Processamento Convergente de Sinais Motivacionais Positivos e Negativos pelas Populações Neuronais de Dopamina VTA (2011)

Citação: Wang DV, Tsien JZ (2011) Processamento Convergente de Sinais Motivacionais Positivos e Negativos pelas Populações Neuronais de Dopamina VTA. PLoS ONE 6 (2): e17047. doi: 10.1371 / journal.pone.0017047

Editor: Hiromu Tanimoto, Instituto Max-Planck de Neurobiologia, Alemanha

Recebido: Novembro 9, 2010; Aceitaram: Janeiro 19, 2011; Publicado em: 15 de fevereiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Wang, Tsien. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença de Atribuição da Creative Commons, que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor e a fonte originais sejam creditados.

Financiamento: Este trabalho foi financiado por fundos do NIMH (MH060236), NIA (AG024022, AG034663 e AG025918), USAMRA00002 e Georgia Research Alliance (todos para JZT). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.

Introdução

Neurônios dopaminérgicos na área tegmentar ventral (VTA) têm sido tradicionalmente estudados por seus papéis na motivação relacionada à recompensa ou dependência de drogas. - . No entanto, acredita-se que os neurônios da dopamina VTA sejam importantes para a motivação negativa - . Na literatura, o papel do neurônio da dopamina na motivação positiva tem sido bem estabelecido e apoiado por muitos estudos que mostram que a recompensa (por exemplo, comida, suco) e estímulos de recompensa (estímulos condicionados) evocam uma latência curta (50-110 ms) e curta duração (~ 200 ms) atividade de explosão do neurônio dopaminérgico - . A capacidade de resposta desses neurônios da dopamina parece codificar uma ampla gama de eventos novos e relacionados à recompensa por meio de uma regra de erro de previsão - . Também se demonstrou que a atividade da dopamina da VTA desempenha um papel essencial na dependência de drogas: quase todas as drogas viciantes aumentam o nível de dopamina sináptica no nucleus accumbens que recebe insumos dopaminérgicos extensivos da área da ATV - .

O papel do neurônio da dopamina VTA na motivação negativa também foi observado. Vários estudos descobriram que eventos aversivos (por exemplo, infusão oral de quinina ou LiCl) ou estados negativos (por exemplo, abstinência de drogas) podem alterar as concentrações de dopamina em áreas cerebrais inervadas pelos neurônios da dopamina VTA - . Além disso, a interrupção da transmissão da dopamina nas estruturas a jusante do VTA leva a condicionamentos prejudicados a experiências aversivas ou medrosas. , . Além disso, os níveis de dopamina podem apresentar funções opostas no reforço do comportamento: acredita-se que o nível mais baixo de dopamina no núcleo accumbens melhora a punição - mas prejudica a aprendizagem baseada em recompensa, enquanto o nível mais alto de dopamina melhora a recompensa - mas prejudica a aprendizagem baseada em punição . Estes estudos acima sugerem fortemente que os neurônios de dopamina VTA também desempenham um papel importante no processamento de sinais motivacionais negativos. No entanto, o papel exato do neurônio da dopamina VTA na motivação negativa não está totalmente claro.

Por outro lado, estudos recentes descobriram que os neurônios da dopamina na substância negra pars compacta (SNc) podem responder tanto à recompensa (por exemplo, suco) e estímulos aversivos (por exemplo, sopro de ar) quanto a duas populações de neurônios dopaminérgicos SNC. e sinais motivacionais negativos , . No entanto, levantaram-se preocupações sobre se o sopro de ar para as peles, ou a pista condicionada que prevê a ocorrência de sopro de ar, é verdadeiramente aversivo para os macacos, desde que tais atividades sejam consideradas não prejudiciais. . Além disso, os neurônios dopaminérgicos SNc são conhecidos por processar diferentes aspectos da informação, e com distintos circuitos neurais de input-output quanto ao VTA. . Portanto, há um forte interesse em investigar se e como os neurônios de dopamina VTA processam experiências negativas, e se há populações distintas de neurônios de dopamina dedicando-se a processar informações positivas e negativas.

Para abordar essas questões importantes, empregamos o registro extracelular de múltiplos tetrodes em camundongos de comportamento livre e usamos dois tipos de eventos robustos e assustadores (queda livre e tremor). como uma maneira de estudar o papel dos neurônios VTA no processamento de sinais motivacionais negativos. Nós também treinamos camundongos para emparelhar um tom neutro com a entrega subsequente de alimentos, o que nos permitiu investigar como a mesma população de neurônios de dopamina VTA pode processar sinais de movimento positivo. Além disso, como as informações de contexto são parte integrante de muitas experiências gerais, perguntamos se e como os contextos ambientais podem desempenhar um papel na discriminação de informações recompensadoras ou aversivas. A esse respeito, realizamos ainda um conjunto de experimentos em que treinamos camundongos para emparelhar um único tom com recompensa alimentar e evento de medo, mas em diferentes contextos, o que nos permitiu determinar como as respostas neurais da dopamina VTA condicionada foram intrinsecamente influenciadas por o contexto ambiental. Nossos resultados sugerem que os neurônios de dopamina VTA podem empregar a estratégia de codificação convergente para o processamento de experiências positivas e negativas.

Consistentes

Classificação de neurônios putativos de dopamina

Implantamos feixes móveis de 8 tetrodos (32 canais) no VTA do hemisfério direito de camundongos, e as posições dos eletrodos de registro foram confirmadas por histologia no final de nosso experimento (Figura 1A). Dados de camundongos 24 dos quais registramos supostos neurônios de dopamina foram utilizados nas análises atuais. Um total de unidades 210 com formas de onda de pico claras foram gravadas a partir desses camundongos 24 (para exemplos de unidades bem isoladas, ver Figura S1). Destes, as unidades 96 foram classificadas como supostos neurônios dopaminérgicos com base em seus padrões de Materiais e Métodos), e as outras unidades 114 foram assim classificadas como neurônios não-dopaminérgicos. Os supostos neurônios de dopamina classificados exibem tipicamente amplos potenciais de ação trifásicos (Figura 1B, vermelho), embora com variação, enquanto os neurônios não-dopamina exibiram potenciais de ação mais trifásicos ou bi-fásicos (Figura 1B, azul e preto, respectivamente). É importante ressaltar que apenas neurônios com baixas taxas de disparo de linha de base (0.5-10 Hz; Figura 1C), intervalo inter-pico relativamente longo (> 4 ms) e padrão de disparo regular foram classificados como neurônios de dopamina putativos. Em contraste, os neurônios classificados como não dopaminérgicos normalmente exibiam uma taxa de disparo inicial mais alta (> 10 Hz; Figura 1C) e / ou modulação significativa na taxa de disparo durante o movimento, em relação à vigília silenciosa - .

Três tipos de neurônios putativos de dopamina VTA responsivos ao medo

Usamos dois tipos de eventos robustos de medo (queda livre e tremor) para examinar como os neurônios VTA podem responder a experiências negativas . Depois que os camundongos se recuperaram das cirurgias e as gravações estáveis ​​foram obtidas (geralmente 1 ~ 2 semanas após a cirurgia), iniciamos os experimentos. Cada camundongo foi colocado em uma câmara de queda livre ou câmara de agitação, onde cerca de ensaios 20 de eventos de queda livre ou tremor foram dados em cada sessão com um intervalo de 1-2 min entre os ensaios (Figura 2A). O intervalo entre sessões é tipicamente 1 – 2 horas. Sempre monitoramos a estabilidade das unidades registradas examinando as formas das formas de onda de pico, o status de disparo da linha de base e as distribuições dos grupos de picos antes e depois dos eventos, bem como por meio de todos os experimentos. Avaliamos que não houve perda temporária de unidades durante os dois eventos de medo examinando unidades gravadas simultaneamente (por exemplo, duas unidades registradas a partir do mesmo tetrode mostrando mudanças de queimadas opostas) (Figura S2). Também garantimos que nenhum ruído artificial, elétrico ou mecânico, fosse incluído nos dados registrados, avaliando as ondas antes, durante e após os eventos de medo (Figura S3). No geral, esses supostos neurônios dopaminérgicos (n = 96) foram amplamente divididos em três tipos principais com base em suas propriedades de resposta aos dois eventos de medo: tipo 1 (59%, 57 / 96), tipo 2 (13%, 12 / 96) e tipo 3 (25%, 24 / 96).

Os neurônios putativos de dopamina do tipo 1 VTA mostraram não apenas supressão significativa de sua ativação nas respostas aos eventos de queda livre e de tremor (Figura 2Apainéis esquerdo e médio) (P<0.05, teste dos postos sinalizados de Wilcoxon), mas também uma forte excitação de ressalto de deslocamento no término de ambos os eventos. Definimos a excitação de rebote como a taxa de disparo de pico de deslocamento (suavizada com um filtro Gaussiano) sendo pelo menos duas vezes maior do que a taxa de disparo de linha de base e com pontuações z maiores do que 2. Tal excitação de rebote pode sinalizar a segurança no final de eventos assustadores ou uma motivação por tais eventos. Em seguida, perguntamos se esses neurônios dopaminérgicos tipo 1 respondiam aos sinais de recompensa. Ao emparelhar repetidamente um tom neutro com a entrega subsequente de uma bolinha de açúcar, descobrimos que esses neurônios também aumentaram significativamente seu disparo para o tom condicionado que previa recompensa de forma confiável (Figura 2A, painel direito). Portanto, esses neurônios dopaminérgicos tipo 1 eram responsivos a sinais de recompensa e negativos.

Os neurônios de dopamina tipo 2 VTA mostraram supressão significativa (P<0.05, teste de classificação sinalizada de Wilcoxon) durante queda livre ou tremor, mas eles não tiveram ativação de rebote após o término desses eventos (escores z <2) (Figura 2Bpainéis esquerdo e médio). Semelhante aos neurônios putativos de dopamina do tipo 1, esses neurônios do tipo 2 aumentaram significativamente seu disparo para o tom condicionado que previa confiavelmente a recompensa (Figura 2B, painel direito). Assim, os neurônios dopaminérgicos tipo 1 e 2 tipo XNUMX exibem modulação bidirecional pelos eventos negativos e positivos, isto é, eles diminuem seu disparo para os eventos de medo enquanto aumentam seu disparo para os sinais de recompensa.

Curiosamente, também registramos um terceiro tipo de neurônios semelhantes a dopaminérgicos, que compartilhavam mais similaridade com os supostos neurônios dopaminérgicos do tipo 1 / 2 do que com os neurônios não-dopaminérgicos. Esses neurônios do tipo 3 (cerca de 25% de todos os supostos neurônios dopaminérgicos registrados) aumentaram seu disparo para eventos de queda livre e tremor (Figura 2Cpainéis esquerdo e médio) (P<0.05, teste dos postos sinalizados de Wilcoxon). Seu aumento de disparos foi normalmente seguido por uma supressão de compensação. Além disso, esses neurônios de dopamina tipo 3 também podem aumentar seu disparo em resposta ao tom condicionado que previu a recompensa (Figura 2C, painel direito). Esses neurônios do tipo 3, que aumentaram seu disparo para eventos positivos e negativos, são bem distintos dos neurônios dopaminérgicos tipo 1 e tipo 2. Isso sugere fortemente a diversidade da população de neurônios de dopamina VTA , .

Globalmente, os neurónios tipo 1 e tipo 2 constituem a maioria (72%) da população neuronal de dopamina putativa de VTA registada, enquanto os neurónios tipo 3 constituem cerca de 25%, com os restantes neurónios de dopamina putativos (3%) não responsivos à eventos temerosos (Figura 2D) Além disso, nossas análises sugerem que todas as respostas desses neurônios aos eventos negativos tendem a ser direcionalmente uniformes (45 neurônios testados tanto para queda livre quanto para eventos de tremor), ou seja, neurônios suprimidos (ou ativados) pelo evento de queda livre sempre foram suprimido (ou ativado) por outros eventos de medo, como o evento de sacudidela e vice-versa. Dos neurônios de dopamina suprimidos pelo medo (tipo-1 e tipo-2) que examinamos quanto à sua responsividade aos sinais de recompensa, 96% deles (44/46) mostraram ativação significativa pelo tom de recompensa (Figura 2E) (P<0.05, teste dos postos sinalizados de Wilcoxon). Isso mostra claramente que a grande maioria dos neurônios de dopamina VTA tipo 1 e tipo 2 são capazes de responder bidirecionalmente a eventos positivos e negativos, ou seja, eles mostram excitação por informações de recompensa enquanto supressão por experiências de medo. Por outro lado, cerca de 71% dos neurônios de dopamina putativos do tipo 3 (12/17) que foram ativados por eventos de medo também podem ser ativados pelos sinais de recompensa (Figura 2F) (P<0.05, teste dos postos sinalizados de Wilcoxon). Isso sugere fortemente que os eventos de medo, não apenas a recompensa, podem excitar alguns dos supostos neurônios de dopamina do VTA.

Padrões de queima e caracterização farmacológica

Apesar de suas semelhanças no padrão de disparo e nas formas de onda dos três tipos de neurônios de dopamina putativos (por exemplo, Figura 3A – C), notamos algumas diferenças entre eles. Primeiro, os neurônios dopaminérgicos do tipo 3 exibiram uma probabilidade significativamente menor (9 ± 2.3%, média ± sem) de disparo de rajada em comparação com o tipo de inibidor de dopamina tipo 1 (55.2 ± 2.5%) ou tipo 2 (32.0 ± 3.8%) neurônios (Figura 3D e E). Segundo, os neurônios do tipo 3 mostraram uma taxa de disparo de linha de base muito menor (2.15 ± 0.33 Hz, média ± sem; n = 24) em comparação com o tipo 1 (5.66 ± 0.27 Hz; n = 57) ou tipo 2 Hz; n = 4.92) neurônios (Figura 3F).

Nós também injetamos os ratos com os agonistas do receptor da dopamina apomorfina (1 mg / kg, ip) e / ou quinpirol (1 mg / kg, ip) que foram mostrados principalmente para inibir a atividade do neurônio da dopamina. , , , . Um total de neurónios 77 VTA (incluindo neurónios putativos de dopamina classificados como 33 e neurónios não dopaminérgicos 44) foram testados com os agonistas do receptor da dopamina. Nossos resultados farmacológicos revelaram que a grande maioria (96%; 23 / 24) dos supostos neurônios dopaminérgicos type-1 e type-2 foram significativamente suprimidos, enquanto surpreendentemente os neurônios do tipo 3 (n = 9) mostraram excitação pela apomorfina (Figura 3H). Além disso, neurônios putativos de dopamina classificados como 4 foram testados com apomorfina e quinpirole (em dias diferentes). Estes supostos neurónios de dopamina 4 exibiram respostas semelhantes à apomorfina e ao quinpirol: os neurónios (n = 2) suprimidos pela apomorfina foram também suprimidos pelo quinpirole; neurônios (n = 2) ativados pela apomorfina também foram ativados pelo quinpirole. Em contraste, os neurônios VTA não-dopaminérgicos (n = 44) mostraram muito pouca ou nenhuma alteração na taxa de disparo após a injeção de apomorfina ou quinpirol (Figura 3I).

Respostas de neurônios de dopamina putativos de VTA a diferentes durações e intensidades de eventos de medo

Para entender melhor as propriedades de codificação dos neurônios de dopamina VTA para eventos de medo, realizamos um conjunto de experimentos paramétricos. Diferentes alturas de queda livre (10 e 30 cm) e durações diferentes de agitação (0.2, 0.5 e 1 seg) foram realizadas em ordens aleatórias durante as experiências de gravação. Descobrimos que os neurônios de dopamina VTA exibiram mudanças de atividade dinâmica temporal que foram proporcionais às durações dos eventos de medo. Como mostrado em Figura 4A, os neurónios putativos de dopamina do tipo 1 exibiram uma supressão dependente da duração durante os eventos de queda livre (10 cm vs. 30 cm de altura). A análise da população revelou que, em resposta a eventos de queda livre 10 e 30 cm (Figura 4B), as latências médias de excitação de deslocamento (latência da taxa de disparo de pico com deslocamento suavizado) dos neurônios de dopamina tipo 1 foram 293 ± 38 ms (média ± dp, n = 15) e 398 ± 28 ms (n = 20), respectivamente (P<0.001, aluno t-teste). Estes resultados sugerem que as respostas dos neurônios de dopamina tipo 1 correlacionam com a duração dos eventos de medo (Figura 4B, painel direito). Observou-se que a taxa de disparo do pico do offset foi ligeiramente superior durante o evento de queda livre 30 cm (30.9 ± 6.6 Hz; média ± sd) em comparação com o evento 10 cm (26.3 ± 5.9 Hz) (P = 0.04, Aluno t-teste), sugerindo que as respostas dos neurônios dopaminérgicos tipo 1 VTA a negativos também podem refletir, em menor grau, a intensidade dos eventos de queda livre.

Da mesma forma, esses neurônios do tipo 1 mostraram propriedades de resposta dependentes da duração aos eventos de agitação (Figura 4C e D). As latências médias de excitação de deslocamento foram 374 ± 25 ms (média ± sd, n = 13), 672 ± 52 ms (n = 20) e 1169 ± 35 ms (n = 14) para eventos de oscilação que duraram 0.2, 0.5 e 1 seg, respectivamente (P<0.001, ANOVA de uma via). Aluno de Acompanhamento t-testes apresentaram diferenças altamente significativas para cada comparação (Figura 4D, painel direito). No entanto, não houve diferenças significativas nas taxas de disparo de pico offset ao longo das diferentes durações dos eventos de oscilação (P> 0.05; ANOVA unilateral). Também variamos a intensidade do evento de agitação: os neurônios do tipo 1 exibiram um pico de excitação de deslocamento ligeiramente maior pelos eventos de agitação de alta intensidade em comparação com o de baixa intensidade (Figura 4E e F; 29.1 ± 7.7 vs. 23.5 ± 9.5 Hz, média ± dp). Estes resultados acima sugerem que as respostas dos neurónios putativos de dopamina tipo XAUMX de VTA correlacionam-se com a duração dos eventos de medo e, em menor grau, com a intensidade dos acontecimentos de medo.

Além disso, a duração da excitação dos neurônios dopaminérgicos do tipo 3 também se correlacionou com a duração dos eventos de medo. Em resposta a eventos de queda livre 10 e 30 cm (Figura 5A e B), as durações de excitação foram 251 ± 29 ms (média ± sd, n = 8) e 345 ± 33 ms (n = 10), respectivamente (P<0.001, aluno t-teste). Em resposta aos eventos de tremulação 0.2, 0.5 e 1 seg (Figura 5C e D), as durações de excitação dos neurônios do tipo 3 foram 294 ± 53 ms (n = 10), 573 ± 80 ms (n = 9) e 1091 ± 23 ms (n = 7), respectivamente (P<0.001, ANOVA de uma via). Aluno de Acompanhamento t-teste mostrou diferenças altamente significativas para cada comparação (Figura 5D, painel direito). Em resposta a diferentes intensidades de eventos de agitação, os neurónios tipo 3 exibiram um pico de excitação mais elevado pelos eventos de agitação de alta intensidade em comparação com os de baixa intensidade (Figura 5E e F; 24.2 ± 4.6 vs. 15.5 ± 1.3 Hz, média ± dp).

Juntos, esses resultados sugerem que as mudanças dinâmicas temporais no disparo de neurônios de dopamina putativos de VTA se correlacionam bem com a duração do estímulo dos eventos com medo, com disparo suprimido para os neurônios tipo 1 e tipo 2 e aumento do disparo para os neurônios do tipo 3. Suas mudanças de disparo também podem se correlacionar com as intensidades de estímulo dos eventos temerosos, mas em muito menos um grau.

Codificação integral de eventos e contextos

O cérebro tipicamente processa experiências episódicas em contextos ambientais, e isso também é verdade para comportamentos aditivos. A informação contextual tem sido sugerida como sendo importante para a capacidade de resposta dos neurônios dopaminérgicos para recompensar as sugestões de previsão . Perguntamos se o contexto ambiental desempenhava um papel na codificação de eventos negativos e, mais importante, como os neurônios da dopamina VTA responderiam à mesma sugestão condicionada, mas co-ligados a contextos distintos que preveriam resultados opostos (por exemplo, recompensa versus estímulos aversivos) .

Assim, conduzimos outro conjunto de experimentos em que os camundongos foram submetidos a condicionamento bidirecional (recompensa e condicionamento aversivo). Usamos um tom neutro como o estímulo condicionado (CS) para emparelhar com estímulos distintos incondicionados (US, quer pellet de açúcar ou queda livre) em diferentes ambientes (Figura 6A). Submetemos os camundongos ao condicionamento pavloviano por uma semana, durante o qual os camundongos receberam pares de 200 CS / US para o condicionamento recompensador e aversivo (ver Materiais e Métodos). Após o treino, os ratos aproximaram-se rapidamente do depósito de pellets de açúcar, normalmente em 3-10 sec (4.3 seg em média) após o início do tom condicionado, mas sem se aproximarem da placa de controlo que não recebeu pellets de açúcar, indicando a eficácia e especificidade da aprendizagem da recompensa associativa (Figura 6B, painel esquerdo). Por outro lado, em resposta ao tom condicionado que previu um evento de queda livre na câmara de queda livre, os ratos mostraram um significativo aumento do movimento para trás ao ouvir o tom condicionado (Figura 6B, painel direito), que pode refletir a fuga ou comportamento defensivo de um animal . As respostas elevadas de medo / ansiedade nesses camundongos também foram evidenciadas pelo aumento da defecação e micção na câmara de queda livre em comparação com a recompensa ou câmaras neutras (Figura 6C).

Registros de atividade neuronal nesses camundongos condicionados (após o treinamento com 1 semanas) revelaram que os neurônios putativos de dopamina de VTA responderam significativamente ao tom condicionado que predisse um pellet de açúcar na câmara de recompensa (Figura 6D, painel esquerdo). Curiosamente, os mesmos neurônios VTA também responderam de forma confiável ao mesmo tom condicionado quando previu queda livre na câmara de queda livre (Figura 6D, painel do meio). Quando o mesmo tom condicionado foi entregue aos camundongos em uma câmara neutra que não estava associada a nenhum evento, não produziu mudanças significativas no disparo (Figura 6D, painel direito).

No total, registramos os neurônios de dopamina 16 suprimidos pelo medo (tipo 1 e tipo 2) dos camundongos que foram submetidos ao protocolo de condicionamento bidirecional. Todos estes neurônios exibiram um aumento significativo nas taxas de disparo após o início do tom condicionado que previa de forma confiável o pellet de açúcar (Figura 6D – Fpainéis da esquerda) (P<0.001, teste dos postos sinalizados de Wilcoxon). Em resposta ao mesmo tom que previu o evento de queda livre, metade dos neurônios (8/16) mostrou uma diminuição significativa na taxa de disparo (Figura 6D, painel do meio) (P<0.05, teste de classificação sinalizada de Wilcoxon), enquanto a outra metade (8/16) mostrou um breve pico de ativação imediata (pelo menos duas vezes maior do que a taxa de disparo inicial e com escores z maiores do que 2) seguido por uma supressão significativa (Figura 6E, painel do meio) (P<0.05, teste dos postos sinalizados de Wilcoxon). Em resposta ao mesmo tom representado em uma câmara neutra, houve muito limitado ou nenhuma mudança no disparo (Figura 6D – F, painéis da direita). Esses resultados sugerem que os neurônios putativos de dopamina type-1 e type-2 VTA podem codificar de forma bidirecional os sinais positivos e negativos integrados (informações de tom condicionado e contexto combinados), aumentando e diminuindo seus disparos, respectivamente.

A importância dos contextos na produção de respostas condicionadas distintas também foi evidente em neurônios dopaminérgicos tipo 3. Como exemplo, o neurônio tipo 3 respondeu significativamente ao tom condicionado associado a um pellet de açúcar na câmara de recompensa (Figura 7A, painel esquerdo) ou queda livre na câmara de queda livre (Figura 7A, painel do meio). Por outro lado, não mostrou qualquer alteração na taxa de disparo quando o tom foi tocado na câmara neutra (Figura 7A, painel direito). A análise populacional confirmou novamente que esses neurônios do tipo 3 aumentaram seu disparo para o mesmo tom condicionado nas câmaras de recompensa e queda livre (Figura 7Bpainéis esquerdo e médio), mas não na câmara neutra (Figura 7B, painel direito) (P <0.05, Student's t-teste). Coletivamente, os experimentos contextuais acima sugerem que a informação representada no nível do neurônio da dopamina VTA é altamente processada e ricamente integrada para codificar um dado conjunto de eventos motivacionais positivos ou negativos associados a contextos ambientais.

Resposta latência de início de neurônios de dopamina VTA

Em seguida, começamos a examinar a latência de resposta dos neurônios de dopamina para os eventos de recompensa e medo. Histogramas por evento de eventos de queda livre de 10 e 30 cm e histogramas peri-evento de 0.2, 0.5 e 1 segundos eventos de agitação foram combinados para neurónios de dopamina individuais para o cálculo da latência de início de resposta. A latência de início de resposta foi determinada obtendo-se primeiro a taxa média de disparo (média) e o desvio padrão (dp) das bandejas 1000 (bin = 10 ms) imediatamente antes do início do estímulo. A latência de resposta foi considerada como sendo o tempo correspondente ao primeiro escaninho de pelo menos três escaninhos consecutivos com escores Z ≥2 após o início do estímulo. Devido à baixa taxa de disparo basal do neurônio dopaminérgico, os histogramas peri-evento (bin = 10 ms) foram suavizados com um filtro Gaussiano (largura do filtro = 3) para o cálculo da latência de resposta de início de supressão (latências de início de resposta do tipo -1 e tipo-2 neurônios para queda livre, agitar e o CS aversivo).

Nossos resultados mostraram que os neurônios dopaminérgicos de tipo 1 e tipo 2 exibiram latências de início de resposta similares para eventos de queda livre e tremor (90.6 ± 31.3 ms vs. 108.4 ± 48.6 ms; média ± dp) (Figura 8A e E). Os neurónios de tipo-3 semelhantes a dopaminérgicos também exibiram latências de início de resposta semelhantes aos dois eventos de medo (43.5 ± 20.6 ms vs. 46.8 ± 24.2 ms), bem como aos dois estímulos condicionados (75.7 ± 19.0 ms vs. 62.9 ± 12.5 ms ) (Figura 8B, D e F). Por outro lado, os neurônios tipo 1 e tipo 2 exibiram latência de início de resposta (de supressão) muito mais longa à CS aversiva em comparação com a latência de início de resposta (de ativação) à CS de recompensa (181.6 ± 51.9 ms vs. 67.1 ± 19.0 ms) (Figura 8C e E). No geral, a latência de resposta de início de supressão foi geralmente mais longa do que a latência de ativação de resposta para qualquer comparação (Figura 8E e F).

Sincronia entre conjuntos únicos de neurônios de dopamina VTA

Uma vez que os níveis de dopamina nas áreas-alvo têm sido frequentemente associados a vários resultados cognitivos, há muito que se supõe que o disparo sincronizado de neurónios de dopamina pode representar um mecanismo neural para implementar esta estratégia química neural. , . Esta noção é corroborada por estudos que mostram que subconjuntos de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNc) exibem atividade sincronizada espontânea. , . Usando a gravação de vários tetrodos em nossos experimentos, tivemos a oportunidade de examinar as correlações dinâmicas entre os neurônios de dopamina putativos gravados simultaneamente no VTA (com até cinco neurônios de dopamina putativos gravados simultaneamente). Nossas análises revelaram que a grande maioria dos supostos neurônios de dopamina mostrou disparo sincronizado espontaneamente, independentemente do ciclo de sono-vigília do animal (Figura 9). Como exemplo, a correlação cruzada de dois neurônios putativos de dopamina tipo 1 registrados simultaneamente foi altamente significativa (Figura 9A e B) A partir da análise dos conjuntos de dados agrupados, em geral, a grande maioria (83%; 48/58 pares) dos neurônios tipo 1 registrados simultaneamente mostraram sincronização significativa (pontuação z de pico> 11) em uma janela de tempo de cerca de 100 ms independentemente de os ratos estarem se comportando ou dormindo livremente (Figura 9C). Do mesmo modo, houve também uma sincronização significativa entre os neurónios de dopamina putativos de tipo 1 e tipo-2 gravados simultaneamente (Figura 9D – F). Dos pares de neurônios dopaminérgicos do tipo 1 e 2 tipo 75 registrados simultaneamente, 6% (8 / XNUMX) deles mostraram sincronização significativa quando os ratos estavam se comportando livremente ou dormindo (Figura 9F).

Além disso, foi observada uma sincronização significativa na população putativa de neurónios dopaminérgicos tipo 3 (Figura 9G – I). Dos pares de neurônios dopaminérgicos tipo 3 registrados simultaneamente, 79% (15 / 19) deles apresentaram sincronização significativa (Figura 9I). Por outro lado, quando os neurônios tipo 1 e tipo 3 registrados simultaneamente, ou os neurônios dopaminérgicos tipo 2 e tipo 3 (pares n = 12) foram calculados para suas correlações cruzadas, não revelou qualquer sincronização significativa (Figura 9J – L). Juntos, a atividade sincronizada entre os supostos neurônios dopaminérgicos suprimidos pelo medo (tipo 1 e tipo 2), bem como entre os neurônios tipo 3 excitados pelo medo, sugere que diferentes subpopulações de neurônios dopaminários putativos podem receber inputs distintos de áreas cerebrais separadas e estão integrados com redes distintas , , .

Discussão

Nossas gravações e análises do conjunto acima forneceram um conjunto de evidências para o papel dos neurônios da dopamina no processamento de experiências positivas e negativas. Descobrimos que os neurônios de dopamina VTA exibiram diversas propriedades de resposta e que a grande maioria dos supostos neurônios de dopamina responde a estímulos de recompensa e medo. Esta estratégia de codificação convergente pelos neurônios de dopamina VTA é interessante à luz de um estudo altamente citado em macacos acordados que mostra que os neurônios de dopamina preferencialmente respondem a estímulos com valor motivacional mais apetitivo do que aversivo . O estímulo aversivo, como o sopro de ar usado neste estudo, é um estímulo bastante leve em comparação com os dois eventos de medo usados ​​em nosso experimento. Alguns pesquisadores sugeriram que estímulos aversivos como sopro de ar podem não apresentar valor negativo porque os macacos podem aprender a piscar ou fechar os olhos ao estímulo condicionado para evitar o estímulo aversivo. , . Por outro lado, estudos mais recentes em macacos acordados mostram a existência de diferentes tipos de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNc) para transmitir sinais positivos e negativos , , . Portanto, os neurônios de dopamina VTA e SNc podem seguir uma estratégia de codificação unificada para o processamento convergente de sinais motivacionais positivos e negativos.

Na VTA, um estudo anterior demonstrou que diferentes populações de neurônios putativos de dopamina VTA foram ativados ou suprimidos pelo condicionamento diferencial do medo. . Recentemente, foi relatado que os neurônios dopaminérgicos localizados na porção ventral da ATV foram ativados por choque nas patas em ratos anestesiados . No entanto, esses dois estudos não examinaram como os mesmos neurônios da dopamina reagiriam à recompensa ou a eventos positivos. Tirando proveito dos estados que se comportam livremente de nossos camundongos registrados, nós apresentamos aos camundongos tanto estímulos positivos quanto negativos e descobrimos que a grande maioria dos neurônios de dopamina VTA reage à recompensa e às experiências negativas.

É importante notar que nossa técnica de registro extracelular atual não tem a capacidade de visualizar diferentes tipos de neurônios de dopamina putativos em nosso experimento. Nós estimamos que os neurônios dopaminérgicos tipo 3 registrados em nosso experimento parecem estar localizados mais dorsalmente ou anteriormente na área de ATV (Figura 1A, quadrados vermelhos e roxos). No entanto, notou-se que pelo menos os pares 12 dos neurônios tipo 1 / 2 e tipo 3 foram registrados simultaneamente e em vários casos registrados a partir de um tetrodo (por exemplo, Figura 3G; Figura 9J) Outros experimentos anatômicos mais cuidadosos podem ser necessários para resolver esse problema. No entanto, nossos resultados de camundongos acordados com comportamento livre apóiam a noção de que, embora a maioria dos neurônios dopaminérgicos putativos de VTA exibam atividade diminuída, um pequeno grupo de neurônios semelhantes aos dopaminérgicos pode ser ativado por eventos negativos ou aversivos. Os neurônios dopaminérgicos tipo 3 registrados em nosso experimento compartilharam mais similaridade com os neurônios dopaminérgicos putativos do tipo 1/2 do que neurônios não dopaminérgicos: todos os três tipos de neurônios exibiram baixa taxa de disparo de linha de base (0.5-10 Hz), relativamente longo intervalo inter-pico (> 4 ms) e padrão de disparo regular. Por outro lado, os neurônios VTA não dopaminérgicos exibiram principalmente maior taxa de disparo basal (> 10 Hz) e forte modulação por movimento - . Em resposta aos dois eventos de medo, a maioria desses neurônios não dopaminérgicos (> 70%) exibiu ativação significativa e com uma grande diversidade de padrões temporais de disparo. A complexa atividade de linha de base, bem como as propriedades de resposta desses neurônios não dopaminérgicos aos dois eventos de medo, estão além do escopo da discussão aqui.

Nossas descobertas atuais também fornecem vários novos insights sobre o papel dos neurônios de dopamina VTA na motivação positiva e negativa. Em primeiro lugar, os neurónios de dopamina putativos de VTA respondem a diferentes estímulos negativos de modos semelhantes em animais acordados. Ou seja, os neurônios que responderam à queda livre sempre responderam a agitar de maneira semelhante (supressão para os neurônios tipo 1 e tipo 2, ativação para neurônios tipo 3). As respostas unidirecionais aos eventos negativos dentro de um determinado tipo de neurônios de dopamina VTA são similares àquelas de suas respostas a uma ampla gama de eventos novos e relacionados a recompensas. , .

A segunda característica notável é a forte excitação de ressalto de compensação de neurônios dopaminérgicos tipo 1 na finalização de eventos de queda livre ou tremor. Essa excitação deslocada nos animais que se comportam livremente pode codificar informações que refletem não apenas um alívio no término de tais eventos temerosos. - , mas talvez fornecendo alguns tipos de sinais motivacionais (por exemplo, motivação para escapar). Também é igualmente possível que a excitação offset-redound possa desempenhar um papel importante no engajamento de comportamentos de busca de emoção (por exemplo, esportes radicais, passeio de Tower of Terror na Disney World). Vale ressaltar que a ativação rebote do neurônio da dopamina VTA também foi relatada na conclusão dos estímulos do choque de cabeça em ratos anestesiados . No entanto, será de grande interesse examinar mais detalhadamente a relevância funcional do neurônio dopaminérgico em vários comportamentos de risco.

Terceiro, os neurônios de dopamina putativos de ATV exibem atividades dinâmicas temporais que se correlacionam estreitamente com as durações dos eventos de medo. O uso da mudança de atividade temporal para codificar a duração do evento temível parece fazer sentido porque a supressão é muito limitada devido à baixa taxa de disparo da linha de base da maioria dos neurônios dopaminérgicos. Isso é interessante em comparação com a descoberta de que os neurônios dopaminérgicos exibem diferentes respostas de pico a diferentes valores de bolus de recompensa. . Ao considerar as fontes que impulsionam a supressão dos neurônios dopaminérgicos tipo 1 e tipo 2, estudos recentes sugerem que o núcleo habenular lateral (LHb) e o núcleo tegmentar rostromedial GABAérgico (RMTg) desempenham papéis importantes. - . Primeiro, esses núcleos exibem respostas opostas aos estímulos recompensadores ou aversivos em comparação com as respostas do neurônio dopaminérgico aos mesmos estímulos , . Segundo, os neurônios dopaminérgicos são fortemente suprimidos após a ativação de LHb ou RMTg , .

Quarto, nós revelamos ainda que os neurônios de dopamina VTA podem exibir mudanças completamente opostas em seus disparos pelo estímulo condicionado para sinalizar recompensa ou eventos temerosos que ocorreram sob contextos distintos (Figura 6). Isso sugere fortemente que o processamento neural que ocorre no nível de VTA é altamente integrado e que as informações contextuais são parte integrante do processo de codificação para experiências positivas e negativas. Esse achado é consistente com as evidências anatômicas e hipóteses anteriores de que os neurônios VTA recebem informações altamente processadas das estruturas do prosencéfalo, como o hipocampo e o córtex pré-frontal. , - . Essa integração de alto nível de experiências e eventos na população neuronal de VTA pode explicar por que os ambientes desempenham um papel tão dominante em provocar o desejo ou o reforço de hábitos.

Finalmente, as nossas técnicas de gravação simultânea permitiram demonstrar uma correlação significativa entre os supostos neurónios dopaminérgicos do tipo 1 e do tipo 2, bem como entre os neurónios do tipo 3. A especificidade dessa sincronia de disparo é altamente interessante, dada a consideração do possível arranjo da rede VTA. Isto sugere que os neurónios putativos de dopamina de VTA podem empregar duas estratégias sincronizadas altamente específicas para optimização e eficácia da transmissão de dopamina e proporcionam assim uma modulação coordenada de estruturas a jusante tais como o núcleo accumbens. A falta de atividade sincronizada entre os neurônios tipo 3 e tipo 1 / 2 é consistente com muitas outras diferenças entre eles, tanto eletrofisiologicamente quanto farmacologicamente (Figura 3). Particularmente, ao contrário dos neurônios de dopamina tipo 1 e tipo 2, quase todos (96%; 23 / 24) dos quais exibem supressão significativa, os neurônios do tipo 3 mostram excitação pelos agonistas do receptor de dopamina (Figura 3H). Note-se que os neurónios putativos de dopamina foram principalmente inibidos ou não afectados pelo agonista do receptor da dopamina em estudos anteriores. Apenas alguns estudos relataram que alguns neurônios dopaminérgicos podem ser ativados por agonistas do receptor de dopamina , , talvez porque os neurônios ativados foram simplesmente classificados como neurônios não dopaminérgicos em estudos anteriores. Notavelmente, um pequeno número de neurônios de dopamina VTA que também são positivos para TH, foi relatado como sendo ativado pelo agonista do receptor de dopamina. . Experimentos futuros, talvez usando optogenética, serão necessários para confirmar se os neurônios tipo 3 ativados pelo medo eram neurônios dopaminérgicos. E a aceitação desses neurônios tipo 3 como neurônios dopaminérgicos deve ser cautelosa até o momento.

Em resumo, mostramos que a grande maioria dos supostos neurônios dopaminérgicos da VTA é capaz de responder tanto à informação aversiva da recompensa quanto à do medo. Esses supostos neurônios dopaminérgicos respondem a diferentes eventos negativos de maneira semelhante e, mais importante, suas durações temporais de mudanças dinâmicas de disparo são proporcionais às durações dos eventos de medo. Os neurônios putativos de dopamina da VTA também integram pistas e informações contextuais para a distinção entre recompensa e eventos temerosos. Em conjunto, sugerimos que os neurônios de dopamina VTA podem empregar a estratégia de codificação convergente no nível da população da rede para o processamento de experiências positivas e negativas. Essa codificação convergente de experiências também é altamente integrada com sugestões e contextos ambientais para melhorar ainda mais a especificidade comportamental.

Materiais e Métodos

Declaração de ética

Todos os animais utilizados neste estudo estavam de acordo com procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Georgia Health Sciences University e cobertos pelo protocolo BR-07-11-001.

Assuntos

Utilizou-se um total de ratinhos C71BL / 57J machos 6 para registo e alojados individualmente num ciclo escuro de luz 12-h / 12-h. Apenas os dados dos camundongos 24 dos quais registramos os supostos neurônios de dopamina foram utilizados nas análises atuais.

Cirurgias

Um conjunto de eletrodos de 32 canais (um feixe de 8 tetrodos), ultraleves (peso <1 g), móveis (acionados por parafuso) foi construído de forma semelhante ao descrito anteriormente . Cada tetrode consistia em quatro fios de Fe-Ni-Cr de 13-µm de diâmetro (Stablohm 675, California Fine Wire; com impedâncias de 2-4 MΩ para cada fio) ou 17-µm de diâmetro Platinum wires (90% Platinum 10% Iridium) California Fine Wire, com impedâncias tipicamente 1 – 2 MΩ para cada fio). Uma semana antes da cirurgia, os ratos (3 – 6 meses de idade) foram removidos da gaiola padrão e alojados em homecages personalizados (40 × 20 × 25 cm). No dia da cirurgia, os ratos foram anestesiados com Ketamina / Xilazina (80 / 12 mg / kg, ip); o conjunto de eletrodos foi então implantado em direção ao VTA no hemisfério direito (3.4 mm posterior ao bregma, 0.5 mm lateral e 3.8 – 4.0 mm ventral à superfície do cérebro) e fixado com cimento dental.

Gravação de Tetrode e Isolamento de Unidades

Dois ou três dias após a cirurgia, os eletrodos foram selecionados diariamente para a atividade neural. Se nenhum neurônio dopaminérgico fosse detectado, o feixe de eletrodos estava avançado 40 ~ 100 µm diariamente, até que pudéssemos gravar a partir de um supostamente neurônio dopaminérgico. O registro extracelular multicanal foi semelhante ao descrito anteriormente . Em resumo, picos (filtrados em 250-8000 Hz; digitalizados a 40 kHz) foram registrados durante todo o processo experimental usando o sistema de processador de aquisição multicanal da Plexon (Plexon Inc.). Os comportamentos dos ratos foram gravados simultaneamente usando o sistema de rastreamento Plexon CinePlex. Picos registrados foram isolados usando o software Plexon OfflineSorter: os parâmetros de classificação de múltiplos picos (por exemplo, análise de componentes principais, análise de energia) foram usados ​​para o melhor isolamento das formas de onda gravadas em tetrode. Combinando a estabilidade da gravação multi-tetrode e técnicas de isolamento de unidades múltiplas disponíveis no OfflineSorter (por exemplo, análise de componentes principais, análise de energia), neurônios VTA individuais podem ser estudados em grande detalhe, em muitos casos por dias (Figura S1).

Eventos Temerosos

Dois eventos de medo, queda livre (de 10 e 30 cm) e batida (para 0.2, 0.5 e 1 sec), foram realizados aleatoriamente em nossos experimentos com um intervalo de, tipicamente, 1-2 horas entre as sessões. Usamos um quadrado (10 × 10 × 15 cm) ou câmara redonda (11 cm de diâmetro, 15 cm de altura) para o evento de queda livre. Utilizamos uma câmara redonda (12.5 cm de diâmetro, 15 cm de altura) para os eventos de agitação. Em cada sessão de queda livre ou sacudida, um camundongo era colocado na câmara de queda livre ou tremor (o camundongo podia se mover livremente dentro das câmaras). Após 3 min habituation, sobre os ensaios 20 de eventos de queda livre (ou tremor) foram dados com um intervalo de 1-2 min entre os ensaios. A câmara de queda livre foi levantada (10 cm ou 30 cm de altura) e amarrada a um sistema de solenóide (Sistemas de Sensores Magnéticos, Série S-20-125) antes de cada evento de queda livre. O evento de queda livre foi então entregue fornecendo controle mecânico preciso (WPI, PulseMaster A300) do sistema solenoide para liberar o cabo de suspensão. A câmara de queda livre pousou em uma almofada macia que reduziu bastante os saltos e evitou possíveis danos à estabilidade da gravação (Figuras S2 e S3) A duração da queda livre foi calculada pela equação: T = SQRT (2 × h / g), onde h é a altura da queda livre eg é a aceleração da gravidade terrestre. Considerando o atraso da aterrissagem suave, as durações estimadas para quedas livres de 10 e 30 cm foram de 230 e 340 ms, respectivamente. O evento de agitação foi fornecido fornecendo controle mecânico preciso de uma máquina de vórtice (Thermolyne Maxi Mix II Tipo 37600 Mixer) a uma velocidade máxima de 3000 rpm, exceto para uma de baixa intensidade, que era cerca de 1500 rpm.

Sempre monitoramos a estabilidade das unidades registradas examinando as formas de onda de pico, o status de disparo da linha de base e as distribuições de cluster de pico antes e depois dos eventos, bem como durante todos os experimentos. Incluímos apenas os conjuntos de dados dos animais que atenderam a esses critérios de registro para mais análises de dados. Como mostrado em Figuras S1, S2 e S3, os neurônios de dopamina listados no presente estudo foram registrados de forma estável e bem isolados durante eventos de queda livre e tremor, sem perda temporária de unidade ou contaminação por ruído / artefato.

Em particular, fizemos três etapas para garantir que os picos não fossem contaminados por quaisquer artefatos: 1) Reduzimos a interferência para a gravação aterrando todo o aparato experimental. Descobrimos que os artefatos elétricos gerados durante os eventos de queda livre e tremor estavam no mesmo nível daqueles durante a exploração locomotora. 2) Também cancelamos os artefatos remanescentes pelo Plexon Referencing Client, o que nos permitiu escolher um canal sem unidades visivelmente boas como canal de referência. Isso eliminou muito os ruídos e artefatos de fundo. 3) Se quaisquer formas de onda de artefato possíveis ainda fossem deixadas, nós as removíamos durante o pré-processamento de formas de onda de pico usando o Plexon Offline Sorter porque formas de onda de artefato eram altamente distintas das formas de onda de pico neuronal.

Recompensa e condicionamento bidirecional

Os camundongos foram um pouco restritos a comida antes do treinamento da associação de recompensas. No condicionamento de recompensa, os ratos foram colocados na câmara de recompensa (45 cm de diâmetro, 40 cm de altura). Os ratinhos foram treinados para emparelhar um tom (5 kHz, 1 seg) com subsequente entrega de pellets de açúcar durante pelo menos dois dias (ensaios 40-60 por dia; com um intervalo de 1-2 min entre os ensaios). O tom foi gerado pelo gerador de sinal de áudio A12-33 (5-ms em forma de ascensão e queda; cerca de 80 dB no centro da câmara) (Coulbourn Instruments). Um pellet de açúcar (14 mg) foi fornecido por um distribuidor de alimentos (ENV-203-14P, Med. Associates Inc.) e colocado em um dos dois receptáculos (12 × 7 × 3 cm) na terminação do tom (o outro O receptáculo foi usado como controle, onde um pellet de açúcar nunca foi recebido).

Em um conjunto separado de experimentos, os camundongos foram treinados para condicionamento bidirecional (recompensa e condicionamento aversivo). O tom condicionado (5 kHz, 1 seg) utilizado foi idêntico, mas em contextos diferentes: durante o condicionamento de recompensa (na câmara de recompensa; 45 cm de diâmetro, 40 cm de altura), o tom foi emparelhado com entrega de pellets de açúcar; durante o condicionamento aversivo (na câmara de queda livre), o mesmo tom foi emparelhado com um evento de queda livre (30 cm de altura). Os ratinhos foram treinados durante uma semana ou mais e foram contrabalançados: metade dos ratinhos recebeu condicionamento de recompensa nos dias 1 e 2, seguido de condicionamento aversivo nos dias 3 e 4 (ensaios 40-60 todos os dias); a outra metade dos ratos recebeu condicionamento aversivo nos dias 1 e 2, seguido por condicionamento de recompensa nos dias 3 e 4 (40-60 por dia). Nos dias 5 e mais tarde, três sessões (testes 20 – 30 por sessão) foram dadas a cada dia em uma ordem aleatória, incluindo condicionamento de recompensa, condicionamento aversivo e em uma terceira câmara neutra (55 × 30 × 30 cm que foi enriquecida com brinquedos ) onde o tom não previa nada. O intervalo entre as sessões foi de 1 – 2 horas; o intervalo entre as tentativas foi 1-2 min. A latência da abordagem do envelope de açúcar / controle após o início do tom condicionado foi examinada no dia 7. Latências maiores que 60 seg foram consideradas como 60 sec; no caso de o mouse estar dentro do receptáculo durante o tom condicionado, a latência não foi usada para cálculo. O comportamento de movimento para trás (cabeça e / ou membros se movendo para trás) após o início do tom condicionado também foi examinado no dia 7.

Verificação Histológica do Site de Gravação

Após a conclusão dos experimentos, a posição final do eletrodo foi marcada pela passagem de uma corrente de 10-sec 20-µA (Isolador de Estímulo A365, WPI) através de dois eletrodos. Os ratinhos foram anestesiados em profundidade e perfundidos com solução salina 0.9% seguida de paraNormaxdeído 4%. Os cérebros foram então removidos e pós-fixados em paraformaldeído durante pelo menos 24 h. Cérebros foram rapidamente congelados e cortados em um criostato (50-µm seções coronais) e corados com violeta de cresil. Os experimentos histológicos foram realizados em camundongos 21 (em outros camundongos 3, as seções do cérebro, infelizmente, não foram bem preparadas). Nossos resultados histológicos confirmaram que os neurônios de dopamina foram registrados a partir da área de VTA em camundongos 17 e da área de borda de VTA-SNc em camundongos 4 (Figura 1A).

Análise de Dados

Picos neurais classificados foram processados ​​e analisados ​​em NeuroExplorer (Nex Technologies) e Matlab. Os neurônios dopaminérgicos foram classificados com base nos três critérios a seguir: 1) baixa taxa de disparo inicial (0.5–10 Hz); 2) intervalo inter-pico relativamente longo (todos os neurônios de dopamina putativos classificados estão com ISIs> 4 ms dentro de um nível de confiança ≥99.8%). O ISI mais curto que registramos foi de 4.1 ms em quaisquer condições em nosso experimento (apenas unidades bem isoladas com amplitude ≥0.4 mV foram usadas para o cálculo do ISI mais curto). A média dos ISIs mais curtos foi 6.8 ± 2.2 ms (Média ± dp; n = 36). Em contraste, o ISI para neurônios não dopaminérgicos pode ser tão curto quanto 1.1 ms; 3) padrão de disparo regular quando os ratos se comportavam livremente (flutuação <3 Hz). Aqui, a flutuação representa o desvio padrão (sd) dos valores da barra do histograma da taxa de tiro (bin = 1 seg; registrado por pelo menos 600 seg). Além disso, observou-se que a grande maioria (89%; 56/63) dos neurônios de dopamina classificados testados mostraram ativação significativa em resposta ao tom de predição de recompensa (Figura 2E e F). Também foi notado que a maioria dos neurônios dopaminérgicos putativos classificados (70%, 23 / 33; tipo 1 e 2) testados mostraram supressão significativa (≤30% taxa de disparo basal) e os outros neurônios 27% tipo-3 (n = 9) mostrou ativação (Figura 3H). Por outro lado, os neurônios não-dopaminérgicos do VTA mostraram pouca ou nenhuma mudança na taxa de disparo pelos agonistas do receptor de dopamina (Figura 3I). Metade das larguras AP das formas de onda do pico foram medidas a partir dos vales até os seguintes picos do potencial de ação (Figura 1B) Metade das larguras de AP maiores que 0.8 ms foram consideradas como 0.8 ms. Para o cálculo da probabilidade de explosão do neurônio da dopamina, a atividade de linha de base quando os camundongos estavam se comportando livremente foi usada de acordo com os critérios estabelecidos anteriormente (início da explosão, ISI de ≤80 ms; deslocamento de explosão, ISI de ≥160 ms) .

Mudanças de atividade neuronal para os estímulos condicionados e incondicionados foram comparadas contra um período de controle de 10-sec antes do início do estímulo em cada tentativa com uma janela de tempo escolhida (dependendo da duração dos estímulos) usando um teste de Wilcoxon. Para eventos de queda livre 10 e 30 cm, as janelas de tempo eram 100 – 230 e 100 – 340 ms após o início do evento de queda livre, respectivamente; Para os eventos 0.2, 0.5 e 1, as janelas de tempo eram 100 – 200, 100 – 500 e 100 – 1000 ms após o início do evento de tremor, respectivamente (notou-se que alguns poucos neurônios de dopamina tipo 1 / 2 , ~ 10%, também mostrou uma pequena ativação durante o 100 ms inicial logo após o início da queda livre e eventos de tremor). Para o condicionamento de recompensa, a janela de tempo era 50-600 ms após o início do tom condicionado; para condicionamento aversivo, a janela de tempo era 200-600 ms após o início do tom condicionado.

Raspadores peri-evento (1-20 ensaios, de cima para baixo) e histogramas foram realizados em NeuroExplorer (Nex Technologies). Todos os alisamentos foram realizados no NeuroExplorer usando um filtro Gaussiano (largura do filtro = caixas 3). As correlações cruzadas foram conduzidas entre os pares de neurônios de dopamina registrados simultaneamente quando os ratos estavam se comportando livremente (sem estímulos externos) ou dormindo no homecage. Para o cálculo do escore z do valor de pico de correlação cruzada, os histogramas de correlação cruzada foram suavizados para obter o valor de pico; média e desvio padrão foram obtidos a partir de picos aleatórios (aleatórios) em Matlab . Note-se que as unidades sincronizadas representam diferentes neurônios de dopamina, em vez do mesmo neurônio. Excluímos a possibilidade de que as unidades sincronizadas fossem gravadas ou contaminadas pelo mesmo neurônio (quando isso acontecesse, haveria um pico acentuado em uma viúva de tempo de ~ 1 ms em vez de ~ 100 ms como mostrado em Figura 9).

Informações de Apoio

Figura S1.

Neurônios de dopamina VTA são registrados de forma estável e bem isolados. (A) Um exemplo de um neurônio de dopamina do tipo 1 bem isolado (pontos azuis) em uma Análise de Componente Principal com dimensões 2 e suas formas de onda representativas (registradas por tetrode) no dia 1 (painel superior) e dia 2 (painel inferior) . Isolamento de pico foi realizado usando Plexon OfflineSorter (Plexon Inc. Dallas, TX). PC1 e PC2 representam o primeiro e o segundo componentes principais, respectivamente. Pontos azuis representam pontos individuais para o neurônio dopaminérgico isolado; pontos pretos indicam picos individuais para outros neurônios VTA. (B) Um exemplo de um neurônio de dopamina tipo 2 bem isolado (pontos azuis) e suas formas de onda representativas no dia 1 (painel superior) e no dia 2 (painel inferior). (C) Um exemplo de um neurônio de dopamina tipo 3 bem isolado (pontos azuis) e suas formas de onda representativas no dia 1 (painel superior) e no dia 2 (painel inferior).

doi: 10.1371 / journal.pone.0017047.s001

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Figura S2.

Sem perda temporária da unidade durante queda livre e eventos de vibração. (A) Respostas de quatro neurônios VTA dopaminérgicos e não dopaminérgicos registrados simultaneamente durante eventos de queda livre. Observe que as unidades gravadas a partir do mesmo tetrodo podem exibir respostas opostas (por exemplo, tetrodo # 5 unidades 1 e 2; tetrodo # 8 unidades 1 e 2), sugerindo que a gravação foi estável sem quaisquer perdas temporárias de unidades. (B) Respostas dos mesmos quatro neurônios VTA durante eventos de agitação. (C) Formas de onda representativas para os mesmos quatro neurônios VTA 1 h antes, durante a queda livre e sessão de evento de agitação, e 1 h depois.

doi: 10.1371 / journal.pone.0017047.s002

(TIF)

Figura S3.

Sem contaminação de ruído / artefato durante eventos de queda livre e tremor. (A) Respostas de um exemplo putativo de neurônio dopaminérgico (tipo-1) e suas formas de onda antes (1 seg), durante (1 seg) e após (1 seg) os eventos de queda livre e tremor. Observe que as formas de onda não mostraram mudanças significativas após o evento de queda livre e tremor, sugerindo que não houve contaminação de ruído / artefato. (B) Respostas de outro neurônio de dopamina putativo (tipo-3) e suas formas de onda antes (1 seg), durante (1 seg) e após (1 seg) queda livre e eventos de tremor.

doi: 10.1371 / journal.pone.0017047.s003

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Agradecimentos

Agradecemos à Dra. Rhea-Beth Markowitz por editar nosso manuscrito e Kun Xie por fornecer suporte técnico.

Contribuições do autor

Concebido e projetado os experimentos: DVW JZT. Realizou os experimentos: DVW. Analisou os dados: DVW JZT. Escreveu o papel: DVW JZT.

Referências

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