Uso excessivo de cocaína resulta da diminuição da sinalização fásica de dopamina no corpo estriado (2014)

Nat Neurosci. Manuscrito do autor; disponível em PMC 2016 Jan 15.

Publicado na forma final editada como:

PMCID: PMC4714770

NIHMSID: NIHMS574802

A versão final editada deste artigo do editor está disponível em Nat Neurosci

Veja o comentário “Perda de sinalização fásica de dopamina: um novo marcador de dependência"em Nat Neurosci, volume 17 na página 644.

Veja outros artigos no PMC que citar o artigo publicado.

Sumário

A dependência de drogas é um distúrbio neuropsiquiátrico marcado pelo aumento do uso de drogas. A neurotransmissão de dopamina no estriado ventromedial (VMS) medeia os efeitos agudos de reforço de drogas abusadas, mas, com o uso prolongado, o corpo estriado dorsolateral (DLS) parece ter controle sobre a busca de drogas. Medimos a liberação de dopamina no estriado durante um regime de auto-administração de cocaína que produziu o aumento do consumo de drogas em ratos. Surpreendentemente, descobrimos que a dopamina fásica diminuiu em ambas as regiões à medida que a taxa de ingestão de cocaína aumentou; com o decréscimo na dopamina no VMS significativamente correlacionado com a taxa de escalonamento. Administração do precursor da dopamina L-DOPA em uma dose que reabastece a sinalização da dopamina no escalonamento reverso do VMS, demonstrando assim a relação causal entre a transmissão diminuída da dopamina e o uso excessivo de drogas. Assim, juntos, esses dados fornecem uma visão mecanicista e terapêutica da ingestão excessiva de drogas que surge após o uso prolongado.

INTRODUÇÃO

O abuso de drogas está intimamente ligado à liberação de dopamina no corpo estriado,. No entanto, as alterações relacionadas ao uso de drogas na neurotransmissão da dopamina variam em duração e sub-região-. Aumento lento na concentração extracelular de dopamina no estriado ventromedial (VMS), estimulado por muitas drogas de abuso, incluindo cocaína, supõe-se que refletem as propriedades reforçadoras das drogas, como os animais regulam sua taxa de auto-administração de cocaína, a fim de manter um nível elevado de concentração de dopamina no ambiente. Dentro do VMS, papéis putativos sobrepostos de sinalização de dopamina no núcleo e sub-regiões de casca do nucleus accumbens foram relatados, mas com ênfase na concha para mediação de recompensa de droga primária e o núcleo para agir como um substrato para reforço condicionado. De fato, a liberação fásica de dopamina no núcleo nucleus accumbens, com duração de alguns segundos, é condicionada à apresentação de estímulos ambientais que foram repetidamente emparelhados com a droga.- e é capaz de controlar a busca e a tomada de drogas. A codificação de tais estímulos condicionados pela liberação de dopamina também é encontrada em aspectos sensório-motores do estriado (corpo estriado dorsolateral, DLS)., uma sub-região estriada que tem sido associada ao desenvolvimento da procura habitual e compulsiva de medicamentos-. Assim, considera-se que a progressão do consumo de drogas além do uso recreativo reflete o envolvimento da sinalização da dopamina em diferentes sub-regiões do estriado,, com ênfase na mudança do estriado límbico (VMS) para o corpo estriado sensório-motor (DLS) durante o desenvolvimento do comportamento de busca de drogas estabelecido,. No entanto, não se sabe se a codificação de ações ou estímulos relacionados à droga por mudanças dopaminérgicas como o comportamento moderado da droga aumenta.

Paradigmas de roedores que são considerados modelos para modelar melhor a transição do uso moderado de drogas para o vício empregam acesso prolongado à droga,, como estender o acesso de um (acesso curto, ShA) a seis horas (acesso longo, LgA) por dia por um período de semanas. Esse regime de auto-administração de medicamentos é capaz de produzir busca compulsiva de drogas, entre outros sintomas cardinais que caracterizam dependência de substâncias em humanos. Aqui, nós testamos como LgA para cocaína afeta a dinâmica regional de sinalização de dopamina fásica no corpo estriado anteriormente caracterizado durante o uso estável de drogas ShA para obter uma melhor compreensão dos mecanismos neurobiológicos subjacentes à escalada do uso de drogas.

PREÇO/ RESULTADOS

Ratos Wistar machos com cateteres venosos de demora foram treinados para auto-administrar cocaína durante as sessões diárias de ShA e, após a aquisição, foram trocados para sessões de LgA em câmaras equipadas com dois orifícios para sugar o nariz. Uma perfuração do nariz na porta ativa provocou uma infusão de cocaína (0.5 mg / kg / infusão) e 20-s apresentação de um estímulo tom de luz em um intervalo 20 de intervalo fixo (FI) de reforço. As respostas na segunda porta inativa (inativo) ou na porta ativa durante a apresentação do estímulo (tempo limite 20-s), não tiveram conseqüências programadas. Para fins de relato, as respostas do nariz puxado na porta ativa fora do período de tempo (isto é, aquelas que provocaram uma infusão de cocaína) são referidas como “cutucadas ativas” e aquelas no inativo fora do período de tempo como “inativas”. cutucadas no nariz ”. O número de pontas de nariz ativas excedeu significativamente os golpes de nariz inativos (efeito principal do orifício do nariz): F(1, 23) = 383.226, P <0.001; FIG. 1) durante cada semana (P <0.001). Após a mudança de ShA para LgA, a ingestão de cocaína aumentou significativamente ao longo do tempo (principal efeito da semana: F(3, 69) = 25.504, P <0.001; FIG. 1), conforme relatado de forma consistente por muitos outros.

Figura 1 

Escalação do consumo de drogas ao longo de semanas

Para avaliar a dinâmica de longo prazo da transmissão de dopamina, os registros neuroquímicos longitudinais foram realizados simultaneamente no núcleo nucleus accumbens do VMS e no DLS em microssensores cronicamente implantados utilizando voltametria cíclica de varredura rápida Figura Complementar 1 para verificação histológica da colocação do eletrodo). Na primeira semana de LgA, observamos um aumento transitório na concentração de dopamina extracelular em VMS após respostas ativas (P <0.001; Fig. 2a). Este padrão de ativação diminuiu durante a LgA, onde a liberação de dopamina na terceira semana foi significativamente menor do que na primeira (P <0.001) e segundo (P = 0.030) semanas (efeito principal da semana: F(2,72) = 10.230, P <0.001; Fig. 2b). A liberação de dopamina fásica no DLS surgiu na segunda semana (P = 0.006; Fig. 2c) mas estava ausente na terceira semana de LgA (principal efeito da semana: F(2,51) = 3.474, P = 0.039; interação cutânea ativa por semana: F(2,51) = 4.021, P = 0.024; Fig. 2c, d). Estes dados mostram que os sinais de dopamina fásica em VMS e DLS emergem sequencialmente em diferentes estágios de tomada de drogas similares aos relatados para um regime ShA.. No entanto, esta sinalização diminuiu em ambas as regiões ao longo do curso da LgA, um período em que se sabe que a farmacocinética da cocaína administrada por via intravenosa não muda,.

Figura 2 

Sinalização de dopamina em VMS e DLS ao longo de semanas

Para testar a relação entre a perda de sinalização de dopamina e o aumento do consumo de drogas, aproveitamos as diferenças individuais na suscetibilidade de escalar a auto-administração de drogas durante o regime de LgA, separando os animais em dois grupos, dependendo se eles apresentaram escalada significativa com base em linear regressão do consumo de drogas sobre as sessões de LgA ou não (Fig. 3a, b). A validação desta separação de animais demonstrou que os animais não escalados não apresentaram aumento significativo nos "nose pokes" ativos ao longo de três semanas de LgA (principal efeito da semana: F(2,18) = 0.633, P = 0.542; Fig. 3b, à esquerda), enquanto ratos escalados aumentaram significativamente sua ingestão (principal efeito da semana: F(2,26) = 14.826, P <0.001; Fig. 3b, certo; interação ingestão x semana: F(2,44) = 4.674, P = 0.014) fazendo cutucadas no nariz mais ativas do que animais não escalonados durante a terceira semana da LgA (t(22) = 2.307, P = 0.031; Fig. 3b). Notavelmente, os animais escalados exibiram uma maior motivação para obter cocaína, como demonstrado em uma tarefa de proporção progressiva (P = 0.028; Figura Complementar 2). Em ratos escalonados, houve um declínio significativo na liberação de dopamina no VMS (principal efeito da semana: F(2,51) = 15.507, P <0.001; Fig. 3cdireito e Complementar Fig. 3a). No entanto, a liberação de dopamina VMS foi estável em ratos não escalados (principal efeito da semana: F(2,18) = 0.057, P = 0.945; Fig. 3c, esquerda e Complementar Fig. 4a) conferindo significativamente mais dopamina fásica na terceira semana em comparação com ratos escalonados (principal efeito da ingestão: F(1,69) = 6.444, P = 0. 013; Fig. 3d, esquerda; interação ingestão x semana: F(1,70) = 4.303, P = 0.042). Esta diferença na liberação de dopamina entre ratos escalados e não escalados foi evidente durante as seis horas de auto-administração (t(43) = 2.599, P = 0.013). É importante ressaltar que essa diferença não resultou de um declínio geral na função da dopamina em animais escalados, já que a liberação de dopamina após infusões de cocaína não contingentes induzidas pelo experimentador não diferiram entre animais não escalados e escalados (P = 0. 605; Complementar Fig. 5a).

Figura 3 

Diferenças individuais no comportamento de tomada de drogas e sinalização de dopamina no estriado

Em contraste com a liberação de dopamina fásica mantida no VMS de ratos não escalonados, relatamos anteriormente que houve uma diminuição na liberação de dopamina em animais que haviam passado por três semanas de acesso limitado a cocaína (ShA) de apenas uma hora por sessão diária. Portanto, realizamos análises adicionais sobre os dados obtidos a partir desses ratos ShA para permitir uma caracterização detalhada da relação entre a função da dopamina e a ingestão de drogas em animais que haviam sido submetidos à autoadministração de cocaína ShA ou LgA. Embora não tenha havido uma escalada significativa do consumo médio de drogas entre os animais durante ShA, houve diferenças individuais com um subconjunto de animais (6 of 16) exibindo escalada significativa da ingestão de drogas ao longo de três semanas de auto-administração de cocaína ShA. Curiosamente, a dopamina fásica VMS na terceira semana de auto-administração de cocaína ShA no grupo de animais que mantiveram o consumo estável de drogas (ou seja, não apresentaram escalada significativa) não foi significativamente diferente da dos animais não escalonados na terceira semana de LgA (P = 0.741; Complementar Fig. 5b). Os animais ShA que aumentaram o consumo de drogas, exibiram taxas mais baixas de consumo de drogas (infusões de 32.7 ± 3.9 versus 43.9 ± 3.1 na primeira hora, P = 0.017) e menor liberação de dopamina atenuada (P = 0.049; Complementar Fig. 5b) do que os animais que aumentaram sua ingestão sob condições de LgA. No entanto, houve uma tendência não significativa de diminuição da dopamina VMS em comparação com suas contrapartes não escalonantes (P = 0.094) e nenhuma interação significativa para a liberação de dopamina ao longo do tempo entre ratos escalonados ShA e LgA (interação interação sem ingestão ×: F(1,57) = 0.111 P = 0.740; Complementar Fig. 5b). Dadas essas diferenças individuais, realizamos análise de regressão em todos os ratos ShA e LgA para testar uma relação direta entre os níveis de dopamina e o grau de escalonamento, e encontramos correlação negativa significativa (ratos ShA e LgA reunidos em conjunto; r = −0.628 , P = 0.005) com maior escalada em animais que tiveram a menor liberação de dopamina na semana 3 (Fig. 3e, esquerda). Portanto, a atenuação da sinalização da dopamina no VMS foi preditiva do aumento da auto-administração do fármaco em esquemas de acesso a drogas LgA e ShA. Estes dados destacam que o aspecto pertinente relacionado às mudanças na liberação de dopamina é se os animais aumentam ou não, em vez do regime de auto-administração a que foram expostos. per se. Da mesma forma, descobrimos que em todos os ratos, a escalada é um preditor significativo do aumento da motivação para a cocaína (P = 0.037, Complementar Fig. 6a), mas o regime de LgA / ShA não é, conforme avaliado em um programa de razão progressiva (P = 0.340, Complementar Fig. 6b).

Em contraste com o VMS, a liberação de dopamina dependente de resposta no DLS não diferiu entre animais LgA escalados e não escalados (principal efeito da ingestão: F(1,48) = 0.472, P = 0. 496; Fig. 3ddireito e Figos Suplementares 3b e 4b), e não houve uma relação significativa entre a inclinação da escalada e a liberação de dopamina entre os animais que foram submetidos à autoadministração de cocaína ShA ou LgA (r = −0.112, P = 0.649; Fig. 3e, certo). Assim, enquanto a dopamina na VMS se correlacionou com o aumento do consumo de drogas, uma correlação semelhante não foi observada na DLS, uma região do cérebro que tem sido amplamente associada à auto-administração prolongada de drogas.,,,.

Dada esta correlação provocativa entre neuroquímica e comportamento, levantamos a hipótese de que o declínio na sinalização dopaminérgica fásica era causal na produção de aumento de consumo de drogas, semelhante ao aumento do consumo de drogas produzido por antagonistas do receptor de dopamina.-e, assim, restaurá-lo produziria uma reversão na escalada (Fig. 4a). Portanto, tratamos de animais escalados (P = 0.024; Fig. 4b) com L-DOPA antes da sessão começar a aumentar a liberação de dopamina fásica. L-DOPA dose-dependente (0, 10, 30 e 90 mg / kg, intravenoso) diminuiu a ingestão de cocaína (efeito principal da L-DOPA: F(3,53) = 5.053, P = 0.004; Fig. 4b), com 30 mg / kg devolvendo a dose ao nível pré-escalonado. É importante ressaltar que a dose 30 mg / kg de L-DOPA foi suficiente para restaurar completamente a sinalização fásica de dopamina no VMS (ver Figura Complementar 7 para locais de registro) durante a toma de drogas (F(2,8) = 6.316, P = 0.023; Fig. 4c), um efeito também observado durante as seis horas completas de auto-administração (F(2,8) = 7.610, P = 0.0141). Assim, a quantidade de liberação de dopamina fásica no VMS previu a quantidade de droga ingerida durante uma sessão de autoadministração de cocaína (r = −0.525, P = 0.046; Fig. 4d). Esse efeito comportamental da levodopa não pode ser explicado por mudanças na resposta farmacológica à cocaína, já que as mudanças lentas de concentração na dopamina VMS após a infusão contingente de droga não foram alteradas pelo tratamento com L-DOPA e, de fato, não diferiram entre escalada, escalada e escalada de estados tratados com L-DOPA (F(2,8) = 0.020, P = 0.980; Figura Complementar 8). Além disso, o efeito da L-DOPA no consumo de drogas também foi observado quando a L-DOPA foi infundida localmente no VMS (ver Figura Complementar 9 para locais de infusão) de ratos escalados antes de uma sessão (t(7) = 6.517, P <0.001; Fig. 4e). Em conjunto, este conjunto de estudos demonstra que uma dose única de L-DOPA administrada antes do acesso a drogas é eficaz em restaurar a sinalização da dopamina e normalizar o uso de cocaína no estado pré-escalonado.

Figura 4 

L-DOPA diminui o consumo de drogas por reabastecimento de liberação de dopamina VMS

Em seguida, testamos se o uso de L-DOPA seria eficaz na redução do consumo de drogas em regimes de dosagem de longo prazo, mais relevantes para as aplicações clínicas. Primeiro, realizamos experimentos introduzindo infusão repetida de levodopa em dias consecutivos durante a indução do escalonamento. Os animais foram treinados para auto-administrar cocaína de forma estável e depois mudaram para LgA ou permaneceram em ShA durante o qual foram injectados com L-DOPA (30 mg / kg, intravenoso) ou solução salina antes de cada sessão durante duas semanas (Fig. 5a). L-DOPA afetou significativamente a ingestão de drogas de maneira específica do regime (efeito principal do tratamento: F(1,53) = 9.297, P = 0.004; efeito principal do regime: F(1,53) = 5.968, P = 0.018; Fig. 5a) com diminuição da ingestão de cocaína em animais LgA (P = 0.004), mas não animais ShA (P = 0.170; Fig. 5a), e sem efeito sobre o nariz inativo (LgA, P = 0.202; ShA, P = 0.101; dados não mostrados). Portanto, o tratamento com L-DOPA foi eficaz na prevenção do aumento do consumo de drogas durante a LgA. No entanto, após a interrupção do tratamento, esse efeito não perdurou (P = 0.789; Fig. 5a). Em segundo lugar, repetidamente administramos L-DOPA em dias consecutivos em animais com consumo de drogas escalonado estabelecido. Os animais foram treinados para auto-administrar cocaína de maneira estável e, posteriormente, foram trocados para LgA ou permaneceram em ShA por três semanas. Estes animais foram então tratados com L-DOPA ou solução salina antes das sessões de auto-administração na terceira semana (Fig. 5b). Animais treinados em LgA mostraram um aumento significativo no uso de cocaína durante as primeiras duas semanas em comparação com animais treinados em ShA (principal efeito do regime: F(1,51) = 15.706, P <0.001; dados não mostrados). O tratamento com L-DOPA produziu um efeito específico do regime (efeito principal do tratamento: F(1,51) = 5.303, P = 0.025; efeito principal do regime: F(1,51) = 11.884, P = 0.001; Fig. 5b), diminuindo a ingestão de cocaína em animais LgA (P = 0.048), mas não animais ShA (P = 0.210; Fig. 5b) sem efetuar respostas inativas (LgA, P = 0.641; ShA, P = 0.664). É importante ressaltar que o efeito diferencial da L-DOPA nos golpes no nariz ativo foi mais robusto quando os animais foram agrupados em escalonados e não escalonados, ao invés de ShA e LgA (animais escalados, P = 0.005; animais não escalados, P = 0.421; Fig. 5c), indicando que a L-DOPA reduziu o consumo de cocaína escalonada preferencialmente em vez de afetar o consumo de drogas per se, uma interação que se desenvolveu ao longo de dias (interação ingestão x tratamento (dia 1): F(1,51) = 0.562, P = 0.457; mas interação ingestão x tratamento (dia 5): F(1,51) = 4.091, P = 0.048). É importante ressaltar que essas diferenças entre sub-populações escalonadas e não escalonadas, bem como os efeitos de diminuição da L-DOPA aguda e cronicamente administrada, também são observadas em todas as seis horas de autoadministração (Figura Complementar 10). Juntas, essas descobertas demonstram que a liberação de dopamina em fases diminui em animais que aumentam a ingestão de cocaína e a restauram com a administração repetida do precursor da dopamina, a L-DOPA, previne e reverte essa escalada, fornecendo evidências de que a diminuição da dopamina aumenta a autoadministração de drogas.

Figura 5 

L-DOPA previne e reverte o aumento do consumo de drogas

DISCUSSÃO

No presente estudo, investigamos a liberação de dopamina fásica na VMS e DLS durante o escalonamento da ingestão de drogas, um fenômeno que modela um critério diagnóstico-chave para a dependência de drogas.,. Nossos resultados demonstram que o escalonamento está associado à diminuição da sinalização da dopamina tanto no VMS quanto no DLS, com o decréscimo da dopamina no VMS significativamente correlacionado com a taxa de escalonamento. Este efeito parece ser seletivo para a dopamina fásica, já que mudanças comparáveis ​​não foram observadas na dopamina tônica no presente estudo, em trabalhos anteriores usando o mesmo esquema em ratos. ou paradigmas de autoadministração relacionados em primatas não humanos,. Houve vários relatos de redução da função fásica da dopamina durante a retirada da droga (testada entre as horas 18 e sete dias da última sessão de autoadministração), que está associada à redução da sensibilidade à cocaína-. Enquanto observamos uma redução similar na resposta da dopamina à cocaína entre ratos ShA e LgA (Complementar Fig. 5a), este efeito não parece ser pertinente à escalada, uma vez que a resposta neuroquímica à cocaína não contingente não é diferente entre os ratos que aumentaram e os que não receberam (sem interação ingestão x regime: F(1,34) = 1.964 P = 0.170; Complementar Fig. 5a). Da mesma forma, as mudanças de pico na concentração de dopamina tônica em até 90 segundos após a cocaína contingente, presumivelmente devido às ações farmacológicas da cocaína, não diferiram entre o estado pré-escalonado e escalonado dentro dos mesmos animais (Figura Complementar 8). Assim, o único aspecto da transmissão da dopamina que observamos que previu o aumento do consumo de drogas foi a resposta fásica que ocorreu imediatamente após um estímulo nasal ativo, que é uma resposta condicionada principalmente a estímulos associados ao medicamento.,,. Esta resposta neuroquímica diminuiu em animais que aumentaram sua ingestão de drogas, que é uma reminiscência de um processo de aprendizado normal onde a liberação de dopamina na VMS provocada por um estímulo relacionado à recompensa diminui à medida que o estímulo é temporalmente previsto,. No entanto, a atenuação da liberação de dopamina durante a auto-administração ocorre muito mais tarde no processo de aprendizagem do que seria esperado para a aprendizagem de contingência, muito tempo depois da aquisição do consumo de drogas estabelecido. Além disso, em animais que não aumentam a ingestão de drogas, a atenuação da liberação de dopamina fásica não ocorre mesmo que esses animais exibam um comportamento instrumental discriminativo assintótico.

À primeira vista, nossas observações sobre o declínio da liberação de dopamina à medida que o uso de drogas progride parecem estar em desacordo com várias teorias contemporâneas da dependência. Teorias que enfocam processos de sensibilização de incentivo induzidos por drogas postulam o aumento da reatividade do sistema de dopamina VMS após exposição repetida a drogas de abuso que medeiam uma resposta sensibilizada à exposição a drogas e estímulos., um fenômeno que é especificamente robusto após LgA. Conceituações sobre o papel da aprendizagem aberrante e a formação de hábito na dependência de drogas sugerem que a sinalização emergente de dopamina no DLS assume cada vez mais controle sobre a busca de drogas,,. Além disso, modelos computacionais proeminentes de vício implicam especificamente o aumento da sinalização de dopamina para sinais associados a drogas como uma força motriz para o vício.,. Por outro lado, nossos achados parecem ser mais consistentes com a hipótese de depleção da dependência da dopamina, proposta por Dackis e Gold.e teorias de processos oponentes relacionados que enfatizam a supressão induzida por abuso de drogas nos processos relacionados à recompensa. Supõe-se que tal supressão cause a autorregulação compensatória do uso de drogas para manter um nível preferido de intoxicação por drogas. Especificamente, humanos e animais compensam baixas doses unitárias de cocaína com resposta aumentada,. Este processo é regulado pela transmissão de dopamina no VMS e, conseqüentemente, a redução da transmissão de dopamina (por exemplo, pelo antagonismo do receptor de dopamina) induz um aumento na taxa de consumo de drogas,. Portanto, a redução na sinalização de dopamina que observamos durante a LgA pode estimular a regulação positiva da ingestão de drogas para alcançar o nível preferido de intoxicação. Em apoio a essa hipótese, a redução da dopamina na VMS foi mais pronunciada em animais que exibiram maior escalonamento de drogas.

Assim, raciocinamos que restaurar a transmissão de dopamina atenuaria a escalada. De fato, a administração de L-DOPA foi eficaz tanto na prevenção como na reversão do aumento do consumo de drogas. Notavelmente, os efeitos da L-DOPA no uso de drogas não perduraram após o término do tratamento, sugerindo que isso não impediu a neuroadaptação subjacente. Portanto, nossos dados indicam que o escalonamento é mediado por um processo que se manifesta através de uma diminuição da dopamina fásica durante o uso de drogas. Esses achados fornecem informações mecanísticas para o uso de L-DOPA no tratamento clínico do abuso de psicoestimulantes, uma estratégia que teve alguns resultados promissores, mas em geral mistos, em um pequeno número de ensaios clínicos recentes.. Especificamente, uma vez que a L-DOPA reduziu o uso de drogas sem produzir abstinência, sugerimos que é mais adequada para abordagens de redução de danos e, em particular, permitindo que os adictos reconquistem um grau de controle do uso de drogas enquanto entram em programas de terapia comportamental. No geral, nossos achados revelam um decréscimo na liberação de dopamina fásica que ocorre durante o acesso demorado à droga, que medeia a mudança do uso recreativo para o uso descontrolado de drogas.

De Depósito

Animais

Ratos Wistar adultos machos de Charles River (Hollister, CA, USA) pesando entre 300g e 400g foram alojados individualmente e mantidos num ciclo de luz 12-h / 12-h escuro (luzes ligadas em 0700) com temperatura e humidade controladas com alimentos e água disponível ad libitum. Todo o uso de animais foi aprovado pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidados com Animais da Universidade de Washington, e procedimentos cirúrgicos foram realizados sob condições assépticas. Para os experimentos de voltametria 50 os animais foram submetidos à cirurgia, dos quais o 29 manteve a patência do cateter ao longo dos experimentos, possuía pelo menos um eletrodo funcional e histologicamente verificado, além de passar por critérios comportamentais (vide abaixo). Para a experiência farmacológica, os ratos 28 32 que foram submetidos a implante de cateter, mantiveram a permeabilidade do cateter intravenoso e foram utilizados no estudo. Os animais foram contrabalançados em grupos experimentais com base em sua taxa de auto-administração durante o treinamento pré-experimental de ShA. Os tamanhos das amostras são semelhantes aos relatados em publicações anteriores.

Cirurgia estereotáxica

Os ratos foram anestesiados com isoflurano, colocados em uma estrutura estereotáxica, administrados com o carprofeno antiinflamatório não esteroidal (5 mg / kg, por via subcutânea) e colocados em uma compressa isotérmica para manter a temperatura corporal. O couro cabeludo foi esfregado com álcool e betadine, banhado com uma mistura de lidocaína (0.5 mg / kg) e bupivacaína (0.5 mg / kg), e incisado para expor o crânio. Furos foram perfurados no crânio e a dura-máter foi liberada para atingir o DLS (1.2-mm anterior, 3.1-mm lateral e 4.8-mm ventral para Bregma) e o núcleo nucleus accumbens do VMS (1.3-mm anterior, 1.3-mm lateral e 7.2-mm ventral para Bregma). Um microeletrodo de fibra de carbono feito internamente foi posicionado no VMS e outro no DLS, e um eletrodo de referência Ag / AgCl foi implantado em uma parte separada do prosencéfalo. Em um conjunto diferente de animais, foram implantadas bilateralmente cânulas-guia (calibre 26; Plastics One, Roanoke, VA, EUA), ocluídas por cânulas “simuladas” de igual comprimento, para atingir o VMS. Os eletrodos e a cânula guia foram fixados com cimento cranioplásico ancorado ao crânio por parafusos. Após a cirurgia, os ratos foram administrados com o carprofeno anti-inflamatório não esteroidal de longa duração (5 mg / kg, por via subcutânea) e colocados numa compressa isotérmica para manter a temperatura corporal até ao ambulatório. Todos os animais foram implantados com cateteres intravenosos durante uma cirurgia separada, uma semana depois.

Implantação de cateteres intravenosos

Os ratos foram anestesiados com isoflurano, administrado com o antiinflamatório não esteroidal carprofeno (5 mg / kg, por via subcutânea) e colocado em almofada isotérmica para manter a temperatura corporal. Os cateteres foram feitos de tubo de silastic com diâmetro externo de 0.6 mm e fixados a um “cubo” em uma das extremidades (inserção distal à veia; Plastics One, VA, EUA) para conexão a uma bomba de infusão. Os cateteres foram empurrados por via subcutânea através de uma incisão nas costas entre os ombros para a frente do corpo e ancorados na veia jugular direita com o auxílio de um cordão de borracha de silicone próximo à extremidade proximal do cateter. O posicionamento ideal do cateter foi verificado puxando sangue com pressão negativa. O hub foi então preso por um pedaço de tela de Teflon suturado ao tecido circundante e as incisões foram fechadas, deixando o hub protuberante nas costas do rato. O cateter foi então enxaguado com solução de heparina (80 U / ml em solução salina) e preenchido com solução viscosa de polivinilpirrolidona (PVP) e heparina (1000 U / ml). O hub do cateter foi tampado com um pedaço curto de tubo de polietileno frisado e a solução de PVP permaneceu no cateter para garantir a permeabilidade. Após a cirurgia, os ratos foram autorizados a se recuperar por pelo menos cinco dias.

Auto-administração de cocaína

Sessões de autoadministração foram realizadas entre 0900 e 1700 hr. Os ratos aprenderam a autoadministrar cocaína (Sigma, St. Louis, MO, EUA) em uma câmara operante modular (Med Associates, VT, EUA) equipada com dois dispositivos de resposta nasal (porta com luzes indicadoras integradas) localizados nos painéis adjacentes da mesma parede, uma luz da casa e alto-falantes para fornecer estímulos de tom puro e ruído branco. A câmara operante estava alojada dentro de uma câmara externa atenuada pelo som. Os ratos (3-4 meses de idade) foram treinados para obter cocaína após uma resposta operante no programa de reforço FI20. Nariz-cutucando na porta ativa (lado contrabalançado entre animais) resultou em uma infusão intravenosa imediata de cocaína (0.5 mg / kg durante cerca de dez segundos) emparelhado com uma segunda apresentação 20 de um estímulo audiovisual (iluminação da luz dentro do nariz picar porta e tom, estímulo condicionado, CS). Durante a apresentação do SC, um segundo tempo de expiração do 20 foi imposto durante o qual o nariz cutucando não resultou em mais infusão de drogas ou quaisquer outras conseqüências programadas. A disponibilidade de medicamentos durante a sessão foi representada por ruído branco e iluminação da luz da casa. Para controlar a especificidade da resposta, o monitoramento da segunda porta (inativa) foi monitorado, mas nunca foi reforçado. Após sessões pré-treinamento com um critério de cinco ou mais respostas ativas por sessão em duas sessões sucessivas para inclusão no estudo, os ratos receberam diariamente acesso a cocaína por uma hora por dia (acesso curto; ShA) por uma semana e depois seis horas por dia (acesso longo; LgA) por três semanas (cinco dias por semana). O número de sessões para atingir o critério variou entre os animais de duas a cinco sessões. Resultados comportamentais de um grupo de controle previamente relatado foram usados ​​como referência para comparar dados comportamentais de ratos submetidos à auto-administração de cocaína LgA a ratos treinados sob um regime ShA de igual número de dias.

Após as três semanas ShA ou LgA da autoadministração da cocaína FI20, um subgrupo de ratos foi submetido a testes de proporção progressiva. Essas sessões eram idênticas às sessões do FI20, exceto que os animais eram obrigados a realizar um número crescente de respostas operantes para infusões sucessivas de cocaína durante essa sessão. O requisito operante em cada tentativa (T) foi o número inteiro arredondado de 1.4(T - 1) alavanca pressiona, iniciando em 1 alavanca de imprensa (ou seja, 1, 1, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 20, 28, 40, 56, 79, 111, 155) . Este requisito de trabalho torna-se tão alto que, eventualmente, os animais param de responder e atingem um “ponto de quebra”. O ponto de quebra foi operacionalmente definido como o número total de infusões obtidas antes de um período de trinta minutos durante o qual nenhuma infusão foi obtida.

Administração de L-DOPA / Benserazide

Foi administrada L-DOPA (L-3,4-di-hidroxifenilalanina) em combinação com o inibidor de descarboxilase de DOPA perifericamente atuante Benserazide para diminuir a degradação periférica de L-DOPA (ambos da Sigma, St. Louis, MO, EUA). Ambas as drogas foram dissolvidas em soro fisiológico e infundidas intravenosamente a um volume de 1 ml / kg de peso corporal. A L-DOPA foi administrada 30 minutos antes do início da sessão em 0, 10, 30 ou 90 mg / kg, enquanto que a Benserazide foi administrada consistentemente com 2 mg / kg, independentemente da dose de L-DOPA administrada. Num primeiro conjunto de estudos (dose-resposta), os ratos foram tratados com L-DOPA num único dia (FIG. 4). Nenhuma das doses de L-DOPA utilizadas inibiu o desempenho geral ou causou discinesia. Para evitar efeitos potencialmente confusos da administração repetida de L-DOPA, os ratos foram treinados sem tratamento com L-DOPA após as “sessões de L-DOPA”. Em um segundo conjunto de estudos, os animais foram tratados com estes L-DOPA antes de cada sessão de auto-administração por um período de até duas semanas (FIG. 5). Num terceiro conjunto de estudos, os ratos que apresentaram escalada da auto-administração de cocaína durante a LgA, os efeitos da infusão bilateral de L-DOPA (25-50 µg dissolvidos em 0.5 µl ACSF em cada hemisfério; 0.25 µl / min; Sigma, St. Louis, MO, EUA) e ACSF em VMS sobre o comportamento de consumo de drogas foram examinados. Nos dias de infusão, a cânula do manequim foi substituída por uma cânula de infusão de calibre 33 que projetava 1.0 mm além da cânula guia. As infusões foram dadas dez minutos antes do início da sessão. Após a infusão, as cânulas foram deixadas no local por dois minutos antes da remoção para permitir a difusão do fármaco.

Medições e análises voltamétricas

Para detecção de dopamina por voltametria cíclica de varredura rápida durante sessões experimentais (gravações realizadas durante duas sessões por semana), microssensores de fibra de carbono cronicamente implantados foram conectados a um amplificador voltamétrico montado na cabeça, interfaceado com um sistema de aquisição de dados e análise acionado por PC (National Instruments, TX, EUA) através de um giro elétrico (Med Associates, VT, EUA) que foi montado acima da câmara de teste. As varreduras voltamétricas foram repetidas a cada 100 ms para atingir uma taxa de amostragem de 10 Hz. Durante cada varredura voltamétrica, o potencial no eletrodo de fibra de carbono foi linearmente aumentado de −0.4 V versus Ag / AgCl para + 1.3 V (varredura anódica) e de volta (varredura catódica) a 400 V / s (tempo total de varredura 8.5-ms ) e mantido em −0.4 V entre as varreduras. Quando a dopamina está presente na superfície do eletrodo, ela é oxidada durante a varredura anódica para formar dopamina-o-quinona (pico de reação detectada em aproximadamente + 0.7 V) que é reduzida de volta à dopamina na varredura catódica (pico de reação detectado em aproximadamente −0.3 V). O fluxo resultante de elétrons é medido como corrente e é diretamente proporcional ao número de moléculas que sofrem eletrólise. Os dados voltamétricos foram filtrados em banda passante em 0.025 - 2,000 Hz. A corrente de fundo subtraído e resolvida no tempo obtida de cada varredura forneceu uma característica de assinatura química do analito, permitindo a resolução da dopamina de outras substâncias. A dopamina foi isolada do sinal voltamétrico por análise quimiométrica utilizando um conjunto de treinamento padrão baseado na liberação de dopamina eletricamente estimulada detectada por eletrodos cronicamente implantados. A concentração de dopamina foi estimada com base na sensibilidade pós-implante média dos eletrodos. Antes da análise da concentração média, todos os dados foram suavizados com um ponto 5 na média de execução do teste. A concentração de dopamina foi calculada em média durante sete segundos (duração aproximada do sinal fásico observado) após a resposta operante (pós-resposta) ou apresentação não contingente do CS e foi comparada com a concentração média ao longo dos dois segundos anteriores ao operante resposta (linha de base). O CS foi apresentado de forma não contingente durante todas as sessões de gravação realizadas na segunda e terceira semanas (duas vezes por sessão por 20 segundos cada), mas não durante a primeira semana para evitar interferência no condicionamento associativo entre a entrega da droga e a sugestão durante um período onde esta associação estava presumivelmente ainda em desenvolvimento.

Análise estatística

Os sinais eletroquímicos individuais foram calculados através da sessão de auto-administração, e depois através dos animais e semanas, para aumentar o poder estatístico. Os sinais foram comparados usando ANOVAs multivariadas com resposta, região do cérebro, consumo de cocaína e semana como fatores. Para comparação com dados eletroquímicos, os dados comportamentais também foram colocados em semanas. Para expericias com L-DOPA, os dados comportamentais (mia de dias se administrados em dias consecutivos) de um tratamento com fmaco respectivo (sem tratamento, dose de L-DOPA ou veulo) foram analisados ​​utilizando ANOVA multivariada com tratamento farmacolico, regime de treino, ingest de cocaa, e semana como fatores. No caso de efeitos ou interacções principais significativos, foram realizadas análises post-hoc e P os valores foram ajustados de acordo com o método de correção de Holm-Bonferroni para múltiplos testes. As parcelas foram feitas usando Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). As análises estatísticas foram realizadas no programa SPSS, versão 17.0 (Chicago, IL, EUA) e Prism. Os dados são apropriados para análise estatística paramétrica. A coleta e a análise de dados não foram realizadas de forma cega para as condições dos experimentos.

Verificação histológica de locais de registro

No final da experimentação, os animais foram anestesiados com uma injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (20 mg / kg). Nos animais com implantes de eletrodos, os locais de registro foram marcados com uma lesão eletrolítica (300 V) antes da perfusão transcardial com solução salina seguida por 4% -paraformaldeído. Cérebros foram removidos e pós-fixados em paraformaldeído por vinte e quatro horas e então rapidamente congelados em banho de isopentano, cortados em um criostato (50-µm seções coronais, −20 ° C), e corados com cresil violeta para auxiliar na visualização de estruturas anatômicas e os locais de lesão ou infusão induzidos por eletrodos.

Agradecimentos

Agradecemos a Scott Ng-Evans, Christina Akers Sanford, Chad Zietz, Nicole Murray e Daniel Hadidi pelo suporte técnico, e a Monica Arnold e Jeremy Clark pelo feedback útil. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Pesquisa Alemã (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG), pelo Instituto de Álcool e Drogas (PEMP) e pelo Reitor da Universidade de Washington (PEMP), e Institutos Nacionais. de concessões de saúde T3643-DA1 (LMB), F1-DA32 (PAG), P027858-DA32 (PEMP), R033004-DA01 (PEMP) e R015916-DA21 (PEMP).

Notas de rodapé

Contribuições do autor

IW e PEMP projetaram pesquisa, IW, LMB e PAG realizaram pesquisas, e IW analisou dados; IW e PEMP escreveram o artigo.

 

Informação sobre o autor

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

 

Referências

1. Everitt BJ, Robbins TW. Sistemas neurais de reforço para dependência de drogas: das ações aos hábitos à compulsão. Neurociência da natureza. 2005; 8: 1481 – 1489. [PubMed]
2. Di Chiara G, Bassareo V. Sistema de recompensa e vício: o que a dopamina faz e o que não faz. Opinião atual em farmacologia. 2007; 7: 69–76. [PubMed]
3. Di Chiara G. Núcleo accumbens shell e core dopamina: papel diferencial no comportamento e dependência. Pesquisa do cérebro comportamental. 2002; 137: 75 – 114. [PubMed]
4. Ito R, Dalley JW, Howes SR, Robbins TW, Everitt BJ. Dissociação na liberação condicionada de dopamina no núcleo e no reservatório do nucleus accumbens em resposta a sinais de cocaína e durante o comportamento de busca de cocaína em ratos. J Neurosci. 2000; 20: 7489 – 7495. [PubMed]
5. Ito R, Dalley JW, Robbins TW, Everitt BJ. Liberação de dopamina no estriado dorsal durante o comportamento de procura de cocaína sob o controle de uma sugestão associada à droga. The Journal of Neuroscience: o jornal oficial da Society for Neuroscience. 2002; 22: 6247 – 6253. [PubMed]
6. Di Chiara G, Imperato A. Drogas abusadas por seres humanos aumentam preferencialmente as concentrações sinápticas de dopamina no sistema mesolímbico de ratos que se movimentam livremente. Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América. 1988; 85: 5274 – 5278. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
7. Wise RA, Bozarth MA. Uma teoria estimulante psicomotora do vício. Revisão psicológica 1987; 94: 469 – 492. [PubMed]
8. RA sábio, et al. Flutuações na concentração de dopamina no nucleus accumbens durante a autoadministração intravenosa de cocaína em ratos. Psicofarmacologia. 1995; 120: 10 – 20. [PubMed]
9. Phillips PEM, Stuber GD, Heien ML, RM Wightman, Carelli RM. A liberação de dopamina de subsegundo promove a busca de cocaína. Natureza. 2003; 422: 614 – 618. [PubMed]
10. Stuber GD, Roitman MF, Phillips PEM, RM Carelli, Wightman RM. Sinalização rápida de dopamina no núcleo accumbens durante a administração de cocaína contingente e não contingente. Neuropsicofarmacologia. 2005; 30: 853 – 863. [PubMed]
11. Stuber GD, Wightman RM, Carelli RM. A extinção da autoadministração de cocaína revela sinais dopaminérgicos funcionalmente e temporalmente distintos no núcleo accumbens. Neurônio 2005; 46: 661 – 669. [PubMed]
12. Owesson-White CA, et al. A codificação neural do comportamento de procura de cocaína é coincidente com a liberação de dopamina fásica no núcleo e na concha de accumbens. Eur J Neurosci. 2009; 30: 1117 – 1127. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
13. Willuhn eu, Burgeno LM, Everitt BJ, Phillips PEM. Recrutamento hierárquico de sinalização fásica de dopamina no estriado durante a progressão do uso de cocaína. Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América. 2012; 109: 20703 – 20708. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
14. NM branco. Drogas viciantes como reforçadores: múltiplas ações parciais em sistemas de memória. Vício. 1996; 91: 921 – 949. discussão 951 – 965. [PubMed]
15. Robbins TW, Everitt BJ. Dependência de drogas: maus hábitos se somam. Natureza. 1999; 398: 567 – 570. [PubMed]
16. Berke JD, Hyman SE. Dependência, dopamina e os mecanismos moleculares da memória. Neurônio 2000; 25: 515 – 532. [PubMed]
17. Kalivas PW, Volkow ND. A base neural do vício: uma patologia de motivação e escolha. O jornal americano de psiquiatria. 2005; 162: 1403 – 1413. [PubMed]
18. Porrino LJ, Smith HR, Nader MA, Beveridge TJ. Os efeitos da cocaína: um alvo variável no curso do vício. Progresso em neuro-psicofarmacologia e psiquiatria biológica. 2007; 31: 1593–1600. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
19. Deroche-Gamonet V, Belin D, Piazza PV. Evidências de comportamento semelhante ao vício no rato. Ciência. 2004; 305: 1014 – 1017. [PubMed]
20. Vanderschuren LJ, Everitt BJ. A busca por drogas torna-se compulsiva após a auto-administração prolongada de cocaína. Ciência. 2004; 305: 1017 – 1019. [PubMed]
21. Ahmed SH, Koob GF. Transição do consumo moderado para excessivo de drogas: mudança no set point hedônico. Ciência. 1998; 282: 298 – 300. [PubMed]
22. Jonkman S, Pelloux Y, Everitt BJ. O consumo de drogas é suficiente, mas o condicionamento não é necessário para o surgimento da compulsão por cocaína em busca de auto-administração prolongada. Neuropsicofarmacologia. 2012; 37: 1612 – 1619. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
23. DSM-IV-TR. Manual diagnóstico e estatístico de transtornos mentais. Vol. IV. Associação Americana de Psiquiatria; 2000.
24. Zernig G, et al. Explicando a escalada do uso de drogas na dependência de substâncias: modelos e testes laboratoriais apropriados em animais. Farmacologia. 2007; 80: 65 – 119. [PubMed]
25. Clark JJ, et al. Microssensores crônicos para detecção longitudinal de subsegundos de dopamina em animais que se comportam. Métodos da natureza. 2010; 7: 126 – 129. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
26. Pan HT, Menacherry S, Justiça JB., Jr. Diferenças na farmacocinética da cocaína em ratos ingênuos e experientes em cocaína. Jornal de neuroquímica. 1991; 56: 1299 – 1306. [PubMed]
27. Ahmed SH, Lin D, Koob GF, Parsons LH. O escalonamento da auto-administração de cocaína não depende de níveis alterados de dopamina no núcleo accumbens induzidos por cocaína. Jornal de neuroquímica. 2003; 86: 102 – 113. [PubMed]
28. De Wit H, sábio RA. Bloqueio do reforço de cocaína em ratos com o bloqueador do receptor de dopamina pimozida, mas não com os bloqueadores noradrenérgicos fentolamina ou fenoxibenzamina. Revista canadense de psicologia. 1977; 31: 195 – 203. [PubMed]
29. Ettenberg A, Pettit HO, Bloom FE, Koob GF. Autoadministração intravenosa de heroína e cocaína em ratos: mediação por sistemas neurais separados. Psicofarmacologia. 1982; 78: 204 – 209. [PubMed]
30. Robledo P, Maldonado-Lopez R, Koob GF. Papel dos receptores de dopamina no nucleus accumbens nas propriedades recompensadoras da cocaína. Anais da Academia de Ciências de Nova York. 1992; 654: 509 – 512. [PubMed]
31. Wightman RM, et al. Caracterização em tempo real do transbordamento e captação de dopamina no corpo estriado de ratos. Neurociência. 1988; 25: 513 – 523. [PubMed]
32. Bradberry CW. Dinâmica da dopamina aguda e crônica em um modelo primata não-humano de uso recreativo de cocaína. J Neurosci. 2000; 20: 7109 – 7115. [PubMed]
33. Kirkland Henry P, Davis M. Howell LL. Efeitos da história de autoadministração de cocaína sob condições de acesso limitado e ampliado na neuroquímica de dopamina do estriado in vivo e sobressalto acústico em macacos rhesus. Psicofarmacologia. 2009; 205: 237 – 247. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
34. Mateo Y, Falta CM, Morgan D, Roberts DC, Jones SR. Redução da função terminal da dopamina e insensibilidade à cocaína após autoadministração e privação de cocaína. Neuropsicofarmacologia. 2005; 30: 1455 – 1463. [PubMed]
35. Ferris MJ, et al. A auto-administração de cocaína produz tolerância farmacodinâmica: efeitos diferenciais sobre a potência dos bloqueadores transportadores de dopamina, liberadores e metilfenidato. Neuropsicofarmacologia. 2012; 37: 1708 – 1716. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
36. Calipari ES, et al. A auto-administração de metilfenidato e cocaína produz distintas alterações terminais da dopamina. Biologia do vício. 2012 [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
37. Calipari ES, Ferris MJ, BA Zimmer, Roberts DC, Jones SR. Padrão Temporal de Consumo de Cocaína Determina Tolerância vs Sensibilização dos Efeitos da Cocaína no Transportador de Dopamina. Neuropsicofarmacologia. 2013; 38 [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
38. Schultz W, Dayan P, Montague PR. Um substrato neural de predição e recompensa. Ciência. 1997; 275: 1593 – 1599. [PubMed]
39. Clark JJ, Collins AL, CA Sanford, Phillips PEM. A codificação de dopamina de estímulos de incentivo pavlovianos diminui com o treinamento prolongado. J Neurosci. 2013; 33: 3526 – 3532. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
40. Robinson TE, Berridge KC. A base neural do desejo de drogas: uma teoria de incentivo-sensibilização da dependência. Pesquisa do cérebro. Revisões de pesquisa do cérebro. 1993; 18: 247 – 291. [PubMed]
41. Ferrario CR, et al. Plasticidade neural e comportamental associada à transição do uso de cocaína controlada para escalada. Psiquiatria biológica. 2005; 58: 751 – 759. [PubMed]
42. AD avermelhado. O vício como um processo computacional deu errado. Ciência. 2004; 306: 1944 – 1947. [PubMed]
43. Keramati M, Gutkin B. A hierarquia de decisão desequilibrada em viciados que emergem do circuito em espiral de dopamina seqüestrada por drogas. PloS um. 2013; 8: e61489. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]
44. Dackis CA, Gold MS. Novos conceitos em dependência de cocaína: a hipótese da depleção de dopamina. Neurociências e análises bio-comportamentais. 1985; 9: 469 – 477. [PubMed]
45. Lynch WJ, et al. Um paradigma para investigar a regulação da auto-administração de cocaína em usuários humanos de cocaína: um estudo randomizado. Psicofarmacologia. 2006; 185: 306 – 314. [PubMed]
46. Pickens R, Thompson T. Comportamento reforçado por cocaína em ratos: efeitos da magnitude do reforço e do tamanho da razão fixa. O Jornal de Farmacologia e Terapêutica Experimental. 1968; 161: 122 – 129. [PubMed]
47. Mariani JJ, Levin FR. Tratamento psicoestimulante da dependência de cocaína. As clínicas psiquiátricas da América do Norte. 2012; 35: 425 – 439. [Artigo gratuito do PMC] [PubMed]