369. doi: 10.1002 / syn.20500. pmid: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996), Mamífero Sug1 e c-Fos no proteassoma nuclear 26S. Proc Natl Acad Sci EUA 93: 8236 – 8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues O 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, BK KP, McNeal S, et al. (2008) Regulação da acetilação no promotor proximal da classe II do complexo de histocompatibilidade principal pela ATPase proteasomal 19S Sug1. Biol de Células Mol 28: 5837 – 5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. pmid: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, XuS, ER Kandel, Schwartz JH (2005) A protea de ligao a CREB controla a resposta cocaa acetilando histonas no promotor fosB no corpo estriado de ratinho. Proc Natl Acad Sci EUA 102: 19186 – 19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, K Choi, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, et al. (2005) O remodelamento da cromatina é um mecanismo chave subjacente à plasticidade induzida pela cocaína no estriado. Neurônio 48: 303 – 314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Funções duais para reguladores transcricionais: mito ou realidade. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Interações de subunidades reguladoras do proteossomo 26S, um problema complexo. Tendências Biochem Sci 25: 83 – 88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, LG Larson (2003) Implicação do sistema ubiquitina / proteassoma na transcrição regulada por myc. Ciclo Celular 2 – 5: 403 – 407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitina e proteassomas na transcrição. Annu Rev Biochem 81: 177 - 201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. pmid: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) O proteassoma: uma ferramenta de utilidade para transcrição? Curr. Genet Dev 16: 197 – 202. pmid: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Identificação de um membro da família Sug1 CAD filogeneticamente conservado que é diferencialmente expresso no sistema nervoso de camundongo. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5