COMENTÁRIOS: Embora tanto o estresse, drogas de abuso e certas recompensas naturais desencadear um acúmulo de DeltaFosB, o estresse ativa diferentes células a jusante e, posteriormente, diferentes receptores e genes. Em outras palavras, os vícios e a resistência ao estresse dependem de mecanismos fundamentalmente diferentes
J Neurosci. 2010 Oct 27; 30 (43): 14585-92.
Vialou V, Labirinto I, Renthal W, Laplante QC, Watts EL, E Mouzon, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ.
fonte
Departamento de Neurociência de Fishberg, Escola de Medicina Mount Sinai, Nova York, Nova York 10029, EUA.
Sumário
Os mecanismos moleculares subjacentes às adaptações neuronais induzidas por estresse e drogas não são completamente compreendidos. Uma molécula implicada em tais adaptações é a ΔFosB, um fator de transcrição que se acumula no núcleo de roedores accumbens (NAc), uma região chave de recompensa do cérebro, em resposta tanto ao estresse crônico quanto à exposição repetida a drogas de abuso. TOs mecanismos transcricionais à montante que controlam a indução de ΔFosB por esses estímulos ambientais permanecem elusivos. Aqui, identificamos o fator de transcrição dependente de atividade, fator de resposta sérica (SRF), como um novo mediador de estresse, mas não cocaína-, induzido ΔFosB. O SRF é regulado negativamente na NAc de pacientes humanos deprimidos e em camundongos cronicamente expostos ao estresse de derrota social. Este downregulation de SRF está ausente em animais resilientes. Através do uso de mutagênese indutível, mostramos que a indução de ΔFosB mediada por estresse, que ocorre predominantemente em camundongos resilientes, é dependente da expressão de SRF nesta região do cérebro.. Além disso, a deleção genética específica para NAC promove uma variedade de fenótipos pró-ansiosos e pró-ansiosos e torna os animais mais sensíveis aos efeitos deletérios do estresse crônico. Em contraste, demonstramos que a SRF não desempenha um papel no acúmulo de ΔFosB no NAc em resposta à exposição crônica à cocaína. Além disso, o knock-out de SRF específico de NAc não tem efeito sobre os comportamentos induzidos por cocaína, indicando que o estresse crônico de derrota social e a exposição repetida à cocaína regulam o acúmulo de ΔFosB e a sensibilidade comportamental por meio de mecanismos independentes.
Introdução
O nucleus accumbens (NAc), uma região chave de recompensa do cérebro, é importante para a integração de informações sensoriais e cognitivas que impulsionam comportamentos motivacionais relevantes em resposta a estímulos ambientais (Nestler e Carlezon, 2006; Sesack e Grace, 2010). O NAc também tem sido implicado em anormalidades comportamentais associadas à dependência de drogas e depressão. Assim, o direcionamento do NAc com a estimulação cerebral profunda tem mostrado aliviar os comportamentos de depressão e vício em humanos e roedores (Schlaepfer et al., 2008; Vassoler et al., 2008; Heinze et al., 2009; Kuhn et al. al., 2009).
A exposição repetida a drogas de abuso ou estresse induz padrões alterados de expressão gênica no NAc, potencialmente subjacente à cronicidade da dependência e depressão (Berton et al., 2006; Krishnan e outros; 2007; Maze e outros, 2010; Vialou e outros ., 2010). Curiosamente, o fator de transcrição ΔFosB, um produto de splice do gene fosB, se acumula no NAc em resposta à exposição repetida a drogas ou estresse (Nestler, 2008; Perrotti et al., 2008; Vialou et al., 2010). ΔFosB tem sido proposto como um potencial interruptor molecular guiando a transição do uso recreativo de drogas para o estado cronicamente viciado (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Renthal et al., 2009), conforme sua acumulação no NAc aumenta recompensando respostas a várias drogas de abuso. Mais recentemente, o papel da indução de ΔFosB no NAc após estresse crônico de derrota social (Nikulina e cols., 2008; Vialou e cols., 2010) foi elucidado: ΔFosB promove respostas ativas de enfrentamento a estímulos estressantes e aumenta a resiliência. Embora a indução de ΔFosB ocorra de forma dependente do estímulo, os mecanismos responsáveis pelo acúmulo de ΔFosB induzido por drogas e estresse no NAc permanecem desconhecidos.
O fator de resposta sérica (SRF) é um fator de transcrição necessário para a ativação transcricional dependente da atividade de vários genes precoces imediatos, incluindo c-fos, fosb, Egr1 e Arc (Knöll e Nordheim, 2009). Estudos recentes demonstraram os efeitos do SRF nas propriedades morfológicas e citoarquiteturais dos neurônios, incluindo a regulação da atividade sináptica e a formação de circuitos no cérebro adulto (Knöll e Nordheim, 2009). Esses achados nos levaram a investigar se o SRF é funcionalmente regulado pela exposição crônica a drogas de abuso ou estresse, bem como o impacto potencial de tal regulação na indução de ΔFosB nessas condições.
Aqui, nós descrevemos um novo mecanismo através do qual a regulação negativa de SRF em NAc promove pró-repressores e fenótipos ansiogênicos, em última análise, aumentando a vulnerabilidade de um animal aos efeitos deletérios do estresse crônico. Esses efeitos são mediados, em parte, pela perda de indução de ΔFosB no NAc de animais estressados. As diminuições observadas na expressão de SRF e ΔFosB em tecido NAc post-mortem obtido de pacientes deprimidos apóiam a relevância de nossos achados para a depressão humana. Curiosamente, este mecanismo que controla o acúmulo de ΔFosB parece ser específico do estresse: a exposição crônica à cocaína não tem efeito na expressão de SRF, a deleção de SRF do NAc não tem impacto sobre o acúmulo de ΔFosB após a exposição crônica à cocaína, e tal deleção de SRF não tem efeito sobre a cocaína- comportamentos induzidos. Essa nova interação entre SRF e ΔFosB, no contexto de estresse, pode representar um importante mecanismo homeostático que regula a sensibilidade de um indivíduo ao estresse crônico.
Materiais e Métodos
Animais
Ratinhos machos C57BL / 6J de oito semanas de idade (Jackson Laboratory) foram utilizados em todas as experiências comportamentais e bioquímicas. Todos os animais foram habituados às instalações dos animais durante pelo menos 1 semanas antes das manipulações experimentais e foram mantidos a 23 – 25 ° C num ciclo 12 h claro / escuro (luzes ligadas de 7: 00 AM a 7: 00 PM) com ad libitum acesso a comida e água. Os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Society for Neuroscience e do comitê institucional de cuidado e uso de animais da Mount Sinai School of Medicine.
Para expericias com cocaa [Western blotting e imunoprecipitao quantitativa da cromatina (ChIP)], foram utilizados ratinhos C8BL / 10J machos 57- a 6 com uma semana de idade. Os animais receberam sete injeções intraperitoneais diárias de solução salina ou cocaína (20 mg / kg de cocaína-HCl; Sigma). Os ratinhos foram utilizados 24 h após o tratamento final. Para expericias comportamentais, os ratos foram alojados individualmente em cirurgia e foram tratados com 10 mg / kg (sensibilizao locomotora) ou 7.5 mg / kg (prefercia condicionada local) cocaa-HCl intraperitonealmente, como descrito abaixo.
Murganhos Srffl / fl foram gerados como descrito anteriormente (Ramanan et al., 2005). O knock-out específico para NAc de Srf foi conseguido através de injeção estereotáxica e subsequente superexpressão viral da Cre recombinase (Cre) fundida a proteína fluorescente verde (GFP) usando vetores de vírus adeno-associados (AAV). Um Cre de não-exclusão foi usado. AAV-GFP foi injectado em vez de AAV-Cre-GFP em ratinhos Srffl / fl como controlo. Resumidamente, os ratinhos foram anestesiados utilizando uma mistura de cetamina (10 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg), com as seguintes coordenadas estereotáxicas utilizadas para distribuição viral: + 1.6 (anterior / posterior), + 1.5 (lateral), 4.4 (dorsal / ventral) em um ângulo de 10 ° a partir da linha média (em relação ao bregma). Um total de 0.5 μl de vírus purificado foi administrado bilateralmente durante um período mínimo de 5 (0.1 μl / min), seguido de 5 min de descanso. Os ratos foram testados 2 semanas após a cirurgia, quando a expressão viral foi máxima, e os locais de injeção viral foram confirmados para todos os animais usando métodos histológicos padrão. A efici�cia da express� Cre mediada por v�us foi validada por imuno-histoqu�ica e por PCR de transcriptase reversa para Srf conduzidas em pun�es de NAc microdissecados de animais que receberam AAV-Cre-GFP e AAV-GFP no NAc. Os vírus AAV-GFP e AAV-Cre-GFP foram gerados como descrito anteriormente (Maze et al., 2010).
Procedimentos Comportamentais
Estresse de derrota social.
Camundongos C57BL / 6J foram submetidos a estresse de derrota social crônica por 10 dias consecutivos, como descrito anteriormente (Berton et al., 2006; Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010). Resumidamente, cada ratinho foi exposto a um ratinho reprodutor aposentado CD1 macho não familiar e agressivo para 5 min por dia. Após interação direta com o agressor CD1, os animais foram então colocados em um compartimento adjacente da mesma gaiola para o próximo 24 h com contato sensorial, mas não físico. Os animais de controlo foram alojados em gaiolas equivalentes mas com membros da mesma estirpe. Testes de interação social foram realizados 24 h após o último dia da derrota.
A evitação social para um camundongo CD1 desconhecido do sexo masculino foi avaliada de acordo com protocolos publicados (Berton et al., 2006; Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010). O rato experimental foi introduzido pela primeira vez em um campo aberto contendo uma gaiola de malha de arame vazia por 2.5 min. Durante uma segunda sessão, um camundongo macho CD1 desconhecido foi introduzido na gaiola com arame. O tempo gasto na zona de interação (um corredor de 8 cm de largura ao redor da gaiola) foi medido. A segregação de camundongos derrotados em subpopulações suscetíveis e resilientes foi realizada conforme descrito anteriormente (Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010). Uma vez que a maioria dos ratos de controle passou mais tempo interagindo com um alvo social do que com um compartimento de alvo vazio, uma proporção de interação de 100 (igual tempo gasto na zona de interação na presença versus ausência de um alvo social) foi definida como um corte. Os camundongos com pontuação <100 foram rotulados como suscetíveis e aqueles com pontuação ≥100 foram rotulados como resilientes. Extensas análises comportamentais, bioquímicas e eletrofisiológicas apóiam a validade dessas distintas subpopulações suscetíveis e resilientes (Krishnan et al., 2007; Wilkinson et al., 2009; Vialou et al., 2010).
Para examinar a vulnerabilidade de ratos Srffl / fl ao estresse de derrota social, os camundongos, injetados bilateralmente com AAV-GFP ou AAV-Cre-GFP, foram submetidos a três derrotas consecutivas no mesmo dia e depois testados para interação social 24 h posteriormente. Este procedimento de derrota submáxima foi validado anteriormente para revelar fenótipos de prosusceptibilidade após manipulações genéticas (Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010).
Desamparo aprendido.
Camundongos Srffl / fl com superexpressão de AAV-GFP ou AAV-Cre-GFP foram submetidos ao procedimento de desamparo aprendido conforme descrito anteriormente (Berton et al., 2007). Resumidamente, os ratos foram expostos a choques intermitentes e inescapáveis para os pés 1 h ao longo de 2 dias consecutivos (0.45 mA, 5 s duração). No dia do teste, os ratos foram reintroduzidos na caixa para testes de escape consecutivos 15. Durante cada tentativa, um choque contínuo foi entregue e os camundongos tiveram a oportunidade de escapar, entrando no compartimento não-eletrificado adjacente. Após uma fuga bem-sucedida, a porta foi automaticamente fechada e a latência de escape foi registrada. Quando os camundongos não escaparam dentro do 25 s, o teste foi finalizado e foi registrado como uma falha. Estudos anteriores demonstraram que a expressão viral em NAc e outras regiões não tem efeito sobre o comportamento de fuga na linha de base na ausência de estresse (Newton et al., 2002; Berton et al., 2007).
Sensibilização locomotora.
Duas semanas após as injeções intra-NAc de AAV-GFP ou AAV-Cre-GFP, os camundongos Srffl / fl foram submetidos a sensibilização locomotora. Os camundongos foram habituados à arena locomotora por 30 min por dia por 4 d. Após a habituação, os animais foram injetados intraperitonealmente com 10 mg / kg de cocaína-HCl e colocados nas caixas do locomotor. As atividades locomotoras dos animais foram registradas usando um sistema de feixe de luz (San Diego Instruments) como quebras de feixe ambulatoriais por 30 min por dia. A sensibilização locomotora foi registrada ao longo de um período de 6 dias.
Preferência de lugar condicionado.
O procedimento de condicionamento do local foi realizado conforme descrito anteriormente (Maze et al., 2010), com as seguintes modificações. Resumidamente, 18 d após infusões intra-NAc de AAV-GFP ou AAV-Cre-GFP em camundongos Srffl / fl, os animais foram colocados nas câmaras de condicionamento, que consistiam em três ambientes contextualmente distintos. Os camundongos exibindo preferência significativa por qualquer uma das duas câmaras de condicionamento foram excluídos do estudo (<10% de todos os animais). Os grupos de condicionamento foram ainda mais equilibrados para se ajustar a qualquer viés de câmara que ainda possa existir. Nos dias subsequentes, os animais foram injetados com solução salina e confinados em uma câmara à tarde por 30 min e, em seguida, injetados com cocaína (7.5 mg / kg, ip) e confinados por 30 min na outra câmara no dia seguinte, totalizando duas rodadas de treinamento de associação por tratamento (dois pares de soro fisiológico e dois pares de cocaína). No dia do teste, os camundongos foram colocados de volta no aparelho sem tratamento por 20 min e testados para avaliar a preferência lateral. As respostas locomotoras à cocaína foram avaliadas por meio de quebras de feixe nas câmaras emparelhadas com cocaína para garantir a eficácia do tratamento com drogas. Para todos os grupos, a locomoção inicial em resposta à solução salina foi avaliada para garantir que a locomoção não foi afetada pelo tratamento viral.
Outros testes comportamentais
Os ratinhos Srffl / fl foram testados em testes de campo aberto, luz / escuridão e nado forçado com base em protocolos publicados (Vialou et al., 2010). A atividade de ratos no campo aberto foi registrada para 5 min usando um sistema de rastreamento de vídeo (Etovisão) sob condições de luz vermelha. Para o teste claro / escuro, os ratos foram autorizados a explorar livremente uma caixa de duas câmaras composta por uma grande arena iluminada ligada a uma pequena arena fechada. Os ratos foram testados por um período de 5 min para avaliar a quantidade de tempo gasto em qualquer gabinete. Nos testes de campo aberto e luz / escuridão, o tempo gasto no centro e na arena de luz, respectivamente, foi avaliado como um índice inverso de respostas relacionadas à ansiedade. Um 1 d teste de natação forçada foi conduzido por um período de 5 min. O aumento do tempo de imobilidade durante o teste de nado forçado foi interpretado como um comportamento tipo prodepressivo. O teste 1 d foi amplamente utilizado em camundongos e foi validado como medida de validade preditiva, na medida em que as terapias antidepressivas reduzem o tempo de imobilidade.
Imunohistoquímica
Murganhos Srffl / fl foram anestesiados e perfundidos intracardialmente com 4% paraformaldeído / PBS. Os cérebros foram removidos e crioprotegidos em 30% de sacarose / PBS. Cortes coronais (30 μm) foram cortados em micrótomo de congelamento e processados para análises imunohistoquímicas. A validação do knockout de Srffl / fl foi realizada utilizando um anticorpo policlonal dirigido contra SRF (1 / 2000; Santa Cruz Biotechnology). A expressão de Cre foi confirmada por meio da expressão GFP (policlonal de frango, 1 / 8000, Aves Labs) em cérebros dissecados, pois o Cre é fundido a GFP. Para quantificação da indução de ΔFosB após estresse de derrota social em camundongos knockout Srffl / fl, ΔFosB foi detectado usando um anticorpo policlonal de coelho criado contra a região N-terminal da proteína (1 / 1000; Santa Cruz Biotechnology). As imagens foram tiradas com um microscópio confocal (20 × ampliação; Zeiss). O nero de culas imunopositivas para GFP contadas como negativas e positivas para imunorreactividade para AFosB foi quantificado em mtiplas imagens para cada animal, com valores mios subsequentemente calculados para cada animal. Cada animal foi considerado uma observação individual para análise estatística.
Tecido NAc pós-morte humano
Tecido cerebral post-mortem humano foi obtido a partir do Dallas Brain Collection, onde o tecido é coletado do Dallas Medical Examiner's Office e do Southwestern's Tissue Transplant Program da University of Texas (UT) após consentimento do parente mais próximo. O tecido foi analisado de machos e fêmeas pareados por idade, intervalo pós-morte, número de integridade de RNA (RIN) e pH. Fatores agonais específicos, incluindo coma, hipóxia, pirexia, convulsões, desidratação, hipoglicemia, falência de múltiplos órgãos e ingestão de substâncias neurotóxicas no momento da morte influenciam a integridade do RNA em tecidos cerebrais pós-morte (Tomita et al., 2004). Usamos uma escala de fator agonal (AFS) para caracterizar as amostras de tecido em cada uma dessas oito condições. A ausência de um fator agonal foi atribuída uma pontuação de 0 e sua presença foi pontuada como 1 para fornecer uma pontuação AFS total entre 0 e 8. Tecido com pontuação agonal de 0 ou 1 reflete amostras de boa qualidade; os dados demográficos do caso são apresentados na Tabela 1. A qualidade notável do tecido foi confirmada por altos valores de RIN. Os casos foram submetidos a uma dissecção padrão antes do congelamento instantâneo em isopentano −40 ° C e armazenamento a −80 ° C; dissecção adicional de NAc foi realizada em tecido congelado. O conselho de revisão institucional da UT Southwestern analisou e aprovou a coleta desse tecido para uso em pesquisa. Uma entrevista direta com o informante foi realizada para cada caso de depressão em uma data posterior, onde as informações sobre a doença do caso foram documentadas; um diagnóstico de consenso de transtorno depressivo maior foi feito usando os critérios do DSM-IV por dois psiquiatras pesquisadores. Nenhum dos casos incluídos neste estudo teve exames toxicológicos do sangue positivos para drogas de abuso, álcool ou medicamentos prescritos que não sejam antidepressivos. Apesar do tratamento com antidepressivos, todos os indivíduos estavam clinicamente deprimidos no momento da morte. As amostras de tecido foram dispensadas de forma cega para análise.
Tabela 1.
Dados demográficos para estudo pós-morte em humanos
Western blotting
As amostras de NAc humanas e de ratinho foram processadas como descrito anteriormente (Maze et al., 2010). O tecido congelado foi sonicado num tampão de lise 5 mM HEPES contendo 1% SDS com protease (Roche) e inibidores da fosfatase (Sigma). As concentrações de proteína foram determinadas pelo ensaio de proteína Dc (Bio-Rad). Quantidades iguais de amostras de proteína foram submetidas a SDS-PAGE e Western blotting. As transfercias de Western foram sondadas utilizando um anticorpo para SRF (1 / 2000; Santa Cruz Biotecnologia) ou GAPDH (1 / 1500; Abcam) e foram depois rastreadas e quantificadas utilizando o sistema de imagiologia Odyssey (Licor).
Isolamento de RNA e PCR quantitativo
Isolamento de RNA, PCR quantitativo (qPCR), e análise de dados foram realizados como previamente descrito (Maze et al., 2010; Vialou e outros, 2010). Resumidamente, o ARN foi isolado com o reagente TriZol (Invitrogen) e foi adicionalmente purificado com micro kits RNAeasy da Qiagen. Todas as amostras de RNA foram determinadas como tendo valores 260 / 280 e 260 / 230 ≥1.8. A transcrição reversa foi realizada usando o iScript (Bio-Rad). qPCR usando SYBR green (Quanta) foi realizado com um sistema 7900HT RT PCR da Applied Biosystems com os seguintes parâmetros de ciclo: 2 min a 95 ° C; Ciclos 40 de 95 ° C para 15 s, 59 ° C para 30 s, 72 ° C para 33 s; e aquecimento graduado a 95 ° C para gerar curvas de dissociação para confirmação de produtos de PCR individuais. Os dados foram analisados comparando os valores de C (t) da condição de tratamento (camundongos controle vs suscetíveis ou resilientes, ou controles humanos versus pacientes deprimidos) com o método ΔΔC (t) (Tsankova et al., 2006). PrimFosB qPCR primers: para frente, AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT e reverso, GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG.
Lasca
A ChIP foi realizada como descrito anteriormente (Maze et al., 2010) em punções NAc bilaterais de controle, suscetíveis e resilientes (quatro punções 14-gauge / mouse) 1 h após a última experiência de derrota e de salina e cocaína animais tratados 24 h após o tratamento final. O tecido foi reticulado em formaldeído 1%. A fixação foi subsequentemente interrompida através da aplicação de glicina e o tecido foi lavado e mantido a −80 ° C até ser utilizado. A cromatina cortada foi incubada durante a noite com um anticorpo anti-SRF (Santa Cruz Biotechnology) previamente ligado a esferas magnéticas (Dynabeads M-280; Invitrogen). Ap� reticula�o reversa e purifica�o de ADN, a liga�o de SRF ao promotor de fosb foi determinada por qPCR utilizando iniciadores que abrangem uma regi� do promotor de fosb contendo dois locais de liga�o ao elemento de resposta ao soro. Os pulldowns da SRF foram significativamente enriquecidos em comparação com os controles sem anticorpos. Iniciadores promotores do gene fosb de ratinho: forward, CCCTCTGACGTAATTGCTAGG e reverse, ACCTCCCAAACTCTCCCTTC.
análise estatística
ANOVAs unilaterais foram usados para comparar as médias entre camundongos controle, suscetíveis e resilientes em análises bioquímicas e comportamentais. ANOVAs de duas vias foram usados para comparar a indução ΔFosB por derrota social em camundongos knock-out Srf local, bem como para comparar o efeito de knock-out Srf nos protocolos de desamparo aprendido e de sensibilização locomotora. Os testes t de Student foram usados para comparar as médias no efeito do nocaute de Srf na indução ΔFosB e entre os grupos em tecido humano pós-morte e análise ChIP de camundongo. As diferenças entre as condições experimentais foram consideradas estatisticamente significativas quando p ≤ 0.05.
Resultados
Expressão de SRF e ΔFosB em depressão humana e camundongos socialmente derrotados
Para explorar um papel potencial do SRF no desenvolvimento de comportamentos semelhantes aos depressivos, primeiro avaliamos a expressão da proteína SRF no NAc de pacientes humanos deprimidos após a morte. Indivíduos deprimidos exibiram níveis de SRF significativamente reduzidos em NAc em comparação com seus controles de mesma idade (t (19) = 1.9; p <0.05) (Fig. 1A). Dado o papel do SRF na regulação da expressão gênica precoce dependente de atividade (Ramanan et al., 2005), formulamos a hipótese de que o SRF pode estar envolvido no controle da expressão de ΔFosB nesta região do cérebro. Em apoio a essa hipótese, observamos que os níveis de mRNA do Δfosb também foram significativamente reduzidos no NAc de humanos deprimidos (t (16) = 1.8; p <0.05) (Fig. 1B). Isso é consistente com as descobertas recentes de níveis diminuídos da proteína ΔFosB também nessas condições (Vialou et al., 2010).
Figura 1. Painel do
A repressão de SRF induzida por estresse crônico se correlaciona com a diminuição da transcrição ΔFosB em NAc. A, B, pacientes humanos deprimidos pós-morte apresentam níveis reduzidos de proteína SRF (n = 10 / grupo; A) e expressão de mRNA de Δfosb em NAc (n = 8 / grupo; B). C, Os camundongos submetidos a estresse de derrota social crônico (10 dias) foram agrupados em subpopulações suscetíveis e resilientes. D, O estresse de derrota social crônica reduz os níveis de proteína SRF em NAc de camundongos suscetíveis, mas não em camundongos resilientes, em comparação com os controles 24 h após o teste de interação social mostrado em C. E, os níveis de mRNA de ΔfosB em NAc estão inalterados em camundongos suscetíveis, mas significativamente regulado positivamente em animais resilientes (n = 7-15 / grupo). F, a proteína SRF exibe maior ligação ao promotor do gene fosb após estresse de derrota social crônica apenas em camundongos resilientes, e não suscetíveis (n = 5 / grupo). Os dados exibidos são expressos como média ± SEM (representados como barras de erro). Con., Controle; Dep., Deprimido; Sus., Suscetível; Res., Resiliente. * p <0.05 versus controle; *** p <0.001 versus controle; #p <0.05 versus suscetível; ## p <0.01 versus suscetível; ### p <0.001 versus suscetível.
Para estender essas descobertas, usamos o protocolo de estresse de derrota social crônica em ratos. Dois grupos distinguíveis de camundongos derrotados, suscetíveis e resilientes, foram aparentes (Krishnan et al., 2007) com base em uma medida de evitação social, em que animais suscetíveis exibiram interação social significativamente reduzida em comparação com animais de controle e resilientes (F (2,23, 157.2) = 0.001; p <0.001; testes t com correção de Bonferroni, suscetível vs controle, p <0.05; resiliente vs controle, p <0.01; resiliente vs suscetível, p <1) (Fig. 2,32C). Dois dias após o último episódio de derrota, camundongos de controle suscetíveis, resilientes e não derrotados foram analisados quanto à expressão de SRF em NAc. Semelhante aos achados na depressão humana, os níveis de proteína SRF foram significativamente reduzidos em NAc de camundongos suscetíveis em comparação com os controles, enquanto os níveis de SRF não foram afetados em NAc de camundongos resilientes (F (4.7) = 0.05; p <0.05; testes t com um Correção de Bonferroni, suscetível vs controle, p <0.05; resiliente vs suscetível, p <1) (Fig. XNUMXD).
A seguir, examinamos a expressão de mRNA de Δfosb no NAc desses três grupos de animais e observamos um aumento significativo na expressão de Δfosb apenas em animais resilientes, com uma tendência, mas nenhum aumento significativo observado em camundongos suscetíveis (t (14) = 2.1; p <0.05 ) (Fig. 1E). Para investigar as possíveis interações entre os níveis de SRF e a transcrição de Δfosb, usamos o ChIP para examinar se a ligação do SRF ao promotor do gene fosb foi alterada após o estresse de derrota social crônica em coortes separadas de camundongos suscetíveis e resilientes. Animais resilientes exibiram ligação de SRF significativamente aumentada ao promotor fosb em NAc em comparação com os controles (t (8) = 2.1; p <0.05), bem como em comparação com camundongos suscetíveis (t (8) = 2.0; p <0.05). Nenhuma diferença foi observada entre controles e camundongos suscetíveis, provavelmente refletindo a falta de indução de SRF em camundongos suscetíveis (Fig. 1F).
Para confirmar o papel do SRF na regulação de ΔFosB após estresse de derrota social crônica, camundongos Srffl / fl foram usados para examinar o efeito de uma deleção seletiva de SRF do NAc na indução de estresse de ΔFosB. Os camundongos Srffl / fl foram injetados estereotaxicamente intra-NAc com vetores AAV que expressam GFP ou Cre-GFP. Um nocaute específico para NAc de SRF induzido por AAV-Cre-GFP foi confirmado imunohistoquimicamente (Fig. 2A). Na verdade, não houve sobreposição entre a coloração SRF e a expressão Cre, demonstrando a eficácia do knock-out. Em punções de NAc microdissecados, detectamos uma redução significativa de 50% nos níveis de proteína SRF (t (11) = 4.3; p <0.001). A magnitude provavelmente reflete o fato de que uma fração do tecido em tais microdissecções não está infectada por vírus.
Figura 2. Painel do
SRF medeia a indução ΔFosB por estresse de derrota social crônica. A, a injeção de AAV-Cre-GFP no NAc de camundongos Srffl / fl resulta no knock-out da proteína SRF em neurônios que expressam Cre. A injeção de AAV-GFP não teve efeito discernível. B, Tal knock-out seletivo de SRF do NAc bloqueia completamente a indução de ΔFosB em NAc após estresse de derrota social crônica (n = 4 / grupo). Os dados exibidos são expressos como média ± SEM (representados como barras de erro). * p <0.05 versus controle AAV-GFP; ** p <0.01 versus derrota AAV-GFP.
Em seguida, realizamos imuno-histoquímica quantitativa para ΔFosB em NAc de camundongos Srffl / fl derrotados injetados intra-NAc com AAV-Cre-GFP ou AAV-GFP. Após o estresse de derrota social crônica, a expressão de ΔFosB foi significativamente induzida em NAc de animais injetados com AAV-GFP (vírus × interação de tratamento, F (1,12) = 6.4; testes t com uma correção de Bonferroni, controle vs derrota, p <0.05; AAV-Cre vs AAV-GFP, p <0.01). No entanto, esta indução não foi observada em camundongos Srffl / fl recebendo AAV-Cre-GFP (Fig. 2B), demonstrando que a indução de ΔFosB em NAc por estresse crônico requer SRF.
Derrame SRF em NAc promove fenótipos pró-estimulantes e pró-ansiosos
Uma vez que a indução de ΔFosB por derrota social crônica de estresse demonstrou anteriormente mediar a resiliência (Vialou et al., 2010), formulamos a hipótese de que a regulação negativa de SRF e a perda resultante de indução de ΔFosB em animais suscetíveis podem representar uma adaptação negativa que acaba resultando animais mais vulneráveis aos efeitos deletérios do estresse. Para testar esta hipótese, induzimos uma deleção local específica de NAc do gene Srf em ratos adultos Srffl / fl, conforme descrito acima, e os ratos resultantes e seus controles foram testados em uma bateria de paradigmas comportamentais para avaliar a depressão e ansiedade basais. como comportamento. A deleção local de NAc de SRF promoveu um efeito semelhante à pró-depressão, conforme medido através do teste de natação forçada (t (30) = 2.5; p <0.05), bem como um efeito ansiogênico medido em campo aberto (t (38) = 1.9; p <0.05) e testes claro / escuro (t (8) = 1.9; p <0.05). Assim, camundongos Srffl / fl recebendo AAV-Cre-GFP no NAc exibiram latência diminuída para imobilidade no teste de natação forçada, menos tempo no centro de um campo aberto e menos tempo no compartimento de luz de uma caixa claro / escuro em comparação com animais injetados com AAV-GFP (Fig. 3A-C). No entanto, a deleção intra-NAc de SRF não alterou os níveis basais de locomoção, sugerindo que os efeitos comportamentais observados em animais knock-out para SRF não foram devidos a anormalidades na atividade locomotora geral (Fig. 3D). Esses dados são interessantes à luz de relatórios anteriores que sugerem que, embora ΔFosB em NAc regule comportamentos semelhantes aos depressivos, não parece estar envolvido em respostas relacionadas à ansiedade (Vialou et al., 2010). Nossos achados atuais de que a perda de SRF induz respostas ansiogênicas sugerem que ela o faz por meio de alvos diferentes de ΔFosB.
Figura 3. Painel do
O nocaute de SRF do NAc promove fenótipos semelhantes a pró-depressão e pró-ansiedade. A – C, Knock-out seletivo de SRF do NAc, obtido por meio da injeção de AAV-Cre-GFP no NAc de camundongos Srffl / fl, reduz a latência à imobilidade no teste de nado forçado (n = 14-18 / grupo; A) e reduz o tempo gasto no centro e o tempo gasto no compartimento claro nos testes de campo aberto (B) e claro / escuro (C), respectivamente (n = 5–15 / grupo). D, Nenhuma diferença na atividade locomotora basal foi observada no campo aberto de camundongos que receberam injeções intra-NAc de AAV-GFP ou AAV-Cre-GFP. E, F, suscetibilidade aumentada ao desamparo aprendido (n = 7–8 / grupo; E) e estresse de derrota social (n = 5–6 / grupo; F), conforme medido, respectivamente, pela latência para escapar e tempo de interação social . Os dados exibidos são expressos como média ± SEM (representados como barras de erro). * p <0.05 versus GFP ou versus alvo ausente; ** p <0.01 versus GFP; *** p <0.001 versus GFP.
Em seguida, estudamos se a deleção de SRF em NAc também aumenta a vulnerabilidade de um animal aos efeitos prejudiciais do estresse repetido. Camundongos Srffl / fl, injetados com AAV-Cre-GFP ou AAV-GFP no NAc, foram examinados em dois modelos de depressão, desamparo aprendido e estresse de derrota social crônica. Em desamparo aprendido, os animais Srffl / fl recebendo AAV-Cre-GFP exibiram latência aumentada para escapar de um choque nas patas após a exposição anterior ao estresse inevitável por choque nas patas (tratamento x interação de ensaios, F (14,180) = 10.2; testes t com uma correção de Bonferroni, p <0.001; AAV-Cre vs AAV-GFP, p <0.01), indicando maior suscetibilidade a déficits comportamentais induzidos por estresse (Fig. 3E). Da mesma forma, a deleção de SRF local de NAc também aumentou a aversão social (t (10) = 1.8; p <0.05) em comparação com animais de controle injetados com AAV-GFP após estresse de derrota social crônica (Fig. 3F), um efeito semelhante a pró-repressão.
Falta de envolvimento da SRF na indução de ΔFosB e respostas comportamentais à cocaína
Dado que ΔFosB também é induzido em NAc em resposta a drogas de abuso, como a cocaína, era interessante examinar um papel potencial do SRF na ação da cocaína. Ao contrário do estresse de derrota social crônica, a exposição repetida à cocaína não alterou a expressão da proteína SRF em NAc (t (14) = 0.8; p> 0.05) (Fig. 4A) e não teve efeito na ligação do SRF ao promotor do gene fosB nesta região do cérebro (t (4) = 0.7; p> 0.05) (Fig. 4B). Isso sugere que, ao contrário do estresse, a indução de ΔFosB após a cocaína crônica não é mediada por SRF. Nós testamos isso diretamente, examinando se o acúmulo de ΔFosB após a cocaína crônica é alterado em animais Srffl / fl recebendo AAV-Cre-GFP versus AAV-GFP em NAc. Descobrimos que a deleção de SRF não teve efeito sobre o acúmulo de ΔFosB induzido por cocaína nesta região do cérebro (Fig. 4C).
Figura 4. Painel do
A perda de SRF não teve efeito sobre a indução de cocaína de ΔFosB ou comportamentos regulados por cocaína. A, B, Exposição repetida à cocaína (7 d, 20 mg / kg de cocaína-HCl) não teve efeito na expressão da proteína SRF em NAc (A) ou na ligação de SRF ao promotor do gene fosB nesta região do cérebro (B) 24 h após exposição a drogas (n = 5 / grupo). O acúmulo de C, ΔFosB, medido imunocitoquimicamente, após a exposição crônica à cocaína, não é afetado pelo "knock-out" específico para NAc da SRF. D, E, Deleção local de SRF do NAc também não teve efeito sobre a atividade locomotora após uma injeção de solução salina (d 1) na atividade locomotora induzida pela cocaína e sensibilização (n = 8 / grupo) (d1-7; D) ou na preferência de lugar condicionado por cocaína (n = 8 / grupo; E). Os dados exibidos são expressos como média ± SEM (representados como barras de erro).
Para acompanhar este achado surpreendente, investigamos se um nocaute seletivo SRF do NAc altera as respostas comportamentais à cocaína. Consistente com a falta de regulação da indução de ΔFosB por cocaína por SRF, o nocaute específico de NAc de SRF não teve efeito sobre a atividade locomotora induzida por cocaína aguda ou sensibilização locomotora observada após exposições repetidas de cocaína (tratamento x interação de tempo, F (4,80) = 0.3; p> 0.05) (Fig. 4D). Da mesma forma, o nocaute específico para NAc do SRF não teve efeito sobre a preferência de lugar condicionada pela cocaína (t (14) = 0.1; p> 0.05) (Fig. 4E), o que fornece uma medida indireta da recompensa da cocaína.
Discussão
Este estudo identificou o SRF como um novo mediador a montante de ΔFosB no NAc após o estresse crônico de derrota social, e implicou o SRF no desenvolvimento de comportamentos depressivos e ansiosos. Nós fornecemos evidências diretas de que o estresse crônico de derrota social diminui os níveis de SRF na NAc de animais suscetíveis, mas não resilientes, e que essa regulação negativa previne a indução de ΔFosB nessa região do cérebro, que demonstramos ser necessária para o enfrentamento eficaz do estresse crônico. isto é, resiliência (Vialou et al., 2010). Uma redução similar na expressão de SRF foi encontrada na NAc de humanos deprimidos, onde o RNAm de ΔFosB e expressão de proteína também foram reduzidos. Em contraste, os níveis de ΔFosB não foram reduzidos no NAc de camundongos suscetíveis, apesar de uma regulação negativa do SRF, o que implica outros mecanismos transcricionais, ainda desconhecidos, no controle da expressão de ΔFosB. Um papel causal da SRF na mediação da indução de ΔFosB no NAc após o estresse crônico foi estabelecido pelo uso da deleção genética indutível da SRF nessa região do cérebro. A análise comportamental de camundongos com esse knock-out de SRF específico de NAc implica ainda que a SRF desempenhe um papel-chave no desenvolvimento de comportamentos de base e de ansiedade e ansiedade-induzidos por estresse. Em impressionante contraste, a deleção da SRF não teve nenhum efeito na indução de ΔFosB em resposta à administração crônica de cocaína ou aos efeitos comportamentais da cocaína. Esses achados suportam um novo papel específico do estímulo para SRF na regulação da indução de ΔFosB e de respostas comportamentais a perturbações ambientais distintas.
Demonstrou-se anteriormente que a transcrição mediada por SRF responde à actividade sináptica, largamente desencadeada pelo aumento do influxo de cálcio, bem como à actividade neurotrófica aumentada, particularmente no caso do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) (Bading et al., 1993; Xia e outros, 1996, Johnson e outros, 1997, Chang e outros, 2004, Kalita e outros, 2006, Knoll e Nordheim, 2009. Isso levanta a interessante questão de por que a SRF é regulada negativamente na NAc de camundongos suscetíveis, mas não resilientes, após o estresse crônico de derrota social. Esta regulação diferencial provavelmente não é mediada pela sinalização da dopamina ou BDNF, uma vez que camundongos suscetíveis apresentam aumento dos níveis de proteína do BDNF e aumento da sinalização de BDNF no NAc, bem como aumento do disparo de neurônios dopaminérgicos da área tegmentar ventral (VTA), que inervam o NAc, enquanto animais resilientes exibem níveis normais de taxas de sinalização de BDNF e de queima de VTA (Krishnan et al., 2007). Uma possibilidade alternativa é que a expressão de SRF é suprimida em NAc em resposta à inervação glutamatérgica alterada desta região do cérebro, que mostramos ser diferencialmente regulada em camundongos suscetíveis versus resilientes (Vialou et al., 2010). Mais trabalho é necessário para estudar diretamente este e outros possíveis mecanismos.
Estudos recentes usando métodos genômicos e outros sugerem que target5-10% de genes alvo de SRF em neurônios são genes precoces imediatos (Philippar et al., 2004; Ramanan et al., 2005; Etkin et al., 2006; Knöll e Nordheim, 2009). Isto é consistente com os nossos dados demonstrando um papel crítico para a SRF na indução de ΔFosB, um produto truncado do gene precoce imediato do fosb, por estresse crônico. Curiosamente, numerosos genes alvos de SRF identificados nestes vários estudos também representam alvos conhecidos de ΔFosB em NAc (Kumar e outros, 2005; Renthal e outros, 2008, 2009; Maze e outros, 2010). Entre esses genes comumente regulados estão vários que são conhecidos por regular o citoesqueleto neuronal (por exemplo, Cdk5, Arc e Actb). Isso, por sua vez, é consistente com relatos de que a SRF influencia a dinâmica de actina e a motilidade neuronal em vários tipos de células neuronais (Alberti et al., 2005; Ramanan et al., 2005; Knöll et al., 2006), enquanto ΔFosB é conhecido por afetam o crescimento da espinha dendrítica dos neurônios NAc (Maze et al., 2010). Esses parâmetros funcionais comuns podem refletir os efeitos combinados da SRF, combinados com a sua indução de ΔFosB, atuando em uma série de genes alvo comuns para influenciar a morfologia neuronal e, em última análise, o comportamento complexo.
A SRF também demonstrou desempenhar papéis críticos na regulação da plasticidade sináptica e da expressão e comportamento gênicos dependentes da atividade neuronal. Por exemplo, a perda de indução dependente de SRF de genes precoces imediatos em resposta à exploração voluntária de um novo ambiente ou ativação neuronal por convulsões eletroconvulsivas tem sido associada com potenciação sináptica de longo prazo prejudicada no hipocampo de mutantes Srf (Ramanan et al. , 2005; Etkin et al., 2006). Além disso, a depleção de SRF no hipocampo tem mostrado causar déficits na depressão sináptica de longo prazo, expressão gênica imediata imediata induzida por um novo contexto e deterioração da habituação durante a exploração de um novo ambiente (Etkin et al., 2006). Esses dados estabelecem a importância do SRF na capacidade de um animal se adaptar adequadamente às perturbações ambientais, como no caso citado de aprender a se habituar a um novo ambiente, ou, no caso de se adaptar a estímulos estressantes negativos, evitar a propagação do estresse. - déficits comportamentais induzidos, como em nosso presente estudo. Assim, observamos que os animais que exibem déficits na expressão do SRF, seja em resposta ao estresse de derrota social em indivíduos suscetíveis ou através do knockdown direto do SRF, apresentam aumento de comportamentos semelhantes aos da depressão e da ansiedade. Dado que sujeitos humanos deprimidos também apresentam níveis diminuídos de SRF no NAc, é concebível que SRF desempenhe um papel fundamental na regulação da capacidade de um indivíduo de se adaptar positivamente a estímulos ambientais negativos, em parte por meio da regulação da expressão de ΔFosB no NAc.
MECANISMOS DIFERENTES: VICIADO VS RESISTÊNCIA AO STRESS
Uma descoberta surpreendente do presente estudo é que, embora a SRF seja necessária para o acúmulo de ΔFosB no NAc em resposta ao estresse crônico, ela não é necessária para a indução de ΔFosB na mesma região do cérebro em resposta à cocaína crônica. Da mesma forma, a SRF não é necessária para respostas comportamentais normais ao medicamento. Estes dados mostram que, apesar do fato de ΔFosB ser induzido em NAc em resposta a muitos tipos de estímulos (Nestler et al., 1999; Nestler, 2008), parece haver distintas vias moleculares levando à indução de ΔFosB. Uma explicação possível para esses achados são os tipos de células parcialmente diferentes que apresentam acúmulo de ΔFosB em resposta ao estresse versus cocaína. O estresse crônico induz ΔFosB aproximadamente igualmente dentro das duas subpopulações principais de neurônios espinhosos médios de NAc, expressando predominantemente receptores D1 versus D2 dopamina, enquanto cocaína crônica induz ΔFosB predominantemente dentro de neurônios D1 + (Kelz et al., 1999; Perrotti et al., 2004) . Assim, é possível que as vias dependentes de SRF possam ser importantes para a indução de ΔFosB em neurônios D2 +. No entanto, isso não explicaria a perda completa da indução de ΔFosB em camundongos SRF knockout após estresse crônico, uma vez que a indução ocorre em ambos os subtipos neuronais. Uma explicação alternativa é que o estresse crônico e a cocaína crónica afetam cascatas de sinalização intracelular distintas, em virtude de seus modos distintos de ação nos neurônios, com o estresse crônico trabalhando talvez através da transmissão glutamatérgica alterada, como observado anteriormente, e da cocaína crônica trabalhando principalmente através da D1. sinalização do receptor (Nestler, 2008). Ainda outra possibilidade é que a indução de ΔFosB pelo estresse crônico versus cocaína crônica é dependente de mecanismos transcricionais distintos que são controlados diferencialmente por inputs neurais distintos que inervam o NAc de várias regiões de projeção glutamatérgica, por exemplo, várias regiões do córtex pré-frontal, hipocampo e amígdala. Muito mais trabalho é necessário para explorar essas possibilidades e alternativas.
Juntos, nossos achados identificam um novo mecanismo transcricional através do qual ΔFosB é induzido em NAc para mediar respostas de proresiliência a estímulos estressantes. Este estudo também fornece uma nova visão importante sobre o papel desempenhado pela SRF no nível do NAc na regulação de comportamentos depressivos e ansiosos. Obter uma melhor compreensão do papel transcricional do SRF na regulação de tais comportamentos ajudará na identificação de novos alvos de genes envolvidos na resiliência a distúrbios relacionados ao estresse e pode facilitar o desenvolvimento futuro de terapias antidepressivas mais eficazes.
Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional de Saúde Mental e Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas e por uma aliança de pesquisa com a AstraZeneca. Agradecemos a David D. Ginty por fornecer os ratos Srffl / fl.
A correspondência deve ser dirigida a Eric J. Nestler, Departamento de Neurociência Fishberg, Escola de Medicina Mount Sinai, One Gustave L. Levy Place, Caixa 1065, Nova York, NY 10029-6574. [email protegido]
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