Proc Natl Acad Sci EUA A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455 – 6460.
Publicado online Apr 15, 2014. doi: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neuroscience
Este artigo foi citado por outros artigos no PMC.
Significado
Neurónios de dopamina (DA) na área tegmentar ventral (VTA) reagem a estímulos aversivos principalmente por silenciamento transitório. Ainda não está claro se essa reação induz diretamente respostas aversivas no comportamento de camundongos. Examinamos essa questão controlando optogeneticamente os neurônios DA na VTA e descobrimos que a inativação dos neurônios DA resultou em resposta e aprendizado aversivos. O nucleus accumbens (NAc), os principais núcleos de saída dos neurônios VTA DA, foi considerado responsável por essa resposta, então examinamos quais das vias fundamentais no NAc foram críticas para esse comportamento usando o knockdown do receptor D1 ou D2, e descobriu que a via específica do receptor D2 era crucial para esse comportamento.
Sumário
A transmissão de dopamina (DA) da área tegmental ventral (VTA) é fundamental para controlar comportamentos recompensadores e aversivos. O silenciamento transitório dos neurônios DA é uma das respostas aos estímulos aversivos, mas suas conseqüências e mecanismos neurais em relação às respostas aversivas e ao aprendizado permaneceram em grande parte indescritíveis. Aqui, relatamos que a inativação optogenética de neurônios VTA DA rapidamente regula negativamente os níveis de DA e induz a suprarregulação da atividade neural no nucleus accumbens (NAc) avaliada pela expressão de Fos. Tsua supressão optogenética do disparo do neurônio DA evocava imediatamente respostas aversivas à sala escura anteriormente preferida e levava a uma aprendizagem aversiva em direção ao local optogeneticamente condicionado. É importante ressaltar que essa aversão ao lugar foi abolida pelo knockdown dos receptores dopaminérgicos D2, mas não pelos receptores D1 no NAc.. O silenciamento dos neurónios DA na VTA foi, portanto, indispensável para induzir respostas aversivas e aprendizagem através dos receptores D2 da dopamina no NAc.
O sistema dopaminérgico mesolímbico não apenas desempenha um papel fundamental em uma ampla gama de motivação e aprendizagem (1-3), mas sua disfunção também foi implicada em distúrbios neuropsiquiátricos graves, como exemplificado na doença de Parkinson, esquizofrenia e dependência de drogas. Neurônios dopaminérgicos (DA) na área tegmental ventral (ATV) reagem aos estímulos recompensadores por disparo fásico, e a principal função desse disparo é a teoria de codificar “o erro de previsão de recompensa”, a diferença no valor entre a recompensa prevista e a recompensa real (4). Em contraste com a resposta aos estímulos recompensadores, suas reações aos estímulos aversivos estão longe de serem homólogas; isto é, alguns neurônios DA são ativados em resposta a estímulos aversivos, enquanto a maioria dos outros reage transientemente suprimindo seus disparos (5-9). De fato, estudos recentes revelaram que a ativação optogenética de neurônios GABAérgicos e a inativação resultante de neurônios DA suprimem o consumo de recompensa e induzem uma resposta aversiva (10, 11). No entanto, tem permanecido em grande parte evasivo sobre quais mecanismos nos circuitos neurais são essenciais para a aquisição de aprendizagem aversiva após a inativação dos neurônios DA na VTA e como as respostas comportamentais são controladas para suprimir o consumo de recompensa e induzir comportamentos aversivos.
Evidências acumuladas revelaram que a aprendizagem motivacional e cognitiva em resposta a estímulos positivos e negativos é amplamente regulada pelos circuitos neurais, incluindo os gânglios basais (12), que recebem uma grande quantidade da projeção dopaminérgica do mesencéfalo. No estriado, dois circuitos neurais fundamentais são constituídos por neurônios espinhosos (MSNs) de tamanho médio especificados, cada um expressando um tipo distinto de receptor DA (13).
- Um circuito é o caminho direto, consistindo dos MSNs projetando diretamente para os núcleos de saída dos gânglios da base, substantia nigra pars reticulata (SNr), e expressando predominantemente os receptores D1 da dopamina (D1Rs).
- O outro é o caminho indireto, constituído pelos MSNs que se projetam indiretamente através do globo pálido até o SNr e expressam principalmente os receptores D2 de dopamina (D2Rs).
Sinais DA do mesencéfalo modulam dinamicamente esses dois caminhos paralelos de maneira oposta via D1Rs e D2Rs, e essa modulação supostamente facilita a aprendizagem motivacional (3, 14).
- Quanto aos estímulos recompensadores, os níveis de DA supra-regulados induzidos por sinais de recompensa são considerados para ativar os D1Rs e assim facilitar predominantemente a via direta no nucleus accumbens (NAc).
- Por outro lado, a supressão dos disparos dos neurónios DA em resposta a estímulos aversivos diminui os níveis DA no NAc; e esta reação deve promover especificamente a transmissão do sinal na via indireta através de D2Rs ativados.
Embora estudos utilizando as estratégias farmacológicas e o método de bloqueio de neurotransmissão reversível (RNB) tenham apoiado este mecanismo de regulação no NAc (15, 16), permanece desconhecido se a supressão do disparo do neurônio DA é suficiente para promover a atividade da via indireta e subsequentemente induzir o comportamento de evitação. No presente estudo, abordamos essa questão pela inativação seletiva dos neurônios DA na VTA manipulando optogeneticamente a proteína Arch hiperpolarizante da membrana (17) e demonstraram explicitamente que a supressão de neurónios DA no VTA diminuiu subsequentemente os níveis de DA no NAc e induziu a reacção e aprendizagem aversiva. Além disso, nós investigamos os mecanismos da regulação desta reação e divulgamos que esta reação aversiva foi especificamente controlada por D2Rs no NAc.
Consistentes
Inativação Optogenética dos Blocos de Neurônios DA Preferência de Sala Escura.
Para inativar seletivamente os disparos de neurônios DA, injetamos uma construção viral adenoassociada induzível por Cre que codifica Arch-eGFP [aro de leitura invertida invertida (DIO) -Arch]17) unilateralmente na VTA de camundongos adultos de tirosina hidroxilase (TH) -Cre (18) e companheiros de ninhada do tipo selvagem (WT) e colocaram uma fibra óptica acima da VTA (Fig. S1 A e C). Duas semanas após a cirurgia, o Arch-eGFP foi detectado de forma restrita na VTA (Fig. S1B). Nós testamos o efeito hiperpolarizante da proteína Arch por registro eletrofisiológico e medimos o efeito da estimulação óptica da ATV de camundongos TH-Cre injetados com AAV-DIO-Arch. Registros eletrofisiológicos in vivo da VTA de camundongos TH-Cre anestesiados revelaram que a estimulação óptica de neurônios DA putativos inibia suas queimas (Fig. S2), indicando que a estimulação óptica suficientemente hiperpolarizou o potencial de membrana das células DA de expressão em Arco e, assim, inibiu a sua combustão espontânea.
Ao usar esses camundongos, em seguida, examinamos se a inativação óptica dos neurônios DA na VTA poderia servir como um sinal aversivo para a aprendizagem comportamental. Os ratos possuem uma tendência inata para preferir um ambiente escuro (19). Nós projetamos um aparato comportamental em que os ratos pudessem explorar livremente a sala escura e abrir espaço brilhante (FIG. 1A). Após a habituação, os camundongos WT permaneceram preferencialmente na sala escura, com ou sem estimulação óptica na sala escura (Fig. S1D), assegurando que a estimulação óptica em si não teve influência sobre o seu comportamento preferencial em sala escura. Nós programamos o experimento comportamental de animais para testar o efeito da inativação ótica de neurônios DA em seu comportamento (Fig. S1E). Após a habituação e o pré-teste, os camundongos foram condicionados estimulando oticamente os neurônios DA na VTA quando eles permaneciam na sala escura. Mesmo durante o primeiro 5 min de condicionamento, os camundongos TH-Cre ficaram fora da sala escura previamente preferida e evitaram sucessivamente a sala escura durante todo o condicionamento (FIG. 1B). Os camundongos TH-Cre não reverteram sua evitação contra o quarto escuro, apesar de não receberem estimulação óptica no pós-teste (FIG. 1C). Esses dados indicam que a hiperpolarização de neurônios DA não apenas induziu comportamento aversivo transitório, mas também serviu como um sinal para aprendizagem aversiva contra a sala escura e também demonstrou que a inativação de neurônios DA desempenhou um papel causal tanto no comportamento aversivo transitório quanto na aprendizagem aversiva prolongada.
Down-Regulation Optogenetic dos níveis de DA no NAc.
Em seguida, investigamos se a inativação de neurônios DA na VTA realmente modificava a concentração de DA em sua principal região alvo, o NAc. Medimos os níveis de DA no NAc por voltametria cíclica de varredura rápida (FSCV) em camundongos TH-Cre anestesiados que haviam sido injetados com AAV-DIO-Arch em seus VTA. Os níveis de AD no NAc foram prontamente elevados pela estimulação elétrica do VTA, e a liberação de DA evocada foi significativamente reduzida pela estimulação óptica simultânea do VTA (Fig. S3). Em seguida, testamos se a estimulação óptica de VTA poderia reduzir o nível de DA tônico no NAc. Nos mesmos cenários experimentais, observamos que o nível DA no NAc foi diminuído transitoriamente por 20 s de estimulação óptica da VTA (FIG. 2), que é consistente com a reação relatada pela FSCV contra os estímulos aversivos (20). Estes dados demonstram que a estimulação óptica do VTA foi suficientemente eficaz para inactivar os neurónios VTA DA e diminuir o nível de DA no NAc durante a experiência comportamental.
Up-Regulation da Expressão Fos Gene por Inativação Óptica de Neurônios DA na VTA.
A alteração comportamental causada pela inativação condicionada dos neurônios DA na ATV sugeriu que a estimulação óptica alterou diretamente a atividade neural e resultou na mudança do desempenho comportamental. Assim, em seguida, investigamos as regiões em que a atividade neural era elevada pela inativação condicionada dos neurônios DA, examinando a expressão de Fos, um gene precoce imediato. Logo após o condicionamento ter sido realizado no teste do quarto escuro, os camundongos foram rapidamente processados para determinar a quantidade de expressão de Fos por análise quantitativa de hibridização in situ (FIG. 3 e Fig. S4). O NAc, a região que recebe uma grande quantidade de projeções dopaminérgicas da VTA, mostrou uma quantidade significativamente aumentada de expressão de Fos nos camundongos TH-Cre (FIG. 3). Essa regulação positiva também foi detectada no lado contralateral da estimulação óptica, supostamente causada por uma pequena quantidade de infecção viral nesse lado. No entanto, a regulação para cima foi muito maior no lado ipsilateral do que no lado contralateral da estimulação óptica, sugerindo que a inativação óptica dos neurônios DA diretamente regulava positivamente a atividade neural do NAc. A expressão aumentada de Fos também foi observada em outras regiões do cérebro, incluindo o septo, regiões periventriculares do estriado, amígdala basolateral (BLA) e hipotálamo lateral, mas não na habenula lateral ou no córtex pré-frontal medial (mPFC; Fig. S4). Esses resultados indicam que as regiões ativadas pela inativação ótica dos neurônios DA não estavam restritas às regiões-alvo diretas dos neurônios VTA DA, mas incluíam as regiões que poderiam ser indiretamente ativadas de maneira dependente do circuito neural. Essa observação sugere que a inativação óptica dos neurônios DA modificou a atividade neuronal em todo o circuito e pode não apenas evocar uma reação aversiva, mas também desencadear várias outras funções cerebrais, como ansiedade, medo e respostas ao estresse (21).
A sinalização de DA através do D2R é crítica para a aversão ao local condicionada induzida optogeneticamente.
A maioria dos sinais dopaminérgicos da VTA é transmitida para os MSNs no NAc através dos receptores DA, D1R e D2R. O D1R é expresso quase exclusivamente nos MSNs que expressam a substância P (codificada pelo gene Tac1), e o D2R é expresso predominantemente nos MSNs que expressam encefalina (codificada pelo gene Penk); cada tipo de MSNs constitui as vias direta e indireta, respectivamente, no NAc (3). Como a afinidade para DA é muito maior para o D2R (ordem nM) do que para o D1R (ordem µM) (22, 23), acredita-se que uma redução nos níveis de DA resulte na inativação de GiD2R acoplado mas sem efeito apreciável no D1R (3, 24), regulando positivamente a atividade neural especificamente na via indireta. Além disso, a ativação de Fos foi mais proeminentemente observada nas células que expressam Penk ou Drd2 (D2R) do que nas células que expressam Tac1 ou Drd1a (D1R) (Fig. S5). Com base nessas observações, hipotetizamos que a sinalização DA através do D2R poderia desempenhar um papel importante no condicionamento aversivo observado.
Para testar essa hipótese, foi realizado o teste de aversão ao local condicionado de três câmaras (CPA) (Fig. S6). Preparamos um aparato comportamental contendo duas câmaras com circunstâncias praticamente idênticas e um pequeno corredor. Essa condição ambiental não-viesada no teste CPA nos permitiu examinar se a inativação de neurônios VTA DA é capaz de induzir reação aversiva e aprendizagem, além de bloquear a preferência do quarto escuro. Quando os animais foram autorizados a circular livremente em todo o aparelho, a maioria permaneceu em duas câmaras sem qualquer diferença comportamental típica no pré-teste. O condicionamento ótico foi então realizado por pareamento da estimulação óptica com uma câmara fixa. Mesmo quando qualquer uma das câmaras foi usada para o condicionamento, os camundongos TH-Cre persistentemente e significativamente evitaram permanecer na câmara opticamente condicionada durante o condicionamento e no pós-teste (Fig. S6 B-E). A análise estatística validou uma redução significativa no tempo de permanência dos camundongos TH-Cre na câmara opticamente condicionada no pós-teste em comparação com o tempo de permanência para os camundongos WT (Fig. S6F).
Em seguida, tentamos especificar subtipos de receptores DA envolvidos nesse comportamento aversivo, suprimindo especificamente cada um dos receptores DA no NAc (FIG. 4 e Fig. S7). Projetamos e validamos vetores lentivirais contendo RNA de gancho de cabelo curto (shRNA) específico para cada receptor DA com expressão constitutiva de mCherry. Três semanas após a injeção do lentivírus no NAc, a expressão robusta do mCherry foi localizada no NAc (FIG. 4B). O knockdown efetivo da expressão de mRNA de cada receptor foi confirmado por análise quantitativa PCR em tempo real (Fig. S7A). A medição dos níveis de proteína através de Western blotting também revelou que a injeção de cada um dos lentivírus reduziu seletivamente seu produto proteico alvo sem afetar a expressão do outro subtipo do receptor DA (FIG. 4C e Fig. S7 B-G). Os lentivírus expressando shD1R e shD2R diminuíram seu nível de proteína alvo para 46.2 ± 1.1% e 38.4 ± 4.9%, respectivamente, em comparação com o nível do vírus controle (FIG. 4C). Estes resultados verificaram que os vetores lentivirais expressando shRNA específico para D1R e D2R suprimiram seletivamente e suficientemente seus RNAs alvo e regularam negativamente a quantidade dos respectivos produtos protéicos. Também confirmamos que a expressão mediada por vírus de mCherry não foi detectada na VTA, excluindo a possibilidade de que o shRNA mediado por lentivírus afetasse diretamente a VTA.
Usando estes lentivírus contendo shRNA, nós testamos qual tipo de receptor DA era responsável pelo comportamento aversivo induzido pela inativação optogenética dos neurônios DA. Nós injetamos lentivírus contendo shRNA ou lentivírus de controle no NAc bilateral juntamente com AAV-DIO-Arch na ATV esquerda dos camundongos TH-Cre. A fibra óptica também foi inserida acima do VTA (FIG. 4A). Quando o teste de CPA de três câmaras foi conduzido três semanas após a cirurgia, os camundongos TH-Cre injetados com lenti: shD1R-mCherry ainda mostraram CPA explícito contra a câmara pareada de estimulação óptica comparável àquela dos camundongos TH-Cre injetados com lentivírus controle (lenti: mCherry). Em contraste, os camundongos TH-Cre injetados com lenti: shD2R-mCherry não mostraram CPA óbvio durante o condicionamento (FIG. 4D). O déficit exclusivo de aprendizado dos camundongos TH-Cre injetados com lenti: shD2R-mCherry foi posteriormente substanciado pela análise da aprendizagem aversiva no pós-teste (FIG. 4E). Estes resultados demonstram que o comportamento aversivo ao local condicionado pela inativação do neurônio DA foi especificamente evocado através do D2R, e não através do D1R, no NAc.
Discussão
No estriado, estudos revelaram que a ativação do GsD1R acoplado facilita seu disparo, enquanto a ativação do GiD2R acoplado à alimentação em eficiência de disparo suprimida (25). Acde acordo com a especificidade da expressão do receptor DA, os disparos fásicos dos neurônios DA ativam principalmente a via direta através do D1R, enquanto uma diminuição transitória nos disparos dos neurônios DA promove predominantemente a competência da via indireta através do D2R (3, 26). Baseado neste mecanismo de regulação, foi proposto que o silenciamento de neurônios DA em resposta a estímulos aversivos é processado principalmente através da via indireta e resulta em comportamento aversivo. (3). Estudos recentes mostraram que o bloqueio da transmissão sináptica da via indireta prejudica a aquisição de comportamento aversivo provocado por um choque elétrico (15) e que esta deficiência é causada pela inibição da transmissão do sinal mediada por D2R (16). EuAlém disso, a supra-regulação optogenética dos MSNs expressando D2R na via indireta evoca a evitação comportamental (27). No entanto, como os neurónios DA exibem disparos aumentados e suprimidos em resposta a estímulos aversivos e porque outras informações sensoriais relacionadas ao choque são simultaneamente processadas no cérebro, ainda resta esclarecer se o silenciamento dos neurônios DA poderia provocar diretamente reação e aprendizado aversivos, e se esta reação é regulada através de MSNs expressando D2R na via indireta.
Neste estudo, utilizamos o controle optogenético dos disparos dos neurônios DA nos dois testes comportamentais: o teste de preferência do quarto escuro e o teste CPA de três câmaras. Nossa manipulação optogenética mostrou eficiente supressão dos disparos de neurônios DA na VTA e down-regulation dos níveis de DA no NAc.. Nossa inativação optogenética precisa dos disparos dos neurônios DA somente durante o período em que os animais permaneceram na câmara condicionada evocou explicitamente uma reação aversiva e o aprendizado, demonstrando que o silenciamento DA transitório causou diretamente o comportamento de esquiva passiva. Além disso, esta investigação elucidou que o processamento de sinal mediado por D2R é um determinante chave para a indução desta reação e aprendizagem aversivas.
Embora nossos dados tenham demonstrado que o D1R não teve efeito nos experimentos comportamentais para evocar o CPA, vários estudos documentaram que o disparo fásico de neurônios DA é necessário para respostas de medo e aprendizagem aversiva (28, 29). Essa diferença é devida ao cenário experimental; isto é, nossa abordagem optogênica excluiu a possibilidade de a sinalização através de neurônios DA ativados evocar comportamento aversivo, indicando que a inativação dos neurônios DA foi suficiente para induzir comportamento e aprendizagem aversivos. A função e o processamento do sinal do disparo ativado evocados por estímulos aversivos teriam contribuições diferentes para os comportamentos aversivos daqueles aqui estudados e precisam ser esclarecidos no futuro.
Os neurônios DA também se projetam para várias outras regiões, incluindo o mPFC, a amígdala e o hipocampo. Um estudo recente indicou que ativação otogenética de neurônios habenulares laterais que se projetam para neurônios DA na VTA são capazes de induzir comportamento aversivo, e esses neurônios DA são alvo principal e especificamente do mPFC (30), apesar de seu condicionamento optogenético ter sido diferente do nosso estudo atual, pois a estimulação optogenética foi prolongada por uma sessão de condicionamento completa. Porque o input dopaminérgico ao mPFC foi relatado como sendo ativado não apenas por estímulos aversivos, mas também por estresse crônico (31, 32), é possível que sua ativação contínua de neurônios DA projetando mPFC seria percebida como sinais de um ambiente altamente estressante; e, como resultado do acúmulo de condicionamento estressante, os animais apresentariam comportamento aversivo à câmara condicionada. Em contraste, inibimos o disparo de neurônios DA apenas enquanto os animais permaneciam na câmara condicionada. Os resultados de nossos experimentos comportamentais usando o condicionamento de acordo com o tempo indicaram que uma supressão súbita do sinal de DA seria percebida como uma entrada repentina e aversiva, que resultava em sua resposta rápida e aversiva.
Os neurônios DA também se projetam para a amígdala, a região que contribui em grande parte para a resposta ao medo. De fato, a sinalização DA para a amígdala foi implicada na resposta ao medo e na aquisição da memória do medo. (33, 34). Em nosso estudo, a rotulagem de neurônios DA no VTA identificou um conjunto de neurônios DA projetados para o BLA, mas a extensão dessas projeções foi muito menor do que a projetada para o NAc. Embora não possamos excluir um efeito sutil da sinalização DA projetada pela amígdala em nosso comportamento aversivo observado, o principal efeito de nossa inativação optogenética dos neurônios DA deve estar no NAc, porque nossos experimentos com knockdown específico do D2R no NAc diminuíram drasticamente o comportamento aversivo. Futuras investigações sobre a sinalização DA específica do alvo são necessárias para elucidar os efeitos da modificação do circuito de neurônios DA no estímulo aversivo e no condicionamento do medo.
Materiais e Métodos
Assuntos.
Tirosina hidroxilase :: IRES-Cre (TH-Cre) ratinhos "knock-in" (EM: 00254) (18) foram obtidos do European Mouse Mutant Archive. Todos os animais experimentais foram cruzados com a cepa C57BL / 6J por mais de 10 gerações. Os camundongos foram acasalados com os camundongos C57BL / 6J WT e alojados com um ciclo padrão 12-h light / 12-h escuro e receberam alimentos e água ad libitum. Cre+ e Cre- Utilizaram-se ratinhos das mesmas ninhadas (3-6 mo de idade) para as experiências. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de animais do Instituto de Biociências de Osaka, sob as diretrizes de experimentos com animais.
Testes Comportamentais.
Durante todos os testes comportamentais, os ratos foram conectados com uma fibra ótica e autorizados a se mover em torno de todo o aparelho. O movimento dos ratos foi monitorado para que eles pudessem se mover sem obstáculos, mesmo quando eles estavam conectados com uma fibra óptica em suas cabeças. A posição de um mouse foi detectada por uma câmera de vídeo suspensa sobre o aparato comportamental e analisada por um programa feito sob medida usando o software Labview.
Teste de preferência de sala escura.
O aparelho comportamental feito sob medida usado no teste foi composto por uma sala escura (15 × 9.5 cm) e um espaço aberto brilhante (15 × 11 cm). A sala escura tinha paredes, um piso e um telhado, todos coloridos de preto e tinham uma entrada (4.5 cm de comprimento) para o espaço aberto e brilhante. O espaço aberto e brilhante tinha a forma de uma elipse e tinha um piso de grade de metal e paredes claras sem teto. Antes do teste, todos os ratos estavam habituados a 10 min no aparelho. O teste consistiu em três sessões: na primeira metade do dia 1 (pré-teste: 5 min), os ratos foram autorizados a explorar todo o aparelho. Desde o final da metade do dia 1 até o dia 4 (condicionamento: 35 min no total), os ratos receberam estimulação óptica quando permaneceram no quarto escuro. No dia 5, a preferência do quarto escuro foi testada sem estimulação óptica (pós-teste: 5 min; Fig. S1E).
Teste CPA de três câmaras.
O aparelho de preferência de lugar condicionado / CPA condicionada por três câmaras feito pelo teste foi composto por duas câmaras (10 × 17 cm) e um corredor de conexão. O teste consistiu em três sessões. Dia 1 (pré-teste: 15 min): Os ratos foram autorizados a explorar livremente todo o aparelho. Os ratos que permaneceram 1.5 mais vezes em uma câmara do que na outra foram excluídos do teste. Dias 2 e 3 (condicionamento: 15 min cada): Os ratos receberam estimulação óptica quando permaneceram na câmara de pares claros. A seleção da câmara de pares claros foi contrabalançada. Dia 4 (pós-teste: 15 min): O teste foi realizado sob as mesmas condições que no pré-teste (Fig. S6A).
Na sessão de condicionamento, a estimulação óptica foi interrompida para 30 s quando os ratos permaneceram continuamente sobre os 30 s na sala escura ou na câmara de pares claros para evitar o superaquecimento. A potência do laser foi controlada para ser aproximadamente 5 mW na ponta da fibra óptica em todos os testes comportamentais.
Voltametria Cíclica Fast-Scan In Vivo.
As experiências de FSCV foram conduzidas utilizando o método descrito em estudos anteriores (35-37). Os ratinhos foram anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina como descrito em Materiais e Métodos da SI e colocado em um quadro estereotáxico. Uma fibra ótica usada para estimular neurônios DA que expressam Arch estava localizada próxima ao eletrodo estimulante. O optrode estimulador foi então colocado no VTA (de bregma: anterior-posterior, −3.2 mm; lateral, 0.5 mm; e dorsal – ventral, 3.5 mm) e abaixado em intervalos de 0.25-mm. Um microeletrodo de fibra de carbono (300 µm de comprimento) para registro voltamétrico foi reduzido no NAc (de bregma: anterior-posterior, 1.0 mm; lateral, 1.0 mm; e dorsal-ventral, 3.5 mm). Medições voltamétricas foram feitas a cada 100 ms aplicando uma forma de onda triangular (−0.4 V a + 1.3 V a − 0.4 V versus Ag / AgCl, a 400 V / s) ao microeletrodo de fibra de carbono. Um potenciostato feito sob medida foi usado para isolamento de formas de onda e amplificação de corrente. A liberação de DA foi evocada por estimulação elétrica de neurônios DA usando estimulação de pulso 24 (100 µA, 5 ms de duração, 30 Hz). Uma estimulação óptica dos neurónios DA (532 nm, ∼5 mW potência na ponta da fibra) foi aplicada para 10 s começar 5 s antes do início de uma estimulação eléctrica. Os microeletrodos de fibra de carbono foram calibrados em uma solução com concentrações conhecidas de DA (0.2 µM, 0.5 µM e 1.0 µM). Todos os dados de voltametria foram analisados por programas customizados utilizando o software Labview e Matlab. A redução nos níveis de DA pela estimulação óptica foi resolvida com a análise de componentes principais, usando as formas de onda modelo DA obtidas a partir de estimulações de VTA para separar sinais de dopamina (35, 36).
Análise Estatística.
A análise estatística foi realizada usando o GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software). Os dados foram analisados por medidas repetidas ANOVA (Figs. 1B, 4D,4D e Fig. S6 D e E) ou one-way ANOVA (Figs. 1C, 3D,3D, 4 C e E e Figs. S4 K-M, S6F e S7A), e análises post hoc foram feitas usando o teste de Bonferroni. Todas as marcas / colunas e barras representaram a média e ± SEM, respectivamente.
Outros procedimentos experimentais, incluindo preparação e injeção de vírus, registro eletrofisiológico e análise imuno-histoquímica e de mRNA, são descritos em detalhes em Materiais e Métodos da SI.
Agradecimentos
Agradecemos a E. Boyden pelo constructo Arch, R. Matsui pelo assessoramento técnico em produção e purificação de lentivírus, e Y. Hayashi por assessoria técnica na programação de análise de dados. Este trabalho foi apoiado por auxílios à pesquisa 22220005 (para SN), 23120011 (para SY e SN), 24700339 (para TD) e 25871080 (para SY) do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão e uma bolsa da Takeda Science Foundation (para a SN).
Notas de rodapé
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Este artigo contém informações de suporte on-line em www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
Referências