PLoS One. 2010; 5(10): e15401.
Sumário
A conclusão do padrão, a capacidade de recuperar memórias completas iniciadas por sugestões parciais, é uma característica essencial do processo de memória. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares e celulares subjacentes a este processo. Para estudar o papel da dopamina na memória, analisamos camundongos knockout heterozigotos transportadores de dopamina (DAT+ / -) e descobriram que, embora esses ratos possuam aprendizado, consolidação e recuperação de memória normais sob condições completas de sinalização, eles exibem déficits específicos na conclusão do padrão em condição de sinalização parcial. Esta forma de déficit de recordação de memória nos camundongos knockout heterozigotos do transportador de dopamina pode ser revertida por uma dose baixa do antagonista da dopamina haloperidol, confirmando ainda que a incapacidade de recuperar os padrões de memória é resultado do desequilíbrio da dopamina. Portanto, nossos resultados revelam que um controle delicado do nível de dopamina no cérebro é fundamental para a conclusão do padrão durante a recuperação associativa da memória.
Introdução
O recall de memória envolve uma recapitulação de informações previamente adquiridas , . Dependendo do estado das condições de recall, a recuperação da memória pode ocorrer com a maioria ou todas as dicas encontradas anteriormente associadas à aprendizagem (por exemplo, vendo uma pessoa e ouvindo sua voz simultaneamente ou revisitando a cidade natal que não mudou muito etc.). Por outro lado, em muitos casos, as recuperações de memória geralmente ocorrem quando apenas subconjuntos de sugestões iniciais estão presentes (por exemplo, reconstruindo os antigos mapas de ruas da cidade natal, quando apenas alguns marcos antigos permaneceram inalterados). Isso é conhecido como conclusão de padrão, na qual o cérebro reconstrói e recupera padrões de memória inteiros a partir de pistas externas parciais ou processos internos auto-iniciados. Atualmente, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares e celulares reais subjacentes à conclusão do padrão de recuperação da memória. No entanto, estudos emergentes indicam que a sinalização de monoamina pode desempenhar um papel na recuperação da memória .
Neste estudo, nos propusemos a examinar como o neurotransmissor modulatório da dopamina desempenha um papel na regulação da conclusão do padrão de memória durante a recuperação parcial da sugestão. A dopamina é um neurotransmissor essencial que pode influenciar a cognição, emoção e movimento. A transmissão dopaminérgica anormal tem sido implicada em vários distúrbios psiquiátricos e neurológicos, incluindo transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH), esquizofrenia e doença de Parkinson - . Embora os neurônios dopaminérgicos se originem apenas da área ventral tegmentar e substantia nigra compacta, seus outputs se projetam para quase todo o cérebro, incluindo o córtex pré-frontal, o lobo temporal medial e o hipocampo, regiões conhecidas por serem ativadas durante a recuperação da memória.l , - .
Também deve ser notado que a dopamina foi considerada funcionalmente crucial para a atenção e memória de trabalho mediada por regiões do cérebro acima - , ambos implícitos no processo de recuperação de memória sob condições de sinalização parcial . Como mecanismo celular primário para terminar a sinalização da dopamina, o transportador de dopamina (DAT), localizado nos terminais pré-sinápticos neuronais, recaptura a dopamina da fenda sináptica de volta aos neurônios dopaminérgicos. Como tal, o DAT é uma molécula crítica na regulação dos níveis sinápticos da dopamina e, consequentemente, determina a duração temporal das ações da dopamina nos circuitos neurais locais. De fato, o nocaute genético do gene do transportador de dopamina resulta em prejuízos profundos. Os camundongos homozigotos DAT-KO sofrem de anormalidades evidentes, incluindo retardo de crescimento, hiperatividade locomotora robusta e muitas outras deficiências, incluindo déficits de habituação e interação social, bem como motilidade intestinal prejudicada, controle respiratório, etc. , , . Os defeitos gerais nos camundongos DAT-KO homozigotos tornaram-no menos adequado para sondar o papel da dopamina na regulação dos processos de memória.
Curiosamente, os camundongos knockout heterozigotos (DAT+ / - camundongos), ainda possuindo um alelo do gene DAT funcional, parecem ser bastante normais em seus comportamentos grosseiros gerais , , . Assim, o DAT+ / - camundongos podem fornecer um modelo valioso para o estudo de alguns dos fenótipos delicados, mas importantes, como os processos de memória associativa e mecanismos relacionados regulados por circuitos dopaminérgicos. Aqui, usamos um conjunto de paradigmas comportamentais para avaliar as conseqüências funcionais do desequilíbrio da dopamina na conclusão do padrão durante a memória associativa.
Consistentes
Para investigar o papel da dopamina na recuperação da memória, usamos os camundongos knockout do transportador de dopamina heterozigotos (DAT+ / -). Empregamos uma bateria de medidas comportamentais básicas para avaliar sua atividade locomotora em campo aberto (Figura 1A), performances rotarod (Figura 1B e 1C), e descobriu que estes ratos knockout heterozigotos são completamente normais. Também confirmamos que o DAT+ / - camundongos exibem desempenhos indistinguíveis no nível de ansiedade, conforme medido pelo labirinto em cruz elevado (Figura 1D).
Além disso, avaliamos as funções básicas de aprendizagem e memória no DAT+ / - ratos. Em primeiro lugar, usamos o novo teste de reconhecimento de objetos e observamos que esses ratos exibiam desempenhos comportamentais completamente normais nos testes de retenção 1 em dias, em comparação com seu controle de ninhada do tipo selvagem (Figura 1E). Além disso, estes ratos também exibem retenção condicionada pelo medo do dia 1 normal que é indistinguível para os seus ratos de controlo de tipo selvagem (Figura 1F). Portanto, esses resultados sugerem que o DAT+ / - os ratos têm uma função normal de aprendizagem e memória nestas duas formas de testes de memória primária.
O teste de memória de referência espacial foi usado anteriormente para avaliar a conclusão do padrão de recuperação de memória. Nós submetemos o DAT+ / - ratos e controles de tipo selvagem para esta tarefa. Usando o protocolo de memória de referência espacial descrito anteriormente treinamos esses ratos no labirinto aquático de plataformas ocultas. O treinamento consistiu em quatro ensaios por dia, com um intervalo de uma hora entre os ensaios. Descobrimos que tanto o DAT+ / - camundongos e camundongos do tipo selvagem exibiram aprendizado comparável e consolidação de memória ao longo das sessões do dia 10 e com velocidades de natação similares (Figura 2A e 2B).
Em seguida, examinamos suas memórias da localização da plataforma oculta usando o teste de sonda (P1) no dia 11, um dia após a conclusão da última sessão de treinamento. Medida pela ocupação do quadrante, tanto o DAT+ / - camundongos e seus irmãos de ninhada controlados foram capazes de focar sua busca no quadrante alvo na presença de pistas completas (Figura 3A). Além disso, DAT+ / - os ratos também exibiram uma forte preferência na área da plataforma fantasma e não houve diferença em comparação com a ocupação da plataforma dos controles (Figura 3B). Além disso, como esperado, tanto o DAT+ / - camundongos e ninhadas do tipo selvagem exibiram um aumento significativo no número de cruzamentos (Figura 3C). Assim, todas essas medidas sugerem que o DAT+ / - os mouses podem aprender essa tarefa normalmente e recuperar essa memória associativa normalmente sob condições de full-cue.
Para determinar se o delicado equilíbrio da dopamina é essencial para a conclusão do padrão sob condições de dicas parciais, realizamos o segundo teste de sonda (P2) no dia seguinte, removendo três das quatro pistas distais (dia 12). Para evitar qualquer possível extinção da sessão de recall anterior, mais um bloco (testes 4) de treinamento foi entregue 1 hora após o teste de sonda P1. Durante este ensaio de sonda de cue parcial, enquanto os ratos de controlo continuaram a concentrar o seu tempo de pesquisa no quadrante alvo em vez dos outros quadrantes, o DAT+ / - camundongos apresentavam apenas um nível de desempenho ao acaso, medido pela ocupação do quadrante alvo (Figura 3D). Além disso, a medição da ocupação das áreas da plataforma fantasma confirmou ainda que estes DATs+ / - ratos foram prejudicados em lembrar a localização da plataforma (Figura 3E). Este défice de recuperação também foi demonstrado pela falta de um aumento no número de travessias de plataforma (Figura 3F), enquanto os irmãos de ninhada de tipo selvagem eram totalmente capazes de realizar a recordação de memória de sinalização parcial. Portanto, esses dados sugerem que o DAT+ / - os ratos são deficientes na recuperação de memórias de referência espacial sob condições de sinal parcial.
Finalmente, perguntamos se poderíamos restaurar a conclusão de padrões nesses DATs.+ / - camundongos usando métodos farmacológicos. Tem sido relatado que uma dose baixa do antagonista da dopamina, o haloperidol, pode ser útil no alívio de certos distúrbios da dopamina. . A justificativa é que a dose baixa de haloperidol pode ser capaz de atenuar um pouco o efeito da dopamina elevada nos camundongos heterozigotos que têm uma recaptação insuficiente de dopamina devido à perda de um alelo do gene transportador de dopamina normal. Nós aplicamos o mesmo conjunto de ratos ao experimento de resgate. No dia 13 e no dia 14, submetemos os camundongos acima ao terceiro teste de sonda (P3) sob condições de cue total e o teste de quarta sonda (P4) sob condições de cue parcial. Novamente, a fim de neutralizar qualquer extinção que possa ter ocorrido durante o teste da sonda, realizamos mais um bloco (testes 4) de treinamento 1 hora após a conclusão do teste de sonda P2 ou P3. Nossas medições da ocupação do quadrante-alvo no teste de sonda P3 mostram que tanto o DAT+ / - os camundongos e os irmãos de controle concentraram sua busca no quadrante alvo na presença de pistas completas (Figura 4A). Além disso, a lembrança da memória normal foi novamente evidenciada pela medição da ocupação da plataforma (Figura 4B), bem como o número de travessias de plataforma (Figura 4C). Assim, esses camundongos mutantes eram totalmente capazes de recuperar memória espacial sob condições de full-cue.
No dia 14, removemos três das quatro pistas distais e conduzimos os testes da quarta sonda (P4) sob a condição de cue parcial. Nós injetamos o DAT+ / - ratos intraperitonealmente com uma dose baixa de haloperidol (0.002 mg / kg de peso corporal) 30 minutos antes dos testes de retenção. As ninhadas do tipo selvagem receberam uma injeção de solução salina como controle. Descobrimos que o DAT+ / - camundongos concentraram seu tempo de busca no quadrante alvo e mostraram desempenhos estatisticamente similares em comparação com os homólogos do tipo selvagem (Figura 4E). Além disso, a medição da ocupação das áreas da plataforma fantasma confirmou ainda que esses DATs+ / - os ratos podem lembrar a localização da plataforma (Figura 4F). A recordação normal da memória foi novamente confirmada por um aumento no número de cruzamentos de plataforma, que estava no mesmo nível que o dos ratos selvagens (Figura 4G). Assim, esses experimentos sugerem que os déficits de conclusão de padrões observados originalmente no DAT+ / - os ratos podem ser causados pelo desequilíbrio da dopamina.
A fim de excluir a possibilidade de que os resultados para o fenótipo injetado com haloperidol no teste da sonda P4 fossem devidos ao supertreinamento durante os testes de sonda repetidos, usamos outro conjunto de DATs.+ / - e controle os irmãos da ninhada e repetiu todo o experimento. Como esperado, ambos os DAT+ / - camundongos e seus camundongos selvagens apresentaram boas taxas de aprendizado durante as sessões de treinamento do dia 10 (Figura 5A). No dia 11, submetemos esses camundongos a testes de recordação completa, não há diferença significativa nos resultados do teste de retenção de memória entre o DAT+ / - camundongos e os irmãos de controle, medidos pela ocupação do quadrante (Figura 5B), ocupação do quadrante alvo (Figura 5C) eo número de travessias da plataforma (Figura 5D). Uma hora após a conclusão do teste da sonda full-cue, nós retreinamos estes ratos com mais um bloco de treinamento para evitar qualquer efeito de extinção. No dia 12, esses ratos foram submetidos aos testes de recordação parcial. Uma dose baixa de haloperidol (ou solução salina) para os controlos foi injectada intraperitonealmente nos ratos 30 minutos antes do ensaio de sinal parcial. Descobrimos que esse tratamento realmente resultou no desempenho normal dos camundongos mutantes. Os camundongos mutantes e controle exibiram desempenhos comparáveis na ocupação do quadrante (Figura 5E), ocupação do quadrante alvo (Figura 5F) eo número de travessias da plataforma (Figura 5G). A medição de suas velocidades de nado também não revelou diferenças (Figura 5H). Portanto, esses dados demonstraram claramente que o déficit de recuperação de+ / - ratos por haloperidol não foi devido ao repetido overtraining durante vários testes de sonda.
Discussão
Enquanto o sistema de dopamina é bem conhecido por ser crucial para a regulação de muitos processos cognitivos , - , - Nosso presente estudo fornece evidências, pela primeira vez, de que o desequilíbrio de dopamina, resultante da perda de um alelo do gene transportador de dopamina normal, causou um déficit específico na conclusão do padrão durante a memória associativa de memória espacial. Esse déficit de recordação de memória é evidente apenas sob as condições de sinal parcial-espacial, mas não sob as condições de sinal completo. Além disso, esse déficit de recordação da memória parece refletir uma forma altamente específica de déficit de memória, pois aspectos gerais de comportamentos básicos (locomoção em campo aberto, rotarod e ansiedade) e outras formas de memória, como condicionamento contextual ao medo e reconhecimento de objetos permanecem normais.
Existem várias moléculas potenciais e cenários celulares que podem, coletivamente, contribuir para o déficit de recordes espacial esporádico observado, entre os quais a dopamina é considerada a principal molécula candidata subjacente a este processo de memória, porque atenção e memória de trabalho são controladas principalmente por sinais de dopamina, são relatados como críticos para a recuperação de memórias espaciais - , . É bem conhecido que os neurônios dopaminérgicos, originários apenas da área ventral tegmentar e substantia nigra compacta, se projetam para quase todos os lugares do cérebro, incluindo o córtex pré-frontal, o lobo temporal medial e o hipocampo. , , - , regiões conhecidas por serem ativadas durante a recuperação de memória, bem como processos de atenção , - , , . Dada a ampla evidência de que a dopamina é essencial para a atenção e memória de trabalho - e que o polimorfismo genético no gene DAT é considerado implicado no TDAH - , é possível que a atenção e a memória de trabalho possam desempenhar um papel na conclusão do padrão de recuperação de memória sob condições de sugestão parcial por meio da regulação da dopamina mediada por DAT. Assim, os déficits de conclusão do padrão de memória observados nos camundongos mutantes heterozigotos DAT podem ser devidos à incapacidade do camundongo de atender às demandas atencionais aumentadas durante a recuperação parcial da memória baseada em sugestões, como resultado do distúrbio da dopamina sináptica.
Nossa descoberta de que o desequilíbrio da dopamina resultou em déficit de recuperação da memória também é interessante à luz da demência clínica observada nos pacientes de Parkinson. Esses pacientes geralmente parecem reter a capacidade de aprender, consolidar e armazenar nova memória, mas são profundamente prejudicados na recuperação de memórias, especialmente sob pistas externas parciais ou recall auto-iniciado. , . Esse déficit é especialmente profundo quando as pistas explícitas estavam ausentes , , - , indicando ainda que a dopamina pode estar envolvida no processo de recuperação da memória. Esses tipos de déficits na recuperação da memória nos pacientes de Parkinson estão em forte contraste com os déficits de memória em outros sistemas de neurotransmissores ou a demência precoce em pacientes com Alzheimer que normalmente são prejudicados em aprender e consolidar novas memórias, preservando a capacidade de recordar memórias antigas , . Isso ilustra a necessidade de desenvolver estratégias terapêuticas diferentes, devido às diferentes vulnerabilidades a processos moleculares e temporais distintos dentro de circuitos de memória.
Nossa demonstração de que a conclusão do padrão pode ser completamente recuperada pela injeção de haloperiodol no momento do recall reforça a idéia sobre o papel dos níveis balanceados de dopamina na recuperação da memória. Este experimento de resgate farmacológico fornece evidências adicionais para especificidade temporal que causam o déficit de recordação parcial baseado em pistas. Deve-se notar que as disfunções da dopamina no DAT+ / - camundongos e pacientes com Parkinson são bastante diferentes um do outro, mas ambos levam a déficits na recuperação de padrões. Essa semelhança fornece apoio coletivo à noção de que o delicado equilíbrio do sistema de dopamina é crucial para a recuperação da memória, e o desequilíbrio em qualquer direção (para cima ou para baixo) causaria déficits na conclusão do padrão de memória durante a recuperação. É importante ressaltar que nossa análise atual não deve ser interpretada como evidência para o uso de camundongos DAT mutantes como modelo de doença de Parkinson. Por outro lado, in vivo medição de dopamina em camundongos knockout homozigotos DAT mostra uma redução significativa na liberação de dopamina desencadeada pela estimulação de explosão - . Isso indica que a capacidade de traduzir a atividade neural estourar em sinais de dopamina nas várias regiões do cérebro de camundongos knockout pode ser deficiente. É concebível que alterações reduzidas na proporção de dopamina possam levar a alterações fisiológicas alteradas nos padrões de disparo nos circuitos neurais envolvidos no processamento da memória. Atualmente, não se sabe se a alteração semelhante também ocorre nos camundongos knockout heterozigotos do DAT ou nos pacientes com doença de Parkinson.
Embora pouco se saiba sobre os circuitos neurais ativados durante a memória espacial, é provável que recrute várias regiões, incluindo o córtex pré-frontal, o córtex temporal medial e o hipocampo. Isso se encaixa bem com a evidência anatômica de que a saída dopaminérgica da área tegmentar ventral se projeta fortemente para a área CA1 ventral e o córtex entorrinal , . Esse laço pré-frontal-VTA hipocampal pode desempenhar um papel crucial para gerar familiaridade contextual que, por sua vez, promove a conclusão do padrão durante a recuperação da memória espacial baseada em estímulos parciais através da facilitação da atenção regulada pela dopamina. , , , . Será importante, em estudos futuros, definir melhor os locos anatômicos dos quais os déficits de conclusão do padrão observados se originam. Seria especialmente interessante investigar locais candidatos como o córtex cingular anterior, o córtex temporal e o hipocampo usando técnicas de gravação in vivo farmacológicas, genéticas e de larga escala. , - . Também é importante avaliar se a compensação genética ou mudanças lentas no cérebro mutante contribuem para os déficits recordatórios observados. Há também indicações de que outros sistemas de neurotransmissores também podem estar criticamente envolvidos na regulação da recuperação da memória. , , , e seria muito interessante examinar e comparar suas interações dinâmicas entre o preenchimento de padrão acionado por estímulo parcial e a recuperação completa de memória baseada em sugestão. Em conclusão, nosso estudo sugere que um equilíbrio delicado nos níveis de dopamina é crucial para a conclusão do padrão durante a recuperação da memória espacial associativa.
Materiais e Métodos
Declarações éticas
Todos os trabalhos com animais descritos no estudo foram conduzidos de acordo com as diretrizes do NIH e aprovados pelo comitê Institucional do IACUC no Medical College of Georgia (número de aprovação AUP: BR07-11-001).
Produção e Genotipagem de Camundongos Mutantes
Os ratos DAT foram um presente generoso do laboratório do Dr. XiaoXi Zhuang da Universidade de Chicago. Criação e genotipagem de camundongos knockout heterozigotos DAT são os mesmos descritos . Para os nossos experimentos, ambos os ratos machos e fêmeas foram igualmente utilizados em uma proporção de 1![[ratio]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
1. PCR para DAT+ / - camundongos foi seguido pelo protocolo como descrito . Todos os ratinhos foram mantidos sob condições padrão (23.1 ° C, 50.5% de humidade) na Instalação Animal do Medical College of Georgia. Todos os experimentos foram conduzidos em uma sala de comportamento à prova de som e especializada. Todos os experimentadores eram cegos para o genótipo do animal individual.
Tarefa de reconhecimento de objeto novo
O protocolo experimental foi o mesmo descrito anteriormente , . Resumidamente, os ratos foram habituados individualmente a uma caixa de campo aberto (20 × 20 × 10 polegadas altas) por 3 dias. Durante as sessões de treinamento, dois novos objetos foram colocados em campo aberto, e o animal foi autorizado a explorar 15 min. O tempo gasto explorando cada objeto foi registrado. Durante os testes de recordação de uma hora, o animal foi colocado de volta na mesma caixa, na qual um dos objetos familiares durante o treinamento foi substituído por um novo objeto e permitido explorar livremente por 15 min. Um índice de preferência, uma razão do tempo gasto explorando qualquer um dos dois objetos (sessão de treinamento) ou o novo (sessão de retenção) sobre o tempo total gasto explorando os dois objetos, foi usado para medir a memória de reconhecimento.
Testes de Campo Aberto e Rota-rod
Os protocolos foram os mesmos descritos . Para a medição da atividade de campo aberto, os ratos foram colocados em um campo aberto, feito de uma caixa preta 14 × 14 polegadas. A caixa foi marcada com pequenas quadrículas 2 × 2 polegadas (quadrados 7 por quadrados 7 com quadrados 49 no total). A actividade de campo aberto dos animais foi medida pelo número de cruzes que os ratinhos passaram no período de 3 minutos. Para a medição do teste Rota-rod, os camundongos foram colocados em uma haste de madeira rotativa em aceleração. A haste é 12 de comprimento longo e 1 polegadas de diâmetro. A velocidade de rotação inicial foi de 4 rpm e depois acelerada para 40 rpm. O desempenho foi medido pela quantidade de tempo (em segundos) que os ratos conseguiram permanecer na haste rotativa durante os testes de recordação de cinco minutos ou de uma hora.
Testes de Labirinto em Mais Elevado
Os protocolos foram os mesmos descritos . O labirinto mais elevado é feito de aço inoxidável, que é pintado de preto fosco, e é composto por quatro braços (dois abertos sem paredes e dois fechados por paredes altas 15.25) com 30 cm de comprimento e 5 cm de largura. Cada braço do labirinto é preso a pernas de metal resistentes de tal forma que ele é elevado 40 cm acima da mesa em que ele descansa. A atividade foi gravada por uma câmera digital (Câmera Logitech, Modelo N231) colocada 130 cm acima do labirinto. Os testes foram realizados sob luz fraca (uma 40-W e uma lâmpada branca suave 60-W, ambas anguladas para criar iluminação indireta no labirinto) durante a fase de luz do ciclo circadiano (entre 0900 he 1400 h). O labirinto foi limpo com 5% ácido acético entre os testes. Ruído branco (30 dB) ruído de fundo externo mascarado. No dia do teste, os animais foram trazidos para a sala de testes em suas gaiolas de origem, e cada par de animais foi então removido de sua gaiola de origem e colocado em uma gaiola separada para 5 min antes de ser colocado no labirinto. Os animais foram colocados individualmente no centro do labirinto, com a posição da cabeça contrabalançada entre os ratos, e o comportamento foi registrado para 5 min. o tempo gasto no braço aberto e no braço fechado (quando as quatro patas do roedor estão no braço aberto ou fechado) foi registrado e analisado.
Condicionamento Contextual do Medo
O condicionamento de medo foi realizado como descrito anteriormente . O experimento foi conduzido em um sistema de condicionamento do medo, uma câmara situada em uma caixa acústica atenuada com uma lâmpada no teto e um piso de grade de aço inoxidável (Coulbourn Instruments, Whitehall, PA). O piso da grade estava ligado a um gerador de choque e a um sinal auditivo originado de um alto-falante ligado à parede da câmara. Todos os estímulos foram controlados automaticamente usando um computador pessoal com um programa de estado gráfico. Uma câmera de vídeo foi colocada na frente da gaiola para registrar o comportamento. Os ratos foram manuseados por 3 dias e depois habituados à câmara de treino para 5 min. O estímulo condicionado (CS) utilizado foi um som 85 dB em 2.8 kHz, enquanto o estímulo incondicionado (US) foi um choque contínuo no pé em 0.8 mA para 2 s. Após um único pareamento CS / US co-terminal, o animal permaneceu na câmara por outros 30 s para a medição do congelamento imediato. Durante o teste de retenção, cada rato foi colocado de volta na mesma câmara, e as respostas de congelamento foram registradas para 5 min (resposta contextual de congelamento). Todos os testes foram gravados em vídeo sob luz vermelha. O tempo total de congelamento foi medido como um índice de memória de medo. O comportamento de congelamento foi definido como uma completa falta de movimento, excluindo a respiração. O comportamento de congelamento foi avaliado por software (Coulbourn Instruments) e convertido para resposta de congelamento [resposta de congelamento 
= (tempo total de congelamento / tempo total de teste) × 100%].
Testes de memória de referência espacial
O teste de memória de referência espacial foi o labirinto aquático de plataforma oculta. Seguimos o protocolo conforme descrito anteriormente por Nakazawa et al. . O treinamento consistiu em quatro ensaios por dia, com uma hora entre os ensaios. O movimento dos ratos foi rastreado por câmera de vídeo e medido por software (Noldul Information Technology, Holanda). A latência de escape para a plataforma, bem como a ocupação do quadrante e o cruzamento da plataforma foram todos registrados e analisados. A piscina tem um diâmetro de 118 cm e a plataforma tem 9.5 cm de diâmetro. Quatro testes de sonda foram realizados. O primeiro teste de sonda (P1) foi realizado no dia seguinte à última sessão de treinamento sob condições de sinalização completa (Dia 11). O segundo teste de sonda (P2) foi conduzido no dia 12 sob condições de sinal parcial (removendo três das quatro sugestões visuais penduradas na parede de cortina preta). Para o DAT+ / - camundongos, realizamos o terceiro teste de sonda (P3) no dia 13 sob condições de pista cheia e teste de quarta sonda (P4) no dia 14 sob condições de sinal parcial. Mais um bloco (testes 4) do treinamento foi entregue 1 hora após os testes com sonda P1, P2 e P3, respectivamente, para neutralizar qualquer extinção que possa ter ocorrido durante o teste da sonda. Além disso, a fim de excluir o efeito de composição do overtraining provável antes P4 (teste de sonda com cue parcial e injeção de haloperidol), submetemos outro grupo de DAT+ / - camundongos, bem como seus ninhadas de controle, do tipo selvagem, para dois testes adicionais (ensaios com P3 ′ e P4 ′). O teste da sonda P3 'foi realizado um dia após a última sessão de treinamento em condições de sinalização completa (dia 10). O teste da sonda P4 'foi realizado no dia 11 sob condições de sugestão parcial. Durante todos os nossos testes de sonda, a plataforma foi removida e os ratos foram autorizados a nadar na piscina pelo mesmo período de tempo usado durante o treinamento (60 segundos). O tempo gasto em cada quadrante foi registrado. Para restaurar os níveis de dopamina , , ratos da DAT+ / - e os grupos controle foram todos injetados por via intraperitoneal com haloperidol (0.002 mg / kg de peso corporal) ou com solução salina 30 minutos antes dos ensaios das sondas P4 e P4 ′.
Análise de Dados
Para contabilizar as correlações intra-animal entre as medidas repetidas, modelos mistos lineares foram empregados para estimar o desempenho comportamental no labirinto aquático de Morris, o novo reconhecimento de objetos, condicionamento de medo contextural e testes de rota-rod. O método de Tukey-Kramer foi utilizado para determinar a significância das medidas comportamentais entre DAT+ / - camundongos e os irmãos de ninhada de controle. Nos testes de campo aberto e labirinto em cruz elevado, ANOVA unilateral e teste post hoc de Dunnett foram usados para determinar os efeitos do genótipo. As variáveis contínuas são apresentadas como a média e o erro padrão da média (EPM). Os dados foram analisados usando SPSS versão 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). As diferenças foram consideradas significativas quando P <0.05.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Xiaoxi Zhuang da University of Chicago pelo fornecimento de DAT+ / - KO ratos e Brianna Klein para assistência técnica para experimentos.
Notas de rodapé
Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Financiamento: Esta pesquisa foi apoiada por fundos do NIMH (MH060236), NIA (AG024022, AG034663 & AG025918), USAMRA00002, Georgia Research Alliance e Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (10140900500) (todos para JZT). Fundação Nacional de Ciência da China (81000592), Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (10DZ2272200, 09DZ2200900, 10PJ1407500 e 10JC1411200), Comissão de Educação Municipal de Xangai (11ZZ103) para FL e XMS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.