fonte
Departamento de Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles, CA 90033, EUA.
Sumário
O abuso de esteróides anabólicos androgênicos (AAS) é generalizado. Além disso, os AAS estão reforçando, como mostrado pela auto-administração em roedores. No entanto, os receptores que transduzem os efeitos reforçadores dos AAS não são claros. Os AAS podem se ligar aos receptores androgênicos nucleares (ARs) clássicos ou receptores de membrana. Usamos duas abordagens para examinar o papel das ARs nucleares na autoadministração de EAA. Primeiro, testamos a autoadministração de andrógenos em ratos com a mutação de feminilização testicular (Tfm), que interfere na ligação de andrógenos. Se as ARs nucleares forem essenciais para a autoadministração de EAA, os homens Tfm não devem se auto-administrar andrógenos. Os machos Tfm e as ninhadas do tipo selvagem (WT) auto-administraram o di-hidrotestosterona de andrógeno não-aromatizável (DHT) ou o veículo intracerebroventricularmente (ICV) na razão fixa (FR) até o FR5. Tanto os ratos Tfm como WT adquiriram uma preferência pelo nariz ativo durante a autoadministração de DHT (respostas 66.4 +/- 9.6 / 4 h para Tfm e 79.2 +/- 11.5 para respostas WT / 4 h), e os impulsos no nariz aumentaram Requisito de FR aumentado. Os escores de preferência foram significativamente menores no veículo autoadministrável de ratos (42.3 +/- 5.3 / 4 h para Tfm e 19.1 +/- 4.0 / 4 h para WT). Também testamos a autoadministração de DHT conjugada à albumina sérica bovina (BSA) em C3 e C17, que é limitada a ações na superfície celular. Os hamsters foram autorizados a auto-administrar conjugados de DHT, BSA e DHT-BSA durante os dias 15 no FR1. Os hamsters mostraram uma preferência significativa pelos conjugados DHT (18.0 +/- 4.1 / 4 h) ou DHT-BSA (10.0 +/- 3.7 / 4 he 21.0 +/- 7.2 / 4 h), mas não para BSA (2.5 + / -2.4 respostas / 4 h). Tomados em conjunto, estes dados demonstram que ARs nucleares não são necessários para a autoadministração de andrógenos. Além disso, a autoadministração de andrógenos pode ser mediada por receptores de membrana plasmática.
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Esteróides anabólicos androgênicos (AAS) são drogas de abuso. Estes derivados de testosterona (T) são utilizados para fins atléticos e estéticos (Yesalis et al., 1993). Os efeitos colaterais variam de hipogonadismo e ginecomastia a disfunção cardíaca e hepática (Leshner, 2000). Além disso, há evidências de que o abuso de EAA causa alterações de humor (Papa e Katz, 1994), agressão (Choi e Pope, 1994, Kouri et al., 1995), e pode produzir dependência (Brower et al., 1991, Brower, 2002). Apesar das preocupações crescentes, os mecanismos subjacentes do abuso de EAA não foram bem compreendidos.
Em humanos, argumenta-se que o início do uso de AAS é em grande parte motivado por efeitos anabólicos, mas alguns abusadores eventualmente desenvolvem dependência (Brower, 2002). Evidências de pesquisas com animais apóiam essa hipótese. AAS induz preferência de lugar condicionada (CPP) em camundongos (Arnedo e outros, 2000) e ratos (Packard e outros, 1997, Packard e outros, 1998, Frye e outros, 2002). Além disso, hamsters consomem voluntariamente AAS através de oral (Madeira, 2002), intravenosa (Wood et al., 2004) e auto-administração intracerebroventricular (ICV) (DiMeo e Wood, 2004, Triemstra e Madeira, 2004, Wood et al., 2004, DiMeo e Wood, 2006b).
Embora a autoadministração do ICV sugira sítios centrais de ação, os hormônios e receptores específicos que medeiam o reforço do AAS não são claros. Evidências atuais sugerem que os efeitos de reforço de T são mediados por andrógenos, ao invés de estrógenos após a aromatização. Hamsters machos auto-administram diidrotestosterona (DHT; DiMeo e Wood, 2006b) e outros androgénios não aromatizáveis (Ballard e madeira, 2005). Além disso, a auto-administração T é bloqueada pela flutamida anti-andrógeno (Peters e Wood, 2004). A questão agora é: como o sinal androgênico é transduzido no cérebro?
O receptor de andrógeno (AR) é um receptor de esteróide nuclear clássico que funciona como um fator de transcrição. Os ARs são esparsos em estruturas associadas ao abuso de drogas, como o nucleus accumbens (Acb) e a área tegmentar ventral (VTA; Simerly e outros, 1990, Madeira e Newman, 1999). Há também evidências de esteróides gonadais atuando via receptores de superfície celular (Mermelstein et al., 1996, Zhu et al., 2003, Thomas et al., 2006, Vasudevan e Pfaff, 2007).
No presente estudo, usamos duas abordagens para determinar o papel da AR nuclear clássica no reforço andrógeno. Para minimizar a possível ativação dos receptores estrogênicos (ER), testamos a auto-administração da DHT. No primeiro experimento, os ratos com a mutação de feminilização testicular (Tfm) foram testados para a autoadministração de ICT de DHT. Tfm é uma substituição de base única que resulta em ARs defeituosos com ligação limitada de ligantes (Yarbrough et al., 1990). Ratos Tfm machos exibem um fenótipo externo feminino devido à estimulação androgênica insuficiente durante o desenvolvimento (Zuloaga et al., 2008b). Se ARs nucleares funcionais forem necessários para o reforço de AAS, os ratos Tfm não devem auto-administrar DHT. Em vez disso, os ratos Tfm foram capazes de adquirir auto-administração de DHT. No segundo experimento, testamos a autoadministração do ICV de formas de DHT impermeáveis à membrana em hamsters. Quando o DHT é conjugado à albumina sérica bovina (BSA), suas ações são restritas aos receptores da superfície celular. Se as ARs nucleares forem necessárias para o reforço de andrógenos, os hamsters não devem se auto-administrar DHT conjugado com BSA. Pelo contrário, os hamsters mostraram uma clara preferência pelo DHT conjugado à BSA. Juntos, esses estudos mostram que ARs nucleares não são necessários para a autoadministração de andrógenos. Em vez disso, o reforço de andrógeno pode ser mediado por ARs de membrana.
Métodos e Materiais
Assuntos
Ratos
Ratos Tfm machos adultos e ninhadas de tipo selvagem (WT) foram obtidos de uma colônia na Michigan State University. Seu genótipo foi verificado por PCR, similar aos métodos descritos anteriormente (Fernandez et al., 2003). Resumidamente, os clipes auriculares foram digeridos durante a noite a 55 ° C em tampão de lise contendo proteinase K, depois inactivado por calor a 95 ° durante 30 minutos. O AR foi amplificado utilizando o iniciador directo 5 '-GCAACTTGCATGTGGATGA-3' e o iniciador inverso 5 '-TGAAAACCAGGTCAGGTGC-3', produzindo um produto 135bp. As amostras amplificadas foram então digeridas com a enzima de restrição Sau96I (R0165L, New England BioLabs, Ipswich, MA) durante a noite a 37 ° C e corridas num gel de agarose 3%. Apenas o WT AR é cortado com esta enzima de restrição, deixando duas bandas abaixo de 100bp, enquanto o Tfm AR permanece sem cortes. Os animais Tfm também foram verificados por fenótipo, pela presença de mamilos, distância anogenital feminina e testículos abdominais. Ratos Tfm foram previamente utilizados para demonstrar efeitos androgênicos não genômicos no hipocampo (MacLusky e outros, 2006). No início da experiência, os ratos WT estavam entre 75 e 140 com um dia de idade e os ratos Tfm estavam entre 75 e 138 com um dia de idade.
Hamsters
Hamsters sírios machos adultos (130 - 150 g) foram obtidos de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Os animais foram alojados individualmente num ciclo de luz invertida (14L: 10D) com alimentos e água disponíveis ad libitum. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados por instituições de cuidados com animais e utilizam comitês das respectivas instituições e conduzidos de acordo Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (NationalResearchCouncil, 1996).
Cirurgia
Todos os animais foram implantados com uma cânula de guia de aço inoxidável 22g (Plastic One, Roanoke, VA) no ventrículo lateral [rato: AP: 0.7, ML: -1.8, DV: -4.0-5.0 (Paxinos e Watson, 1998); hamster: AP: + 1.0, ML, + 1.0, DV: -3.0 ∼ -5.0 (Morin e Madeira, 2001), mm de bregma], sob Na+ anestesia pentobarbital (rato: 50 mg / kg, hamster: 100mg / kg) como descrito anteriormente (Wood et al., 2004). Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob condições assépticas de acordo com Princípios do Cuidado Animal de Laboratório (NIH, 1985). Os animais foram autorizados a recuperar por pelo menos uma semana após a cirurgia antes do teste.
Drogas
DHT, DHT-carboximetil-oxima (CMO), DHT-CMO-BSA, DHT-hemisuccinato (Hemis) e DHT-Hemis-BSA foram obtidos de Steraloids (Newport, RI). Em DHT-CMO-BSA, DHT é conjugado a BSA na posição C3 com CMO como o ligante. Da mesma forma, DHT está ligado à BSA na posição C17 via Hemis para formar DHT-Hemis-BSA. Ambos DHT-CMO-BSA (Gatson e outros, 2006) e DHT-Hemis-BSA (Braun e Thomas, 2003) foram previamente utilizados para investigar possíveis efeitos dos andrógenos na membrana plasmática. O DHT foi dissolvido numa solução aquosa de 13% β-ciclodextrina (βCD, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 1μg / μl. Conforme determinado pelo nosso estudo anterior em hamsters, esta dose produz um robusto operante que responde durante a autoadministração da ICV (DiMeo e Wood, 2006b). Derivados de DHT foram dissolvidos no mesmo veículo na concentração equivalente molar de DHT (DHT-CMO: 1.25 μg / μl, DHT-CMO-BSA: 8.7 μg / μl, DHT-Hemis: 1.34 μg / μl, DHT-Hemis-BSA : 8.83μg / μl). A BSA (Sigma-Aldrich) foi dissolvida no mesmo veículo a 7.45 μg / μl para atingir a concentração equivalente molar de BSA como em DHT-CMO-BSA e DHT-Hemis-BSA. Os medicamentos contendo BSA foram preparados diariamente, imediatamente antes da sua utilização, para evitar a degradação, e todas as soluções foram filtradas através de um filtro 0.22 μm. Estudos anteriores mostraram que apenas uma pequena proporção de esteróides se dissocia da BSA (Stevis et al., 1999), e essa quantidade é insuficiente para induzir efeitos androgênicos significativos (Lieberherr e Grosse, 1994, Gatson e outros, 2006). Do mesmo modo, o nosso estudo anterior demonstrou que o DHT é auto-administrado a 1.0 μg / μl, mas não a 0.1 μg / μl (DiMeo e Wood, 2006b) Portanto, é improvável que o DHT livre (> 10%) se dissocie da BSA em quantidade suficiente para suportar a autoadministração.
Aparelho
Permitiu-se que os animais auto-administrassem uma solução de fármaco ou veículo 4 horas / dia, 5 dias / semana numa câmara operante (Med Associates, St. Albans, VT) encerrada numa câmara de atenuação acústica com ventilação forçada. Cada câmara era equipada com furos de nariz em forma de 2 e uma bomba de seringa controlada por computador ligada a um giro líquido em um braço de equilíbrio. Soluções de uma seringa de vidro 100 μl foram entregues ao animal através de tubos Tygon ligados à articulação. A tubagem que liga a articulação e a cânula ICV estava protegida por uma mola de metal. Solução de droga ou veículo foi entregue através de uma cânula interna 28-ga inserida na cânula guia imediatamente antes do teste. Cada perfusão administrou 1 μl de solução a 0.2 μl / s. Furos de nariz foram localizados 6 cm do chão sob a luz da casa. Um dos orifícios de perfuração do nariz foi designado como o orifício ativo de perfuração do nariz. Uma resposta neste buraco foi registrada como uma estimulação do nariz ativa (R: ativa-reforçada) e contada para o requisito de resposta (FR1 a 5) para desencadear uma infusão. Uma vez iniciada a infusão, a luz da casa foi apagada e o orifício ativo foi iluminado durante a infusão do 5-s para auxiliar na discriminação do orifício ativo do nariz-puxão. Nariz-cutucando no buraco ativo durante este 5-s período de tempo limite foi registrado mas não contou para reforço adicional (NR: ativo-não-reforçado). Uma resposta no outro orifício de puxão do nariz foi registrada como uma injeção inativa (I), mas não resultou em qualquer infusão. A localização do orifício do nariz para frente ou para trás da câmara foi balanceada para controlar as preferências laterais. Os dados foram gravados pelo software WMPC (Med Associate) em um PC com Windows.
Autoadministração de ICV
Ratos
A auto-administração de DHT em ratos Tfm e WT seguiu um esquema de taxa fixa ascendente (FR) de FR1 para FR5. Inicialmente, os ratos foram treinados em FR1, onde cada resposta no nariz ativo foi reforçada. Posteriormente, o número de respostas necessárias para obter uma infusão foi aumentado em um a cada 5 dias. No FR5, cinco respostas no orifício ativo foram necessárias para uma infusão. Em geral, os ratos foram testados em FR1 por 10 dias e FR2 em FR5 (5 dias cada), para um total de 30 dias. Os ratos de cada genipo foram aleatoriamente designados para grupos DHT ou veulo (Veh) e autorizados a auto-administrar DHT ou o veulo? CD, respectivamente. Trinta e seis ratos (nWT = 19, nTfm = 17) foram utilizados neste experimento.
Hamsters
Hamsters foram testados sob um cronograma FR1 para 15 dias. Em estudos prévios, os dias 15 de autoadministração de ICV T são suficientes para adquirir uma preferência pelo toque de nariz ativo. Hamsters foram aleatoriamente designados para DHT (n = 8), DHT-CMO (n = 9), DHT-CMO-BSA (n = 10), DHT-Hemis (n = 11), DHT-Hemis-BSA (n = 8 ), ou grupos BSA (n = 9).
A análise dos dados
Ratos
Os escores diários de preferência para o nariz ativo foram determinados pela subtração de "nose-pokes" inativos da soma dos "nose-pokes" não reforçados e ativos (R + NR-I). A pontuação média de preferência foi calculada para cada animal dos últimos 5 dias de FR1 e durante FR2 para FR5. Além disso, o número médio de reforços por sessão para cada animal em cada FR foi comparado.
Os dados foram analisados por ANOVA 3-way, com genótipo (WT ou Tfm), droga (DHT ou veículo) e horário FR (1 ∼ 5) como fatores entre os indivíduos. O esquema de FR foi tratado como um fator intermediário, uma vez que alguns animais não conseguiram completar todos os dias de teste 30 devido ao entupimento da cânula guia do ICV. Nesses casos, apenas os dados dos cronogramas concluídos foram incluídos nas análises. O número de animais incluídos em cada condição é mostrado tabela 1. Um ANOVA de três vias foi seguido por ANOVAs de ordem inferior apropriadas para efeitos simples. O teste de Newman-Keuls para comparações de pares post-hoc foi usado quando necessário.
tabela 1
Hamsters
As médias individuais de R, NR e I foram usadas para análise de dados. O escore de preferência para cada animal foi determinado subtraindo-se a média inativa do nariz-cutucada (I) do estímulo nasal médio (R + NR-I). O escore médio de preferência foi analisado com uma amostra t-test contra 0 (ou seja, sem preferência) para cada grupo. Além disso, o número de reforços recebidos foi calculado em média para cada animal. A armadura média recebida para cada grupo de droga foi comparada com a dos controles de BSA com amostras independentes de 2 t-teste. Os animais que não conseguiram completar um mínimo de sessões 5 foram excluídos da análise (1 de cada um dos grupos DHT-Hemis e DHT-Hemis-BSA).
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 12 (SPSS Inc., Chicago, IL). Para toda análise, p <0.05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados são apresentados como média ± SEM por sessão de 4h.
Consistentes
Ratos WT e Tfm auto-administram DHT
Resposta operante
Figs. 1 ilustra a preferência média por cutucada ativa no nariz (R + RN - I) em cada FR para os grupos DHT e Veh. Ratos autoadministrados com DHT mostraram uma preferência maior pelo nariz ativo (73.1 ± 7.6 resp / 4h), em comparação com os controles de veículo (29.8 ± 3.5 resp / 4h; F1,145 = 31.77, p <0.001). Houve também um efeito principal da programação FR (F4,145 = 4.25, p <0.01), interação genótipo-droga (F1,145 = 5.27, p = 0.02) e uma interação de programação droga-FR (F4,145 = 2.60, p = 0.02). Não houve efeito principal do genótipo, e outras interações não foram significativas.
Testes post-hoc revelaram que os ratos auto-administrados DHT mostraram uma preferência significativamente maior sobre o horário FR (F4,73 = 4.18, p <0.01), aumentando a preferência de FR1 (33.4 ± 4.4 resp / 4h) para FR4 (110.8 ± 26.7 resp / 4h) e FR5 (106.4 ± 18.9 resp / 4h). Nenhum efeito do genótipo foi observado neste grupo (esquema genótipo-FR: F4,73 = 0.13, ns; genótipo: F1,73 = 0.86, ns).
Em contraste, os ratos auto-administrando Veh não mostraram nenhuma mudança na preferência sobre o esquema de FR (F4,72 = 0.31, ns) e nenhuma interação de cronograma genótipo-FR (F4,72 = 0.12, ns). Diferentemente do DHT, os ratos Tfm apresentaram maior preferência do que WT nesse grupo (42.3 ± 5.3 e 19.1 ± 4.0 resps / 4h, respectivamente;4,72 = 11.81, p <0.01).
Infusões
O número médio de infusões de DHT e Veh recebidas em cada FR é mostrado FIG. 2. No geral, os ratos receberam mais infusões quando autorizados a auto-administrar DHT (26.9 ± 2.2 μg / 4h) vs. veículo (15.4 ± 1.9 μl / 4h, F1,145 = 14.70, p <0.001). Houve também um efeito principal da programação FR (F1,145 = 3.32, p = 0.01) e interação genótipo-droga (F1,145 = 6.41, p = 0.01). Todas as outras interações e efeitos principais não foram significativos.
A ingestão diária média de DHT em todos os esquemas de FR foi semelhante nos ratos Tfm (24.3 ± 2.9 μg / 4hr) e WT (29.4 ± 3.4 μg / 4h). Em ambos os grupos, a ingestão de drogas permaneceu constante à medida que o4,73 = 0.54, ns). Durante os homens FR1, Tfm e WT administraram DHT em 24.5 ± 2.3 μg / 4h e 37.3 ± 6.7 μg / 4h, respectivamente. Sob uma programação FR5, a média de auto-administração do DHT foi em média 18.3 ± 4.5 μg / 4h para Tfm e 23.9 ± 5.9 μg / 4h para ratos WT. Este grupo não exibiu diferenças baseadas em genótipo ou genótipo-FR (F1,73 = 1.17, ns; F4,73 = 0.34, ns, respectivamente).
Em contraste, nos ratos Tfm e WT, o número de infusões de veículos diminuiu significativamente à medida que aumentava o requerimento de FR (F4,72 = 4.73, p <0.01). Surpreendentemente, ratos Tfm se auto-administraram aproximadamente duas vezes mais veículo (20.7 ± 2.4 μl / 4h) do que ratos WT (10.7 ± 1.4 μl / 4h, F1,72 = 7.77, p <0.01). Em ratos Tfm em FR1, o número de infusões de veículo (39.9 ± 13.2 μl / 4h) excedeu o número de infusões de DHT (24.5 ± 2.3 μl / 4h). No entanto, ao final do experimento, a autoadministração do veículo diminuiu para 10.3 ± 2.4 μl / 4h. Da mesma forma, ratos WT auto-administraram 18.6 ± 4.1 μl / 4h de veículo em FR1, que diminuiu para 6.6 ± 1.8 μl / 4h em FR5.
O peso corporal médio no início de cada esquema de FR e o número de animais em cada condição é mostrado tabela 1. Os ratos WT foram significativamente mais pesados que os ratos Tfm (F1,174 = 144.62, p <0.001), e todos os grupos ganharam peso ao longo do tempo (F5,174 = 5.59, p <0.001). Não houve efeito da condição da droga (DHT vs Veh) no peso corporal (F1, 174 = 0.31, ns) ou qualquer interação. O consumo de DHT ajustado para o peso corporal foi semelhante em ambos os genótipos tanto em FR1 (WT: 77.9g / kg, Tfm: 65.4g / kg) e FR5 (WT: 46.5g / kg, Tfm: 42.6g / kg).
Hamsters sírios auto-administram DHT conjugado com BSA
Resposta operante
Hamsters auto-administrados DHT e DHT conjugados com BSA, mas não BSA sozinho. Fig. 3a mostra a preferência média (ativo - cutucões inativos no nariz) para DHT, BSA, DHT-CMO-BSA e DHT-Hemis-BSA, DHT-CMO, DHT-Hemis. Consistente com nossos estudos anteriores, os hamsters desenvolveram uma preferência pelo nariz ativo durante a auto-administração de DHT (t7 = 4.34, p <0.01), mas não mostrou preferência ao autoadministrar BSA (t8 = 1.03, ns). Da mesma forma, hamsters mostraram uma preferência para o nariz ativo com DHT-CMO-BSA (t9 = 2.71, p = 0.02) e DHT-Hemis-BSA (t7 = 2.92, p = 0.02). Com DHT ligado a linkers sozinho, hamsters auto-administrados DHT-CMO (t8 = 3.91, p <0.01), mas não mostrou uma preferência significativa ao autoadministrar DHT-Hemis (t10 = 1.87, p = 0.09). Com DHT-Hemis, as respostas no nariz ativo (40.5 ± 10.3 resp / 4h) foram semelhantes às do DHT-Hemis-BSA (41.2 ± 11.4 resp / 4h), mas esses machos também apresentaram respostas aumentadas para o nariz inativo -poke (28.7 ± 6.6 resp / 4h) em comparação com aqueles para DHT-Hemis-BSA (20.3 ± 4.4 resp / 4h).
Infusões
O número de infusões recebidas para cada grupo é mostrado em Fig. 3b. Os hamsters receberam significativamente mais infusões de DHT que de BSA (t15 = 3.04, p = 0.01). Da mesma forma, os hamsters receberam mais infusões quando autorizados a auto-administrar DHT-Hemis-BSA (t15 = 2.72, p = 0.02) ou DHT-CMO (t16 = 2.70, p = 0.02) em comparação com BSA. Os números de perfusões recebidas pelos grupos DHT-CMO-BSA (17.2 ± 3.2 μl / 4hr) e DHT-Hemis (22.7 ± 5.9 μl / 4hr) foram semelhantes aos de auto-administração de DHT, DHT-Hemis-BSA e DHT- CMO. No entanto, os hamsters não receberam significativamente mais DHT-CMO-BSA (t17 = 1.96, p = 0.07) ou DHT-Hemis (t18 = 1.91, p = 0.07) em comparação com BSA.
Overdose
Onze dos hamsters 55 morreram antes de completar todas as sessões de teste 15. Mortes por overdose de androgênio durante a autoadministração de testosterona já foram descritas anteriormente (Peters e Wood, 2005). No presente estudo, 2 de homens 8 (25%) morreu durante a auto-administração de DHT, semelhante ao 24% relatado para overdose de testosterona (Peters e Wood, 2005). Auto-administração de DHT-CMO e DHT-Hemis foram associadas com as maiores perdas (cada 3 de 8 por grupo, 38%), enquanto houve poucas mortes entre hamsters auto-administrados BSA (1 de 9, 11%) ou DHT -Hemis-BSA (0 de 8). Como com a overdose de testosterona, nenhum dos hamsters no presente estudo morreu durante a auto-administração. Em vez disso, hamsters morreram várias horas depois em suas gaiolas, com depressão respiratória e locomotora grave.
A sobredosagem de testosterona está intimamente relacionada com a ingestão de testosterona, particularmente a ingestão máxima por sessão (Peters e Wood, 2005). FIG. 4 compara as pontuações de preferência, o número de reforços recebidos e o pico de consumo para os hamsters que completaram todas as sessões de teste 15 e aqueles que não o fizeram. Ambos os grupos mostraram uma preferência significativa pelo nariz ativop <0.05). No entanto, a preferência foi significativamente maior em hamsters que morreram durante a auto-administração (25.7 ± 5.2 resp / 4h) em comparação com aqueles que sobreviveram (9.5 ± 2.0 resp / 4h, t53 = 3.42, p <0.01). Hamsters que não conseguiram completar 15 sessões receberam mais de duas vezes mais infusões por sessão (31.2 ± 5.0 inf / 4h) do que aqueles que completaram todas as sessões (14.8 ± 1.1 inf / 4h, t53 = 5.05, p <0.001). Além disso, para hamsters que morreram durante o estudo, a ingestão máxima por sessão foi significativamente maior (77.0 ± 9.8 inf / 4h) do que para os machos que sobreviveram (36.1 ± 2.9 inf / 4h, t53 = 5.41, p <0.001).
Discussão
A autoadministração de andrógenos pode ser mediada por receptores associados a membrana, mas não por receptores nucleares de andrógenos
O presente estudo demonstra que ARs nucleares clássicos não são essenciais para a autoadministração de andrógenos. Ambos os ratos Tfm e WT desenvolveram uma preferência para o nariz ativo durante a auto-administração de DHT. Além disso, eles foram capazes de responder ao esquema ascendente de FR, aumentando o número de arremetidas do nariz ativas, mantendo, assim, um nível estável de ingestão de drogas, independentemente do esquema FR. Em contraste, os ratos que recebiam veículos falharam em responder às mudanças na programação do FR. Seus narizes ativos não aumentaram significativamente em resposta a mudanças no esquema FR, e eles receberam menos infusões à medida que aumentava o requerimento de resposta. Como a ligação do ligante ao receptor de androgênio nuclear “clássico” está comprometida em mutantes de Tfm, isso sustenta nossa hipótese de que o reforço de andrógeno é mediado por vias alternativas.
É improvável que a resposta inesperadamente alta para veículos por ratos Tfm seja devida ao próprio veículo. Observamos fenômenos semelhantes em um grupo separado de ratos Tfm que não estavam recebendo nenhuma infusão (dados não mostrados). Em vez disso, pode estar relacionado a traços comportamentais feminizados nos homens do Tfm. O aumento do número de "nose-pokes" por ratos Tfm pode ser análogo às maiores depressões exploratórias observadas em ratos fêmeas (Marrom e Nemes, 2008). Alternativamente, sabe-se que os ratos e camundongos Tfm exibem comportamentos intensos semelhantes à ansiedade (Zuloaga et al., 2006, Zuloaga e outros, 2008a). Talvez, os efeitos sedativos / ansiolíticos do DHT (Agren et al., 1999, Arnedo e outros, 2000, Frye e Seliga, 2001, Berbos e outros, 2002, Peters e Wood, 2005) atenuou os comportamentos ansiosos quando os ratos Tfm se auto-administraram DHT.
Além disso, a auto-administração de conjugados DHT-BSA em hamsters machos fornece evidências de que os andrógenos podem atuar na membrana plasmática neuronal para ter ação reforçadora. Hamsters exibiram uma preferência significativa por ambos os conjugados de DHT-BSA. As doses auto-administradas estão de acordo com os nossos estudos anteriores em T, DHT e esteróides comumenteBallard e madeira, 2005, DiMeo e Wood, 2006b). Em contraste, os hamsters não mostraram preferência pela BSA isoladamente. Os dados sobre mortalidade e consumo de drogas demonstram que a DHT e seus derivados podem ser letais, estendendo nossos dados anteriores sobre a overdose de T (Peters e Wood, 2005).
O presente estudo revela um padrão específico de espécie de resposta operante. Hamsters não preferiram o nariz ativo enquanto se auto-administravam veículo, como demonstrado anteriormente (Johnson e Wood, 2001, Madeira, 2002, DiMeo e Wood, 2004, Triemstra e Madeira, 2004, Wood et al., 2004, Ballard e madeira, 2005, DiMeo e Wood, 2006b). Em ratos, no entanto, houve uma clara preferência pelo nariz ativo, independentemente da droga recebida. Observamos uma tendência semelhante em nosso estudo anterior sobre a autoadministração IV de T em ratos, embora não tenha sido estatisticamente significativa (Wood et al., 2004). Com base na diferença comportamental específica da espécie na autoadministração, deve-se ter cautela ao comparar dados comportamentais de ratos e hamsters.
Existem várias ressalvas que precisam ser consideradas na interpretação do presente estudo. Em primeiro lugar, ARs nucleares com ligação do ligando significativamente diminuída ainda estão presentes em ratos Tfm (Yarbrough et al., 1990), ao contrário dos ratos Tfm (Ele et al., 1991). É possível que estas ARs nucleares mutadas sejam suficientes para mediar os efeitos dos andrógenos em doses suprafisiológicas. Em segundo lugar, os conjugados de DHT-BSA podem degradar in vivo, resultando em DHT livre. Embora isso não pareça ser um problema significativo in vitro (Lieberherr e Grosse, 1994, Gatson e outros, 2006), o grau e o tempo de degradação do DHT-BSA in vivo no cérebro é atualmente desconhecido. Finalmente, os conjugados de DHT-BSA podem não penetrar significativamente no tecido cerebral. A DHT-BSA é significativamente maior do que a DHT, portanto, os efeitos da DHT-BSA observados no estudo atual provavelmente serão mediados em locais próximos aos ventrículos.
Apesar dessas ressalvas, essas duas abordagens diferentes produziram resultados consistentes que argumentam fortemente contra a necessidade de AR nuclear no reforço andrógeno. Além disso, a auto-administração de conjugados de BSA sugere que os andrógenos podem atuar na membrana plasmática no reforço de andrógeno. Para nosso conhecimento, o estudo atual fornece o primeiro in vivo evidência de efeitos comportamentalmente relevantes dos andrógenos na membrana plasmática.
Os andrógenos exercem rápidos efeitos independentes de AR nuclear na recompensa
Vários outros estudos sobre a recompensa dos andrógenos mostraram resultados consistentes com os efeitos não genômicos ou da membrana plasmática. CPP se desenvolve dentro de 30 min de injeção sistêmica de T (Alexander et al., 1994), um curso de tempo consistente com os efeitos agudos não genômicos de T. CPP também pode ser induzido com infusões intra-Acb de T ou seu metabólito (Packard e outros, 1997, Frye e outros, 2002), embora o Acb tenha poucos AR genómicos. Além disso, o VTA expressa Fos em resposta à infusão de ICV T (Dimeo e Madeira, 2006a), apesar da falta de expressão AR clássica significativa. O presente estudo não fornece informações sobre o local de ação no cérebro. No entanto, indica que a falta relativa de AR nuclear por si só não é razão suficiente para excluir estruturas como Acb e VTA dos locais potenciais que podem mediar os efeitos androgênicos.
Os efeitos rápidos da membrana plasmática dos esteroides no estriado dorsal e ventral não estão limitados aos andrógenos. Sabe-se que as progestinas induzem a CPP, possivelmente através dos receptores do ácido gama-aminobutírico (GABA) em Acb (Frye, 2007). Os estrogênios também exercem efeitos rápidos mediados por receptores de membrana no estriado dorsalMermelstein et al., 1996, Becker e Rudick, 1999). Um receptor associado à membrana já foi isolado para progestágenos (Zhu et al., 2003), e evidências estão se acumulando para receptores de superfície celular para estrogênios (revisado em Vasudevan e Pfaff, 2007) e andrógenos (revisto em Thomas et al., 2006). Embora os estrogênios também estejam reforçandoDiMeo e Wood, 2006b), os efeitos reforçadores do T parecem ser predominantemente androgênicos. Hamsters auto-administram andrógenos não-aromatizáveis, como drostanolona e DHT (Ballard e madeira, 2005, DiMeo e Wood, 2006b). Além disso, a flutamida anti-andrógeno pode bloquear a autoadministração de T (Peters e Wood, 2004). Embora isso possa parecer contradizer o papel da AR da membrana relatado neste estudo, foi relatado que a flutamida bloqueia também a ativação da AR da membrana (Braun e Thomas, 2003, Braun e Thomas, 2004).
As propriedades dos receptores androgênicos de membrana
Historicamente, os efeitos dos esteróides, incluindo andrógenos, foram considerados transduzidos por processos mediados por receptores nucleares. No entanto, relatos de efeitos rápidos de andrógeno, presumivelmente mediados por receptores associados à membrana, estão disponíveis há várias décadas. Por exemplo, na área pré-óptica medial, os andrógenos podem alterar o disparo neuronal em segundos (Yamada, 1979) a minutos (Pfaff e Pfaffmann, 1969). Além disso, Orsini e colegas (Orsini, 1985, Orsini et al., 1985) mostraram uma rápida modificação da freqüência de disparo neuronal por andrógenos no hipotálamo lateral (LHA). Este efeito dos andrógenos na LHA pode ser de particular relevância para o presente estudo, já que a LHA é conhecida por estar envolvida no circuito de recompensa (Olds e Milner, 1954) e LHA orexina / hipocretina é regulada por esteróides gonadais (Muschamp et al., 2007).
Os tipos de células com possíveis ARs de membrana incluem glial (Gatson e outros, 2006), gonadal (Braun e Thomas, 2003, Braun e Thomas, 2004) e células imunes (Benten et al., 1999, Guo et al., 2002), miócitos (Estrada et al., 2003) e osteoblastos (Lieberherr e Grosse, 1994). Embora a identidade molecular ainda tenha que ser determinada, os candidatos para a membrana AR incluem receptores de membrana com sítios conhecidos de ligação a esteróides, como o GABA-A (revisto em Lambert et al., 2003) e subunidades NR2 dos receptores do ácido N-metil-D-aspártico (Malayev et al., 2002). Alternativamente, Thomas e seus colegas (2004) relataram evidências de um novo receptor acoplado à proteína G como uma AR de membrana. Além disso, os efeitos dos andrógenos não relacionados a um receptor específico não podem ser excluídos no estudo atual.
Recentes in vitro estudos sugerem que existem múltiplas ARs de membrana, ou mais de um sítio de ligação em um único receptor, como proposto para o receptor de progesterona de membrana (Ramirez et al., 1996). Em muitos tipos de células, a AR da membrana parece ser um receptor de membrana acoplado a Gq / o (Lieberherr e Grosse, 1994, Benten et al., 1999, Zhu et al., 1999, Guo et al., 2002, Estrada et al., 2003). No entanto, as características de ligação a esteróides e a sensibilidade aos anti-andrógenos da AR putativa da membrana variam muito dependendo do tipo de célula. Por exemplo, anti-andrógenos podem bloquear os efeitos da DHT em células ovarianas de corvina (Braun e Thomas, 2003, Braun e Thomas, 2004), embora não sejam eficazes em outros tipos de células (Lieberherr e Grosse, 1994, Benten et al., 2004, Gatson e outros, 2006), ou pode mesmo exercer efeitos semelhantes aos agonistas nas células do hipocampo (Pike, 2001, Nguyen et al., 2007) e várias linhas celulares de cancro (Peterziel et al., 1999, Zhu et al., 1999, Evangelou et al., 2000, Papakonstanti e outros, 2003). Além disso, foram reportadas diferentes características de ligação a T para diferentes órgãos em peixes (Braun e Thomas, 2004).
A nossa experiência com AAS comumente abusivo indica que grandes modificações no anel A (no C2 e / ou C3) e no C17 tendem a interferir na auto-administração (Ballard e madeira, 2005). Por exemplo, o stanozolol, que tem uma modificação importante no C2 e no C3, bem como um grupo metil ligado ao C17, não é autoadministrado. No presente estudo, os hamsters auto-administraram ambos BSA conjugados em C3 (DHT-CMO-BSA) e C17 (DHT-Hemis-BSA). Mais pesquisas são necessárias para elucidar as características dos andrógenos auto-administrados.
Significado clínico
AAS, especialmente T, são de longe os agentes de aumento de desempenho mais comuns usados pelos atletas, respondendo por quase metade dos testes positivos de doping (Agência Mundial Antidopagem, 2006). Dada tal uso disseminado, o abuso de EAA tem amplas conseqüências para a saúde. Os efeitos colaterais cardíacos e hepáticos do abuso de EAA estão bem estabelecidos (Leshner, 2000). Acredita-se que estes e os efeitos anabólicos dos EAA sejam mediados pela AR nuclear. No entanto, os possíveis efeitos nucleares independentes de AR de andrógenos sugerem que a influência dos EAA pode se estender muito além das estruturas com expressão de AR nuclear.
Na medida em que se assemelham a outras drogas de abuso, os AAS produzem diferentes efeitos e possuem diferentes mecanismos de ação dos estimulantes. Ao contrário dos estimulantes (Graybiel et al., 1990), O AAS induz a ativação de c-Fos apenas na VTA e não na Acb (Dimeo e Madeira, 2006a). Além disso, o AAS atenua a liberação de Acb DA induzida por estimulantes (Birgner e outros, 2006) e inibem a liberação de DATriemstra et al., 2008). Comportamentalmente, os AAS não induzem a ativação locomotora característica dos estimulantes (Peters e Wood, 2005).
Em vez disso, as respostas comportamentais aos AAS agudos assemelham-se às dos opioides ou benzodiazepínicos, possivelmente exercendo efeitos aditivos quando tomados em conjunto. A exposição aguda ao AAS deprime as funções autonômicas, incluindo a respiração e a temperatura corporal (Peters e Wood, 2005). A depressão autonómica induzida por AAS é reminiscente dos sintomas de sobredosagem com opiáceos e é bloqueada pelo antagonista opiáceo naltrexona (Peters e Wood, 2005). Além disso, a nandrolona, um AAS comumente usado, potencializa os efeitos hipotérmicos da morfina e exacerba os sintomas de abstinência de morfina precipitada pela naloxona (Celerier et al., 2003). Além disso, está bem estabelecido que os AAS agudos são sedativos / ansiolíticos (Agren et al., 1999, Arnedo e outros, 2000, Frye e Seliga, 2001, Berbos e outros, 2002, Peters e Wood, 2005), possivelmente mediados por seus efeitos diretos sobre os receptores GABA-A (Masonis e McCarthy, 1995, Masonis e McCarthy, 1996). O aumento do consumo de etanol em ratos cronicamente tratados com AAS também pode ser um reflexo da função GABAérgica alterada (Johansson et al., 2000).
Nossas descobertas sobre overdose levantam uma preocupação adicional com a saúde. Atualmente, a classificação dos AAS como substâncias de controle é baseada em suas propriedades anabolizantes (Lei de Substâncias Controladas, 1991). No entanto, o presente estudo demonstra que a eficácia anabólica dos EAA não corresponde necessariamente às suas propriedades de reforço e riscos de overdose. Além dos conjugados de DHT-BSA, o DHT-CMO usado neste estudo não é uma substância controlada, embora suas propriedades de reforço e mortalidade de sua overdose pareçam ser bastante semelhantes ao DHT e T (Peters e Wood, 2005). O padrão de sobredosagem também se assemelhou ao anteriormente relatado para T (Peters e Wood, 2005), onde a alta ingestão resultou em mortalidade 24 para 48 horas mais tarde. À luz desses achados, os critérios usados para programar um esteroide como substância controlada podem exigir revisões que levem em conta sua responsabilidade pelo abuso e toxicidade, além de sua potência anabólica.
Os resultados do presente estudo sugerem que a AR nuclear, a única AR isolada até o momento, não é essencial para o reforço andrógeno. Em vez disso, os resultados sugerem que o reforço de andrógeno é transduzido na membrana plasmática. Assim, investigações adicionais sobre a identidade da AR putativa da membrana, suas características funcionais e distribuição anatômica são necessárias para elucidar o mecanismo subjacente do abuso de AAS e suas implicações clínicas.
Notas de rodapé
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