Cdk5 Fosforila Receptor Dopamine D2 e Atenua Sinalização a Jusante (2013)

Citação: Jeong J, Parque YU, Kim DK, Lee S, Y Kwak et al. (2013) Cdk5 Fosforila o Receptor de Dopamina D2 e Atenua a Sinalização a Jusante. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter, Universidade de Dakota do Norte, Estados Unidos da América

Recebido: May 20, 2013; Aceitaram: Novembro 14, 2013; Publicado em: 31 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Jeong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos do Licença Creative Commons Attribution, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados.

Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelos subsídios (NRF-2012R1A2A2A01012923 e NRF-2012R1A4A1028200) do governo coreano (MSIP) e também apoiado no âmbito do programa de cooperação internacional gerido pela NRF da Coreia (2012K2A1A2033117) e do Korea Brain Research Institute (KBRI) Programa de Pesquisa Básica do MSIP (2031-415). A SKP recebeu o prêmio 2004 e 2006 National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD) Young Investigator Awards. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.

Introdução

A sinalização da dopamina está envolvida em várias funções cerebrais, incluindo coordenação motora, controle do humor e mecanismos de recompensa. . Um componente importante da sinalização da dopamina em vertebrados é exercido por neurônios espinhais médios estriados (MSNs) que expressam seletivamente um subconjunto de receptores de dopamina e recebem estímulos dopaminérgicos principalmente da área tegmental ventral (VTA) e substantia nigra (SN).) . Os receptores de dopamina são receptores acoplados à proteína G (GPCR) com sete domínios transmembrana e consistem em dois subtipos, Receptores do tipo D1 e do tipo D2, que medeiam ações recíprocas na sinalização da dopamina . Por exemplo, os receptores do tipo D1 da dopamina (D1, D5) ativam a adenilil ciclase através de G_αs e aumentar o nível intracelular de cAMP, mas os receptores do tipo D2 da dopamina (D2, D3, D4) inibem a adenilil ciclase através de G_αi e diminuir o nível intracelular de AMPc , .

Entre os receptores de dopamina, o receptor D2 (DRD2) está implicado na fisiopatologia de múltiplos transtornos psiquiátricos, incluindo esquizofrenia e dependência de drogas. , de tal modo que muitos fármacos antipsicóticos visam, pelo menos parcialmente, o DRD2. Sabe-se também que a atividade de DRD2 correlaciona-se bem com as conseqüências comportamentais de drogas de abuso em modelos animais. . Os antidepressivos e a eficácia do estabilizador de humor também foram associados a alterações na expressão da superfície celular de DRD2 ou sinalização intracelular a jusante mediada por PKA, ERK e GSK3 , , . Apesar desses papéis críticos para o DRD2 no cérebro, os mecanismos reguladores detalhados que conferem heterogeneidade e complexidade às propriedades do DRD2 não são completamente compreendidos.

As linhas de evidência convergentes indicam que várias modificações pós-tradução estão envolvidas no ajuste fino da atividade do DRD2. A glicosilação extensa de DRD2 foi revelada em estudos iniciais de rotulagem de fotoafinidade e a formação de ligação dissulfureto dentro de DRD2 também foi identificada como uma modificação importante para ligação de ligante . Além disso, os locais de fosforilação de DRD2 foram inicialmente identificados in vitro ensaio com radioisótopos, fornecendo rotas para várias vias reguladoras mediadas por várias quinases . De fato, a proteína quinase C (PKC) regula a mobilização mediada por DRD2 de cálcio intracelular e modula a interação de DRD2 com proteínas do citoesqueleto . Fosforilação por GPCR quinase 2 (GRK2) regula os padrões de ressensibilização induzida por agonistas de DRD2 .

Quinase dependente de ciclina 5 (Cdk5) é uma serina / treonina quinase dirigida por prolina que tem atividade preferencial devido à expressão cerebral específica de seus ativadores essenciais, p35 e p39 . Cdk5 está envolvido em vários processos neuronais, incluindo migração neuronal e orientação axonal, e os ratos nulos Cdk5 e p35 apresentam defeitos na estratificação cortical . Recentemente, foi demonstrado que a fosforilação de WAVE1 e ephexina por Cdk5 regula a morfogênese da coluna dendrítica. . Além disso, o Cdk5 também regula os níveis de expressão de superfície das correntes NMDA do receptor NMDA, NR2B e NR2A , . É digno de nota que várias evidências sugerem uma relação íntima entre o Cdk5 e o sistema de dopamina. O Cdk5 fosforila a tirosina hidroxilase (TH), regulando sua estabilidade, mantendo assim a homeostase dopaminérgica . Em neurônios pós-sinápticos, quando o resíduo T75 de dopamina e fosfoproteína-32kD regulada por AMP cíclico (DARPP-32) é fosforilado por Cdk5, ele pode inibir a atividade de PKA e assim antagonizar a sinalização de PKA mediada por dopamina DRD1 . Curiosamente, quando a cocaína, um agonista indireto dos receptores dopaminérgicos, é administrada cronicamente em ratos, os níveis de mRNA e proteína do Cdk5 aumentam em neurônios espinhosos médios . Coletivamente, o Cdk5 parece estar envolvido em adaptações sinápticas induzidas por drogas. Neste estudo, mostramos uma interação funcional de DRD2 e Cdk5 que amplia ainda mais o papel do Cdk5 na sinalização da dopamina.

Materiais e Métodos

Anticorpos

Soros anti-coelho foram criados contra ptidos contendo fosfo-serina 321 (pS321) da terceira ansa intracelular de DRD2 (D2i3). Fosfo-péptido, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), foi utilizado para preparar uma coluna conjugada com péptido para purificação por afinidade (20401, PIERCE). O anticorpo anti-pS321 foi enriquecido por um sistema de purificação por afinidade seguindo as instruções do fabricante. O fosfo-anticorpo purificado foi armazenado em PBS com 0.1% de azida de sódio e 0.1% de gelatina. O anticorpo anti-ratinho anti-Cdk5 (sc-249) e o anticorpo anti-coelho anti-p35 (sc-820) foram utilizados para o Western blotting e imunocitoquimica de Cdk5 / p35. Utilizou-se anticorpo anti-GFP anti-ratinho (sc-9996) para a imunoprecipitação e transferência Western de DRD2-GFP. Anticorpo anti-FLAG anti-coelho (sc-807), anticorpo anti-HA anti-coelho (sc-805), anticorpo anti-GST anti-ratinho (sc-138) e anticorpo anti-GAPDH anti- ratinho (sc-32293) XNUMX) foram adquiridos à Santa Cruz Biotechnologies.

Animais

O mouse knockout p35 foi um presente gentil do Dr. Katsuhiko Mikoshiba no RIKEN Brain Science Institute no Japão e usado para cultura de neurônios primários. Os conjuntos de primers para genotipagem foram 5′-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC e 5′-TCCATCT GCACGAGACTAGT, conforme descrito anteriormente . Ratos ICR e ratos Sprague Dawley foram utilizados para preparação de lisado cerebral. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Pohang.

Construções Plasmid

A isoforma humana DRD2 longa num vector plasm�ico EGFP-N1 e a terceira ansa intracelular de DRD2 (res�uos de amino�idos 212-XUMUMX incluindo os res�uos de amino�idos adicionais 373 �icos da isoforma longa DRD29) foram utilizados num vector plasm�ico pFLAG-CMV-2. O Cdk2 humano foi inserido num vector plasmídico pCMV-HA e o p5 humano foi inserido num vector plasmídico pcDNA 35. O Cdk3.1 humano foi inserido sob um promotor de citomegalovírus (CMV) juntamente com p5 humano em um vetor pcDNA 35 para fazer uma construção de expressão dupla (Cdk3.1 / p5) para imunocitoquímica, ensaio de internalização de receptor, [³⁵S] -GTP_γEnsaio de liga�o ao S, ensaio de liga�o ao radioligando e imunoensaio enzim�ico de cAMP.

In Vitro Ensaio de quinase

Vinculado ao IP in vitro o ensaio de cinase foi realizado como se segue. Um cérebro inteiro de rato foi lisado em 3 mL de tampão de lise de eritrócitos (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) por 20 de um homogeneizador Dounce para obter lisados ​​cerebrais homogeneizados . Os lisados ​​foram incubados em gelo por 30 min, sonicados e centrifugados a 16,000 × g para 10 min. Os sobrenadantes foram imunoprecipitados com anticorpo anti-p35 de coelho para obter um complexo Cdk5 / p35 activo. O complexo Cdk5 / p35 e proteína de fusão GST purificada foi misturado com adenosina 5′-triposfato, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) e incubadas em tampão de quinase (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) para 1 h à temperatura ambiente , . O complexo Cdk5 / p25 purificado (14 – 516, Millipore) também foi utilizado in vitro ensaio de cinase como descrito acima. O tampão de carregamento da amostra 2 × foi adicionado à mistura reaccional e fervido a 100 ° C. As amostras foram então submetidas a SDS-PAGE e o gel seco foi avaliado por autorradiografia.

Cromatografia Líquida (LC) - Espectrometria de Massas (MS) / MS Analysis

A proteína GST-D2i3 recombinante foi analisada por LC-MS / MS seguindo-se in vitro ensaio de cinase. Foi realizada a identificação de peptídeos de dados de LC-MS / MS usando X !! Tandem (versão Dec-01-2008). Cada arquivo de dados RAW foi primeiro convertido em mzXML usando o pipeline trans-proteômico (TPP; versão 4.3). As exploraes de MS / MS nos mzXMLs convertidos foram ent submetidas a pesquisa contra a base de dados de sequcias de proteas de ratinho UniProt (libertao 2010_07) incluindo a sequcia GST-D2i3 utilizando X! Tandem. A tolerância foi ajustada para 3 Da para íons precursores e 2 Da para íons de fragmento. A especificidade enzimática para tripsina foi utilizada. Opções de modificação variável foram usadas para a carbamidometilação da cisteína (57.021 Da), a oxidação da metionina (15.995 Da), a hidrólise da asparagina (0.987 Da) e a fosforilação da serina (79.966 Da).

Imunoprecipitação

A imunoprecipitação foi realizada em lisados ​​celulares em tampão de lise ELB. O anticorpo anti-GFP foi adicionado aos lisados ​​e incubado para 3 h a 4 ° C. Os imunocomplexos foram purificados utilizando agarose de proteína A. Os precipitados foram incubados com tampão de carga de amostra SDS para 30 min a 37 ° C, e submetidos a SDS-PAGE e Western blots.

Ensaio Pull-down GST

10 de GST purificada e GST-D2i3 foram incubados com lisado de cérebro de rato para 1.5 h a 4 ° C. 30 de esferas de Sepharose 4B conjugadas com glutationa (GSH) (17-0756-01, GE Healthcare) equilibradas com tamp de lise foram adicionadas e incubadas durante 1 h adicional. As contas foram recolhidas por centrifugação a 2,000 ×g e lavado com tampão de lise 4 vezes , . Os precipitados foram analisados ​​por Western blotting utilizando anticorpos anti-Cdk5 e anti-p35.

Imunocitoquímica

Células HEK 293 transfectadas e neurónios estriados cultivados em lamelas foram lavados uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixados por imersão em% de paraformaldeído / PBS 4% frio para 30 min. O anticorpo primário foi diluído na solução de bloqueio (2% de soro de cavalo e 1% de Triton X-100 em PBS). O anticorpo anti-murganho conjugado com Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) e o anticorpo anti-coelho conjugado com Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen) foram utilizados como anticorpos secundários. Hoechst foi usado para coloração do núcleo. As imagens foram obtidas por microscopia confocal (Olympus, FluoView-1000).

Ensaio de Internalização de Receptores

24 h após a transfecção, as células foram tratadas com 1 µM ​​quinpirole (Q102, Sigma) para 30 min e 90 min a 37 ° C. As culas foram ressuspensas em 2 mL de PBS frio e aluotas de 200 foram utilizadas para cada reaco. Tratamentos com fármacos foram realizados à temperatura ambiente para 3 h nas seguintes concentrações; 3 nM [³H] -espiperona (NET-565, PerkinElmer), 3 � sulpirida (895, TOCRIS), 10 � haloperidol (H1512, Sigma). Hidrofóbico [³H] -espiperona foi usada para marcar os receptores expressos totais e o sulpirido hidrofílico foi usado para substituir o receptor membranoso [³Sinais de H] -espiperona. Os sinais dos receptores associados à membrana foram calculados subtraindo os valores dos receptores intracelulares dos valores totais dos receptores expressos. As células foram filtradas num filtro GF / B (Millipore) e lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Os filtros foram secos e a radioatividade residual foi medida usando um contador de cintilação líquida .

Preparação da membrana celular

As células confluentes em placas de cultura 100 mm após a transfecção foram lavadas com PBS gelado e colhidas em tampão 1 mL HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). Os lisados ​​homogeneizados foram centrifugados com 500xg para 15 min e os sobrenadantes foram subsequentemente centrifugados com 36,000xg para 30 min. Pelotas ressuspensas em tampão HME foram usadas para ensaios.

[³⁵S] -GTP_γEnsaio de Ligação S

As fracções da membrana celular foram pré-incubadas com 1 µM ​​quinpirole (Q102, Sigma) no tampão de ensaio (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA e 0.01 mM GDP) para 10 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) foi adicionado à concentração final de 3 nM em 30 µL e posteriormente incubado por 90 min. 170 µl de tampão gelado (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂e 0.1 mM GTP) foi adicionado para parar a reacção. As membranas foram filtradas num filtro GF / B (Millipore) e lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Os filtros foram secos e a radioatividade foi medida usando o contador de cintilação , .

Ensaio de Ligação Radioligante

As membranas celulares preparadas foram incubadas com 0.01 nM [³H] -espiperona (NET-565, PerkinElmer) e concentrações crescentes de quinpirol (Q102, Sigma) para 30 min no tampão de ensaio (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). As membranas foram filtradas num filtro GF / B (Millipore) e lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). A reacção foi terminada por filtração rápida através de filtros GF / C. A radioatividade residual foi medida usando um contador de cintilação líquida - .

Imunoensaio enzimático de AMPc

Células HEK 293 transfectadas foram pré-tratadas com 10 µM ​​de rolipram (R6520, Sigma) para 1 h, e depois tratadas com forscolina 0.1 µM ​​(F6886, Sigma) e concentrações crescentes de quinpirole (Q102, Sigma) para 30 min. Os neurónios estriados de cultura primária foram tratados com 10 µM ​​de rolipram para 1 h e, em seguida, 1 µM ​​de dopamina para 1 h . Os lisados ​​de c�ulas foram preparados com 0.1 M HCl e os n�eis de cAMP foram detectados pelo kit de imunoensaio de enzima cAMP (Sapphire Bioscience) seguindo as instru�es do fabricante.

Neurônio Estriado Cultivado Primário

A área do estriado foi isolada do cérebro embrionário do rato (E15). O tecido dissecado foi dissociado em meio essencial mínimo (MEM) (11095, Invitrogen) contendo 0.25% de tripsina (T4549-100, Sigma) e 0.1% DNase I para 6 min a 37 ° C. As células foram re-suspensas nos meios de revestimento (MEM com 0.01 M HEPES (pH 7.4) e 10% (vol / vol) de soro de cavalo (16050-122, GIBCO)). Neurônios foram cultivados por 7 dias in vitro (DIV 7) em MEM com suplemento B27 (17504-044, Invitrogen) antes de ser aplicado a imunoensaios enzimáticos cAMP.

Consistentes

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 no terceiro loop intracelular de DRD2 in vitro

Para identificar novos substratos Cdk5, foi realizada uma pesquisa sistemática utilizando (S / T) PX (K / H / R) como as sequências de consenso de reconhecimento Cdk5 e identificou o DRD2 como um substrato candidato. A sequência de consenso, incluindo a serina 321, está localizada na terceira alça intracelular de DRD2 (D2i3) onde vários mecanismos regulatórios foram implicados , , . A seqüência é evolutivamente conservada em DRD2 em vertebrados, implicando uma importância funcional do resíduo (Fig. 1A).

Para avaliar a capacidade do Cdk5 de fosforilar o D2i3, realizamos in vitro Ensaios de cinase utilizando um complexo Cdk5 / p35 activo enriquecido a partir de lisado de cérebro de murganho por imunoprecipitação de p35 com proteínas GST-D2i3 (resíduos de aminoácido 212-373) recombinantes purificadas como substratos. Observamos sinais de fosforilação nas proteínas purificadas GST-D2i3 e GST-D2i3 S297A, mas o sinal foi significativamente diminuído com GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Para verificar a fosforilação da serina 321 no GST-D2i3, realizamos a análise por LC-MS / MS das amostras de in vitro Ensaios de cinase usando espectrometria de massa LTQ XL. Consistentemente, fosfo-peptídeos correspondentes à massa dos peptídeos fosfo-serina 321 foram recuperados (Fig. 1C). Considerando que a aquisição dependente de dados durante a análise por LC-MS / MS tende a detectar proteínas abundantes na amostra , estes dados sugerem que o resíduo de serina 321 é o local de fosforilação dominante de Cdk5 na região D2i3. Para provar a fosforilação direta de serina 321 no GST-D2i3 por Cdk5, in vitro Foi realizado ensaio de cinase utilizando o complexo Cdk5 / GST-p25 purificado com proteínas GST-D2i3 recombinantes purificadas. Identificamos um sinal de fosforilação significativo no GST-D2i3 que estava ausente no GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o resíduo D2i3 S321 é um alvo preferencial para a fosforilação mediada por Cdk5.

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 no Terceiro Circuito Intracelular de DRD2 em Células

Para identificar a fosforilação da serina 321, levantamos anticorpos específicos para a fosfo-serina 321 (pS321). Amostras do link do IP in vitro O ensaio de cinase foi analisado por Western blotting utilizando o anticorpo anti-pS321. Os blots mostraram uma banda distinta na reação de quinase que dependia de GST-D2i3 (Fig. 2A). Para verificar a potencial fosforilação de serina 321 em DRD2 por Cdk5 em células, imunoprecipitados anti-GFP de células HEK 293 expressando DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP com ou sem HA-Cdk5 e p35 foram analisados ​​por Western blotting utilizando anti-GFP e anticorpos anti-pS321. Os sinais característicos de bandas borradas pelo anticorpo anti-GFP que são conhecidos por serem excessivamente glicosilados de DRD2 são observados apenas na presença de DRD2-GFP, e o anticorpo anti-pS321 detectou sinais DRD2 similares apenas com expressão de Cdk5 / p35 (Fig. 2B) . Para verificar melhor a fosforilação de serina 321 por Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) e forma mutante de D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) foram gerados. FLAG-D2i3 e FLAG-D2i3 S321A expressos com ou sem HA-Cdk5 e p35 em células HEK 293 foram analisados ​​por um ensaio de deslocamento de mobilidade SDS-gel. Foi observado um desvio de mobilidade significativo dependente de Cdk5 para FLAG-D2i3, mas não para FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). Nós também avaliamos o nível de fosforilação de DRD2 em Ser321 após estimulação com agonista. As culas HEK 293 que expressam o complexo DRD2-GFP e Cdk5 / p35 foram estimuladas por quinpirole e os imunoprecipitados anti-GFP dos lisados ​​celulares foram analisados ​​por Western blotting utilizando anticorpos anti-GFP e anti-pS321. Descobrimos que a fosforilação de DRD5 mediada por Cdk2 em Ser321 não foi afetada pela estimulação por agonistas, que parece diferente das fosforilações mediadas por GRK e PKC (Fig. 2D) , . Juntos, esses resultados indicam que o Cdk5 pode fosforilar o resíduo serina 321 do DRD2 no ambiente celular.

Complexo Cdk5 / p35 e DRD2 estão fisicamente associados

Nós investigamos a interação física potencial entre o complexo Cdk5 / p35 e DRD2 porque muitos substratos Cdk5 são conhecidos por estarem fisicamente associados ao complexo Cdk5 / p35 , , . Primeiro, o experimento de pull-down do GST foi realizado. A prote�a GST-D2i3 recombinante purificada foi incubada com lisado de c�ebro de rato e os precipitados precipitados de GST foram analisados ​​para Western blotting. Como mostrado em Fig. 3A, Cdk5 e p35 endógenos foram identificados nos precipitados pull-down, indicando uma interação física entre DRD2 e o complexo Cdk5 / p35 (Fig. 3A). Além disso, foram detetados HA-Cdk5 e p35 nos imunoprecipitados anti-GFP de lisados ​​de células HEK 293 expressando DRD2-GFP e Cdk5 / p35 (Fig. 3B). Além disso, realizamos análises imunocitoquímicas e observamos que DRD2-GFP, HA-Cdk5 e p35 mostram sinais significativos de co-localização na área membranosa de células HEK 293 (Fig. 3C, painéis superiores). Nós também investigamos a co-localização de DRD2 e Cdk5 / p35 no contexto neuronal. Consistentemente, DRD2-GFP também mostrou co-localização significativa com Cdk5 endógena e p35 nos neurônios estriados cultivados (DIV7), apoiando ainda mais as ligações funcionais entre DRD2 e Cdk5 / p35 (Fig. 3C, painéis inferiores). Os resultados indicam que DRD2 e Cdk5 / p35 podem formar um complexo e, portanto, suportam a noção de que DRD2 é um substrato fisiológico de Cdk5.

Fosforilação mediada por Cdk5 de DRD2 atenua a atividade do receptor

Foi relatado que a fosforilação modula as propriedades críticas dos GPCRs, como o acoplamento da proteína G, a internalização do receptor, a localização intracelular e a associação com proteínas moduladoras. , , . UMAA internalização do receptor induzida por gonistas é um processo regulador crítico da transdução de sinal. Nós investigamos a modulação mediada por Cdk5 da internalização de DRD2. Células HEK 293 expressando DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP com ou sem Cdk5 / p35 foram incubadas com 1 µM ​​quinpirole para induzir a internalização de DRD2 estimulada por agonistas (Fig. 4A). [³Os sinais de H3-espiperona de c�ulas expressando DRD2-GFP foram significativamente reduzidos no tratamento com 30 min quinpirole e recuperados a 90 min. Curiosamente, [³Os sinais de H3 -espiperona de células que expressam DRD2-GFP e Cdk5 / p35 foram também reduzidos no tratamento com 30 min quinpirole, mas não recuperados a 90 min (Fig. 4A, segunda seção). Por outro lado, [³Os sinais de H3-espiperona de c�ulas expressando DRD2 S321A-GFP foram reduzidos a 30min e recuperados a 90min, independentemente da co-express� com Cdk5 / p35. Estudos anteriores demonstraram que o DRD2 internalizado se recicla de volta à membrana plasmática após estimulação agonista prolongada .Assim, parece que a fosforilação de DRD5 mediada por Cdk2 está envolvida nos processos de ressensibilização após internalização por DRD2 induzida por agonista.

Nós avaliamos ainda uma potencial mudança de acoplamento de proteína G estimulada por agonista para DRD2 associado à fosforilação mediada por Cdk5 usando [³⁵S] -GTP_γEnsaio de ligação S , . DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP com ou sem Cdk5 / p35 foram expressos em células HEK 293. Membranas foram preparadas e estimuladas com 1 µM ​​quinpirole e permitidas [³⁵S] -GTP_γIncorporação S As membranas celulares que expressam DRD2-GFP e Cdk5 / p35 mostraram-se significativamente prejudicadas [³⁵S] -GTP_γLigação S em comparação com todas as outras membranas celulares (Fig. 4B). Estes resultados indicam que a fosforilao mediada por Cdk5 regula negativamente a ligao da protea G estimulada por agonistas em DRD2.

Além disso, quinpirole-competindo [³Os ensaios de ligação de H-espiperona foram realizados para investigar qualquer alteração potencial na afinidade de agonista em DRD2 por fosforilação mediada por Cdk5. Ligação competitiva de [³H] -espiperona após o tratamento de concentrações crescentes de quinpirole para a preparação da membrana a partir de transfectadas foi medida. Ligação competitiva do quinpirole e [³H] -spiperona em DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP produziu logK semelhante_i valores (−9.789 para DRD2-GFP; −9.691 para DRD2 S321A-GFP), indicando que a afinidade do ligante para DRD2 não é significativamente afetada pela fosforilação mediada por Cdk5 em DRD2 (Fig. 4C).

Fosforilação mediada por Cdk5 Regula negativamente a via de sinalização DRD2-cAMP

Em seguida, investigamos se a modificação de DRD2 por Cdk5 afeta as vias de sinalização a jusante. Monitorizámos a inibição mediada por DRD2 da produção de AMPc estimulada por forscolina por adenililciclase nas células que expressam DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP utilizando o imunoensaio enzimático cAMP. As c�ulas que expressam DRD2 mostraram n�eis diminuidos de cAMP em resposta ao quinpirole de um modo dependente da dose. Notavelmente, a co-expressão de Cdk5 / p35 reduziu significativamente a inibição máxima da formação de cAMP (Fig. 4D, painel esquerdo). Por outro lado, nas c�ulas expressando DRD2 S321A-GFP, as forma�es de cAMP foram efectivamente inibidas em resposta ao tratamento com quinpirole independentemente da express� de Cdk5 / p35 (Fig. 4D, painel direito). Estes resultados indicam que a fosforilao mediada por Cdk5 de DRD2 atenua a actividade inibidora de DRD2 na via de sinalizao cAMP a jusante. Para confirmar ainda mais os fenômenos em um cenário mais fisiologicamente relevante, fizemos uso de neurônios primários de cultura de embriões knockout deficientes em p35, um ativador Cdk5 essencial. Os neurónios estriados de cultura primária foram tratados com 1 | iM dopamina e analisados ​​por imunoensaio enzimático cAMP. Neurônios de camundongos nocautes p35 exibiram níveis de cAMP reduzidos em comparação com neurônios do tipo selvagem quando estimulados com dopamina (Fig. 4E). TEm conjunto, concluímos que a fosforilação mediada por Cdk5 de DRD2 resulta numa diminuição do tom inibitório na via do cAMP exercida por DRD2.

Discussão

Identificamos DRD2 como um novo substrato de Cdk5. A fosforilação parece diminuir a expressão da superfície de DRD2 afetando o destino de DRD2 após a internalização do receptor, reduzindo assim DRD2 G_i-acoplamento e via de cAMP a jusante. Como o resíduo de fosforilação S321 existe tanto nas isoformas DRD2 longas quanto nas curtas, o mecanismo proposto neste estudo pode ser um modo geral de regulação na sinalização mediada por DRD2.

DRD2 em neurônios espinhosos médios não só tem sido considerado como um subtipo principal de receptores de dopamina, mas também tem sido reconhecido por sua suscetibilidade a mudanças na disponibilidade em resposta a estímulos ambientais. A dessensibilização e a ressensibilização induzida por agonistas de DRD2 foram extensivamente estudadas , . Em particular, vários estudos mostraram que os efeitos da exposição crônica ao psicoestimulante, como a cocaína e a anfetamina, que elevam o nível extracelular de dopamina na sinapse do corpo estriado, são acompanhados por mudanças dinâmicas de DRD2 pós-sináptica . De fato, sabe-se que os usuários crônicos de cocaína reduziram os níveis de DRD2 na área do estriado, e a disponibilidade de DRD2 no nucleus accumbens (NAcc) mostra uma correlação negativa com os comportamentos de busca e reforço de drogas em camundongos e primatas - . Esses achados indicam que a funcionalidade do DRD2 é altamente suscetível à regulação adaptativa ou compensatória em resposta a vários estímulos, incluindo exposição crônica a medicamentos. Nossos resultados mostram que o resíduo S321 na terceira alça intracelular de DRD2 pode ser fosforilado por Cdk5, o que resulta em uma diminuição na influência inibitória de DRD2 na via do cAMP. Essa interação propõe um novo mecanismo de regulação associado ao Cdk5 em neurônios dopaminoceptivos que podem estar ligados à natureza dinâmica da disponibilidade de superfície do DRD2.

Deve-se notar que Cdk5 é conhecido por ser um componente chave na mediação de mudanças adaptativas do ambiente neuronal. Por exemplo, alterações estruturais e funcionais das espinhas dendríticas nos neurônios do circuito límbico são uma das consequências da exposição repetida ao psicoestimulante . Estas alterações são acompanhadas por várias alterações moleculares, incluindo a indução da proteína de ligação ao elemento de resposta ao AMPc (CREB) e ΔFosB, fatores de transcrição que exibem uma regulação positiva em resposta à administração crônica de cocaína. , . Importante, Cdk5 é um alvo de ΔFosB , e muitos componentes críticos envolvidos na dinâmica da espinha dendrítica, como PSD-95, quinase ativada por p21 (PAK), β-catenina e spinofilina, foram relatados como substratos Cdk5 - . Consistentemente, manipulações genéticas ou farmacológicas da atividade de Cdk5 induzem alterações da morfologia da espinha dendrítica e respostas comportamentais à cocaína, implicando papéis críticos para Cdk5 nas alterações moleculares e morfológicas dos circuitos de dopamina mesolímbica. , . Nossos resultados mostrando que DRD2 é um novo alvo de Cdk5 fornece uma visão adicional sobre as mudanças adaptativas do sistema de dopamina em resposta a exposições crônicas a drogas devido à subseqüente regulação de ΔFosB de Cdk5 pode induzir um aumento tônico na fosforilação de DRD2 . Além disso, DRD2 é conhecido por afetar numerosos processos celulares, incluindo a regulação das vias de cAMP e MAP quinase e eventos de transcrição a jusante. , . Assim, as descobertas neste estudo podem não apenas descrever uma regulação direta de DRD2 por Cdk5, mas também fornecer uma nova visão sobre as respostas adaptativas do sistema de dopamina à exposição crônica a drogas.

Contribuições do autor

Concebeu e desenhou as experiências: JJ YUP DH SKP. Realizou os experimentos: JJ YUP DKK YK. Analisou os dados: JJ YUP DKKSL YK SAL HL YSG DH SKP. Reagentes / materiais / ferramentas de análise: YHS. Escreveu o papel: JJ SKP.