O estabilizador de monoamina (-) - OSU6162 neutraliza a produção de dopamina regulada negativamente no núcleo accumbens de ratos Wistar de consumo prolongado (2015)

Kristin Feltmann1, †Ida Fredriksson1, †Malin Wirf1, Björn Schilström2,3 e Pia Steensland1 *

Artigo primeiro publicado online: 14 OCT 2015

DOI: 10.1111 / adb.12304

Sumário

Recentemente, estabelecemos que o estabilizador de monoamina (-) - OSU6162 (OSU6162) diminuiu comportamentos voluntários mediados por álcool, incluindo ingestão de álcool e reintegração induzida por estímulo / priming, em ratos que bebiam por longo prazo, enquanto embotava a produção de dopamina induzida por álcool no núcleo accumbens (NAc) de ratos sem álcool. Portanto, formulamos a hipótese de que o OSU6162 atenua os comportamentos mediados pelo álcool ao embotar os efeitos recompensadores do álcool. Aqui, avaliamos os efeitos do consumo de álcool por longo prazo e do tratamento com OSU6162 (30 mg / kg, sc) na produção de dopamina NAc basal e induzida por álcool (2.5 g / kg, ip) em ratos Wistar após 10 meses de acesso intermitente a 20 % de álcool. Os resultados mostraram que a produção de dopamina NAc basal e induzida pelo álcool foi significativamente menor em ratos que bebiam por muito tempo, em comparação com ratos que não bebiam álcool. Nos ratos que bebiam há muito tempo, OSU6162 aumentou lentamente e manteve a produção de dopamina significativamente elevada em comparação com a linha de base por pelo menos 4 horas. Além disso, o pré-tratamento com OSU6162 não atenuou a produção induzida por álcool em ratos que bebiam por muito tempo, um achado que contrastou com nossos resultados anteriores em ratos virgens de álcool. Finalmente, OSU6162 não induziu preferência de lugar condicionada (CPP) em ratos que bebiam por muito tempo ou sem álcool, indicando que OSU6162 não tem propriedades de reforço. Para verificar se os resultados do CPP não foram devidos ao comprometimento da aquisição da memória, demonstramos que o OSU6162 não afetou o reconhecimento de novos objetos. Em conclusão, esses resultados indicam que OSU6162 atenua comportamentos mediados pelo álcool ao neutralizar os déficits de dopamina de NAc em ratos que bebem por muito tempo e que OSU6162 não é recompensador por si só. Juntamente com o perfil de efeito colateral benéfico do OSU6162, o presente estudo merece avaliação da eficácia clínica do OSU6162 para atenuar o uso de álcool em pacientes dependentes de álcool.

Introdução

O transtorno do uso de álcool (AUD) é um distúrbio crônico e recidivante que contribui significativamente para o ônus global da doença (Rehm et al. 2009). A limitada eficácia clínica dos poucos medicamentos disponíveis (Anton et al. 2006) enfatiza a necessidade crucial de melhores tratamentos.

O sistema de dopamina mesolímbica é um possível alvo de tratamento. Álcool aumenta liberação de dopamina no nucleus accumbens (NAc) de ratos virgens de álcool (Di Chiara e Imperato 1988) e sujeitos saudáveis ​​(Boileau et al. 2003) e, portanto, induz efeitos de reforço (Tupala e Tiihonen 2004). No corpo estriado de indivíduos com AUD, no entanto, tanto a densidade do receptor D2 da dopamina (Hietala et al. 1994; Volkow et al. 1996) e liberação de dopamina induzida por estimulante central são reduzidas (Martinez et al. 2005; Volkow et al. 2007). Estas adaptações têm sido sugeridas para impulsionar o desejo pelo álcool, o consumo compulsivo e aumentar o risco de recaída (Diana 2011). De fato, sugeriu-se que a gravidade do desejo está correlacionada com um rápido turnover de dopamina (Kumakura et al. 2013) e uma reduzida densidade de receptores D2 no corpo estriado de pacientes dependentes de álcool desintoxicado (Heinz et al. 2004). Em roedores de origem, no entanto, os efeitos no sistema dopaminérgico mesolímbico após o tratamento crônico com álcool são inconsistentes (Tupala e Tiihonen 2004). Uma possível explicação para essas discrepâncias pode ser que a maioria dos estudos pré-clínicos até hoje tenha usado a administração forçada de álcool, o que introduz um elemento de estresse e artifício no experimento, lançando dúvidas sobre a aplicabilidade do nosso entendimento sobre o AUD humano.. Recentemente, reintroduzimos o procedimento de escolha de duas garrafas em acesso pré-clínico de acesso intermitente 20% (IA20E) (Sensato 1973; Simms et al. 2008), que mostra uma clara validade de rosto e várias características de um perfil de AUD (Carnicella et al. 2014) incluindo o seguinte: (1) escalada de consumo voluntário; (2) ciclos de consumo excessivo e abstinência; (3) concentrações alcoólicas de álcool no sangue (Simms) et al. 2008); e (4) beber compulsivo (Hopf et al., 2010). Além disso, o modelo IA20E mostrou validade preditiva, pelo menos para o caso dos medicamentos atuais do AUD (Simms et al. 2008) e vareniclina (Steensland et al. 2007; Litten et al. 2013). TO modelo IA20E também induz neuroadaptações relevantes para o entendimento do AUD, iincluindo uma neurotransmissão glutamatérgica desregulada no córtex pré-frontal medial (Fredriksson et al. 2015). Além disso, as semanas 7 de IA20E diminuem a produção de dopamina (Barak et al. 2011), safirmando a hipótese de que o consumo crônico de álcool induz um estado de dopamina hipo-funcional no AUD (Diana 2011; Becker e Mulholland 2014). No entanto, os níveis de expressão do gene do receptor de dopamina foram anteriormente demonstrados como inferiores, comparativamente com os ratos virgens de álcool da mesma idade, após meses 2 e 4, mas não 10, de consumo de álcool voluntário (Jonsson et al. 2014). Assim, o presente estudo de microdiálise investiga os efeitos de dez meses de IA20E nos resultados de dopamina basal e induzida por álcool para compreender melhor a influência do consumo de álcool voluntário a longo prazo no sistema de dopamina.

Apesar da importância do sistema de dopamina no desenvolvimento e manutenção do AUD (Tupala e Tiihonen, 2004), estudos com antagonistas e agonistas tradicionais da dopamina D2 em pacientes com AUD têm desencorajado (Rápido 2010). No entanto, estudos recentes com modafinil (um modulador do transportador de dopamina) e aripiprazol (um agonista parcial do D2) mostram resultados promissores em pacientes dependentes de álcool (Brunetti et al. 2012; Joos et al. 2013). Assim, o tratamento ideal pode não depender de bloqueio ou ativação, mas sim de uma modulação ou 'estabilização' do sistema dopaminérgico.

(-) - OSU6162 (OSU6162) pertence a uma classe de compostos que, quando desenvolvidos, foi denominada 'estabilizadores da dopamina', com base na sua capacidade de inibir ou estimular comportamentos relacionados com a dopamina, dependendo do tom dopaminérgico predominante. (Sonesson et al. 1994; Degrau et al. 2008) OSU6162 é clinicamente seguro e foi avaliado em vários distúrbios neuropsiquiátricos, como doença de Huntington e fadiga mental após acidente vascular cerebral e trauma cerebral (Johansson et al. 2012; Kloberg et al. 2014). In vitro estudos indicam que o OSU6162, como o aripiprazol, atua como um agonista parcial com baixa atividade intrínseca nos receptores D2 (Seeman e Guan 2007; Kara et al. 2010); no entanto, estudos comportamentais falharam em demonstrar qualquer atividade intrínseca do OSU6162 (Sonesson et al. 1994; Natesan et al. 2006), indicando um mecanismo diferente do de um agonista parcial clássico. EuNo entanto, tem-se suposto que o OSU6162 atua predominantemente como um antagonista em receptores D2 pré-sinápticos (Carlsson et al. 2004). No entanto, observações recentes demonstram que o OSU6162 também atua como um agonista parcial nos receptores serotoninérgicos, notadamente receptores 5-hidroxitriptamina 2A, o que pode muito bem contribuir para suas propriedades estabilizantes (Carlsson et al. 2011) e indica que os “estabilizadores de monoamina” podem ser um nome mais apropriado para esta classe de compostos. No entanto, um estudo de imagens cerebrais humanas (Tolboom et al. 2015) mostraram que OSU6162 ocupou receptores D2 / D3 de forma dependente da concentração no estriado, incluindo o estriado ventral (NAc), destacando o potencial do OSU6162 para atingir o sistema dopaminérgico e as regiões do cérebro conectadas ao AUD. De fato, identificamos recentemente o OSU6162 como um medicamento potencial para AUD, mostrando que ele reduziu a ingestão voluntária de álcool, a busca de álcool, a reintegração induzida por estímulo / priming e sintomas semelhantes aos de abstinência em ratos que bebiam por muito tempo (Steensland et al. 2012). Descobrimos ainda que o OSU6162 atenuou a produção de dopamina induzida por um desafio sistêmico do álcool em ratos virgens de álcool (Steensland et al. 2012), destacando a capacidade do OSU6162 de neutralizar um pico agudo de dopamina. Além disso, o OSU6162 por si só aumentou a produção de dopamina NAc durante as condições basais em ratos virgens de álcool (Steensland et al. 2012), o que pode indicar uma potencial responsabilidade por abuso. O presente estudo avalia ainda o mecanismo por trás do potencial do OSU6162 como um medicamento de AUD. Primeiro, os efeitos de OSU6162, sozinho e em combinação com um desafio de álcool, sobre a produção de dopamina NAc foram investigados usando microdiálise em ratos acordados após 10 meses de IA20E. Em segundo lugar, as propriedades de recompensa do OSU6162 foram avaliadas usando preferência de lugar condicionada (CPP). Finalmente, como a aquisição de memória contribui para estabelecer o CPP, os efeitos do OSU6162 no reconhecimento de novos objetos (NOR) foram avaliados.

Material e Métodos

Descrições detalhadas de animais [machos Rcc Wistar Han Rats (Harlan, Países Baixos)], condições de alojamento, o paradigma de consumo IA20E (Wise 1973; Simms et al. 2008) e drogas e produtos químicos estão disponíveis na Information Support (SI). Todos os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações da Lei Sueca de Bem-Estar Animal e foram aprovados pelo Comitê de Ética Sueco em Pesquisa Animal em Estocolmo (Dnr: N475 / 12 e N64 / 12).

Na Vivo microdiálise

A microdiálise foi realizada no NAc de ratos após 10 meses de consumo voluntário de álcool (IA20E; n = 44) e em ratos virgens de álcool de mesma idade (n  = 8) para medir as saídas basais e induzidas por álcool (2.5 g / kg, ip) de dopamina e seus metabólitos ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA). O grupo de ratos que bebiam por muito tempo foi dividido em quatro grupos de tratamento para avaliar os efeitos de OSU6162 (30 mg / kg, sc), sozinho e em combinação com álcool (2.5 g de etanol / kg, ip), na dopamina NAc, Níveis de saída DOPAC e HVA. A dose OSU6162 foi baseada em resultados anteriores, mostrando eficácia na atenuação de comportamentos mediados por álcool (Steensland et al. 2012), e o intervalo de minutos 60 entre as injeções foi escolhido para permitir que a produção de dopamina induzida por OSU6162 atinja um máximo antes da segunda injeção (Steensland et al. 2012). A dose de álcool foi baseada em estudos anteriores que aplicaram microdiálise no NAc de ratos acordados (Lido et al. 2009; Steensland et al. 2012).

A cirurgia foi realizada conforme descrito anteriormente (Schilström et al. 1998; Steensland et al. 2012); entretanto, a anestesia com isoflurano foi usada. Sondas de diálise concêntrica foram construídas como descrito anteriormente (Malmlöf et al. 2015) com uma membrana ativa 2.25-mm (Filtral 10 AN69, Hospal, Meyzieu, França) e implantado no NAc direito em AP + 1.6, ML-1.1 e DV-8.2 mm em relação ao bregma e dura-máter (Atlas of Paxinos e Watson 2007). Duas horas após os ratos terem acordado da anestesia, eles tiveram acesso a um ciclo de IA20E (isto é, 24 horas de ingestão voluntária de álcool, seguido de livre acesso à água).

A diálise foi iniciada aproximadamente 21 horas após o final da última sessão de ingestão de álcool (ou seja, aproximadamente 48 horas após a cirurgia), por perfusão (2.5 µl / min) com solução de perfusão fisiológica (mm: 147 NaCl, 3.0 KCl, 1.3 CaCl2, 1 MgCl, 1.0 NaHPO4; pH = 7.4). Após aproximadamente 2 horas, as amostras de dialisante foram recolhidas a intervalos de 15-minutos em tubos contendo 5-µL ácido perclórico 0.5-m / 1.76-μm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). As amostras de base foram recolhidas durante 45 minutos antes da administração de OSU6162 (30 mg / kg, sc) ou veículo (solução salina). Sessenta minutos depois, os ratos receberam uma injecção de álcool (2.5 g / kg, ip) ou veículo (solução salina) e as amostras foram recolhidas por mais minutos 180. As amostras de diálise foram imediatamente resfriadas a 4 ° C, transferidas a cada hora para o congelador −20 ° C e armazenadas a −80 ° C até analisadas usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) conforme descrito anteriormente, mas com injeção manual de amostras (Steensland et al. 2012).

Durante a HPLC, a fase móvel (55 mm acetato, 10-12% metanol, 0.1 mm ácido octanossulfónico, 0.01 mm Na2EDTA; pH = 4.1) foi bombeado (0.8 ml / min) através de uma coluna C-18 com partículas centrais densas (Kinetex 150 × 4.6 mm, 2.6 µm, Phenomenex, Torrance, CA, EUA). Após a separação na coluna, dopamina, DOPAC e HVA foram eletroquimicamente detectados usando uma célula analítica ESA (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) com um potencial de oxidação de 400 mV e um potencial redutor de −200 mV, e as concentrações foram quantificadas por comparação de áreas de pico com padrões externos (software TotalChrom, PerkinElmer, Waltham, MA, EUA).

A colocação da sonda foi verificada usando microscopia de luz de seções de 50-µm, coradas com vermelho neutro. No total, o 16 dos ratos 44 a beber a longo prazo foi excluído devido ao deslocamento da sonda (n = 5) ou dificuldades técnicas durante a cirurgia (n = 2), diálise (n = 6) e análise de HPLC (n  = 3). Um rato foi excluído da comparação da produção basal (fmol), porque a concentração absoluta de dopamina não pôde ser avaliada. No entanto, as mudanças relativas puderam ser determinadas e, portanto, este rato foi incluído quando os dados foram apresentados como porcentagem das mudanças da linha de base. No grupo ingênuo ao álcool (n = 8), um rato foi excluído devido ao deslocamento da sonda. Dois ratos foram incluídos apenas na comparação do débito basal, visto que ocorreram dificuldades técnicas com o procedimento de microdiálise após a amostragem da linha de base.

Preferência de lugar condicionado

A preferência de lugar condicionada foi levada a cabo usando um desenho polarizado (isto é, os compostos de teste foram emparelhados com o compartimento menos preferido e veículo com o compartimento preferido) como descrito anteriormente (Jerlhag et al. 2009) em quatro caixas CPP idênticas (TSE Systems, Bad Homburg, Alemanha), cada uma constituída por dois compartimentos (45 × 22 × 40 cm) separados por uma porta de guilhotina e distinguíveis por padrões de parede e pavimento, bem como textura do piso. O tempo gasto em cada compartimento foi automaticamente registado por sensores de infravermelhos 32 localizados a 2 cm acima do piso do compartimento (ActiMot, TSE Systems).

O experimento CPP consistiu de três fases: pré-condicionamento (dia 1; 15 minutos), condicionamento (dia 2-5; 60 minutos / sessão) e pós-condicionamento (dia 6; 15 minutos). A preferência lateral inicial (ou seja, o lado onde o rato passou mais de 50% do tempo) foi determinada durante a fase de pré-condicionamento. Para cumprir o design tendencioso, os ratos que gastaram menos do que 51 e mais de 75% do seu tempo no lado preferido foram excluídos. Durante a fase de condicionamento (porta da guilhotina fechada), cada rato recebeu duas injeções com 6 de intervalo de horas por dia e foram aleatoriamente designados para o condicionamento com o composto de teste pela manhã e o veículo à tarde ou vice-versa. Quatro sessões de condicionamento foram escolhidas, pois três a quatro sessões são geralmente usadas para obter CPP robusta para recompensar substâncias em roedores (Cunningham et al. 2006; Tzschentke 2007). Os ratos de controlo foram emparelhados com o veículo em ambos os lados. Durante o teste de pós-condicionamento, os ratos receberam novamente livre acesso a ambos os compartimentos, e o tempo gasto em cada compartimento foi registrado. A expressão de CPP foi avaliada comparando o tempo gasto no compartimento pareado com drogas durante o pós-condicionamento, com o tempo gasto no mesmo compartimento durante o pré-condicionamento. A expressão robusta de CPP tem sido repetidamente demonstrada após o condicionamento com morfina (Karami e Zarrindast 2008); a capacidade do contexto ambiental nas nossas caixas CPP para induzir CPP foi, portanto, confirmada usando morfina (10 mg / kg, sc, n = 10) ou solução salina (n = 10) condicionamento conforme descrito anteriormente, com a exceção de que a fase de condicionamento durou 30 minutos.

O efeito de OSU6162 na expressão de CPP foi avaliado como descrito acima em ambos os ratos virgens de álcool (n = 20) e ratos que receberam IA20E por aproximadamente 3 meses antes do experimento (n  = 20). Durante a fase de condicionamento, OSU6162 (30 mg / kg, sc) ou as injeções de veículo foram administradas 30 minutos antes de os ratos serem confinados a um compartimento. A duração da sessão de condicionamento (60 minutos) e o tempo de pré-tratamento (30 minutos) foi baseado em nossos estudos anteriores, mostrando que a produção de dopamina no NAc atingiu um máximo de 45 minutos após uma injeção sistêmica de OSU6162 (30 mg / kg) e foi posteriormente mantido por mais de 60 minutos em ratos sem álcool (Steensland et al. 2012).

Reconhecimento de objeto novo

Detalhes sobre a câmara NOR e objetos podem ser encontrados em SI. Durante a primeira sessão da NOR, cada rato ficou livre para explorar a câmara sem quaisquer objetos presentes durante os minutos 8 (sessão de habituação). Depois de 12 minutos na gaiola de casa, o rato foi colocado na câmara novamente e permitiu explorar dois objetos idênticos presos às paredes opostas da câmara por 2 minutos (sessão de treinamento). Após um intervalo de interseção de 2 ou 24 horas, respectivamente, o rato foi novamente colocado na câmara e permitiu explorar uma cópia de um objeto familiar da sessão de treinamento junto com um novo objeto durante cinco minutos (sessão de teste). Posições de objetos e combinações foram contrabalançadas entre cada rato. Tanto as sessões de treinamento quanto as de teste foram gravadas em vídeo e os ratos que passaram tempo explorando cada objeto foram marcados manualmente por um pesquisador cego (XNote Stopwatch). Durante a sessão de teste, a razão de discriminação (ou seja, tempo total explorando o novo objeto dividido pelo tempo total explorando os dois objetos) foi calculada e devido à preferência natural dos ratos em explorar novos objetos, a exploração predominante do novo objeto foi considerada como lembrança do objeto familiar. A exploração de um objeto foi definida como sniffing, mordendo ou lambendo o objeto. Sentar, subir ou inclinar-se sobre o objeto sem qualquer sinal de exploração ativa não foi pontuado como exploração.

Primeiro, confirmamos que um intervalo de interseção 2-hora permitiria que os ratos lembrassem do objeto familiar introduzido durante a sessão de treinamento, durante a sessão de teste, comparando a razão de discriminação após um intervalo 2-hora (n = 16) com isso após um intervalo de 24 horas (n = 16), quando ocorre o esquecimento natural (Nilsson e Carlsson 2013). Posteriormente, o intervalo de intersessão 2-hour foi usado para testar os efeitos do OSU6162 na aquisição de memória. OSU6162 (30 mg / kg, sc, n = 8) ou veículo (n  = 8) foi dado 60 minutos antes da sessão de treinamento, e a taxa de discriminação durante a sessão de teste foi comparada entre os dois grupos de tratamento.

Análise estatística

No experimento de microdiálise, os resultados basais de dopamina, DOPAC e HVA (fmol) foram comparados entre o consumo a longo prazo (n = 27) e naïve ao álcool (n = 7) ratos usando o Mann-Whitney U-teste porque suposições para o t-teste [desvios-padrão (DP) iguais) não foram cumpridos.

Analisar o efeito de um desafio sistêmico do álcool na produção de dopamina no consumo de álcool (n = 7) versus ratos virgens de álcool (n  = 5), foi utilizada uma ANOVA de medidas repetidas de duas vias com condição como o fator entre sujeitos e tempo como o fator dentro de sujeitos. Os valores absolutos (fmol) da produção de dopamina foram usados ​​na análise devido aos níveis basais de dopamina significativamente diferentes nas duas condições (consumo de álcool ou naïve de álcool). Após uma condição significativa e efeito de interação, a área sob a curva (AUC) (ponto de tempo 0-45 minutos) em relação ao valor no ponto de tempo 0 (ΔAUC) foi calculada e analisada usando Student's desemparelhados t-teste a comparar o pico induzido pelo álcool entre beber a longo prazo e ratos virgens de álcool. As saídas basais de DOPAC e HVA, por outro lado, eram independentes da condição e foram, portanto, normalizadas para porcentagem dos respectivos valores basais (média de pontos no tempo - 90 para - 60 minutos) e depois analisadas usando medidas repetidas de duas vias ANOVA conforme descrito para dopamina mais cedo.

Nos ratos bebedores de álcool, não houve diferenças significativas nos resultados basais de dopamina, DOPAC e HVA (fmol) (média de pontos no tempo - 90 para - 60 minutos) entre os diferentes grupos de tratamento: veículo - veículo, OSU6162 - veículo, veículo –Alcool e OSU6162 – alcohol (one-way ANOVA; n  = 6–8 por grupo). Assim, os dados sobre a produção de dopamina e metabólitos foram normalizados para a porcentagem da linha de base e analisados ​​separadamente para cada grupo de tratamento usando ANOVA de uma via de medidas repetidas com o tempo como o fator dentro do sujeito seguido pela diferença menos significativa de Fisher post hoc teste para comparar mudanças significativas em relação à linha de base.

Para avaliar os efeitos do OSU6162, em comparação com o pré-tratamento do veículo na produção de dopamina induzida pelo álcool, a variação percentual na produção de dopamina após a injeção de álcool foi calculada usando a amostra imediatamente antes da injeção de álcool como referência (ponto no tempo 0 minutos). Os dados foram analisados ​​com medidas repetidas ANOVA two-way com tratamento como o fator entre-sujeito e tempo como o fator dentro do sujeito.

A análise estatística dos dados do CPP foi realizada usando Student's pareado t-teste dentro de cada grupo de tratamento conforme determinado a priori. A análise dos dados de NOR foi realizada usando Student's desemparelhados t-teste dentro de cada sessão.

O consumo médio de álcool (g / kg por 24 horas) foi apresentado como mediana e intervalo interquartil (IQR). Todos os demais valores foram apresentados como média e erro padrão da média (EPM). O nível de significância foi estabelecido em α = 0.05. A análise estatística foi realizada com os softwares spss versão 22 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) e GraphPad Prism versão 5.0 (La Jolla, CA, EUA).

Consistentes

Dez meses de consumo voluntário de álcool induziram um estado hipo-dopaminérgico no núcleo accumbens

Utilizando microdiálise, basal e induzida por álcool (2.5 g / kg, ip), os resultados de dopamina e seus metabólitos foram comparados entre ratos que tomaram álcool voluntariamente por 10 meses [4.2 (2.4 – 4.7) g / kg por 24 horas; mediana e IQR do seu consumo de álcool ao longo da vida] e ratos virgens de álcool da mesma idade. O débito basal de dopamina (expresso como mediana e IQR em fmol / min) foi significativamente diminuído (U = 41.5; P <0.05) no consumo de longo prazo [1.8 (1.2–2.7); n = 27] em comparação com ratos sem álcool [2.5 (2.3 – 3.3); n  = 7]. Em contraste, não houve diferença significativa entre os grupos no DOPAC basal [álcool: 638 (504-734), naïve ao álcool: 691 (582-734); U = 85.5; não significativo (ns)] ou HVA [álcool: 243 (199–294), naïve ao álcool: 251 (192–263); U = 90.5; ns] saída.

Análise da produção de dopamina após um desafio sistêmico com álcool (Fig. 1a) mostrou um efeito principal geral do tempo (F12, 120 = 51.1; P <0.001), condição [consumo de álcool (n = 7) ou ratos sem álcool (n = 5)] (F1, 10 = 7.3; P <0.05) e uma interação de condição de tempo * (F12, 120 = 2.7; P <0.01). Post hoc A análise mostrou que o pico de dopamina induzida pelo álcool (ΔAUC, tempo 0 – 45 minutos) foi significativamente menor no consumo de álcool em comparação com ratos virgens de álcool. (FIG. 1b, t10 = 2.8; P  <0.05). A análise dos resultados de DOPAC e HVA após o desafio de álcool não revelou diferenças significativas entre ratos que bebiam álcool e ratos virgens de tratamento (Informações de Apoio Fig. S1; ver detalhes estatísticos em SI).

Figura 1.

Figura 1. A produção de dopamina no nucleus accumbens após um desafio sistêmico com álcool foi atenuada em ratos que bebiam há muito tempo. Para avaliar os efeitos de um desafio agudo de álcool (2.5 g / kg, ip) na produção de dopamina no nucleus accumbens após o consumo voluntário de álcool a longo prazo, a microdiálise foi aplicada em ratos Wistar acordados após 10 meses de acesso intermitente a etanol a 20% em um paradigma de escolha de duas garrafas (n = 7) e em ratos virgens de álcool da mesma idade (n = 5). (a) O desafio de álcool afetou a produção de dopamina (média ± SEM, fmol / min) de forma diferente em ratos que bebiam por muito tempo e não consumiam álcool, como mostrado por uma condição geral significativa e uma condição * efeito de interação de tempo (medidas repetidas de duas vias ANOVA com condição como o fator entre sujeitos e tempo como o fator dentro de sujeitos). (b) O pico de dopamina induzido por álcool foi significativamente embotado em ratos que bebiam álcool em comparação com ratos virgens de álcool, conforme revelado pela comparação da área sob a curva (ΔAUC) entre os pontos de tempo 0 e 45 minutos em relação ao ponto de tempo 0 dentro de cada grupo (Teste t de Student, * P <0.05 em comparação com ratos virgens de álcool)

(-) - OSU6162 neutralizou o estado hipo-dopaminérgico no nucleus accumbens induzido pelo consumo voluntário de álcool a longo prazo

O grupo de ratos que bebem a longo prazo (com débito de dopamina basal reduzido em comparação com ratos virgens de álcool, ver resultados anteriores) foi dividido em quatro grupos de tratamento: veículo-veículo (n = 6), veículo-álcool (n = 7), veículo OSU6162 (n = 8) e OSU6162 – álcool (n  = 7) para avaliar os efeitos de OSU6162, sozinho ou em combinação com álcool, na dopamina, DOPAC e saídas de HVA no NAc. Não houve diferença significativa entre os grupos de tratamento em dopamina basal (1.97 ± 0.22 fmol / min; F3, 23 = 0.2), DOPAC (649 ± 46 fmol / min; F3, 23 = 0.3) ou HVA (242 ± 22 fmol / min; F3, 23  = 1.2) saída. Assim, os dados foram normalizados e apresentados como porcentagem da linha de base individual. No grupo veículo-veículo (Fig. S2), não houve efeito principal geral na dopamina (F16, 80 = 0.9; ns) ou HVA (F16, 80 = 1.1; ns) saídas. Houve, no entanto, um efeito geral principal na saída DOPAC (F16, 80 = 3.2; P <0.001), e post hoc A análise revelou uma diminuição significativa em relação à linha de base nos momentos 150 e 180.

No grupo álcool-veículo (Fig. 2a), houve um efeito significativo sobre a dopamina (F16, 96 = 18.0; P <0.001), DOPAC (F16, 96 = 8.6; P <0.001) e HVA (F16, 96 = 9.3; P <0.001) saídas. Post hoc A análise revelou que a produção de dopamina foi significativamente aumentada nos intervalos de tempo 15 e 30 em comparação com o valor basal, enquanto que foi significativamente diminuída em comparação com os valores basais desde os pontos no tempo de 90 a 165. Além disso, a produção de DOPAC foi significativamente aumentada em comparação com o valor basal no momento do 30-minute, enquanto que o débito do HVA foi significativamente elevado dos timepoints de 30 a 135 em comparação com o valor basal.

Figura 2.

 

Figura 2. (-) - OSU6162 (OSU6162) neutraliza o estado hipo-dopaminérgico no nucleus accumbens induzido pelo consumo voluntário de álcool a longo prazo. A microdiálise foi usada para medir a produção de dopamina e os metabólitos da dopamina no núcleo accumbens Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA) após tratamento com veículo-álcool (2.5 g / kg, ip) (a), OSU6162 (30 mg / kg, sc) - veículo (b) e álcool OSU6162 ( c) (n = 7-8 por tratamento) em ratos Wistar acordados, que tiveram menor produção de dopamina basal após meses 10 de beber no acesso intermitente a 20% etanol paradigma escolha de duas garrafas (durante a retirada 24-hora) do que o álcool -nave controles pareados por idade. a) TO desafio do álcool agudo aumentou significativamente e diminuiu a produção de dopamina em comparação com a linha de base entre os minutos 15 e 30 e entre 90 e 165 minutos após a injeção, respectivamente. As saídas de DOPAC e HVA foram significativamente aumentadas em comparação com a linha de base em 30 e 30–135 minutos após o teste de álcool, respectivamente. (b) a administração de OSU6162 aumentou significativamente e manteve as saídas de dopamina (do ponto de tempo −45 minutos), DOPAC e HVA (do ponto de tempo −30 minutos) elevadas em comparação com a linha de base ao longo do experimento (ou seja, pelo menos 4 horas após a injeção de OSU6162). (c) Quando OSU6162 foi administrado 60 minutos antes do desafio de álcool, a dopamina foi significativamente elevada em comparação com a linha de base de -45 a 60 minutos, e os resultados de DOPAC e HVA foram significativamente aumentados em comparação com a linha de base em todos os pontos de tempo medidos. Os valores são apresentados como porcentagem da respectiva linha de base individual (média ± SEM), porque os valores basais (fmol / min) não diferiram entre os grupos de tratamento (ANOVA de uma via). Os dados foram analisados ​​usando ANOVA de uma via de medidas repetidas dentro de cada grupo de tratamento separado com o tempo como o fator dentro do sujeito seguido pelo teste post hoc de diferença mínima significativa de Fisher. As setas indicam a hora das injeções. Os asteriscos indicam pontos de tempo quando a produção de dopamina foi significativamente diferente da linha de base (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001). Para evitar confusão, os asteriscos foram omitidos para DOPAC e HVA. OSU, OSU6162; Alc, álcool; Veh, veículo

No grupo de veículo OSU6162 (Fig. 2b), houve um efeito principal geral significativo na dopamina (F16, 112 = 4.0; P <0.001), DOPAC (F16, 112 = 19.6; P <0.001) e HVA (F16, 112 = 53.6; P <0.001) saídas. Post hoc A análise revelou que a produção de dopamina foi significativamente elevada em comparação com a linha de base imediatamente após a injeção (tempo 45 minutos), atingiu um máximo de 75 minutos após a injeção (tempo 15 minutos) e permaneceu significativamente elevada durante a sessão de diálise (tempo 180 minutos). O DOPAC e o HVA aumentaram significativamente em comparação com os valores basais desde os pontos no tempo de −30 a 180.

No grupo OSU6162 – alcool (Fig. 2c), houve um efeito principal global sobre a dopamina (F16, 96 = 7.3; P <0.001), DOPAC (F16, 96 = 17.5; P <0.001) e HVA (F16, 96 = 29.9; P <0.001) saídas. Post hoc A análise revelou que a produção de dopamina foi significativamente elevada em comparação com a linha de base dos pontos no tempo de −30 a 60. As saídas de DOPAC e HVA foram significativamente elevadas em comparação com o valor basal em todos os momentos após a injeção de OSU6162.

Para avaliar melhor o efeito de OSU6162 na produção de dopamina induzida pelo álcool no NAc, a diferença percentual na produção de dopamina no momento imediatamente anterior à injeção de álcool (minuto 0 minuto) foi comparada entre os grupos de tratamento álcool-veículo e álcool OSU6162. Houve um efeito global significativo do tempo (F3.1, 36.7 = 20.1; P <0.001), mas não de tratamento (F1, 12 = 0.46; ns), e sem interação de tratamento de tempo * (F3.1, 36.7 = 2.6; P = 0.067) na produção de dopamina induzida por álcool (Fig. 3). Assim, não post hoc análise foi realizada.

Figura 3.

Figura 3. O pré-tratamento com (-) - OSU6162 (OSU6162) não teve efeito significativo na produção de dopamina induzida pelo álcool no nucleus accumbens de ratos que bebem a longo prazo. Para avaliar os efeitos do OSU6162 especificamente sobre a produção de dopamina induzida pelo álcool no nucleus accumbens em ratos consumidores de longa duração, a alteração percentual na produção de dopamina em relação à produção no momento imediatamente anterior à injeção de álcool (ponto no tempo 0 minutos ) foi comparada entre os ratos tratados com álcool de veículo (2.5 g / kg, ip) ou OSU6162 (30 mg / kg, sc) - álcool. Não houve diferença significativa nos grupos pré-tratados com OSU6162 em comparação com os pré-tratados com veículo (ANOVA two-way de medidas repetidas com tratamento como o fator entre indivíduos e tempo como o fator intra-sujeito). Os valores são apresentados como média ± SEM (n = 7 por tratamento)

(-) - OSU6162 não induziu preferência de lugar condicionado em ratos a longo prazo ou ratos virgens de álcool

A capacidade de facilitar um CPP nas nossas caixas CPP foi confirmada mostrando que os ratos com morfina (n  = 8) passou significativamente mais tempo no lado pareado com morfina durante a sessão de pós-condicionamento, em comparação com o mesmo lado durante o pré-condicionamento (Fig. 4painel direito), enquanto tal efeito não foi observado nos ratos condicionadosn = 9; FIG. 4a, painel esquerdo).

Figura 4.

Figura 4. (-) - OSU6162 (OSU6162) não induziu preferência por lugar condicionada (CPP) em ratos que bebiam por muito tempo ou que não bebiam álcool. Para avaliar os efeitos de reforço do OSU6162, ratos sem álcool e ratos que beberam álcool (acesso intermitente a 20% de etanol) por 3 meses antes do experimento foram submetidos ao paradigma CPP. (a) Primeiro, as caixas de CPP foram validadas mostrando que o condicionamento de morfina (10 mg / kg, sc) induziu CPP, conforme mostrado por um aumento significativo do tempo gasto no lado pareado com morfina durante o pós-condicionamento em comparação com o pré-condicionamento. Em contraste, não houve expressão de CPP nos ratos tratados com veículo. OSU6162 (30 mg / kg, sc) e o tratamento com veículo não induziram a PPC em ratos (b) virgens de álcool ou (c) consumidores de álcool. Todos os valores são apresentados como média ± SEM (n = 8–9 por tratamento). Os dados foram analisados ​​usando o teste t de Student pareado dentro de cada grupo de tratamento (comparando o tempo gasto no lado pareado com a droga durante o pós-condicionamento com o mesmo lado durante o pré-condicionamento); *** P <0.001 em comparação com o pré-condicionamento correspondente

Para avaliar as possíveis propriedades de reforço de OSU6162, um experimento CPP foi conduzido em ratos que haviam bebido álcool [IA20E; 2.6 (2.1–3.2) g / kg / dia] por 3 meses, bem como em ratos virgens de álcool. Os resultados mostraram que nem ratos virgens de álcool nem bebedores de álcool (Fig. 4b e c, respectivamente), condicionados com OSU6162 ou veículo (n = 8–9 por grupo de tratamento), mostrou diferença significativa na quantidade de tempo gasto no lado OSU6162 ou no lado do veículo, respectivamente, durante o pós-condicionamento em comparação com o mesmo lado durante o pré-condicionamento.

(-) - OSU6162 não afetou a aquisição de memória no novo teste de reconhecimento de objetos

No teste NOR, os ratos tiveram uma taxa de discriminação significativamente maior após um intervalo de intersecção 2-hora, em comparação com um intervalo de intersecção 24-hora (Fig. 5a), confirmando que os ratos, durante a sessão de teste, lembravam do objeto introduzido durante a sessão de treinamento realizada 2 horas antes. Portanto, um intervalo entre as sessões de 2 horas foi usado para testar a capacidade do OSU6162 de afetar a aquisição da memória em ratos que bebiam há muito tempo. Os resultados não mostraram nenhuma diferença significativa no tempo total gasto explorando os dois objetos durante a sessão de treinamento entre os ratos tratados com OSU6162 ou tratados com veículo (Fig. 5b). Tanto os ratos tratados com OSU6162 como os tratados com veículo tiveram uma razão de discriminação acima de 0.5 durante a sessão de teste (sem diferenças significativas entre os tratamentos; 5c), indicando uma aquisição de memória funcional.

 

Figura 5.

Figura 5. (-) - OSU6162 (OSU6162) não prejudicou a memória do objeto 2 horas após a apresentação do objeto. Os ratos foram autorizados a explorar dois objetos idênticos por 2 minutos durante uma sessão de treinamento e, após um intervalo entre as sessões de 2 ou 24 horas, os ratos foram apresentados a um objeto familiar da sessão de treinamento e um novo objeto durante a sessão de teste de 5 minutos . Uma taxa de discriminação (média ± SEM, exploração do novo objeto dividido pela exploração de ambos os objetos) acima de 0.50 durante a fase de teste indica a lembrança do objeto familiar. (a) Os ratos se lembraram do objeto familiar após um intervalo de interseção de 2 horas, mas não após um intervalo de interseção de 24 horas (n = 16 por condição). (b) O tempo total gasto para explorar ambos os objetos durante a sessão de treinamento não foi significativamente diferente entre ratos tratados com OSU6162 (30 mg / kg, sc; n = 8, 60 minutos antes de S1) e ratos tratados com veículo (n = 8). (c) Usando um intervalo de interseção de 2 horas, não houve diferença significativa na razão de discriminação entre ratos tratados com OSU6162 e tratados com veículo durante a sessão de teste. Todos os valores são expressos como média ± SEM. Os dados foram analisados ​​usando o teste t de Student não pareado em cada sessão; *** P <0.001 em comparação com o intervalo de interseção de 24 horas

Discussão

No presente estudo, Nós mostramos pela primeira vez que o estabilizador de monoamina OSU6162 neutraliza os déficits de dopamina no NAc durante a abstinência em ratos Wistar de consumo prolongado. Além disso, mostramos que o OSU6162 não era recompensador por si só, conforme medido pelo CPP e, portanto, provavelmente não possui nenhuma responsabilidade por abuso. Coletivamente, esses achados confirmam nosso estudo anterior que estabelece que OSU6162 (na mesma dose avaliada no presente estudo) atenua vários comportamentos mediados pelo álcool em ratos a longo prazo em beber (Steensland et al. 2012) e, portanto, tem potencial como uma nova medicação AUD.

O presente estudo indica que os meses 10 de ingestão voluntária de álcool (IA20E) induz um estado hipo-dopaminérgico no NAc em comparação com ratos virgens de álcool da mesma idade. Em primeiro lugar, a produção de dopamina basal (valores de fmol) diminuiu significativamente após 24 horas de retirada, apoiando outro estudo de microdiálise mostrando resultados similares em ratos Wistar após 7 semanas de IA20E (Barak et al. 2011). Estes resultados indicam ainda que os efeitos do consumo de álcool no sistema dopaminérgico são duradouros, o que contrasta com um estudo anterior mostrando uma diminuição da expressão gênica do receptor de dopamina após meses 4, mas não 10 meses de consumo de álcool (Jonsson et al. 2014). No entanto, deve-se notar que uma ingestão de álcool bastante baixa e o cronograma de acesso contínuo podem explicar a falta de efeitos duradouros sustentados no último estudo. Em segundo lugar, houve uma resposta de dopamina embotada após um desafio sistêmico de álcool no consumo prolongado em comparação com ratos virgens de álcool, apoiando estudos de imagens cerebrais que mostraram redução da liberação de dopamina induzida por estimulantes centrais em pacientes dependentes de álcool desintoxicados (Martinez et al. 2005; Volkow et al. 2007). Finalmente, a produção de dopamina diminuiu abaixo dos valores de referência após a cessação do pico de dopamina induzida pelo álcool. Coletivamente, os resultados atuais de microdiálise, mostrando um sistema de dopamina hipo-funcional após meses de ingestão voluntária intermitente de altas quantidades de álcool, dão suporte à hipótese de que o consumo crônico de álcool contribui para um sistema de dopamina sub-regulado em pacientes dependentes de álcool que tem sido sugerido para ser associado com disforia, que por sua vez pode desencadear o desejo de álcool levando a recaída em pacientes com AUD (Weiss et al. 1996; Graça 2000; Diana 2011; Becker e Mulholland 2014).

Nós estabelecemos previamente que o estabilizador de monoaminas OSU6162 atenua o consumo voluntário de álcool, a procura de álcool, a reintegração induzida por cue / priming e os sintomas semelhantes aos de abstinência em ratos que bebem a longo prazo (Steensland et al. 2012). Além disso, nosso estudo anterior mostrou que OSU6162 atenuou o pico de dopamina induzida pelo álcool no NAc de ratos virgens de álcool (Steensland et al. 2012). No entanto, o presente estudo de microdiálise conduzido em ratos bebedores a longo prazo mostrou que o OSU6162, em comparação com o pré-tratamento do veículo, não teve efeito significativo no pico da dopamina induzida pelo álcool. Os resultados contrastantes da microdiálise em ratos que bebem álcool e ratos que nunca tomaram álcool nos levaram a rejeitar nossa hipótese anterior de que OSU6162 atenua comportamentos mediados pelo álcool ao embotar as propriedades recompensadoras do álcool (Steensland et al. 2012). EuPor outro lado, os presentes resultados indicam que o OSU6162 tem a capacidade de neutralizar o estado hipo-dopaminérgico induzido pelo beber a longo prazo. Esta hipótese é corroborada pelos presentes achados de que o OSU6162 sozinho induziu um aumento duradouro na produção de dopamina NAc e que o pré-tratamento OSU6162 impediu que a produção de dopamina caísse abaixo dos valores basais após a cessação do pico de dopamina NAc induzido pelo álcool a longo prazo. ratos que bebem a termo. Esta sugestão é ainda apoiada por um estudo anterior mostrando que ratos submetidos à abstinência de álcool se auto-administram apenas álcool suficiente para retornar a produção de dopamina de volta à linha de base (Weiss et al. 1996) e a hipótese de que um estado hipo-dopaminérgico durante o AUD motive o desejo de álcool, o consumo compulsivo de álcool e aumente o risco de recaída (Diana 2011). Assim, é possível que OSU6162, através da sua capacidade de neutralizar um estado hipodopaminérgico induzido pelo álcool, atenua comportamentos voluntários mediados pelo álcool, diminuindo o desejo de beber álcool.

O mecanismo exato por trás da capacidade do OSU6162 de neutralizar o estado hipo-dopaminérgico NAc em ratos que bebem por muito tempo permanece desconhecido. No entanto, sugeriu-se que o OSU6162 aumentasse a actividade da dopamina actuando da seguinte forma: (1) um antagonista nos autorreceptores D2, desinibindo desse modo o feedback negativo da libertação de dopamina (Carlsson et al. 2004), ou (2) um modulador alostérico nos receptores D2 pós-sinápticos, aumentando assim os efeitos da dopamina (Kara et al. 2010). Um aumento nos níveis de dopamina, conforme registado por microdiálise, após o tratamento com OSU6162 no presente estudo, indica um aumento da libertação de dopamina ou uma diminuição da recaptação de dopamina. Os presentes resultados mostraram que o OSU6162 aumentou lentamente e manteve os níveis de dopamina e DOPAC elevados acima do valor basal em uma extensão similar (uma indicação de aumento da liberação de dopamina em vez de uma diminuição da recaptação de dopamina), indicando assim que o antagonismo pré-sináptico é o mecanismo mais provável. Além disso, a elevação da dopamina induzida pelo OSU6162 foi mais duradoura nos ratos que bebiam álcool no presente estudo, em comparação com a observada anteriormente em ratos virgens de álcool. (Steensland et al. 2012), pOssivelmente devido a um aumento da sensibilidade do autoreceptor D2, que foi mostrado anteriormente em macacos após 18 meses de consumo de álcool voluntário (Budygin et al. 2003) e em camundongos utilizando o paradigma da exposição crônica ao vapor de etanol intermitente (Karkhanis et al. 2015). Deve-se notar, no entanto, que o rato virgem de álcool em nosso estudo anterior (Steensland et al. 2012) foram alguns meses mais jovens do que os ratos a beber a longo prazo no presente estudo. Assim, existe a possibilidade de que os efeitos diferenciais observados de OSU6162 em ratos não tratados com álcool versus beber álcool possam resultar de diferenças relacionadas à idade no sistema de dopamina. Finalmente, um estudo recente usando optogenética mostrou que a liberação de dopamina tônica (baixa, mas duradoura), mas não fásica (grande, mas de curta duração) no NAc reduziu a ingestão voluntária de álcool em ratos que haviam sido submetidos ao procedimento IA20E para 7 semanas (Baixo et al. 2013). Esses resultados apoiam nossa interpretação geral de que a capacidade do OSU6162 de induzir níveis elevados e estáveis ​​de dopamina pode ser a principal característica da capacidade do composto de atenuar comportamentos mediados por álcool em ratos.

No que diz respeito à potencial aplicabilidade terapêutica do OSU6162 em uma população de pacientes com AUD, deve-se notar que as descobertas presentes e anteriores que mostram que OSU6162 aumenta a produção de dopamina NAc no consumo de longo prazo, bem como em ratos virgens de álcool, podem indicar abuso responsabilidade. No entanto, em contraste com o pico rápido tipicamente associado aos efeitos reforçadores do álcool e outras drogas de abuso (Di Chiara e Imperato 1988; Volkow e Swanson 2003), o aumento de dopamina induzido por OSU6162 foi lento e duradouro tanto em ratos que bebiam álcool como em ratos virgens de álcool. Além disso, o OSU6162 não induziu um CPP em ratos a longo prazo que bebem ou que não receberam álcool. A possibilidade de que uma capacidade prejudicada para aprender a associação entre os potenciais efeitos de reforço e a câmara emparelhada fosse a razão por trás da falta de uma CPP induzida por OSU6162 foi excluída pela descoberta de que ratos tratados com OSU6162 prontamente discriminavam entre um objeto novo e familiar no paradigma NOR. Além disso, um estudo recente mostrou que o tratamento com OSU6162 na verdade melhorou a memória de localização de objetos (envolvendo associação a sinais espaciais) (Nilsson e Carlsson 2013), indicando que o tratamento com OSU6162 aumenta as propriedades cognitivas em um paradigma natural de esquecimento. Coletivamente, esses resultados indicam que o OSU6162 provavelmente não possui nenhuma propriedade reforçadora por si só e argumentam contra uma potencial responsabilidade por abuso.

Em conclusão, o presente estudo mostrando um decréscimo na produção de dopamina basal no NAc de ratos Wistar a longo prazo reforça a hipótese de que o consumo crônico de álcool induz um estado hipo-dopaminérgico em pacientes com AUD. Além disso, mostramos pela primeira vez que o estabilizador de monoamina OSU6162 tem a capacidade de neutralizar essas mudanças alostáticas dentro do sistema dopaminérgico mesolímbico induzidas por ciclos de consumo voluntário de álcool a longo prazo e períodos de abstinência. Finalmente, os presentes resultados indicam que o OSU6162 não tem responsabilidade por abuso. TEssas descobertas, juntamente com nosso recente estudo de laboratório humano 'prova de conceito', mostrando que OSU6162 atenua o desejo e o gosto induzido pelo álcool consumido em pacientes dependentes de álcool (resultados não publicados de nosso grupo de pesquisa) e o efeito colateral favorável do composto perfil (Johansson et al. 2012; Kloberg et al. 2014) merecem avaliação adicional da eficácia clínica do OSU6162 para atenuar o uso de álcool em pacientes com AUD.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Arvid Carlsson, Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, pela generosa doação de OSU6162 (fornecido ao Dr. Arvid Carlsson pela Pfizer Pharmaceuticals, Inc.), comentários valiosos sobre o manuscrito e discussões inspiradoras sobre os resultados apresentados no presente manuscrito. Agradecemos aos técnicos Monica Aronsson, Linnea Tankred e aos alunos de graduação Weinni Mussie, Carolina Bengtsson-Gonzales e Mohammed Elhassan pela excelente assistência com os experimentos. O estudo foi financiado pelo Swedish Research Council (2009-2612), Karolinska Institutet's Research Funds, o Research Council do Swedish Alcohol Retailing Monopoly (FO2012-0053), a Torsten Söderberg Foundation (M203 / 12), a Swedish Brain Foundation ( FO2011-0106, FO2012-0083 e FO2013-0042) e o Conselho de Pesquisa Sueco para Saúde, Vida Profissional e Bem-estar (2013-1781) para PS

Divulgação / Conflito de Interesse

Nenhum dos autores declara quaisquer interesses financeiros biomédicos ou conflitos de interesses.

Contribuição dos autores

Os autores KF, BS e PS projetaram, analisaram e interpretaram os dados do experimento de microduálise. KF e PS projetaram, analisaram e interpretaram os dados do experimento NOR. KF realizou a microdiálise e os experimentos NOR. IF e PS projetaram analisaram e interpretaram os dados que o CPP experimenta. IF e MW realizaram as experiências de CPP. KF, IF e PS escreveram o primeiro rascunho do manuscrito. Todos os autores contribuíram e aprovaram a versão final do manuscrito.

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