J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
fonte
Departamento de Psiquiatria, Centro de Neurociências Básicas, Centro Médico Southwestern da Universidade do Texas, Dallas, Texas 75390-9070, EUA.
Sumário
O fator de transcrição DeltaFosB (também conhecido como FosB2 ou FosB [forma abreviada]) é um importante mediador da plasticidade a longo prazo induzida no cérebro pela exposição crônica a vários tipos de estímulos psicoativos, incluindo drogas de abuso, estresse e convulsões eletroconvulsivas. . Uma característica distinta de DeltaFosB é que, uma vez induzida, persiste no cérebro por períodos de tempo relativamente longos na ausência de estimulação adicional. Os mecanismos subjacentes a esta aparente estabilidade, no entanto, permaneceram desconhecidos. Aqui, demonstramos que DeltaFosB é um fator de transcrição relativamente estável, com uma meia-vida de aproximadamente 10 h em cultura de células. Além disso, mostramos que DeltaFosB é uma fosfoproteína no cérebro e que a fosforilação de um resíduo de serina altamente conservado (Ser27) em DeltaFosB protege-o da degradação proteasomal. Nós fornecemos várias linhas de evidência sugerindo que esta fosforilação é mediada pela caseína quinase 2. Estas descobertas constituem a primeira evidência de que o DeltaFosB é fosforilado e demonstra que a fosforilação contribui para a sua estabilidade, que está no centro da sua capacidade de mediar adaptações de longa duração no cérebro.
Introdução
O fator de transcrição ΔFosB, também designado por FosB2 ou FosB [forma abreviada], é uma variante de splice truncada no terminal C do gene inicial imediato. fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu e Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Como o FosB de comprimento total, o ΔFosB possui um domínio básico de ligação ao DNA e um zíper de leucina através do qual ele dimeriza com proteínas Jun para formar complexos ativadores da proteína-1 (AP-1), que regulam a expressão de muitos genes (Morgan e Curran, 1995; Rylski e Kaczmarek, 2004). Apesar de não possuir parte do domínio de transativação encontrado no terminal C de FosB, o ΔFosB funciona tanto como um potente ativador transcricional como repressor em células cultivadas e no cérebro (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu e Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung e Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).
ΔA FosB é induzida a níveis elevados de uma maneira específica da região no cérebro após exposição crônica, mas não aguda, a uma variedade de estímulos psicoativos, incluindo estresse, certas lesões, antipsicóticos e antidepressivos, drogas de abuso e recompensas naturais. (Hope et al., 1994b; Hiroi e Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby e outros, 2003; Peakman e outros, 2003; Perrotti e outros, 2004; Zachariou e outros, 2006). A indução de ΔFosB tem sido relacionada diretamente aos efeitos funcionais de vários desses estímulos no cérebro. A persistência da ΔFosB mesmo na ausência de estimulação adicional a distingue de todos os outros fatores de transcrição da família Fos, que são induzidos rapidamente em resposta a estímulos agudos, decaem de volta aos níveis basais em poucas horas e geralmente mostram dessensibilização após estimulação crônica (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi e Graybiel, 1996; Perrotti e outros, 2004). Isso torna o ΔFosB um candidato atraente para mediar algumas das mudanças duradouras na expressão gênica que estão por trás das adaptações neuronais estáveis causadas por certos estímulos crônicos.
Porque a presença prolongada de ΔFosB ocorre na ausência de indução adicional de seu mRNA (Chen et al., 1995), especulamos que, ao contrário do FosB de comprimento total e de todas as outras proteínas da família Fos, que são intrinsecamente instáveis, ΔFosB pode ser um fator de transcrição invulgarmente estável (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler e outros, 2001; McClung et al., 2004). Além disso, a análise de immunoblotting do tecido cerebral agudo versus o tecido cerebral estimulado crônico sugeriu que ΔFosB se desloca Mr (massa molecular) de ∼33 kDa na condição aguda para ∼35 – 37 kDa durante o tratamento crônico (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Como não há evidências para a existência de mRNAs adicionais que poderiam codificar para essas várias isoformas, especulamos ainda que ΔFosB é modificado pós-traducionalmente e que talvez isso contribua para sua estabilidade incomum. Até o momento, no entanto, nenhuma análise bioquímica do turnover ou modificações pós-traducionais de ΔFosB foram relatadas. O objetivo do presente estudo foi determinar se ΔFosB é uma fosfoproteína e se a fosforilação desempenha um papel na sua estabilidade.
Materiais e Métodos
Linhas de células de mamíferos e construções de DNA.
Culas PC12 (Clontech, Mountainview, CA) foram cultivadas em DMEM de alta glucose contendo l-glutamina (L-Gln) e suplementadas com 5% de soro bovino fetal (FBS), soro de cavalo 10% (ambos da Invitrogen, Carlsbad, CA) 100 U / ml de penicilina e 100 μg / ml de estreptomicina (ambos da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). As culas HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) foram cultivadas em DMEM de elevado teor de glucose contendo L-Gln e suplementadas com 10% de FBS, penicilina e estreptomicina. Ambas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C num 5% CO húmido2 atmosfera.
Para as transfecções transientes com DNA, as células PC12 ou HeLa foram semeadas em placas de seis poços (revestidas com colagénio I para células PC12) de modo a atingir 90-100% confluência no dia seguinte e foram então transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Em algumas experiências (ver Figs. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB foi transitoriamente expresso em células PC12 por infecção com o vírus herpes simplex recombinante (HSV).
Os cDNAs ΔFosB e FosB foram obtidos a partir de nossas próprias construções pTetop (Chen et al., 1997) e subclonado num vector pcDNA3.1 (Invitrogen). Estas constru�es pcDNA3.1-AFosB / FosB foram utilizadas para express� em c�ulas de mam�eros e como molde para a mutag�ese dirigida ao local. O HSV-ΔFosB recombinante foi preparado como descrito anteriormente (Neve et al., 1997), e a preparação tinha um título de ∼1 × 108 pfu / ml.
Experimentos de perseguição de pulso.
Aproximadamente 24 h após infecção / transfecção, as células (PC12 ou HeLa) em placas de seis poços foram lavadas duas a três vezes com 2 ml de PBS e incubadas a 37 ° C durante ∼1 h em 2 ml de DMEM livre de Cys / Met. (Invitrogen) suplementado com 5% dialisado FBS (Hyclone, Logan, UT) para esgotar os pools intracelulares de Met e Cys. No final deste período de “inanição”, foram adicionados fármacos (se as células foram tratadas) e as células foram marcadas (pulso) com 12 – 25 μCi de 35Mistura de Rotulagem de Proteína S (PerkinElmer, Wellesley, MA) para ∼1 h a 37 ° C para marcar todas as proteínas recém-sintetizadas. O radiomarcador foi então removido por lavagem das células duas a três vezes com 2 ml de PBS, e o 35As proteínas marcadas com S foram seguidas (perseguição) substituindo o meio por meio "frio" (não radioativo) suplementado com 5% FBS e colhendo as células em vários momentos. Os tratamentos celulares foram mantidos durante toda a perseguição. Todos os números dessas experiências mostram quantidades iniciais semelhantes das várias proteínas para otimizar comparações de suas taxas de turnover.
Animais e tratamento convulsivo crônico eletroconvulsivo.
Ratos machos adultos Sprague Dawley (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) foram tratados uma vez por dia com convulsões electroconvulsivas (ECS) para 7-9 d. A ECS foi realizada conforme descrito anteriormente (Hope et al., 1994a) usando um Ugo Basile (Comerio VA, Itália) Unidade ECS com as seguintes configurações: frequência, 100 pulsos / s; pulso com, 0.5 ms; duração de choque, 1.0 s; e atual, 75 mA. Os animais de controle foram tratados em paralelo, aplicando os eletrodos de clipe de ouvido sem qualquer corrente elétrica.
32 P rotulagem metabólica.
Para a marcação das fatias do cérebro, os ratos foram decapitados, os cérebros foram rapidamente dissecados e fatias corticais frontais de 300 μm foram preparadas com um microssilador DSK (Ted Pella, Redding, CA). As fatias foram incubadas dentro de tubos de plástico em 2 ml de CSF artificial deficiente em fosfato (ACSF) e mantidas a 30 ° C sob borbulhamento suave e constante com um O2/CO2 mistura (Hemmings e outros, 1989). As fatias (duas fatias por tubo) foram marcadas com 1.3 mCi para 8-10 h na presença ou ausência de ácido ocadaico (100 ng / ml). No final desta incubação, as fatias foram enxaguadas pelo menos três vezes com ACSF frio e depois homogeneizadas por sonicação em tampão 250 de ensaio de radioimunoprecipitação a frio (RIPA) [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v ) Igepal, 0.5% (p / v) de desoxicolato de sódio, 0.1% (p / v) SDS, 1 mm de EDTA] suplementado antes da utilização com SDS até 0.6%, coquetel de inibidores da protease para células de mamíferos (utilizado em 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), coquetéis inibidores da fosfatase I e II (usados em 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF e 2% glicerol. Os homogenatos foram então fervidos para 15 min e limpos por centrifugação a 15,000 × g para 15 min. A concentrao de protea nos sobrenadantes resultantes foi avaliada utilizando o ensaio da protea BCA (Pierce, Holmdel, NJ).
Para o 32P marcação de células cultivadas, N24 h após infecção / transfecção, as células foram lavadas duas a três vezes com meio livre de fosfato e incubadas neste meio para ∼1 h. Após este período de fome, 0.2 – 0.3 mCi de 32PH3PO4 (PerkinElmer) foram adicionados a cada poço, e as células foram rotuladas para 4 – 12 h dependendo do tipo de experiência (ver as Figuras 1 – 7 para especificações). As células foram então lavadas três vezes com PBS e lisadas em gelo por 15 min com 50 μl de tampão RIPA suplementado. Os lisados foram recolhidos por raspagem e foram passados 10 vezes através de uma agulha 25 ga para cortar DNA, fervidos a 10 min e centrifugados a 15,000 rpm para 15-30 min a 4 ° C. Os lisados clarificados (sobrenadantes) foram transferidos para um novo tubo e foi realizado um ensaio de proteína BCA (Pierce). Todos os números destas experiências mostram quantidades semelhantes de proteínas do tipo selvagem total (WT) e S27A ΔFosB para otimizar comparações dos seus níveis relativos de fosforilação.
Químicos e tratamentos de cultura celular.
O ácido okadaico (OA; Sigma-Aldrich) foi dissolvido em etanol e utilizado a uma concentração final de 100 ng / ml. O 5,6-Dicloro-1-β-d-ribofuranosil-benzimidazole (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich) e utilizado em cultura celular a uma concentração final de 50 μm. A espermina (Sigma-Aldrich) foi dissolvida em água e utilizada numa concentração final de 200 μm. O Calphostin-C (Biomol) foi dissolvido em DMSO e utilizado a 0.2 μm, enquanto que o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA; Promega, Madison, WI) foi dissolvido em DMSO e utilizado a 0.1 μm. peptídeo inibitório relacionado ao 2 miristoylated-autocamtide (m-AIP; Biomol) foi dissolvido em água e usado em uma concentração final de 1 e 10 μm. Os inibidores da proteína-quinase de largo espectro H-7 e H-8 (Biomol) foram dissolvidos em água e utilizados numa concentração final de 150 e 200 μm, respectivamente. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) e epoxomicina (Peptides International, Louisville, KY) foram ambos dissolvidos em DMSO e utilizados numa concentração final de 12.5 e 7.5 μm, respectivamente. Em todas as experiências, o DMSO (veículo) foi adicionado às células conforme necessário para manter uma quantidade constante de DMSO ao longo dos tratamentos. Para 32Experimentos de rotulagem P, os medicamentos foram adicionados imediatamente antes do rótulo e mantidos para o restante do período de rotulagem. Para experimentos de perseguição de pulso, drogas foram adicionadas no momento da "inanição" de Cys / Met, mantidas através do período de rotulagem, e então adicionadas de volta ao meio de perseguição. Os inibidores do proteassoma foram adicionados a cada 3-4 h durante toda a perseguição para compensar o rápido turnover desses peptídeos.
Imunoprecipitação ΔFosB, immunoblotting e autoradiografia.
Para as imunoprecipitações, os lisados foram diluídos 1: 5 com RIPA simples para reduzir a concentração de SDS para 0.1% antes de prosseguir com a imunoprecipitação (IP). Para limitar a ligação não específica, os lisados foram primeiro eliminados por imunoprecipitação com IgG não imune e proteína G-Sepharose (Sigma-Aldrich) durante pelo menos 4 h. A ΔFosB foi então imunoprecipitada dos lisados clarificados usando um anticorpo policlonal de cabra que reconhece um epítopo interno presente tanto em FosB quanto em ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) em 0.5-1 μg IgG por 10 μg de proteína lisada (50-300 μg de proteína total) num volume total de 0.5 ml. Os IPs foram misturados suavemente a 4 ° C num rotor durante pelo menos 8 h e, em seguida, foram adicionados 15 μl de proteína G-Sepharose e misturaram-se IPs durante pelo menos outro 4 h. IPs foram peletizados girando a 3000 × g para 3-5 min a 4 ° C, lavado três vezes com 0.5 ml de RIPA simples a frio e duas vezes com PBS frio contendo 0.1% Tween 20. Os IPs foram então ressuspendidos em 0.5 ml de PBS frio, transferidos, sedimentados num novo tubo e as proteínas imunoprecipitadas foram depois eluídas pela adição de 15-25 μl de 2 × reduzindo o tampão de amostra de proteína Laemmli. Este protocolo IP resultou na precipitação específica e efetiva de praticamente todos os ΔFosB no lisado. As proteínas imunoprecipitadas foram submetidas a SDS-PAGE carregando todo o IP num gel 12.5% Tris-HCl Criterion (Bio-Rad, Hercules, CA) e depois transferidas para PVDF ou nitrocelulose. Após a transferência, a membrana foi seca ao ar e 32P e 35Foram observadas bandas de proteína marcadas por S-radioactividade por autorradiograf ia utilizando película autoradiográfica Kodak (Rochester, NY), bem como por fosforimagem utilizando um PhosphorImager Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). O Total (não fosforilado e fosforilado) ΔFosB nos lisados celulares ou homogenatos cerebrais foi detectado por imunotransferência da proteína imunoprecipitada (utilizando a mesma membrana utilizada para detectar a proteína imunoprecipitada). 32Prote�a marcada com P), ou de quantidades iguais de prote�a de lisado / homogeneizado sujeitos a SDS-PAGE e transferidos para PVDF ou nitrocelulose. A membrana foi primeiro bloqueada incubando-a com 1% (p / v) de leite seco desnatado (Bio-Rad) em PBS suplementado com 0.1% (v / v) de Tween 20 (Sigma) para 1 h a 25 ° C. A membrana foi então imunotransferida durante a noite a 4 ° C com o nosso próprio anticorpo policlonal de coelho anti-FosB gerado contra os aminoácidos 1-16 de FosB / ΔFosB (usado em 1: 10,000). Após incubação primária, as membranas foram lavadas quatro vezes para 5 min com tampão de bloqueio e depois incubadas a 25 ° C para ∼1 h com IgG de cabra anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano (utilizada em 1: 5000 em tampão de bloqueio, da Vector Laboratories, Burlingame, CA). As membranas foram então lavadas três vezes para 10 min com tampão de bloqueio e uma vez para 5 min com PBS. As bandas de proteína ΔFosB totais foram visualizadas no filme Kodak MR por quimiluminescência aumentada (Pierce) e / ou por detecção de fluorescência usando os reagentes ECL-Plus (Amersham Biosciences) e o Storm PhosphorImager.
Superexpressão e purificação de ΔFosB recombinante de células de inseto.
A ΔFosB foi superexpressa em células de inseto Sf9 como uma proteína marcada com N-hexa-His terminal (N-His (6) ΔFosB) usando o sistema de expressão de baculovírus Bac-to-Bac (Invitrogen) e seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, o ADNc de ΔFosB (resíduos 2-237) precedido pelo sinal N de terminal de afinidade MGHHHHHHAG foi subclonado no vector pFASTBacTM1, que foi utilizado para gerar baculovírus recombinante. Células Sf9 foram infectadas com vírus recombinante, e N-His (6) ΔFosB foi purificado de lisados celulares por vários passos cromatográficos incluindo cromatografia de afinidade usando uma coluna de níquel (Qiagen, Valencia, CA), troca aniônica usando uma coluna mono-Q (Amersham Biociências) e exclusão de tamanho usando uma coluna de filtração em gel (Amersham Biosciences).
In vitro estudos de fosforilação.
In vitro reacções de fosforilação para análises temporais e estequiométricas foram realizadas num volume de 30 μl contendo substrato 10 μm (N-His (6) ΔFosB ou um substrato de controlo positivo), 250 μm ATP e 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, o tampão fornecido pelo fabricante da quinase e uma das seguintes quinases: CK2 (UpNate / Upstate), CaMKII (UpNate), PKC (20 ng / μl; Calbiochem) ou p10S1.6K (70 mU / μl; Upstate). As reacções ao longo do tempo foram realizadas removendo alíquotas 6 μl da solução reaccional nos pontos de tempo designados e adicionando um volume igual de 2.5 × reduzindo o tampão de amostra da proteína Laemmli. Os parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten para a reação CK5 foram determinados sob condições estacionárias lineares definidas empiricamente. Estas reacções foram efectuadas para 4 min num volume de 2 μl contendo 15 ng / μl da enzima, 10 μm ATP, 2 μCi / μl [γ-32Concentrações de P] ATP e N-His (6) ΔFosB variando de 2.5-30 μm. Todas as reações foram realizadas a 30 ° C em banho-maria. Após SDS-PAGE e coloração do gel com Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), o gel foi seco e 32A incorporação de fosfato-P foi avaliada por análise de fosforescência (ver abaixo, quantificação de dados, cálculos e estatísticas).
Mapa de fosfoptido bidimensional e anise de fosfoaminoido.
Ambas as análises foram realizadas conforme descrito por Ploegh e Dunn (2000). Resumidamente, fragmentos de gel seco contendo 32FosB marcado com P (ou de in vitro reacções ou a partir de imunoprecipitados de células metabolicamente marcadas), foram excisadas, re-hidratadas, lavadas e submetidas a digestão tríptica. O sobrenadante contendo os produtos de digestão tríptica foi liofilizado e o liofilizado foi lavado várias vezes e ressuspenso em 10 μl de tampão de electroforese, pH 1.9. A amostra (3 μl) foi localizada em uma placa de cromatografia em camada fina de celulose (TLC) (Analtech, Newark, DE) e separada em uma dimensão por eletroforese e a outra dimensão por TLC ascendente. Os mapas de fosfopéptidos resultantes foram visualizados por autorradiografia e fosforescência. Para análise do fosfoaminoácido, 2 μl das digestões trípticas que haviam sido ressuspensas em tampão de eletroforese foram adicionalmente clivadas por hidrólise de HCl a 105 ° C por 25 min em 3 m HCl sob um N2 atmosfera. A reacção foi interrompida por uma diluição de seis vezes em água e a mistura foi liofilizada. O liofilizado foi ressuspenso em tampão 5 de electroforese, pH 1.9, e colocado numa placa de CCF de celulose juntamente com padrões de fosfo-Ser, -Thr e -Tyr. A electroforese foi realizada ao longo de metade do comprimento da placa de TLC utilizando um tampão de electroforese, pH 1.9, e depois a placa foi transferida para o tampão de pH 3.5, e a electroforese foi realizada até à conclusão. Os padrões de fosfoaminoácido foram visualizados pulverizando a placa de TLC com uma solução de ninidrina 1% (v / v) em acetona, e 32As amostras de aminoácidos marcadas com P foram visualizadas por autoradiografia e fosforescência.
CK2α induzida por siRNA knock-down.
Usamos um método de interferência de RNA para derrubar seletivamente os níveis de CK2 (Di Maira et al., 2005). Células PC12 foram semeadas em placas de seis poços recobertas com colágeno I para atingir ∼70-80% confluência no dia seguinte, quando transfectadas transitoriamente com 20 nm (concentração final) de siRNA não direcionador ou siRNA direcionado para o mRNA do catalisador Subunidade α do Rato CK2, utilizando 5 μl do agente de transfecção SilentFectin (Bio-Rad) e seguindo as instruções do fabricante. Aproximadamente 24 h mais tarde, as células foram transfectadas transientemente com o plasmídeo ΔFosB, como indicado acima. Aproximadamente 24 h mais tarde (∼48 h após a transfecção de siRNA), as células foram submetidas a 32P rotulagem metabólica ou análise de pulso-perseguição como descrito acima. Os seguintes quatro siRNAs CK2α foram utilizados com resultados semelhantes: 5′P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3′, 5′P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3′, 5′P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3′, 5′P-AAAUCCCUGACAUCAUAUUUU3′ (Dharmacon, Lafayette, CO). Como controle negativo, usamos Silenciador controle negativo #3 siRNA da Ambion (Austin, TX). A extensão da queda de CK2 foi monitorizada por imunotransferência utilizando um anticorpo policlonal anti-CK2 (nº de catálogo 06-873 de Upstate) durante a noite a uma diluição de 1: 1000. A β-tubulina foi utilizada como controlo de carga e detectada com um anticorpo monoclonal (nº de catálogo 05-661 de Upstate) durante a noite a uma diluição 1: 20,000.
Mutagênese sítio-dirigida.
A mutao de Ser27 para Ala ou para Asp foi realizada utilizando um kit de Mutagese Dirigida no Local de Troca Rida (Stratagene, La Jolla, CA) e seguindo as instrues do fabricante. Para introduzir as mutaes Ser27 na protea? FosB de ratinho, foram utilizados os seguintes iniciadores de mutagese. Ser27 para Ala: (primer reverso) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 para Asp (primer forward) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. As bases mutadas estão em negrito e o codão Ser27 está em itálico.
Bioinformática.
Os potenciais locais de fosforilação e quinases para ΔFosB foram pesquisados submetendo a sequência da proteína do rato a bases de dados especializadas, incluindo a ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004) e NetPhosK (Blom et al., 2004).
Quantificação de dados, cálculos e estatísticas.
A quantidade de proteína presente na membrana de PVDF ou nitrocelulose foi quantificada utilizando um Storm PhosphorImager e o software ImageQuant que o acompanha (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). Nos estudos de cultura de células e fosforilação de fatias cerebrais, os valores obtidos para o 32A proteína marcada com P foi então dividida pelos valores obtidos para o ΔFosB total e expressa como uma razão. No in vitro estudos de fosforilação, a quantidade de 32A ΔFosB por mole de ΔFosB (estequiometria) foi calculada como descrito anteriormente (Sahin et al., 2004). Todas as medidas foram realizadas dentro da faixa de linearidade do instrumento utilizado. Os parâmetros cinéticos foram calculados usando o modelo de Michaelis-Menten, pelo V = VMax[S] / [S]+KM) e VMax = k2[ESegurança]. A meia-vida (t1/2) de ΔFosB e FosB foram estimados a partir dos gráficos de pulso-perseguição (usando a regressão não linear que melhor se ajustou aos pontos de dados) e correspondem ao tempo em que a quantidade de proteína restante é 50% do original. Em todas as figuras, os resultados apresentados são representativos de pelo menos dois a três experimentos independentes. Em todos os gráficos, os dados mostrados são médias ± SEMs (3 ≤ n ≤16). A significância estatística das diferenças foi avaliada por meio de um questionário não pareado. t teste, corrigido para comparações múltiplas, e os asteriscos indicam p ≤ 0.05.
Consistentes
ΔFosB é um fator de transcrição invulgarmente estável
Embora tenhamos especulado anteriormente que ΔFosB é um fator de transcrição relativamente estável (Nestler e outros, 2001), uma análise direta do perfil de turnover da proteína ainda não foi realizada. Para resolver esta questão, conduzimos experimentos de perseguição de pulso usando células PC12, que foram extensivamente usadas como uma linhagem celular semelhante a um neurônio, na qual ΔFosB foi expresso transitoriamente via infecção com um vírus herpes simplex recombinante (HSV-ΔFosB). Proteínas recém-sintetizadas foram metabolicamente 35S-Met / Cys e o padrão de degradação de 35FosB marcado com S35S-ΔFosB) foi monitorizado imunoprecipitando-o a partir de lisados celulares obtidos em vários momentos após a remoção dos aminoácidos radiomarcados. A análise dos imunoprecipitados por SDS-PAGE e autoradiografia revelou que a semivida de ΔFosB nas células PC12 é ∼10 h (FIG. 1). Esses achados mostram que a meia-vida de ΔFosB é maior do que a da maioria dos fatores de transcrição indutíveis (ver Discussão), incluindo FosB de comprimento total, cuja meia-vida em cultura de células foi relatada como ∼90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Além disso, vale ressaltar que a degradação de ΔFosB não se ajusta a uma curva de decaimento exponencial de primeiro grau, mas sim é bifásica, iniciando com uma taxa de degradação mais lenta. Isto sugere a existência de mais de uma espécie ΔFosB e / ou mais de uma via de degradação.
Ver versão ampliada:
Figura 1. Painel do
ΔFosB é um fator de transcrição incomumente estável. A meia-vida de ΔFosB é ∼10 h em cultura celular. A ΔFosB foi expressa em células PC12 tanto por infecção com HSV-ΔFosB ou por transfecção transiente com o plasmídeo contendo ΔFosB, e as células foram submetidas a experiências de perseguição de pulsos, como descrito em Materiais e Métodos. Resultados equivalentes foram obtidos independentemente do método usado para superexpressar ΔFosB. A figura mostra o curso do tempo (e autorradiograma representativo) da degradação de ΔFosB. Os dados plotados são a média ± SEM de pelo menos 15 pontos de dados individuais obtidos de pelo menos cinco experimentos independentes. Para comparação, a meia-vida relatada do FosB completo é indicada.
ΔFosB é uma fosfoproteína no cérebro
Temos a hipótese de que a modificação pós-traducional de ΔFosB pode contribuir para a sua aparente estabilidade. Porque a fosforilação demonstrou modular a atividade dos fatores de transcrição de várias maneiras, incluindo sua estabilidade (para revisão, ver Desterro e outros, 2000; Whitmarsh e Davis, 2000), investigamos se ΔFosB é uma fosfoproteína. Para este fim, a expressão de ΔFosB foi induzida em cérebro de ratos usando ECS crônica, um tratamento conhecido por induzir altos níveis de ΔFosB, particularmente no córtex frontal (Hope et al., 1994a). Um dia após o último tratamento com ECS, quando os níveis de ΔFosB permaneceram altos, cortes corticais frontais finos foram preparados e metabolizados 32P-ortofosfato. Um conjunto paralelo de fatias não foi radiomarcado, e estes foram usados para detectar níveis totais de ΔFosB. Após imunoprecipitação com um anticorpo específico anti-FosB / ΔFosB e separação das proteínas imunoprecipitadas por SDS-PAGE, fosforilada 32A FFosB marcada com P foi detectada por autorradiografia, enquanto que a ΔFosB total foi detectada por imunotransferência. Esta análise revelou que ΔFosB é fosforilado no cérebro, como evidenciado por um 32P-banda marcada de ∼35 kDa presente nas amostras de cérebro tratadas cronicamente, mas é virtualmente indetectável nos controles tratados com sham (FIG. 2A). Isso é consistente com o fato de que, na ausência de estimulação crônica, os níveis basais de ΔFosB são muito baixos. A especificidade da reacção de imunoprecipitação é ilustrada pela falta de sinal no precipitado de IgG não imune.
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Figura 2. Painel do
ΔFosB é uma fosfoproteína no cérebro. A, ΔFosB é fosforilado no cérebro. A ΔFosB endógena foi induzida em cérebro de rato por tratamento ECS crónico como descrito em Materiais e Métodos. Fatias corticais frontais foram metabolicamente 32PH3PO4 por várias horas. Após a homogeneização das fatias, a ΔFosB foi imunoprecipitada e fosforilada ΔFosB (32P-ΔFosB) foi detectado por autorradiografia (painel superior). A ΔFosB total em imunoprecipitados não radioativos foi detectada por immunoblotting (painel inferior). Como controlos negativos, o imunoprecipitado de um animal tratado de forma simulada e IgG não imune são mostrados. BOs locais de fosforilao de candidatos e cinases com pontuaes de previs correspondentes para a sequcia da protea? FosB de ratinho foram obtidos por anise bioinformica. Os locais candidatos com as maiores pontuações de previsão são destacados na seqüência de proteínas e listados na tabela. O domínio de ligação ao DNA (básico) e o zíper de leucina estão em negrito na sequência da proteína. C, DA fosforilação ΔFosB é aumentada pelo inibidor da fosfatase Ser / Thr OA. C, 32Níveis de P-AfosB em imunoprecipitados de cortes corticais frontais marcados na ausência (Ctr) ou presença de 100 ng / ml de OA (gráfico e painel superior) foram detectados por autorradiografia. O painel inferior mostra ΔFosB total detectado em imunoprecipitados de fatias não marcadas por imunotransferência. D, As células PC12 foram infectadas com HSV-ΔFosB ou HSV-LacZ (vetor) e metabolizadas 32PH3PO4 na ausência (Ctr) ou presença de 100 ng / ml OA. 32Níveis de P-ΔFosB em imunoprecipitados foram detectados por autorradiografia (gráfico, painel superior). O painel inferior mostra ΔFosB total detectado em lisados celulares por imunotransferência.
Como um primeiro passo para elucidar quais as quinases e o (s) local (is) estão envolvidos na fosforilação de ΔFosB, submetemos a sua sequência de aminoácidos a várias análises bioinformáticas. Isto revelou que, apesar de ΔFosB não conter locais candidatos à fosforilação de Tyr, contém vários locais de consenso de Ser / Thr quinase, incluindo três locais CaMKII, três locais CK2 e dois locais PKC com pontuações de predição de fosforilação muito elevadas (FIG. 2B). Se, como previsto pela bioinformática, ΔFosB é apenas fosforilado em resíduos Ser ou Thr, então a sua fosforilação deve ser significativamente modulada pela atividade das fosfatases Ser / Thr. Para testar essa hipótese, rotulamos cortes corticais frontais com 32P-ortofosfato na presença ou ausência de OA, um inibidor da proteína fosfatase Ser / Thr. Como mostrado em Figura 2C, OA causou um grande aumento (∼2.5 vezes) na 32P-ΔFosB. Também causou um pequeno aumento nos níveis totais de ΔFosB, o que é consistente com relatos anteriores ligando os efeitos carcinogênicos da OA à sua capacidade de induzir vários genes precoces imediatos, incluindo proteínas Fos (Miller e outros, 1998; Choe et al., 2004). O resultado líquido é um aumento global significativo (∼60%) nos níveis de ΔFosB fosforilados.
Nós então investigamos se, nas células PC12, que são mais passíveis de manipulação experimental, ΔFosB mostrou um padrão de fosforilação semelhante ao observado no cérebro. Expressamos ΔFosB em células PC12 via infecção por HSV-ΔFosB e rotulamos metabolicamente as células com 32P-ortofosfato na presença ou ausência de OA. A express� e imunoprecipita�o bem sucedida da prote�a de c�ulas infectadas com HSV-FAosB �demonstrada pela presen� tanto no imunotransfer�cia (FIG. 2D, painel de baixo) e a autorradiografia (painel superior) de uma banda de ∼35 kDa, ausente nas células infectadas por vectores. Como observado no cérebro, a OA causou um pequeno aumento nos níveis totais de ΔFosB, mas um aumento muito maior (aproximadamente duas vezes) no 32P-ΔFosB, resultando em um aumento líquido significativo (∼50%) na fosforilação de ΔFosB. Além disso, consistente com as predições bioinformáticas, o tratamento de células PC12 com um inibidor de fosfatase de Tyr não resultou em mudanças significativas 32Níveis P-ΔFosB (dados não mostrados). Juntos, esses achados revelaram que ΔFosB é fosforilado em resíduos Ser e / ou Thr em células cerebrais e PC12 e confirmou que este último é um bom sistema de cultura de células para estudar ainda mais os perfis de fosforilação e degradação de ΔFosB.
CK2 mas não PKC ou CaMKII fosforila ΔFosB in vitro
Como descrito acima, a análise da sequência de aminoácidos AFosB revelou pontuações de predição elevadas para os locais de fosforilação de CK2, PKC e CaMKII. Para determinar quais destas quinases podem fosforilar ΔFosB, realizamos uma série de in vitro reacções de fosforilação utilizando quinases purificadas e ΔFosB recombinante purificado. Como mostrado em Figura 3A, das três quinases candidatas, apenas CK2 fosforilou ΔFosB de uma maneira significativa. Além disso, várias outras quinases foram testadas (por exemplo, GSK3 e p70S6K), mas não conseguiram fosforilar significativamente ΔFosB (dados não mostrados). A caracterização adicional da reação CK2 pela análise de tempo-curso revelou que esta quinase pode catalisar a incorporação de ∼0.5 mol de fosfato por mole de ΔFosB (FIG. 3B). O fato de que CK2 pode fosforilar ΔFosB in vitro para uma considerável estequiometria (∼50%) é sugestivo de uma reação fisiologicamente relevante. Em seguida, estudamos a cinética dessa reação incubando CK2 na presença de quantidades crescentes de ΔFosB purificado, e determinamos que CK2 fosforila ΔFosB com um Vmax de 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 de enzima, um KM de 18.4 μm e um kgato de 0.2 / s (FIG. 3C). Os valores obtidos para estes parâmetros cinéticos sustentam ainda mais a relevância fisiológica desta reação. Por exemplo, o KM de CK2 para DARPP32, um dos seus substratos mais conhecidos, é 3.4 μm, e o kgato é ∼0.3 / s (Girault et al., 1989); a KM para as gamas de ATP de ∼10 – 40 μm (Cochet e outros, 1983; Silva-Neto e outros, 2002) e para caseína varia de ∼10 – 50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Juntos, esses dados indicam que ΔFosB é um substrato fidedigno para CK2 in vitro.
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Figura 3. Painel do
CK2 mas não PKC ou CaMKII fosforila ΔFosB in vitro. A autorradiografia (painel superior) mostra o produto fosforilado e o gel corado com Coomassie (painel inferior) mostra ΔFosB total presente na reacção. A, RecombinFosB recombinante Purificado foi submetido a in vitro fosforilação por várias quinases candidatas (três das quais são mostradas). B, Curso de tempo e análises estequiométricas indicam que CK2 pode fosforilar ΔFosB in vitro com estequiometria de ∼50%. CA análise cinética da reação CK2 revelou que ΔFosB é um produto genuíno in vitro substrato. A linearização da reação é mostrada em um gráfico duplo-recíproco (inferior), mas os parâmetros cinéticos foram derivados da curva de Michaelis-Menten (topo).
CK2 modula a fosforilação e estabilidade de ΔFosB em células intactas
Para avaliar a relevância fisiológica da fosforilação mediada por CK2 de ΔFosB, foi realizado um mapeamento comparativo de fosfopeptídeos utilizando in vitro fosforilada e fosforilada por células PC12 ΔFosB. Após SDS-PAGE e eluição gel de 32P-ΔFosB (do in vitro reacções ou do imunoprecipitado de 32Culas marcadas com P), a protea foi digerida com tripsina e os fosfoptidos resultantes foram sujeitos a separao bidimensional. Esta anise revelou que o principal fosfoptido da reaco CK2 comigrou com um dos dois principais fosfoptidos de? FosB fosforilados em culas PC12 (FIG. 4A), enquanto que os fosfopéptidos resultantes da reacção de PKC ou CaMKII (dados não mostrados) não o fizeram. Houve um segundo fosfopeptídeo ΔFosB presente no mapa de células PC12, mas devido à incapacidade de qualquer uma das quinases que testamos para gerar um fosfopeptídeo similar in vitro, não sabemos presentemente se este segundo fosfopéptido contém um local de fosforilação diferente do outro fosfopéptido ou se representa um péptido tríptico distinto contendo o mesmo local de fosforilação.
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Figura 4. Painel do
CK2 modula a fosforilação e estabilidade de ΔFosB em células intactas. A, CK2 mas não PKC parece fosforilar ΔFosB nas células. Mapas de fosfopeptídeos bidimensionais de ΔFosB fosforilados por CK2 ou PKC in vitro ou por células PC12 intactas. As setas mostram a comigração do péptido fosforilado por CK2 mas não o fosforilado por PKC com um dos fosfopeptidos AFosB obtidos a partir de células PC12. BA fosforilação de ΔFosB nas células PC12 é aumentada pelo tratamento de células com o potente espermático ativador CK2 (SP) e diminuído pelo tratamento com o inibidor DRK CK2. Em contraste, a fosforila�o de FFosB nas c�ulas PC12 n� foi afectada pelo tratamento com um activador de PKC (PMA) ou com o inibidor espec�ico de PKC, calfostina-C (Calph). Um autoradiograma representativo (painel superior) e immunoblot (painel inferior) são mostrados. C – F, Efeito da atividade de CK2 na estabilidade de ΔFosB. As figuras mostram o curso do tempo (e autorradiograma representativo) da degradação de ΔFosB. Células PC12 expressando transientemente ΔFosB foram submetidas a experimentos de pulsação realizados na ausência ou na presença do inibidor DRK CK2 (C), a espermina ativadora CK2 (D) ou o inibidor de largo espectro da quinase H-8 (E), que foi utilizado para controlar os efeitos inespecíficos do DRB. F, Efeito de derrubar a subunidade catalítica de CK2 na estabilidade de ΔFosB. As células PC12 foram transfectadas com siRNA (Ctr) ou siRNA não direcionador, visando CK2α e 24 h posteriormente transfectados com um plasmídeo ΔFosB. O painel de topo mostra imunotransf erências de lisados de células completas mostrando o efeito do ARNsi de CK2 nos níveis de proteína CK2 e ΔFosB. A imunotransferência correspondente para a β-tubulina é mostrada como um controle de carregamento.
Para tratar adicionalmente da relevância fisiológica de CK2 como uma ΔFosB quinase, tratamos as células PC12 que expressam FFosB com dois fármacos que modulam a atividade de CK2. Como mostrado em Figura 4BA fosforilação ΔFosB foi diminuída pelo tratamento de células PC12 com o inibidor de CK2 permeável às células DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995) e aumentada pelo tratamento com a poliamina espermina, conhecido por ser um potente ativador de CK2 (Cochet e Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). Em contraste, o tratamento de células PC12 com o inibidor da PKC, calfostina-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki e outros, 1990) ou o PKC activator PMA (Schmidt e Hecker, 1975; Beh et al., 1989) não resultou em alterações significativas na fosforilação de ΔFosB. No caso do PMA, o ligeiro (e não significativo) aumento de 32P-ΔFosB poderia ser explicado por um aumento nos níveis totais de ΔFosB causados por este fármaco; De facto, foi relatado que os ésteres de forbol induzem a expressão de várias proteínas da família Fos, incluindo FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Além disso, o tratamento de células com o inibidor específico da célula CaMKII permeável m-AIP (Ishida e Fujisawa, 1995; Stevens e outros, 1999) também não resultou na diminuição da fosforilação de ΔFosB (dados não mostrados). Juntos, esses resultados são consistentes com nossos in vitro descobertas e indicam que em células intactas ΔFosB é provavelmente fosforilado por CK2 mas não por PKC ou CaMKII. O facto de a inibição de CK2 não impedir completamente a fosforilação de AfosB indica a existência de locais de fosforilação adicionais na proteína.
Em seguida, examinamos se o CK2 desempenha um papel no turnover de ΔFosB e, portanto, em sua estabilidade. Para este fim, conduzimos experimentos de perseguição de pulso usando células PC12 expressando ΔFosB tratadas com o inibidor CK2 ou com o ativador CK2 usado no estudo de fosforilação. Como mostrado em Figura 4C, o tratamento de células com o DRB inibidor de CK2 teve um efeito significativo na taxa de turnover de ΔFosB, evidenciado pela mudança na forma de sua curva de degradação, de bifásico para uma curva que é mais próxima à de um decaimento exponencial. Por outro lado, a presença da espermina ativadora CK2 causou uma diminuição significativa na taxa de degradação de ΔFosB, o que levou ao acúmulo da proteína durante as primeiras horas da perseguição (FIG. 4D).
Como é o caso de muitos ativadores e inibidores de quinase, espermina e DRB podem ter efeitos metabólicos fora da modulação da atividade de CK2. De fato, o DRB demonstrou inibir a quinase associada ao fator de transcrição IIH (TFIIH) (Yankulov et al., 1995), que resulta na inibição da transcrição mediada pela RNA polimerase II. Como esse efeito poderia afetar a estabilidade de ΔFosB, analisamos o efeito do inibidor de amplo espectro de quinase H-8 (Hidaka e Kobayashi, 1992) no turnover ΔFosB em uma concentração (200 μm) conhecida por inibir quinase associada a TFIIH, mas não por CK2 (Yankulov et al., 1995). Como mostrado em Figura 4E, o tratamento com H-8 não afetou a taxa de turnover de ΔFosB. Resultados semelhantes foram obtidos com H-7, outro inibidor de cinase de largo espectro, utilizado numa concentração que inibe a cinase associada a TFIIH mas não a CK2 (dados não mostrados). Estes dados apoiam ainda a interpretação de que a redução na estabilidade de ΔFosB causada por DRB é mais provavelmente atribuível à inibição de CK2.
Para estabelecer ainda mais o papel do CK2 no turnover de ΔFosB, investigamos as conseqüências de derrubar o CK2 via siRNA. Realizámos estas experiências utilizando células PC12 que foram primeiro transfectadas com siRNA de controlo (não segmentação) ou um siRNA que tem como alvo o ARNm da subunidade catalítica de rato CK2 (CK2a) e 24 h posteriormente transfectadas com ΔFosB. Como mostrado em Figura 4F, a transfec�o com o ARNsi de CK2? derrubou eficientemente e especificamente os n�eis de prote�a CK2? sem afectar os n�eis de ΔFosB (painel de topo). A análise de pulso-perseguição revelou que derrubar CK2 resultou em um aumento significativo na taxa de turnover de ΔFosB como evidenciado pela degradação mais rápida da proteína. O fato de que inibir a atividade de CK2 (seja via tratamento DRB ou siRNA) aumenta o turnover de ΔFosB e resulta no desaparecimento do componente de taxa lenta da curva bifásica, enquanto a ativação de CK2 aumenta a fase lenta da curva, fornece forte suporte para a ideia de que o CK2 desempenha um papel na regulação da estabilidade de ΔFosB.
CK2 fosforila ΔFosB em Ser27
Para começar a identificar o (s) site (s) em ΔFosB fosforilado por CK2, conduzimos a análise de fosfoaminoácido da ΔFosB recombinante fosforilada por CK2 in vitro e de ΔFosB fosforilado em células PC12. Estas experiências revelaram que, em ambos os casos, o único fosfoaminoácido detectado foi o fosfo-Ser (FIG. 5A). Este achado, juntamente com a estequiometria obtida para o CK2 in vitro reacção de fosforilação (∼50%) (FIG. 3B) e a presença de apenas um ponto significativo no mapa do fosfopéptido CK2 (FIG. 4A), sugere que a fosforilação de CK2 de ΔFosB é provavelmente limitada a um único resíduo de serina. Esta conclusão é consistente com a análise do local de consenso da fosforilação (FIG. 2B), que previu apenas uma serina candidata, ou seja, Ser27, para CK2. A análise taxonômica revelou que o Ser27 é altamente conservado através da evolução entre os membros da família Fos (FIG. 5B), sugerindo que pode ter uma importante função fisiológica.
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Figura 5. Painel do
CK2 Phosphorylates ΔFosB em Ser27. AAnálise do ácido fosfoamino do CK2-fosforilado (in vitro) e ΔFosB fosforilado por células PC12 mostrando que, em ambos os casos, o principal resíduo fosforilado é serina. BA análise de espécies cruzadas da sequência de aminoácidos FosB / ΔFosB revelou alta conservação de Ser27 entre os membros da família Fos de humano para peixe-zebra (destaque escuro). No entanto, o resíduo ácido na posição + 3, que é necessário para o local de consenso CK2, não é conservado (destaque claro). C, Células HeLa foram transientemente transfectadas com ΔFosB (WT) de tipo selvagem ou ΔFosB contendo uma mutação pontual para substituir Ser27 por Ala (S27A). As células foram metabolicamente marcadas com 32PH3PO4 e tratado com veículo ou com espermina (SP) para ativar CK2. É apresentado um autorradiograma representativo (painel de topo) e imunotransferência (painel inferior) dos imunoprecipitados de ΔFosB obtidos. O imunoprecipitado de células falsamente transfectadas (vetor) é mostrado.
Para determinar se o Ser27 é fosforilado em ΔFosB, nós mutamos este resíduo para Ala e analisamos as consequências no estado de fosforilação da proteína. Para este fim, usamos células HeLa (que podem ser transfectadas com maior eficiência) para expressar transitoriamente WT ou mutante S27A ΔFosB. Aproximadamente 24 h após a transfecção, as células foram metabolicamente marcadas com 32P-ortofosfato e lisados de células inteiras foram preparados. Após imunoprecipitação e SDS-PAGE, 32P-ΔFosB foi detectado por autoradiografia e ΔFosB total por imunotransferência. Como mostrado em Figura 5C (painel inferior), o ΔFosB não foi detectado nas células transfectadas com o vector, enquanto as células transfectadas com o mutante WT ou S27A ΔFosB exprimiram com sucesso a proteína. Descobrimos que a mutação S27A causou uma redução significativa (∼30%) na 32Níveis de P-ΔFosB (FIG. 5C, painel superior e gráfico), indicando que em células vivas, ΔFosB é fosforilado em Ser27. Em um esforço para estabelecer se nas células Ser27 é de fato fosforilada por CK2, comparamos a capacidade da espermina ativadora CK2 para modular a fosforilação de WT e S27A ΔFosB. Como havíamos observado anteriormente em células PC12 (FIG. 4B), o tratamento de células HeLa com espermina aumentou significativamente a fosforilação da proteína WT. O facto de este efeito ter diminuído significativamente pela mutação S27A (FIG. 5C) suporta a interpretação de que Ser27 em ΔFosB é um substrato fisiológico para CK2.
Fosforilação de Ser27 regula a estabilidade de ΔFosB
Tendo estabelecido que a estabilidade de ΔFosB é diminuída quando CK2 é inibido e aumentado quando CK2 é ativado (FIG. 4), e que CK2 fosforila ΔFosB em Ser27 (FIG. 5), previmos que a prevenção da fosforilação deste local deve desestabilizar a proteína. Expericias de perseguio de pulsos conduzidas com culas HeLa que transientemente expressam WT ou mutante S27A? FosB revelaram que, como previsto, a mutao S27A resultou num aumento significativo na taxa de degradao de? FosB, e uma diminuio concomitante na meia-vida da protea (FIG. 6A). Em seguida, investigamos se esse mecanismo regulatório também ocorre na linhagem celular PC12, mais parecida com um neurônio. Estes experimentos revelaram que, como observamos em células HeLa, a mutação pontual S27A causa uma diminuição dramática na meia-vida de ΔFosB em células PC12 (de ∼11 para ∼4 h) (FIG. 6B). O facto de esta desestabilização ser semelhante à causada pela inibição ou knock-down de CK2 (FIG. 4) fornece suporte adicional para a ideia de que a fosforilação mediada por CK2 de Ser27 regula a estabilidade de ΔFosB. Evidência adicional para o papel regulador da fosforilação de Ser27 no turnover da proteína ΔFosB foi obtida usando uma mutação fosfomimética de Ser27 para Asp (S27D). A mutação S27D é considerada fosfomimética, porque coloca um grande grupo (carboxil) carregado negativamente no aminoácido 27 e, assim, em parte mimetiza a fosforilação do Ser27. Como mostrado em Figura 6C, a mutação S27D causou o efeito oposto da mutação S27A e resultou em uma proteína significativamente mais estável que a proteína WT. Similarmente ao efeito obtido após a ativação do CK2 (FIG. 4D), a mutação S27D resultou na acumulação e, assim, aumentou os níveis de ΔFosB durante as primeiras horas de perseguição.
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Figura 6. Painel do
A fosforilação de Ser27 regula a estabilidade de ΔFosB. A, CAnálise de pulso-perseguição mostrando o efeito da fosforilação de Ser27 na taxa de turnover de ΔFosB. O perfil de degradação e as semi-vidas estimadas de ΔFosB (WT) do tipo selvagem, o mutante Ser27 para Ala (S27A) e o mutante phosphomimetic Ser27 para Asp (S27D) são mostrados. Os mesmos achados foram obtidos em células HeLa (A) e células PC12 (B, C).
A fosforilação de Ser27 estabiliza ΔFosB impedindo a sua degradação proteasomal
Para começar a elucidar o mecanismo pelo qual a fosforilação de Ser27 estabiliza ΔFosB, examinamos a capacidade dos inibidores de proteassoma MG132 (Palombella e outros, 1994; Tsubuki et al., 1996) e epoxomicina (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) para modular a taxa de degradação do mutante WT e S27A ΔFosB. As expericias de impulso de impulsos foram conduzidas utilizando culas PC12 infectadas com um HSV recombinante expressando WT ou S27A? FosB e tratadas com DMSO ou um dos dois inibidores de proteassoma. Estas experiências revelaram que, embora a taxa de degradação da proteína WT seja relativamente insensível à presença de qualquer um dos dois inibidores do proteassoma (FIG. 7A), a do mutante S27A é sensível a estas drogas (FIG. 7B). Isto indica que, ao contrário da proteína WT, o mutante S27A é um alvo de degradação proteasomal. De fato, o tratamento de células com MG132 ou epoxomicina reverteu completamente o efeito da mutação S27A na taxa de degradação de ΔFosB, evidenciada por um aumento na meia-vida do mutante S27A de ∼4 para ∼9 h para MG132 e para ∼ 12 h para a epoxomicina (FIG. 7B). Juntos, esses achados indicam que a fosforilação de ΔFosB em Ser27 protege a proteína da degradação proteasomal e é, portanto, essencial para sua estabilidade incomum.
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Figura 7. Painel do
A fosforilação do Ser27 estabiliza o ΔFosB impedindo a sua degradação proteasomal. A, BAnálises de pulso-perseguição com células PC12 infectadas com HSV mostrando o perfil de degradação e as meias-vidas estimadas de ΔFosB de tipo selvagemA) ou S27A ΔFosB (B) na ausência ou presença de um dos dois inibidores do proteassoma [MG132 e epoxomicina (Epoxo)]. Observe o fato de que nenhum dos fármacos tem um efeito significativo no turnover do ΔFosB do tipo selvagem, enquanto o tratamento de células com o inibidor do proteassoma resultou na estabilização do S27A ΔFosB. CUm modelo para o papel da fosforilação de Ser27 na habilidade de ΔFosB de mediar a plasticidade cerebral a longo prazo. Uma vez induzida, uma porção de ΔFosB é estabilizada no cérebro pela fosforilação mediada por CK2 de S27. Isso resulta em seu acúmulo, que por sua vez resulta em mudanças duradouras na expressão gênica. Estas mudanças estáveis na expressão gênica contribuem para adaptações comportamentais estáveis. Por outro lado, a desfosforilação de S27 pelas fosfatases de Ser / Thr PP1 e / ou PP2A resulta na desestabilização da proteína e no seu processamento pela maquinaria proteasomal.
Discussão
No presente estudo, mostramos que ΔFosB tem uma meia-vida de ∼10 h em cultura celular, o que o torna estável em comparação com FosB de comprimento total e a maioria dos outros fatores de transcrição indutíveis, cujas meias-vidas em cultura celular podem ser tão curtas como alguns minutos e raramente exceder 3 h (Hann e Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts e Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Além disso, descobrimos que ΔFosB é fosforilado no cérebro e que a sua fosforilação é sensível ao ácido okadaico do inibidor PP1 / PP2A. Nossos estudos de cultura de células demonstram que a estabilidade de ΔFosB é modulada por CK2, com maior atividade de CK2 estabilizando a proteína. Finalmente, nossos achados sugerem que CK2 fosforila ΔFosB em uma serina de terminação N altamente conservada (S27) e demonstra que a fosforilação de S27 protege ΔFosB da degradação proteasomal. Propomos, portanto, um modelo pelo qual a fosforilação de ΔFosB em S27 por CK2 é um mecanismo regulador crítico do turnover de ΔFosB (FIG. 7C). Tal estabilização mediada pela fosforilação de ΔFosB é funcionalmente importante, porque se demonstrou que níveis aumentados de ΔFosB em regiões cerebrais particulares regulam diretamente numerosos genes neuronais in vivo e exercer efeitos comportamentais potentes em modelos animais de vários distúrbios neuropsiquiátricos (ver Introdução).
Embora a fosforilação seja uma maneira rápida e reversível de regular a atividade transcricional de certos fatores de transcrição, como CREB (proteína de ligação ao elemento de resposta cAMP) (Bohmann, 1990), modulando a degradação dos fatores de transcrição fornece uma forma de regulação ainda mais poderosa (menos facilmente reversível) (Desterro e outros, 2000). Fatores de transcrição cuja atividade funcional é regulada ao nível de sua degradação incluem NFκB (Desterro e outros, 2000), c-Myc (Sears e outros, 1999) e c-Fos (Ferrara et al., 2003), entre outros. Em muitos casos, a fosforilação é um regulador chave da estabilidade de um fator de transcrição, como foi demonstrado para c-Fos (Okazaki e Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Antígeno Fos-1 (Fra-1) (Frasco e Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000) e p53 (Buschmann et al., 2001). Nossos estudos, portanto, adicionam ΔFosB a essa lista de fatores de transcrição cuja atividade funcional é regulada através de sua estabilidade dependente de fosforilados.
CK2 é uma Ser / Thr quinase onipresente e constitutivamente ativa que tem> 300 supostos substratos identificados até agora e está implicada em vários processos biológicos, incluindo morte celular e sobrevivência (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), respostas ao estresse celular (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003) e reparo do DNA e remodelação da cromatina (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Mais de um terço dos substratos putativos de CK2 são proteínas envolvidas na regulação da expressão gênica (Meggio e Pinna, 2003). Na verdade, o CK2 demonstrou ser uma quinase nuclear proeminente (Krek et al., 1992) (para revisão, ver Yu et al., 2001) e interagir com os domínios bZIP de vários fatores de transcrição (Yamaguchi e outros, 1998). Foi também demonstrado que a fosforilação mediada por CK2 modula a degradação (aumentando ou diminuindo) de muitas proteínas, incluindo IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres e Pulido, 2001), conexina da lente (Yin et al., 2000), proteína HMG1 associada à cromatina (Wisniewski et al., 1999) e vários fatores de transcrição, como o HMGB (Stemmer e outros, 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997) e c-Myc (Channavajhala e Seldin, 2002). CK2 é mais abundante no cérebro (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), e sua atividade tem sido implicada em muitos aspectos da função cerebral, incluindo a sobrevivência neuronal (Boehning et al., 2003), diferenciação (Nuthall et al., 2004), função do canal iônico (Jones e Yakel, 2003; Bildl et al., 2004) e potenciação de longo prazo e plasticidade neuronal (Diaz-Nido e outros, 1992; Lieberman e Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Apesar dessa crescente evidência do papel do CK2 na regulação da função neuronal, pouco se sabe sobre o que controla sua atividade. Acredita-se que o CK2 seja constitutivamente ativo, com regulação de sua capacidade de fosforilar substratos específicos dependendo principalmente de mudanças em sua localização intracelular (por exemplo, citosol vs núcleo) (Ahmed e Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Esta informação levanta uma importante questão sobre quais sinais são necessários para induzir a acumulação de ΔFosB no cérebro após a estimulação crônica (FIG. 7C). Um requisito é a ativação repetida do fosB gene e indução do mRNA ΔFosB (Chen et al., 1995). Nossos dados indicam que a fosforilação de C82 de ΔFosB é crítica para sua estabilidade, sugerindo que um segundo sinal pode ser necessário para os efeitos de longo prazo de ΔFosB na expressão gênica, a saber, um sinal que estimula a fosforilação de proteína por CK2. Isso poderia envolver a ativação do CK2 por algum mecanismo desconhecido ou sua translocação para o núcleo. Alternativamente, a fosforilação de CK2 de ΔFosB pode ser constitutiva, de tal modo que como a proteína ΔFosB é traduzida em resposta a cada estímulo, uma porção dela se fosforila e assim estabiliza, de modo que com estimulação repetida ela se acumula em níveis elevados nos neurônios afetados.
Nossos achados mostram que CK2 e S27 provavelmente não são a única quinase e local responsável pela fosforilação de ΔFosB, porque nem a inibição de CK2 nem a mutação S27A foram capazes de impedir completamente a fosforilação de ΔFosB. Da mesma forma, o fato de que a mutação S27A resulta em uma redução de 30% em fosfo-ΔFosB argumenta que S27 é um importante local de fosforilação na proteína. Estamos, no entanto, investigando outras quinases putativas e locais de fosforilação em ΔFosB. Por fim, será importante também analisar a fosforilação de S27 e de quaisquer outros locais de fosforilação em ΔFosB no cérebro. in vivo após vários tipos de estimulação crônica, por exemplo, através do uso de espectrometria de massa ou de anticorpos fosfoespecíficos.
Como mencionado acima, o S27 em ΔFosB é altamente conservado ao longo da evolução e entre outras proteínas da família Fos. No entanto, o site de consenso para CK2 não é: como mostrado Figura 5B, apenas FosB / ΔFosB (e o xenologista Zebrafish), mas não c-Fos ou Fra-2, possuem um resíduo acídico em + 3, um determinante chave da fosforilação de CK2 (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Assim, a falta de fosforilação de CK2 em S27 pode explicar porque outras proteínas da família Fos não são tão estáveis como ΔFosB. No entanto, isso não explica por que o FosB de tamanho completo, que tem o mesmo site de consenso CK2 como ΔFosB, não está estabilizado de maneira semelhante. Não sabemos se FosB de tamanho completo é fosforilado por CK2 neste resíduo conservado. Os únicos relatórios de FosB (Skinner et al., 1997) e c-Fos (Okazaki e Sagata, 1995; Chen et al., 1996) a fosforilação descreve os locais na região C-terminal dessas proteínas, que está ausente em ΔFosB. A potencial fosforilação de FosB de comprimento total e outras proteínas da família Fos por CK2 requer investigação direta. No entanto, mesmo que sejam fosforilados, sabe-se que as outras proteínas da família Fos contêm motivos nos seus terminais C que têm como alvo as proteínas para uma rápida degradação (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Por exemplo, foi demonstrado que um trecho de resíduos ∼21 presentes no terminal C de todas as proteínas da família Fos, mas ausente em ΔFosB, atua como um domínio desestabilizador para c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Descobrimos que, embora essa sequência desestabilize de maneira semelhante o FosBCarle e outros, 2004), a ausência deste domínio em ΔFosB não conta totalmente para sua estabilização. Em vez disso, a combinação da ausência deste domínio terminal C e da fosforilação de Ser27 parece ser totalmente responsável pela diferença de aproximadamente cinco vezes na estabilidade entre ΔFosB e FosB.
Embora a degradação das proteínas da família Fos seja complexa e não totalmente compreendida, a degradação proteasomal parece ser a principal via envolvida (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Os dados apresentados aqui, nos quais os inibidores proteossômicos não alteram significativamente a taxa de degradação de ΔFosB, argumentam que, diferentemente de outras proteínas da família Fos, ΔFosB evita o proteassoma 26S, e isso desempenha um papel central em sua estabilização. Portanto, propomos um esquema pelo qual a estabilidade aumentada de ΔFosB é atribuível à combinação de dois fatores principais: (1) a ausência de um domínio desestabilizante C-terminal e (2) a fosforilação de S27 por CK2.
Em resumo, o presente estudo fornece uma visão mecanicista do porquê ΔFosB, um produto do gene precoce imediato fosBé, ao contrário de todos os outros membros da família Fos, uma proteína relativamente longa. Embora outras proteínas da família Fos sejam capazes de mediar o acoplamento de transcrição de estímulo rápido mas transiente (Morgan e Curran, 1995), a estabilidade relativa de ΔFosB confere-lhe a capacidade de mediar alterações transcricionais de longa duração induzidas por estimulação crónica. Isto suporta a visão de que ΔFosB funciona como um interruptor molecular sustentado no cérebro, convertendo gradualmente respostas agudas em adaptações crônicas. A identificação da fosforilação de Ser27 como um mecanismo central para a estabilidade de ΔFosB abre novos caminhos para o desenvolvimento de meios para regular a função de ΔFosB e, assim, modular seus efeitos a longo prazo sobre a plasticidade neural e comportamental.
Notas de rodapé
- Recebido novembro 21, 2005.
- Revisão recebida em fevereiro 21, 2006.
- Aceito em abril 2, 2006.
- Este trabalho foi apoiado por uma National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression Young Investigator Award para PGU, um National Institute on Drug Abuse (NIDA) National Research Service Award para PGU, e doações do Instituto Nacional de Saúde Mental e NIDA para EJN Nós agradeça ao Dr. James Bibb por sua ajuda com o in vitro ensaios de fosforilação, Dr. Ming-Hu Han por sua ajuda com a preparação de fatias do cérebro usadas para rotulagem metabólica, e Dr. Rachael Neve por sua ajuda com o empacotamento dos HSVs recombinantes.
- Endereço atual de G. Rudenko: Instituto de Ciências da Vida e Departamento de Farmacologia, Universidade de Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- A correspondência deve ser endereçada a Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. O email: [email protected]
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